(19) 대한민국특허청(KR) (12) 공개특허공보(A) - Questel
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여기서 서술한 백신의 제조방법은 접합백신 기술보다 간단한데, 이는 상기 방법의 화학적 특성이 수송단백질(예 를 들어 DNI, 콜레라 톡신B 서브유닛, 디프테리아 톡신, 테타누스 톡신 C절편 또는 대장균 베타-갈락토시다제) 의 크로스링크 화학구조에만 좌우되기 때문이다. 예를 들어, 캡슐 중합체가 DNI와 혼합된 경우 크로스링크 비 율에 영향을 미치지만, 크로스링크의 패턴 및 범위는 사용되는 단백질, 그 농도 및 글루타르알데히드 등의 크로 스링크 시약의 농도에 더 영향을 받을 뿐 캡슐 중합체의 영향을 받지 않는다. 이러한 변수는 쉽게 조정되므로, 백신을 만드는 시간, 노력 및 비용이 절감될 수 있다. 여기서 서술한 PCMV 백신의 제조방법은 어떠한 캡슐 중합체, 아미노기가 포함된 중합체등의 어떤 항원에도 적용 될 수 있으며. 보로화 수소의 환원에 의해 파괴될 수 있는 중요한 에피토프를 가지지 않는 수송단백질 등의 어 떤 수송단백질에도 적용될 수 있다. 본 방법에서 사용되는 수송단백질은 바람직하게는 적어도 2개의 라이신 잔기 또는 블록되지 않고 화학적 변형에 의하여 크로스링크를 할 수 있는 다른 잔기를 가진다. 테타누스 톡소 이드는 가능한 수송단백질의 하나이다. 이 독소는 단백질의 아미노기와 반응하는 포름알데히드에 의해 해독된 다. 다른 바람직한 수송단백질에는 코레라 톡신 B 서브유닛(SBL Vaccin AB에서 구입가능), 디프테리아 톡신, 테타누스 톡신 C절편 (Sigma Aldrich에서 구입가능), DNI 또는 대장균의 베타-갈락토시다제(Sigma Aldrich에서 구입 가능)이 있다. 현재 다가(multivalent) 접합백신은 각각의 접합백신을 만든 후, 이들을 혼합하여 "칵테일(cocktail)" 접합백신 을 형성함으로써 제조된다(예를 들어 Wyeth 7가 폐렴구균 백신, Prevnar). 본 발명에서의 백신 제조방법은 수 송단백질과 크로스링크되기 전에 화학적으로 다른 백신들(예를 들어 캡슐 유기 중합체)을 혼합함으로써 또는 개 별적으로 합성된 본 발명의 특이적 백신을 혼합함으로써 다가 백신을 만드는 데에 사용될 수 있다. 이러한 유 연성은 현재의 다가 백신 제조법에 비해 중요한 이점을 제공한다. 본 발명의 실시예에서 논의된 예시적인 백 신인 PCMV 백신 #1-3은 이들 백신이 PGA 분자와 DNI 단백질을 이루는 원자들간 공유결합을 형성하지 않을 것으 로 예상되었음에도 접합백신처럼 작용했다. 글루타르알데히드는 라이신 잔기의 입실론 아미노기를 가지는 단 백질의 아미노 측쇄와 주로 잘 반응한다. PGA 중합체는 자유로운 아미노기를 가지지 않고, 글루타르알데히드 와 반응하지 않는 카르복실 측쇄만을 가지고 있다. 따라서, PCMV에 의해 유발된 접합-유사 면역반응은 긴 PGA 분자가 DNI 단백질 분자의 크로스링크된 매트릭스 내에서 분자적으로 포획되어 있음을 말해준다. 무제한 모델에 의하면, 포획은 DNI 단백질과 PGA를 B-세포내로 운반하기 위해 일어나며, B-세포는 PGA를 면역학 적으로 인식하는 Ig 수용체를 경유하여 이러한 매트릭스에 결합한다. B-세포들이 수용되면, 매트릭스는 종래 의 접합백신에서와 비슷한 방법으로 분해되며 이로써 MHC-Ⅱ 분자에 나타나는 DNI-유래 펩타이드가 된다. 이후 T-세포의 도움으로 B-세포는 확장하고 Ig G를 생산하는 플라즈마 세포 및 PGA 특이적 기억 세포가 된다. 따라 서, 무제한 모델에 의하면 PCMV는 단백질-접합 캡슐 백신과 면역학적으로 유사하게 작용하지만 PCMV는 수송단백 질과 캡슐 중합체간의 공유결합이 없다는 점에서 차이가 난다. PCMV를 포함한 본 발명의 백신들은 소아 백신등에서 조합으로서 사용될 수 있다. 뿐만 아니라, 본 발명의 백 신은 폐렴상구균 감염, 스트렙토코커스(A 및 B그룹)감염, 인플루엔자간균 B("HiB") 감염, 수막염균(예를 들어 나이세리아 수막염균) 감염 및 그람 네거티브 박테리아(예를 들어 녹농균, 야토균) (Thirumalapura et al. J. Med. Microbiol. 54:693-695 (2005); Vinogradov and Perry, Carbohydr. Res.339:1643-1648 (2004); Vinogradov et al. Carbohydr. Res. 214:289-297 (1991)), 쉬겔라 종, 살모넬라 종, 아시네토박터 종, 버크홀 데리아 종 및 대장균에 대한 백신으로 사용될 수 있다. 본 발명의 백신을 생산하는 데 있어 하나 또는 그 이상의 항원(예를 들어 여기서 언급한 항원)의 존재하에서 수 송단백질(예를 들어 여기서 언급한 단백질)을 크로스링크시키기 위해 어떠한 링커(예를 들어 여기서 언급한 링 커)도 사용할 수 있다. 만약 하나의 항원이 사용된다면, 본 발명의 단백질 매트릭스 백신은 1가라고 불린다. 만약 1개가 넘는 항원이 사용된다면, 본 발명의 단백질 매트릭스 백신은 다가라고 불린다. 만약 미생물 캡슐 중합체가 항원이라면, 본 발명의 단백질 매트릭스 백신은 단백질 캡슐 매트릭스 백신(PCMV)이라고 불린다. 링커 크로스링킹 수송단백질은 당업계에 잘 알려져 있고 글루타르알데히드, m-말레이미도벤조일-N-하이드록시숙시니 미드에스테르(m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester), 카보디이미드 및 비스-비아조타이즈드 벤지딘 을 포함한다. 수송단백질에의 직접 크로스링크하는 일반적 방법 및 반응 부분은 호모 이중작용기 또는 헤테로 이중작용기 링 커를 이용하는 방법이 기술된다. (G. T. Hermanson. Bioconjugate Techniques, (1996)); Dick and Beurret. - 22 - 공개특허 10-2009-0066272
Conjugate Vaccines. Contribu. Microbiol. Immunol. 10:48-114 (1989)). 예를 들어, 수송단백질에 라이신이 많으면 이론적으로 크로스링커의 카르복실기와 반응할 수 있는n+1개의 1차 아민(말단 아민을 포함하여)이 있다. 따라서, 이러한 직접적인 접합과정을 이용하면 생성물은 n+1개의 아미드 결합을 가지는 것으로 제한된다. 본 발명의 바람직한 구현예에서 채택한 링커는 두 개의 단백질을 연결하는 결합이다. 링커는 두 개의 수송단 백질 (A) 및 (B)와 공유결합하는 부속기가 있는 선형, 고리형 또는 분쇄형 분자 골격을 가질 수 있다. 어떤 수송단백질도 1개 가 넘는 수송단백질과 결합할 수 있으며, 이에 의해 수송단백질들이 교차결합된 매트릭스가 만들어져 항원이 여기에 포획될 수 있다. 결합기란 작용기(A) 또는 (B)를 가지는 링커(L)의 반응 부위의 조합 으로 만들어진 공유 결합을 말한다. 링커 그룹은 에스터, 카바메이트, 사이오에스터(thioester), 이민, 다이 설파이드, 아마이드, 에테르, 사이오에테르(thioether), 설폰아미드, 아이소우레아, 이미도에스터, 아미딘, 포 스포아미데이트(phosphoramidate), 포스포다이에스터 및 하이드라존을 제한없이 포함한다. (A)와 (B)의 링크는 공유적 수단에 의해 이뤄지는데, 여기엔 (A) 및 (B)에 위치한 1개 또는 그 이상의 작용기와 의 결합(결합기)형성을 포함한다. 이러한 목적을 위한 화학적 반응성을 가지는 작용기의 예는 많은 수송단백질에 포함된 자연계의 아미노산에 존 재하는 아미노, 하이드록시, 설피드릴 (sulfhydryl), 카복시, 카보닐, 사이오에테르, 구아니딜, 이미다졸 및 페 놀기를 제한없이 포함한다. (A)와 (B)간의 공유결합은 이들 내의 작용기와 반응할 수 있는 부분을 가진 (L)링커를 사용함으로써 효율적일 수 있다. 반응의 생성물은 (L)과 (A)를 그리고 (L)과 (B)를 연결하는 새로운 결합을 포함하는 결합기이다. 예를 들어, (A)의 하이드록시기는 (L)이나 그 활성화 된 유도체의 카복시기와 반응하여(아래 참조) 에스터 결합 기를 형성할 수 있다. 설피드릴기와의 반응을 할 수 있는 부분의 예에는 XCH2CO-(X=Br, Cl, or I)타입의 α-할로아세틸(α- haloacetyl)이 있으며, 이는 설피드릴기와 특별한 반응성을 보이지만, 이미다졸, 사이오에테르, 페놀 및 아미노 기와도 반응한다.(Gurd, Methods Enzymol. 11:532 (1967). N-말레이미드(N-Maleimide) 유도체도 설피드릴기 에 대해 선택성이 있는 것으로 생각되지만, 특정 조건하에서 아미노기들을 결합시키는데 더 유용할 수 있다. 2-이미노사이올란(2-iminothiolane)같은 시약은 아미노기를 변형하여 사이오기(thiol group)를 도입하는데, 다 이설파이드 브릿지(disulphide bridge)를 형성하면서 크로스링크가 일어난다면 이는 설피드릴기로 간주될 수 있 다. 아미노기와 반응할 수 있는 반응성 있는 부분의 예로는, 알킬화 및 아실화 시약이 있다. 대표적인 알킬화 시 약은 다음과 같다: (i)α-할로아세틸(α-haloacetyl)로서, 이는 반응성있는 사이올기가 없을 때 아미노기에 대한 특이성을 보이며, XCH2CO-(X=Br, Cl, or I) 타입이다(Wong. Biochemistry 24:5337 (1979)); (ii) N-말레이미드 (N-maleimide derivative) 유도체로서, 이는 마이클 반응(Michael type reaction) 또는 고 이구조에 카보닐기를 첨가하는 아실화 반응을 톨해 아미노기와 반응할 수 있다(Smyth et al. Chem. Soc. 82:4600 (1960): Biochem. J. 91:589 (1964)); (iii) 반응성 있는 니트로할로아로마틱 (nitrohaloaromatic)화합물과 같은 아릴 할라이드; (iv) 알칼할라이드 (McKenzie et al. J. Protein Chem. 7:581 1988); (v) 아미노기와 함께 쉬프(Schiff)염기를 형성할 수 있는 알데히드 및 케톤으로서, 이들 아미노기는 환원을 통 해 안정된 아민을 형성한다; (vi)에피크로로하이드린(epichlorohydrin) 및 비속시란(bisoxirane)과 같은 에폭사이드(epoxide) 유도체로서, 이들은 아마노기, 설피드릴기, 페놀릭하이드록시기와 반응할 수 있다; (vii) s-트리아진(s-triazines)의 염소 함유 유도체로서, 이들은 아미노, 설피드릴, 하이드록시기와 같은 친핵 체에 대해 매우 반응성이 크다; (viii) 상기의 s-트리아진에 기초한 아지리딘(aziridines)으로서 (Ross. J. Adv. Cancer Res. 2: 1 (1954)), 이는 아미노기와 같은 친핵체와 고리열림을 통한 반응성이 크다; (ix) 스권린산 디에틸 에스터(squaric acid diethyl ester) (Tietze. Chem. Ber.124:1215 (1991)); 및 - 23 - 공개특허 10-2009-0066272
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많으면 이론적으로 크로스링커의 카르복실기와 반응할 수 있는n+1개의 1차 아민(말단 아민을 포함하여)이 있다.<br />
따라서, 이러한 직접적인 접합과정을 이용하면 생성물은 n+1개의 아미드 결합을 가지는 것으로 제한된다.<br />
본 발명의 바람직한 구현예에서 채택한 링커는 두 개의 단백질을 연결하는 결합이다. 링커는 두 개의 수송단<br />
백질 (A) 및 (B)와 공유결합하는 부속기가 있는 선형, 고리형 또는 분쇄형 분자 골격을 가질 수 있다. 어떤<br />
수송단백질도 1개 가 넘는 수송단백질과 결합할 수 있으며, 이에 의해 수송단백질들이 교차결합된 매트릭스가<br />
만들어져 항원이 여기에 포획될 수 있다. 결합기란 작용기(A) 또는 (B)를 가지는 링커(L)의 반응 부위의 조합<br />
으로 만들어진 공유 결합을 말한다. 링커 그룹은 에스터, 카바메이트, 사이오에스터(thioester), 이민, 다이<br />
설파이드, 아마이드, 에테르, 사이오에테르(thioether), 설폰아미드, 아이소우레아, 이미도에스터, 아미딘, 포<br />
스포아미데이트(phosphoramidate), 포스포다이에스터 및 하이드라존을 제한없이 포함한다.<br />
(A)와 (B)의 링크는 공유적 수단에 의해 이뤄지는데, 여기엔 (A) 및 (B)에 위치한 1개 또는 그 이상의 작용기와<br />
의 결합(결합기)형성을 포함한다.<br />
이러한 목적을 위한 화학적 반응성을 가지는 작용기의 예는 많은 수송단백질에 포함된 자연계의 아미노산에 존<br />
재하는 아미노, 하이드록시, 설피드릴 (sulfhydryl), 카복시, 카보닐, 사이오에테르, 구아니딜, 이미다졸 및 페<br />
놀기를 제한없이 포함한다.<br />
(A)와 (B)간의 공유결합은 이들 내의 작용기와 반응할 수 있는 부분을 가진 (L)링커를 사용함으로써 효율적일<br />
수 있다. 반응의 생성물은 (L)과 (A)를 그리고 (L)과 (B)를 연결하는 새로운 결합을 포함하는 결합기이다.<br />
예를 들어, (A)의 하이드록시기는 (L)이나 그 활성화 된 유도체의 카복시기와 반응하여(아래 참조) 에스터 결합<br />
기를 형성할 수 있다.<br />
설피드릴기와의 반응을 할 수 있는 부분의 예에는 XCH2CO-(X=Br, Cl, or I)타입의 α-할로아세틸(α-<br />
haloacetyl)이 있으며, 이는 설피드릴기와 특별한 반응성을 보이지만, 이미다졸, 사이오에테르, 페놀 및 아미노<br />
기와도 반응한다.(Gurd, Methods Enzymol. 11:532 (<strong>19</strong>67). N-말레이미드(N-Maleimide) 유도체도 설피드릴기<br />
에 대해 선택성이 있는 것으로 생각되지만, 특정 조건하에서 아미노기들을 결합시키는데 더 유용할 수 있다.<br />
2-이미노사이올란(2-iminothiolane)같은 시약은 아미노기를 변형하여 사이오기(thiol group)를 도입하는데, 다<br />
이설파이드 브릿지(disulphide bridge)를 형성하면서 크로스링크가 일어난다면 이는 설피드릴기로 간주될 수 있<br />
다.<br />
아미노기와 반응할 수 있는 반응성 있는 부분의 예로는, 알킬화 및 아실화 시약이 있다. 대표적인 알킬화 시<br />
약은 다음과 같다:<br />
(i)α-할로아세틸(α-haloacetyl)로서, 이는 반응성있는 사이올기가 없을 때 아미노기에 대한 특이성을 보이며,<br />
XCH2CO-(X=Br, Cl, or I) 타입이다(Wong. Biochemistry 24:5337 (<strong>19</strong>79));<br />
(ii) N-말레이미드 (N-maleimide derivative) 유도체로서, 이는 마이클 반응(Michael type reaction) 또는 고<br />
이구조에 카보닐기를 첨가하는 아실화 반응을 톨해 아미노기와 반응할 수 있다(Smyth et al. Chem. Soc.<br />
82:4600 (<strong>19</strong>60): Biochem. J. 91:589 (<strong>19</strong>64));<br />
(iii) 반응성 있는 니트로할로아로마틱 (nitrohaloaromatic)화합물과 같은 아릴 할라이드;<br />
(iv) 알칼할라이드 (McKenzie et al. J. Protein Chem. 7:581 <strong>19</strong>88);<br />
(v) 아미노기와 함께 쉬프(Schiff)염기를 형성할 수 있는 알데히드 및 케톤으로서, 이들 아미노기는 환원을 통<br />
해 안정된 아민을 형성한다;<br />
(vi)에피크로로하이드린(epichlorohydrin) 및 비속시란(bisoxirane)과 같은 에폭사이드(epoxide) 유도체로서,<br />
이들은 아마노기, 설피드릴기, 페놀릭하이드록시기와 반응할 수 있다;<br />
(vii) s-트리아진(s-triazines)의 염소 함유 유도체로서, 이들은 아미노, 설피드릴, 하이드록시기와 같은 친핵<br />
체에 대해 매우 반응성이 크다;<br />
(viii) 상기의 s-트리아진에 기초한 아지리딘(aziridines)으로서 (Ross. J. Adv. Cancer Res. 2: 1 (<strong>19</strong>54)),<br />
이는 아미노기와 같은 친핵체와 고리열림을 통한 반응성이 크다;<br />
(ix) 스권린산 디에틸 에스터(squaric acid diethyl ester) (Tietze. Chem. Ber.<strong>12</strong>4:<strong>12</strong>15 (<strong>19</strong>91)); 및<br />
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공개특허 10-2009-0066272
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