(19) 대한민국특허청(KR) (12) 공개특허공보(A) - Questel
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화학식 4 Z 5 는O, S, 또는 NR16(R16은 수소 또는 알킬기이다; R15는 수소, 알킬 또는 헤테로알킬로부터 선택되었다; Y 3 는 카 보닐, 사이오카보닐, 설포닐, 포스포릴 또는 (A)의 산소와 공유결합 하는 유사한 산-생산기이다; w 는 0 또는 1 이다; R14는 탄소수 1-10의 선형 또는 분쇄형 알킬, 탄소수 1-10의 선형 또는 분쇄형 헤테로알킬, 탄소수 2-10의 선형 또는 분쇄형 알켄, 탄소수 2-10의 선형 또는 분쇄형 알킨, 탄소수 5-10의 방향족 잔기, 탄소수 3-10의 고 리계, -(CH2CH2O)nCH2CH2 (n은 1-4) 또는 -(Y 3 )-(Z 5 )w-를 에 연결시키는 화학결합이다; X4는 하이드 라진기를 가지면서 X4가 케톤 또는 알데히드의 산소원자인 링커 2의 전구체 (B)의 축합반응에 의해 만들어진 하 이드라존이다. 수송단백질 일반적으로, 본 발명에서는 생리학적으로 항원에 의해 포획될 수 있는 수송단백질이 사용될 수 있다.바람직하게 는, 항원은 수송단백질과의 중요한 공유결합 없이 복합체 내에서 수송단백질에 포획된다.중요한 공유결합이 없 다 함은 50 % 가 넘지 않는 항원이 수송단백질에 공유적으로 결합한 것을 말한다.바람직한 구현예에 의하면, 40%, 30%, 10%, 또는 5%가 넘지 않는 항원이 수송단백질에 공유적으로 결합한다.항원/수송단백질 복합체는 알룸 (alum) 같은 다른 화합물을 포함할 수 있으며, 이러한 다른 화합물은, 바람직하게는 항원과 수송단백질을 포획 할 수 있다. 본 발명의 백신에서 사용된 수송단백질은 바람직하게는 홀로이거나 항원과 결합된 형태로서 대상체에서의 면역 반응을 유발한다.바람직하게는, 수송단백질은 T-세포에 의해 인식되는 적어도 한개의 에피토프를 가진다. 바람직하게는, 에피토프는 대상체에서 T-세포 반응을 유도할 수 있고, B-세포를 자극하여 중요한 전체 항원에 대한 항체생산을 유도할 수 있다.본 발명에서 언급된 에피토프는 특정 항체분자나 그 절편에 대한 특이적 반응 의 원인이 되는 항원에 대한 어떠한 결정자도 포함한다.에피토프 결정자는 대개 화학적 활성을 가지는 아미노산, 당 측쇄 등의 표면 분자의 집합으로 구성되며, 특이적 전하 특성 뿐 아니라 특이적 3차원 구조를 가 진다.면역원성 특성을 가지기 위해서는 단백질이나 다당류는 T-세포를 자극할 수 있어야 한다.그러나 T-세포에 의해 인식되는 에피토프를 가지지 않는 수송단백질도 역시 면역원성이 있다. 강력한 면역반응을 유발하는 것으로 알려진 수송단백질을 선택함으로써, 다양한 집단의 대상체가 여기서 언급한 PCMV에 의해 치료될 수 있다.수송단백질은 바람직하게는 백신에 대한 강력한 면역반응을 유발할 수 있도록 충분 히 외래적인 물질이다.전형적으로, 사용되는 수송단백질은 중요한 항원에 대한 면역원성을 부여할 수 있는 분자 이다.바람직한 구현예에 따르면, 수송단백질은 본래 높은 면역원성을 가지는 단백질이다.따라서 높은 면역원성 을 가지고 항원에 대한 항체생산을 최대화 할 수 있는 수송단백질이 바람직하다. 본 발명에서의 다양한 수송단백질에는, 예를 들어 톡신과 (화학적 또는 유전적)톡소이드가 있으며, 이들은 변이 체일 수도 그렇지 않을 수도 있는 바, 여기에는안트락스 톡신, PA 및 DNI (PharmAthene, Inc.), 디프테리아 톡 소이드 (Massachusetts State Biological Labs; Serum Institute of India, Ltd.) 또는 CRM 197, 테타누스 톡 신, 테타누스 톡소이드(Massachusetts State Biological Labs; Serum Institute of India, Ltd.),테타누스 톡 신 절편 Z, 녹농균 엑소톡신 A 또는 그 변이체, 박테리아 편모, 뉴몰리신, 나이세리아수막염균의 외막단백질 (American Type Culture Collection, Manassas, VA)), 녹농균 Hcpl 단백질, 대장균의 이열성 엔테로톡신, 쉬가 -유사 톡신, 인간 LTB 단백질, 총 박테리아 세포 추출 단백질 및 그 밖에 링커에 의해 크로스 링크될 수 있는 모든 단백질이 포함된다.바람직스럽게는, 수송단백질은 콜레라 톡신 B 서브유닛(SBL 백신B에서 얻을 수 있다), 디프테리아 톡신, 테타누스 톡신 절편 C(Sigma Aldrich로부터 구입할 수 있다), DNI 및 대장균의 베타-갈락토시 다아제(Sigma Aldrich로부터 구입할 수 있다)이다.다른 바람직한 수송단백질은 BSA(bovine serum albumin), P40 및 치킨 리보플라빈(다른 기재가 없는 수송단백질은 Sigma Aldrich에서 구입항 수 있다)이다.다른 예시적인 수송단백질로 분쇄형 펩타이드인 MAP(multi-antigenic peptide)가 있다.MAP를 사용함으로써, 다중 분쇄 아미노 산 잔기에 의해 크로스링크 밀도는 최대화되었다.MAP를 형성하는 아미노산의 예시로서 라이신이 있으나 이에 한 정되지 않는다. BSA와 KLH(keyhole limpet hemocyanin)는 모두 동물을 이용한 백신의 개발과정에서 수송체로 쓰였다.치료용 백 신의 합성에 이용되는 수송단백질에는 수많은 병원성 박테리아의 톡신과 그들의 톡소이드가 포함되나 이에 한정 - 26 - 공개특허 10-2009-0066272
되지 않는다.그 예로는 티프테리아와 테타누스 톡신과 이들의 의학적으로 허용되는 톡소이드가 포함된다.다른 가능한 수송단백질에는 CRM(cross-reacting material)이라 불리는 박테리아 톡신과 유사한 항원성을 가지는 단 백질이 있다.본 발명의 수송단백질은 인간에게서 유래하지 않고 인간의 음식에 존재하지 않는 모든 단백질도 포 함된다. 본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 고리-유사 구조를 형성하는 단백질은 PCMV를 만드는데 사용된다.이러한 단백질에는 녹농균의 Hcp 단백질, 콜레라 톡신 B 서브유닛, 대장균의 이열성 엔테로톡신 및 쉬가-유사 톡신이 있다.이러한 고리-유사 구조는 선형 다당류 사슬이 링 모양의 단백질 복합체를 관통하는 염주(beads on a string)형태를 형성할 수 있다.단백질이 크로스링크된 후에, 이러한 복합체는 매우 안정할 것으로 예측되었다. 단백질의 구조적 데이터는 이러한 중앙 채널이 다당류 사슬이 쉽게 들어갈 수 있을 만큼 넓음을 보여준다.에를 들어, Hcp1 헥사고리의 중앙 채널은 42 옹스트롬으로 5.5 옹스트롬의 다당류 사슬 몇개를 수용하기에 충분한 너 비이다(Mougous et al., Science 312(5779) 1526- 1530, (2006)).다른 한편, 단백질 고리는 다당류 주위를 둘 러쌀 수도 있다(예를 들어, 특정 물리적 화학적 환경 하에서 자연적으로 링에 합쳐지는 모노머 수송단백질의 서 브유닛으로부터).이러한 링 안에 합쳐져 들어갈 수 있는 모노머 단백질은 당업계에 공지되어 있으며, 뉴몰리신 (Walker et al. Infect.. Immun. 55(5): 1184-1189 (1987); Kanclerski and Mollby, J. Clin. Microbiol. 25(2):222-225 (1987)), 리스테리올리신 O(Kayal and Charbit. FEMS Microbiol. Rev. 30:514- 529 (2006); Mengaud et al. Infect. Immun. 55(12):3225-3227 (1987)), DNI, 안트락스 PA, Hcp1, 콜레라 톡신 B 서브유닛, 쉬가 톡신 B 서브유닛, 편모 및 당업계에 알려진 많은 관련 단백질을 포함한다. 또 다른 바람직한 구현예에 의하면, TLR(Toll-like receptor) 아고니스트가 수송단백질로 사용될 수 있다.TLR의 활성화는 적합한 면역반응을 형성하는데 있어 중요하며, 친화력의 성숙, 아이소타입 스위치, 면역학적 기억에 있어 핵심적 역할을 한다.콜레라균(Vibrio cholerae)의 편모(FLA)는 TLR 아고니스트이다.20 mg 이상의 FLA 단백 질이 재조합 대장균으로부터 추출되었으며, 이는 IL-6 대식세포의 유도 분석에서 강력한 TLR 활성인자임이 밝혀 졌다.뿐만 아니라, 잘 보존된 폐렴연쇄상구균의 단백질인 뉴몰리신 또한 TLR4를 활성화시키는 것으로 밝혀졌으 며, 또한 방어항원이기도 하다.따라서, 이 단백질은 PCMV 수송단백질로 이용될 수 있다. 더 나아가, 나이세리아 수막염균 등의 외막단백질(OMP)은 HIB 접합백신(Merck)의 수송단백질로 이용되며, 폐렴 연쇄상구균의 총 박테리아 세포에서 추출한 단백질은 동물 감염 모델에서 적어도 부분적인 보호역할을 함아 밝 혀졌다.본 발명의 바람직한 구현예에 있어서, 이러한 단백질 혼합물은 PCMV 수송단백질의 원천임이 밝혀졌다. 바람직한 구현예에 따르면, PCMV 방법은적어도 2개의 라이신 잔기 또는 블록되지 않고 화학적 변형에 의해 크로 스링크 할 수 있는 다른 잔기를 가지는 수송단백질이 사용된다. 또 다른 바람직한 구현예에 따르면, 수송단백 질은 멀티머(예를 들어 적어도 5개의 서브유닛을 포함하는)이다. 바람직하게는, 멀티머는 호모멀티머이다. 또 다른 구현예에 의하면, DNI는 사용전 해독이 필요없는 비독성 물질이므로 수송단백질로 사용된다. 나아가, DNI가 중요한 항원에 대한 면역반응 뿐 아니라탄저균에 대한 방어면역 반응도 유도하기 때문에 DNI의 사용은 바람직하다. 또한 DNI는 내부에 설파이드 결합이 없다. 이러한 결합은 단백질을 변성시켜 에피토프를 파괴 할 수도 있는 보로화수소 환원에 민감하다 목적의 항원 본 발명의 백신 조성물과 그 제조 및 투여 방법은 어떠한 중요 항원, 예를 들어 다당류, 폴리 알콜 또는 폴리 아미노산에 대해서도 사용될 수 있다. 바람직하게는, 중요 항원은 백신의 제조 과정에서 일어나는 화학반응에 의해 파괴되는 1차 그룹을 가지지 않는다. 예를 들어 보로화수소의 환원을 통해 항원의 다이설파이드 결합을 파괴함으로써 항원을 변성시키는 경우가 그것이다. 예시적인 중요 항원으로 다당류같은 유기중합체(예를 들어 적어도 18개의 잔기를 가지는 다당류), 인다당류(phosphopolysaccharide), N-아세틸 치환된 아미노 당을 가진 다당류, 설펀화 슈가(sulfanylated sugar)를 가진 다당류, 그밖의 황산-변성(sulfate-modified)슈가, 인산-변 성(phosphate-modified)슈가, 폴리 알콜, 폴리 아미노산, 테이콘산, 및 지질다당류의 O 측쇄이다. 예시적인 중요 항원은 캡슐 유기 중합체를 포함하며, 여기엔 박테리아, 곰팡이, 기생충 및 바이러스 등의 미생물이 합성 하는 것과 일반적인 방법으로 생물학적 원천에서 채취한 것이 있다. 예시적인 중요 항원은 미생물 캡슐 유기 중합체를 포함하며, 여기에는 탄저균과 같은 바실러스 종(Wang and Lucas. Infect. Immun. 72(9): 5460-5463 (2004)), 폐렴연쇄상구균(Bentley et al. PLoS Genet. 2(3):e31, Epub (2006); Kolkman et al. J. Biochemistry 123:937-945 (1998); and Kong et al. J. Med. Micorbiol. 54:351-356 (2005)), 쉬겔라(Zhao et - 27 - 공개특허 10-2009-0066272
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화학식 4<br />
Z 5<br />
는O, S, 또는 NR16(R16은 수소 또는 알킬기이다; R15는 수소, 알킬 또는 헤테로알킬로부터 선택되었다; Y 3<br />
는 카<br />
보닐, 사이오카보닐, 설포닐, 포스포릴 또는 (A)의 산소와 공유결합 하는 유사한 산-생산기이다; w 는 0 또는 1<br />
이다; R14는 탄소수 1-10의 선형 또는 분쇄형 알킬, 탄소수 1-10의 선형 또는 분쇄형 헤테로알킬, 탄소수 2-10의<br />
선형 또는 분쇄형 알켄, 탄소수 2-10의 선형 또는 분쇄형 알킨, 탄소수 5-10의 방향족 잔기, 탄소수 3-10의 고<br />
리계, -(CH2CH2O)nCH2CH2 (n은 1-4) 또는 -(Y 3<br />
)-(Z 5<br />
)w-를 에 연결시키는 화학결합이다; X4는 하이드<br />
라진기를 가지면서 X4가 케톤 또는 알데히드의 산소원자인 링커 2의 전구체 (B)의 축합반응에 의해 만들어진 하<br />
이드라존이다.<br />
수송단백질<br />
일반적으로, 본 발명에서는 생리학적으로 항원에 의해 포획될 수 있는 수송단백질이 사용될 수 있다.바람직하게<br />
는, 항원은 수송단백질과의 중요한 공유결합 없이 복합체 내에서 수송단백질에 포획된다.중요한 공유결합이 없<br />
다 함은 50 % 가 넘지 않는 항원이 수송단백질에 공유적으로 결합한 것을 말한다.바람직한 구현예에 의하면,<br />
40%, 30%, 10%, 또는 5%가 넘지 않는 항원이 수송단백질에 공유적으로 결합한다.항원/수송단백질 복합체는 알룸<br />
(alum) 같은 다른 화합물을 포함할 수 있으며, 이러한 다른 화합물은, 바람직하게는 항원과 수송단백질을 포획<br />
할 수 있다.<br />
본 발명의 백신에서 사용된 수송단백질은 바람직하게는 홀로이거나 항원과 결합된 형태로서 대상체에서의 면역<br />
반응을 유발한다.바람직하게는, 수송단백질은 T-세포에 의해 인식되는 적어도 한개의 에피토프를 가진다.<br />
바람직하게는, 에피토프는 대상체에서 T-세포 반응을 유도할 수 있고, B-세포를 자극하여 중요한 전체 항원에<br />
대한 항체생산을 유도할 수 있다.본 발명에서 언급된 에피토프는 특정 항체분자나 그 절편에 대한 특이적 반응<br />
의 원인이 되는 항원에 대한 어떠한 결정자도 포함한다.에피토프 결정자는 대개 화학적 활성을 가지는<br />
아미노산, 당 측쇄 등의 표면 분자의 집합으로 구성되며, 특이적 전하 특성 뿐 아니라 특이적 3차원 구조를 가<br />
진다.면역원성 특성을 가지기 위해서는 단백질이나 다당류는 T-세포를 자극할 수 있어야 한다.그러나 T-세포에<br />
의해 인식되는 에피토프를 가지지 않는 수송단백질도 역시 면역원성이 있다.<br />
강력한 면역반응을 유발하는 것으로 알려진 수송단백질을 선택함으로써, 다양한 집단의 대상체가 여기서 언급한<br />
PCMV에 의해 치료될 수 있다.수송단백질은 바람직하게는 백신에 대한 강력한 면역반응을 유발할 수 있도록 충분<br />
히 외래적인 물질이다.전형적으로, 사용되는 수송단백질은 중요한 항원에 대한 면역원성을 부여할 수 있는 분자<br />
이다.바람직한 구현예에 따르면, 수송단백질은 본래 높은 면역원성을 가지는 단백질이다.따라서 높은 면역원성<br />
을 가지고 항원에 대한 항체생산을 최대화 할 수 있는 수송단백질이 바람직하다.<br />
본 발명에서의 다양한 수송단백질에는, 예를 들어 톡신과 (화학적 또는 유전적)톡소이드가 있으며, 이들은 변이<br />
체일 수도 그렇지 않을 수도 있는 바, 여기에는안트락스 톡신, PA 및 DNI (PharmAthene, Inc.), 디프테리아 톡<br />
소이드 (Massachusetts State Biological Labs; Serum Institute of India, Ltd.) 또는 CRM <strong>19</strong>7, 테타누스 톡<br />
신, 테타누스 톡소이드(Massachusetts State Biological Labs; Serum Institute of India, Ltd.),테타누스 톡<br />
신 절편 Z, 녹농균 엑소톡신 A 또는 그 변이체, 박테리아 편모, 뉴몰리신, 나이세리아수막염균의 외막단백질<br />
(American Type Culture Collection, Manassas, VA)), 녹농균 Hcpl 단백질, 대장균의 이열성 엔테로톡신, 쉬가<br />
-유사 톡신, 인간 LTB 단백질, 총 박테리아 세포 추출 단백질 및 그 밖에 링커에 의해 크로스 링크될 수 있는<br />
모든 단백질이 포함된다.바람직스럽게는, 수송단백질은 콜레라 톡신 B 서브유닛(SBL 백신B에서 얻을 수 있다),<br />
디프테리아 톡신, 테타누스 톡신 절편 C(Sigma Aldrich로부터 구입할 수 있다), DNI 및 대장균의 베타-갈락토시<br />
다아제(Sigma Aldrich로부터 구입할 수 있다)이다.다른 바람직한 수송단백질은 BSA(bovine serum albumin),<br />
P40 및 치킨 리보플라빈(다른 기재가 없는 수송단백질은 Sigma Aldrich에서 구입항 수 있다)이다.다른 예시적인<br />
수송단백질로 분쇄형 펩타이드인 MAP(multi-antigenic peptide)가 있다.MAP를 사용함으로써, 다중 분쇄 아미노<br />
산 잔기에 의해 크로스링크 밀도는 최대화되었다.MAP를 형성하는 아미노산의 예시로서 라이신이 있으나 이에 한<br />
정되지 않는다.<br />
BSA와 KLH(keyhole limpet hemocyanin)는 모두 동물을 이용한 백신의 개발과정에서 수송체로 쓰였다.치료용 백<br />
신의 합성에 이용되는 수송단백질에는 수많은 병원성 박테리아의 톡신과 그들의 톡소이드가 포함되나 이에 한정<br />
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