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실시예 2 : 면역화와 항-DNI 및 항-PGA 면역반응의 분석
표 1에 게재된 5개 반응의 가용성 생성물을 흡광도 280 nm 의 동일한 단백질 농도로 조절하였다. 생후 약 5-7
주 된 BALB/c 마우스(Charles River)를 그림 2에 나타낸 면역화 연구에 사용하였다. 마우스들을 실험 첫날
PCMV 백신1-3 과 DNI 단백질 20 μg의 항원 표본 대조군 4 및 5 를 복강주사 함으로써 면역 접종시켰다. 모든
마우스들은 7일째에 출혈을 보였고 10일째에 같은 양의 항원표본을 투여하자 면역반응이 부스팅되었다. 마우
스들은 30일째에 다시 출혈을 하며 사망했다.
혈액 표본의 혈청은 응고가 일어난 후 수집한 후 -20℃에서 저장하였다. ELlSA(Enzyme-linked immunosorbent
assay) 분석을 통해 항-PGA 및 항-DNI 혈청 항체의 양을 측정하였다. 요약하자면, Immulon 2HB ELISA (VWR)
마이크로티터 디쉬를 pH 9.6, 0.5 μg/well, 100 μl/well의 탄산나트륨 완충액에서 BSA-PGA 또는 DNI 로 코
팅하였다. 밤새 4℃에서 배양한 후, 항원으로 코팅된 플레이트는TBST(TBS-0.1% Tween)에 첨가된 3% BSA
(w/v)와 함께 1시간동안 실온 또는 하룻밤동안 4℃에서 배양함으로써 차단하였다. 면역 촉진 이후의 각각의
시점에서의 4마리 마우스로부터 추출한 혈청표본은 TBST로 순차적으로 희석한 후, 항원으로 코팅한 플레이트에
첨가한 후 최소 1시간동안 배양하였다. 항-DNI 및 항-PGA 항체 반응은 알칼린 포스페이타제(Zymed)와 접합된
마우스 Ig G 또는 Ig M에 대한 레빗 항-혈청을 이용하여 측정하였다. p-니트로페닐 포스페이트(PNPP)기질을
각각의 웰에 첨가하고 각각의 반응에 대하여 405 nm에서의 흡광도를 결정하였다. 데이터는 상호 최종 타이터
(reciprocal endpoint titer)로 기재되어 있고, 이는 음성대조군의 흡광도보다 높은 두 개의 표준편차인 OD405
리딩을 얻기 위한 최대 희석치로 정의된다.
세 개의 PCMV 표본 1-3과 두 개의 항원 대조군 표본 4 및 5(그림 3-5)로 면역 접종한 마우스의 Ig M과 Ig G 특
이 항-DNI 및 항-PGA 면역반응을 측정하기 위해 ELISA 분석을 실시하였다. 그림 3에서 보듯이 DNI 단백질은
글루타르알데히드와 크로스링크되지 않은 대조군 표본 4를 제외하고 모든 표본에서 매우 면역반응을 잘 일으킨
다. 그러나, 이런 DNI 특이 면역반응은 전적으로 Ig G에 기초한다. 어떤 항-DNI Ig M 도 면역접종 후 7일째
까지 검출하지 못했으나, PCMV 표본들 또는 DNI로만 크로스링크 된 표본(5번 표본)으로 면역접종한 마우스에서
중요한 항-DNI Ig G 의 반응은 17일째에 검출하였다.
항-PGA Ig M 의 반응은 캡슐중합체의 전형적인 패턴을 보인다(그림 4). 대조군 표본 4는 7일째에 탐지 가능한
항-PGA Ig M 반응을 보이지만, 이 반응은 17일 또는 30일째에 상승되지 않는다. 모든 PCMV 표본은 7일째에 항
-PGA Ig M 반응을 유도하였고, 더 강한 항-PGA Ig M 반응을 17일째 및 30일째에 생성하였다. 예상했듯이, 대
조군 표본 5(DNI와만 크로스 링크된)는 Ig M 또는 Ig G 에 기초한 항-PGA 반응을 생성하지 않았다. 반대로,
PCMV 1-3(표본 1-3)은 17일째에 명확히 나타나고, 30일째에 확연히 부스팅하는 강한 Ig G 에 의한 항-PGA 반응
을 생성하였다(그림 5). PCMV 1-3에 의한 Ig G 의 항-PGA 반응은 Aulinger 등이 보고한 종래의 PGA-DNI 접합
백신에서 관찰된 PGA에 대한 반응(Infect. Immun. 73:3408-3414(2005)) 및 Rhie 등이 보고한 폴리아미노산
(PA)-PGA에 대한 반응(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:10925-10930(2003))과 유사하다. 따라서 PCMV백신
#1, #2 및 #3은 알려진 탄저균의 T-의존성 방어항원인 캡슐 PGA에 대한 면역그로불린 G의 반응을 유도함으로써
모두 종래의 PGA 접합백신과 동일한 작용을 한다(Wang et al. Infect. Immun. 72:5460-5463(2004)). PGA와
혼합된 DNI(크로스링크되지 않는)를 함유한 대조군 표본 5는 PGA에 대해 탐지 가능한 Ig G 반응을 유발시키지
않아 PCMV 표본 1-3에서 DNI가 Ig G 의 항-PGA 반응을 촉진시키는데 있어 TLR 리간드로 작용하지 않음을 보여준
다. 이 결과로 또한 PGA는 낮은 면역원성을 가지는 T-세포 비의존성 면역원이라는 사실을 확인하였다. 그렇
지 않으면 단백질과 공유결합을 통해 결합하였을 것이기 때문이다(Rhie et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA
100:10925-10930 (2003)). PCMV 방법은 상기 방법이 결과적으로 DNI 단백질을 PGA 분자와 직접적으로 크로스
링크시키지 않음에도 불구하고 명확히 PGA를 T-세포 의존성 면역원으로 변환시킨다.
이러한 데이터는 PCMV 방법이 종래의 접합백신과 유사한 특성의 면역원을 생산할 수 있음을 보여준다. PGA
PCMV는 여기서 서술한 방법을 이용하여 쉽게 만들 수 있고, 전형적인 PGA-단백질 접합백신에 의한 면역반응을
유도한다는 것을 발견하였다. 표 1에 개시된 작은 스케일의 반응들은 도 3에 요약된 도식에 따라 1000마리의
마우스를 면역접종하기에 충분한 양의 PCMV를 만든다. 본 데이터는 PGA와 DNI로부터 만들어진 PCMV가 탄저균
에 의해 유발된 탄저병을 예방하는 백신으로 쓰일 수 있음을 뒷받침한다.
실시예 3 : 추가적 PCMVs의 생성 및 특성
PCMV 기술은 다양한 구조와 이온 극성의 캡슐 항원에 적용될 수 있다. 23 개 타입의 폐렴연쇄상구균
(Streptococcus pneumonia) 다당류는 ATCC(American Type Culture Collection)에서 구입하였고, Merck, Inc.에
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공개특허 10-2009-0066272