(19) 대한민국특허청(KR) (12) 공개특허공보(A) - Questel
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: 물에서 30 mg/ml BSA 5 ml 를 NP7.5에서 134 mg/ml PGA 1 ml 와 혼합한다. EDCA 50 mg 을 첨가하여 실온에서 반응을 3시간동안 진행시킨다. 반응은 활성화기를 차단하기 위한 1 mM 의 글리신이 포함된 SP7.4에 대해 18 시간동안 4℃에서 투석하였다. 그리고 나서 SP7.4에 대해서만 24시간동안 4℃에서 투석하였다. 최종산물은 PGA-BSA 접합체라고 불린다. PCMV와 대조군 표본을 합성하고 투석한 뒤, DNI 단백질의 분자 상태를 시험하여 다양한 양의 PGA의 존재 혹은 부존재하에서 글루타르알데히드가 분자 단계에서 정말로 단백질과 크로스링크 되었는지 확인하였다. PCMV와 대조군표본은 SDS (sodium dodecyl sulphate) 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동(PAGE)과 항-PA 항혈청을 이용한 웨스턴 블로팅에 의해 모니터링한다. 도 2에서 보듯이 DNI 단백질은 글루타르알데히드의 크로스링크 이전에 84kDa에서 이동한다. PCVMl-PCMV3(레인1-3)은 220kDa 이상의 분자량에서 밴드가 이동함으로써 DNI 단백질이 광범위한 크로스링크를 함을 보여준다. PGA가 없이 홀로 크로스링크되는 DNI 단백질도 높은 분자량을 나타낸 다(레인 5). 반대로, PGA와 혼합하였으나 글루타르알데히드를 처리하지 않은 DNI는 DNI 또는 더 낮은 분자 량의 물질과 함께 이동한다. Vedan(Taiwan)에서 구입한 PGA 표본은 DNI에 대한 활성을 가지는 프로테아제에 의해 오염된 것으로 보인다. 그러나 6번 레인의 Vedan PGA의 샘플은 항-PA 항혈청과 반응하는 오염단백질의 함유량이 낮아 관찰된 밴드는 다양한 반응을 통해 DNI로부터 유래된 생성물임을 보여준다. 뿐만 아니라, 콜레라균(Vibrio cholerae)의 편모(FLA)가 PCMV에 포함되는 DNI보다 나은 수송단백질인지 여부를 알아보기 위해 PGA 와 하나 이상의 폐구균(pneumococcal) 다당류를 항원으로 사용하였다. 수송단백질의 효과 는 PGA에 작용하는 Ig G 의 양과 다양한 PCMV 및 이들의 단백질에 의한 면역과정을 톨해 얻어지는 다당류의 양 에 의해 측정한다. PCMV는 아미노기를 이중작용기성 크로스링커를 사용하지 않고 카르복시기에 직접 크로스링크시켜 만들 수 있다. 특히 PCMV는 카보디이마드를 이용하여 아미노기와 수송단백질의 카르복시기를 크로스링크시킴으로써 만 들 수 있다. 이 화학구조는 라이신 측쇄의 1차 아미노기와 아스파르테이트 및 글루타민산 측쇄의 카르복시기 간의 펩타이드 결합을 형성한다. 아미노기는 톡소이드로 처리된 포르말린에 대부분 차단되지만 포르말린은 카 르복시기와 전혀 반응하지 않는다. 따라서, 카보디이미드는 글루타르알데히드에 저항할 수 있는 포르말린 톡 소이드를 이용한 PCMV 함성에 유용할 수 있다. 크로스링킹은 SDS-PAGE에 의해 쉽게 탐지된다. 글루타르알데 히드와 같은 크로스링커의 첨가에 따른 고분자량의 단백질“얼룩”의 존재는 크로스 링크가 일어났음을 알려준 다. 표 2 SDS-PAGE에 의해 탐지된 수송단백질의 크로스링크 글루타르알데히드 부존재 존재 존재 존재 존재 캡슐 중합체 -PGA -PGA +PGA +PS6B +PS23F BSA - + + + + 디프테리아 톡신 - + + n.d. n.d 디프테리아 톡소이드 - - - n.d. n.d 테타누스 톡소이드 - + + n.d. n.d +표시는 SDS-PAGE에서 크로스 링크가 탐지되었음을 나타내고, -표시는 글루타르알데히드가 없는 대조군에서 단 백질 이동의 변동이 없음을 나타낸다. n.d.는 분석이 행해지지 않아 알 수 없음을 나타낸다. 표 2에 나타난 실험을 위해 200 마이크로리터의 반응을 pH 7.5의 50 mM HEPES(4-(2- hydroxyethyl)-1- piperazineethane sulfonic acid)에서 수행하고 2시간동안 분위기온도(Ambient Temperature)에서 배양하였다. 반응은 120M의 보로수소화나타륨에 의해 종료되었다. 글루타르알데히드는 64 mM 를 첨가하였고, BSA( bovine serum albumin) 15mg/ml를 사용하였으며, 디프테리아 톡신,디프테리아 톡소이드 및 테타누스 톡소이드가 약 5 mg/ml 로 사용되었다. PGA는 13.4 mg/ml, 폐 다당류(pneumo PS) 6B 및 23F가 4 mg/ml 첨가되었다. 표 2에서 보는 바와 같이, 포르말린이 처리된 몇몇 단백질(예;디프테리아 톡소이드)은 글루타르알데히드와 잘 크로스링크되지 않으며, 따라서 PCMV 합성을 위해서 다른 크로스링크 화학구조가 필요하다. 테타누스 톡소이 드와 같은 다른 단백질들은 글루타르알데히드와 크로스링크되기는 하나 디프테리아 톡신이나 BSA같은 비변형 단 백질만큼 광범위하게 크로스링크되지는 않는다. - 30 - 공개특허 10-2009-0066272
실시예 2 : 면역화와 항-DNI 및 항-PGA 면역반응의 분석 표 1에 게재된 5개 반응의 가용성 생성물을 흡광도 280 nm 의 동일한 단백질 농도로 조절하였다. 생후 약 5-7 주 된 BALB/c 마우스(Charles River)를 그림 2에 나타낸 면역화 연구에 사용하였다. 마우스들을 실험 첫날 PCMV 백신1-3 과 DNI 단백질 20 μg의 항원 표본 대조군 4 및 5 를 복강주사 함으로써 면역 접종시켰다. 모든 마우스들은 7일째에 출혈을 보였고 10일째에 같은 양의 항원표본을 투여하자 면역반응이 부스팅되었다. 마우 스들은 30일째에 다시 출혈을 하며 사망했다. 혈액 표본의 혈청은 응고가 일어난 후 수집한 후 -20℃에서 저장하였다. ELlSA(Enzyme-linked immunosorbent assay) 분석을 통해 항-PGA 및 항-DNI 혈청 항체의 양을 측정하였다. 요약하자면, Immulon 2HB ELISA (VWR) 마이크로티터 디쉬를 pH 9.6, 0.5 μg/well, 100 μl/well의 탄산나트륨 완충액에서 BSA-PGA 또는 DNI 로 코 팅하였다. 밤새 4℃에서 배양한 후, 항원으로 코팅된 플레이트는TBST(TBS-0.1% Tween)에 첨가된 3% BSA (w/v)와 함께 1시간동안 실온 또는 하룻밤동안 4℃에서 배양함으로써 차단하였다. 면역 촉진 이후의 각각의 시점에서의 4마리 마우스로부터 추출한 혈청표본은 TBST로 순차적으로 희석한 후, 항원으로 코팅한 플레이트에 첨가한 후 최소 1시간동안 배양하였다. 항-DNI 및 항-PGA 항체 반응은 알칼린 포스페이타제(Zymed)와 접합된 마우스 Ig G 또는 Ig M에 대한 레빗 항-혈청을 이용하여 측정하였다. p-니트로페닐 포스페이트(PNPP)기질을 각각의 웰에 첨가하고 각각의 반응에 대하여 405 nm에서의 흡광도를 결정하였다. 데이터는 상호 최종 타이터 (reciprocal endpoint titer)로 기재되어 있고, 이는 음성대조군의 흡광도보다 높은 두 개의 표준편차인 OD405 리딩을 얻기 위한 최대 희석치로 정의된다. 세 개의 PCMV 표본 1-3과 두 개의 항원 대조군 표본 4 및 5(그림 3-5)로 면역 접종한 마우스의 Ig M과 Ig G 특 이 항-DNI 및 항-PGA 면역반응을 측정하기 위해 ELISA 분석을 실시하였다. 그림 3에서 보듯이 DNI 단백질은 글루타르알데히드와 크로스링크되지 않은 대조군 표본 4를 제외하고 모든 표본에서 매우 면역반응을 잘 일으킨 다. 그러나, 이런 DNI 특이 면역반응은 전적으로 Ig G에 기초한다. 어떤 항-DNI Ig M 도 면역접종 후 7일째 까지 검출하지 못했으나, PCMV 표본들 또는 DNI로만 크로스링크 된 표본(5번 표본)으로 면역접종한 마우스에서 중요한 항-DNI Ig G 의 반응은 17일째에 검출하였다. 항-PGA Ig M 의 반응은 캡슐중합체의 전형적인 패턴을 보인다(그림 4). 대조군 표본 4는 7일째에 탐지 가능한 항-PGA Ig M 반응을 보이지만, 이 반응은 17일 또는 30일째에 상승되지 않는다. 모든 PCMV 표본은 7일째에 항 -PGA Ig M 반응을 유도하였고, 더 강한 항-PGA Ig M 반응을 17일째 및 30일째에 생성하였다. 예상했듯이, 대 조군 표본 5(DNI와만 크로스 링크된)는 Ig M 또는 Ig G 에 기초한 항-PGA 반응을 생성하지 않았다. 반대로, PCMV 1-3(표본 1-3)은 17일째에 명확히 나타나고, 30일째에 확연히 부스팅하는 강한 Ig G 에 의한 항-PGA 반응 을 생성하였다(그림 5). PCMV 1-3에 의한 Ig G 의 항-PGA 반응은 Aulinger 등이 보고한 종래의 PGA-DNI 접합 백신에서 관찰된 PGA에 대한 반응(Infect. Immun. 73:3408-3414(2005)) 및 Rhie 등이 보고한 폴리아미노산 (PA)-PGA에 대한 반응(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:10925-10930(2003))과 유사하다. 따라서 PCMV백신 #1, #2 및 #3은 알려진 탄저균의 T-의존성 방어항원인 캡슐 PGA에 대한 면역그로불린 G의 반응을 유도함으로써 모두 종래의 PGA 접합백신과 동일한 작용을 한다(Wang et al. Infect. Immun. 72:5460-5463(2004)). PGA와 혼합된 DNI(크로스링크되지 않는)를 함유한 대조군 표본 5는 PGA에 대해 탐지 가능한 Ig G 반응을 유발시키지 않아 PCMV 표본 1-3에서 DNI가 Ig G 의 항-PGA 반응을 촉진시키는데 있어 TLR 리간드로 작용하지 않음을 보여준 다. 이 결과로 또한 PGA는 낮은 면역원성을 가지는 T-세포 비의존성 면역원이라는 사실을 확인하였다. 그렇 지 않으면 단백질과 공유결합을 통해 결합하였을 것이기 때문이다(Rhie et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:10925-10930 (2003)). PCMV 방법은 상기 방법이 결과적으로 DNI 단백질을 PGA 분자와 직접적으로 크로스 링크시키지 않음에도 불구하고 명확히 PGA를 T-세포 의존성 면역원으로 변환시킨다. 이러한 데이터는 PCMV 방법이 종래의 접합백신과 유사한 특성의 면역원을 생산할 수 있음을 보여준다. PGA PCMV는 여기서 서술한 방법을 이용하여 쉽게 만들 수 있고, 전형적인 PGA-단백질 접합백신에 의한 면역반응을 유도한다는 것을 발견하였다. 표 1에 개시된 작은 스케일의 반응들은 도 3에 요약된 도식에 따라 1000마리의 마우스를 면역접종하기에 충분한 양의 PCMV를 만든다. 본 데이터는 PGA와 DNI로부터 만들어진 PCMV가 탄저균 에 의해 유발된 탄저병을 예방하는 백신으로 쓰일 수 있음을 뒷받침한다. 실시예 3 : 추가적 PCMVs의 생성 및 특성 PCMV 기술은 다양한 구조와 이온 극성의 캡슐 항원에 적용될 수 있다. 23 개 타입의 폐렴연쇄상구균 (Streptococcus pneumonia) 다당류는 ATCC(American Type Culture Collection)에서 구입하였고, Merck, Inc.에 - 31 - 공개특허 10-2009-0066272
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: 물에서 30 mg/ml BSA 5 ml 를 NP7.5에서 134 mg/ml PGA 1 ml 와 혼합한다. EDCA 50 mg 을 첨가하여 실온에서<br />
반응을 3시간동안 진행시킨다. 반응은 활성화기를 차단하기 위한 1 mM 의 글리신이 포함된 SP7.4에 대해 18<br />
시간동안 4℃에서 투석하였다. 그리고 나서 SP7.4에 대해서만 24시간동안 4℃에서 투석하였다. 최종산물은<br />
PGA-BSA 접합체라고 불린다.<br />
PCMV와 대조군 표본을 합성하고 투석한 뒤, DNI 단백질의 분자 상태를 시험하여 다양한 양의 PGA의 존재 혹은<br />
부존재하에서 글루타르알데히드가 분자 단계에서 정말로 단백질과 크로스링크 되었는지 확인하였다. PCMV와<br />
대조군표본은 SDS (sodium dodecyl sulphate) 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동(PAGE)과 항-PA 항혈청을 이용한<br />
웨스턴 블로팅에 의해 모니터링한다. 도 2에서 보듯이 DNI 단백질은 글루타르알데히드의 크로스링크 이전에<br />
84kDa에서 이동한다. PCVMl-PCMV3(레인1-3)은 220kDa 이상의 분자량에서 밴드가 이동함으로써 DNI 단백질이<br />
광범위한 크로스링크를 함을 보여준다. PGA가 없이 홀로 크로스링크되는 DNI 단백질도 높은 분자량을 나타낸<br />
다(레인 5). 반대로, PGA와 혼합하였으나 글루타르알데히드를 처리하지 않은 DNI는 DNI 또는 더 낮은 분자<br />
량의 물질과 함께 이동한다. Vedan(Taiwan)에서 구입한 PGA 표본은 DNI에 대한 활성을 가지는 프로테아제에<br />
의해 오염된 것으로 보인다. 그러나 6번 레인의 Vedan PGA의 샘플은 항-PA 항혈청과 반응하는 오염단백질의<br />
함유량이 낮아 관찰된 밴드는 다양한 반응을 통해 DNI로부터 유래된 생성물임을 보여준다.<br />
뿐만 아니라, 콜레라균(Vibrio cholerae)의 편모(FLA)가 PCMV에 포함되는 DNI보다 나은 수송단백질인지 여부를<br />
알아보기 위해 PGA 와 하나 이상의 폐구균(pneumococcal) 다당류를 항원으로 사용하였다. 수송단백질의 효과<br />
는 PGA에 작용하는 Ig G 의 양과 다양한 PCMV 및 이들의 단백질에 의한 면역과정을 톨해 얻어지는 다당류의 양<br />
에 의해 측정한다.<br />
PCMV는 아미노기를 이중작용기성 크로스링커를 사용하지 않고 카르복시기에 직접 크로스링크시켜 만들 수<br />
있다. 특히 PCMV는 카보디이마드를 이용하여 아미노기와 수송단백질의 카르복시기를 크로스링크시킴으로써 만<br />
들 수 있다. 이 화학구조는 라이신 측쇄의 1차 아미노기와 아스파르테이트 및 글루타민산 측쇄의 카르복시기<br />
간의 펩타이드 결합을 형성한다. 아미노기는 톡소이드로 처리된 포르말린에 대부분 차단되지만 포르말린은 카<br />
르복시기와 전혀 반응하지 않는다. 따라서, 카보디이미드는 글루타르알데히드에 저항할 수 있는 포르말린 톡<br />
소이드를 이용한 PCMV 함성에 유용할 수 있다. 크로스링킹은 SDS-PAGE에 의해 쉽게 탐지된다. 글루타르알데<br />
히드와 같은 크로스링커의 첨가에 따른 고분자량의 단백질“얼룩”의 존재는 크로스 링크가 일어났음을 알려준<br />
다.<br />
표 2<br />
SDS-PAGE에 의해 탐지된 수송단백질의 크로스링크<br />
글루타르알데히드 부존재 존재 존재 존재 존재<br />
캡슐 중합체 -PGA -PGA +PGA +PS6B +PS23F<br />
BSA - + + + +<br />
디프테리아 톡신 - + + n.d. n.d<br />
디프테리아 톡소이드 - - - n.d. n.d<br />
테타누스 톡소이드 - + + n.d. n.d<br />
+표시는 SDS-PAGE에서 크로스 링크가 탐지되었음을 나타내고, -표시는 글루타르알데히드가 없는 대조군에서 단<br />
백질 이동의 변동이 없음을 나타낸다. n.d.는 분석이 행해지지 않아 알 수 없음을 나타낸다.<br />
표 2에 나타난 실험을 위해 200 마이크로리터의 반응을 pH 7.5의 50 mM HEPES(4-(2- hydroxyethyl)-1-<br />
piperazineethane sulfonic acid)에서 수행하고 2시간동안 분위기온도(Ambient Temperature)에서 배양하였다.<br />
반응은 <strong>12</strong>0M의 보로수소화나타륨에 의해 종료되었다. 글루타르알데히드는 64 mM 를 첨가하였고, BSA( bovine<br />
serum albumin) 15mg/ml를 사용하였으며, 디프테리아 톡신,디프테리아 톡소이드 및 테타누스 톡소이드가 약 5<br />
mg/ml 로 사용되었다. PGA는 13.4 mg/ml, 폐 다당류(pneumo PS) 6B 및 23F가 4 mg/ml 첨가되었다.<br />
표 2에서 보는 바와 같이, 포르말린이 처리된 몇몇 단백질(예;디프테리아 톡소이드)은 글루타르알데히드와 잘<br />
크로스링크되지 않으며, 따라서 PCMV 합성을 위해서 다른 크로스링크 화학구조가 필요하다. 테타누스 톡소이<br />
드와 같은 다른 단백질들은 글루타르알데히드와 크로스링크되기는 하나 디프테리아 톡신이나 BSA같은 비변형 단<br />
백질만큼 광범위하게 크로스링크되지는 않는다.<br />
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