(19) 대한민국특허청(KR) (12) 공개특허공보(A) - Questel
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본 명세서에서 "폴리알콜(polyalcohol)"은 카보닐기가 1차 또는 2차 하이드록시기로 환원된 탄수화물의 수소화 형태를 말한다. 예시적인 폴리알콜은 폴리알킬렌 글리콜(PAG)과 같은 폴리알킬렌 옥사이드(PAO)로서 폴리메틸 렌 글리콜(PMG), 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 메톡시폴리에틸렌글리콜(mPEG) 및 폴리프로필렌글리콜이 이에 속하고, 폴리비닐알콜 (PVA); 폴리에틸렌-코-말레산 무수물; 폴리스티렌-코-말레산무수물; 카복시메틸-덱스트란 을 포함하는 덱스트란; 메틸셀룰로오스, 카복시메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 하이드록시에틸세룰로오스, 카 복시에틸셀룰로오스 및 하이드록시프로필셀룰로오스를 포함하는 셀룰로스; 치토산의 (chitosan)의 가수분해산물; 하이드로에틸-스타치 및 하이드록시 프로필- 스타치 같은 전분; 글리코겐; 아가로스 및 그 유도 체; 구아 검(guar gum); 풀루란(pullulan); 이눌린; 잔탄 검(xanthan gum); 카라지난(carrageenan); 펙틴; 알 진산 가수분해물; 소르비톨(sorbitol); 글루코스, 만노오스, 갈락토스, 아라비노스, 글루코스, 자일로스, 쓰레 오스(threose), 소르보스(sorbose), 프럭토스, 글리세롤, 말토스셀로비오스(maltose cellobiose), 수크로스, 아밀로스, 아밀로펙틴의 알콜; 또는 모노프로필렌글리콜(MPG). 본 명세서의 "폴리아미노산(poly amino acid)"는 최소 2개의 아미노산들이 펩타이드 결합으로 연결된 것을 말한 다. 바람직하게는, 폴리아미노산은 아미노산 시퀀스의 반복 또는 동일한 아미노산의 사슬(예; 호모 중합체)을 포함하는 펩타이드이다. 본 명세서에서 "쉬프 염기의 환원(reducing a Schiff base)"은 아조메틴(azomethine) 또는 화학식 R1R2C=N-R3의 화합물(R1, R2 및 R3는 전형적으로 탄소를 포함하는 화학구조이다)을 쉬프 염기의 이중결합을 수소원자로 포화시키 는 환원제에 노출시키는 것을 말한다. 환원 방법은 당업계에 공지되어 있다. 본 명세서에서 항체 또는 항체의 절편에 "특이적으로 결합(specifically binds)"한다 함은 항체 또는 항체의 절편이 특정단백질, 예를 들어 항원,에 대해 동량의 다른 단백질에 대해서보다 증가된 친화력을 가짐을 말한다. 바람직하게는, 항체 또는 항체의 절편은 그들의 항원에 대해 연관된 항원들을 포함하여 동량의 다른 항원에 대 해서보다 2배, 5배, 10배, 30배 또는 100배의 친화력을 가지며, 이는 ELISA(enzyme linked immunosorbent assay)분석을 이용하여 결정되었다. 본 명세서에서 "대상체(subject)"라 함은 미생물에 의해 감염될 수 있는 동물을 말한다. 바람직하게는, 대상 체는 인간, 원숭이, 개, 고양이, 마우스, 랫트,소, 양, 염소 또는 말일 수 있다. 바람직한 구현예에 따르면, 대상체는 인간 어린이와 같은 인간이다. 바람직하게는 대상체는 인간 갓난아기, 유아 또는 사춘기 이전의 어 린이이다. 본 명세서에서 "T세포-비의존성 항원(T-cell independent antigen)"은 T 림프구의 도움 없이 항체를 생산하는 항원을 말한다. 바람직하게는 T세포-비의존성 항원은 T 림프구의 도움 없이 B 림프구를 직접 자극한다. 예 시적인 T세포-비의존성 항원은 바람직하게는 캡슐 항원 폴리-감마-D-글루타민산(PGA), 알진산(algenate), 덱스 트란, 다당류(PS), 폴리아미노산, 폴리알콜, 및 핵산을 포함한다. 발명의 이점 본 발명은 종래의 백신 기술에 비해 제조가 더 간단하고, 화학적 문제가 적고, 면역학적 문제가 적으며, 더 저 렴하며, 다양한 항원 및 수송단백질에 대한 적응성이 접합 기술에 비해 더 뛰어나며, 다가 항원의 생성을 위한 유연성이 더 뛰어난 백신을 제공한다. 본 발명의 백신은 면역반응을 유발시키는 항원과 수송단백질 사이에 공유 결합을 필요로 하지 않으므로 접합 백신 기술에 비해 백신의 제조 방법이 단순하고 비용이 절감된다. 다당류-단백질 접합 백신은 생산단가가 매 우 높아 선진국에서만 판매되어 왔다; 종래의 접합 백신은 각각의 백신에 요구되는 특화된 화학구조와 다당류 및 단백질의 생산 및 순화를 위한 비용으로 인해 낮은 가격으로 생산하기가 어려웠다. 또한, 본 발명의 백신은 종전에 다루기 어려운 항원에 대한 면역반응을 안전하게 유도한다. 이러한 백신은 모 노밸런트(면역반응을 유도하는 단일의 항원을 가짐) 혹은 멀티밸런트(다중의 면역반응을 유도하는 다중의 항원 을 가짐)일 수 있다. 다루기 어려운 항원에 대한 면역반응을 유도하는 것으로 알려진 TLR(Toll-like receptor) 리간드를 가지는 백신은 안전하지 못한바, 그 이유는 본 발명의 백신과 비교하여 TLR 리간드가 종종 친염증성이고, 소량에 의해서도 독성을 나타내며, 반응성이 크며, 부작용을 유발하는 경향이 있기 때문이다. 본 발명의 다른 특성 및 이점은 이하의 발명의 상세한 설명과 도면, 청구항을 통해 명확해진다. 본 발명은 백신 조성물, 그 제조방법 및 T-세포 비의존성 항원 또는 약한 면역반응을 유발하는 다당류, 폴리알 - 18 - 공개특허 10-2009-0066272
콜, 폴리아미노산 및 다른 유기 중합체들과 같은 항원에 대한 면역을 제공하는 상기 백신의 투여방법에 관한 것이다. 본 발명의 백신은 종래의 다당류-단백질 접합 백신의 유효한 면역학적 특성을 가지지만 접합백신과 비교하여 바람직한 차이점이 있다. 즉, 다당류 또는 캡슐 유기중합체와 같은 항원과 수송단백질을 연결함에 있어 중요한 원자공유결합을 필요로 하지 않는다. 대신 다당류 또는 캡슐 유기중합체와 같은 항원은 수송단백 질에 포획된다. 예를 들어, 단백질 매트릭스는 다당류 또는 캡슐 유기중합체와 같은 용해성 항원의 존재 하에 서 수송단백질 분자와 공유 크로스링크를 함으로서 형성될 수 있다 : 이들 백신은 단백질 매트릭스 백신으로 불 린다. 수송단백질은 서로 매우 잘 크로스링크되어 항원을 포획하고 항원의 수용을 촉진하며 면역세포에서의 항체생산을 유발할 수 있는 매트릭스를 형성할 수 있다. 수송단백질 매트릭스는 항원을 에워싸는 "망사 (mesh)" 형태 또는 항원이 "실(string)"이고 단백질 또는 크로스링크된 단백질 복합체가 "구슬(bead)"인 "실 위 의 구슬(beads on a string)"형태일 수 있다. 수송단백질이 상기 항원을 둘러싸 링을 형성하거나 3차원적 망 사를 형성하여 그안에 항원이 빠져들게되면서 항원이 수송단백질에 포획된다. 또한, 수송단백질과 항원은 크 로스링크될 수 있다. 예를 들어, 항원사슬과 수송단백질의 사슬 내 크로스링크(intra-chain cross-links)가 이루어진다. 바람직한 구현예에 따르면, 항원과 수송단백질은 비공유결합을 한다. 이러한 비공유 결합은 소 수성 상호작용, 이온성 상호작용, 반데르 발스 상호작용 또는 수소결합을 포함할 수 있다. 비공유결합은 항원 과 단백질 복합체가 비공유적으로 결합된 물리적인 기하구조일 수 있다(상기 "실 위의 구슬형태(bead on a string" analogy above)참조). 수송단백질은 항원을 포획하기 위해 스스로와 크로스링크될 필요는 없다. 항원은, 예를 들어, 수송단백질과 항원을 액체용제에서 혼합한 뒤 수송단백질을 침전시켜, 결과적으로 항원과 단백질을 동반침전시킴으로서 포획 될 수 있다. 항원은 항원과 수송단백질의 혼합물로부터의 화합물(예를 들어 알부민, 소듐 헥사메타포스페이트, 폴리포스파젠 또는 그 밖의 소수성 또는 이온성 상호작용에 의해 유발된 단백질에 대한 친 화력을 가지는 중합체)을 침전시켜 수송단백질에 포획시킬 수 있다. 단백질을 침전시키는 방법은 공지된 기술 이며, 예를 들어 다음의 단계를 포함한다; (1) 혼합물의 pH를 변화시키는 단계; (2) 혼합물의 이온염의 농도를 증가 또는 감소시킴으로써 용액의 이온세기를 변화시키는 단계; (3) 또는 TCA(trichloroacetic acid) 또는 황산 암모늄을 용액에 첨가하는 단계; (4) 혼합물을 가열하여 단백질을 응고시킴으로써 침전 또는 젤 등을 형성하는 단계; (5) 혼합물 내의 단백질을 화학적으로 변형시켜 불용성으로 만드는 단계; 및 (6) 단백질 용액을 이온화 방사선(자외선, 감마선 또는 베타선)으로 충분히 조사하여 단백질을 크로스링크시키거나 침전시키는 단계. 병원균의 캡슐 단백질이 사용되면, 이러한 백신은 PCMV(protein capsular matrix vaccines)라 불린다. 실시 예에서 기재한 것처럼, PCMV는 T-세포 비의존성 캡슐 항원, PGA(poly-gamma-D-glutamic acid), 알진산 (algenate), 덱스트란 및 예시적인 수송단백질인 DNI에 기초한 백신들을 포함하여 생산된다. PGA PCMV는 대량 생산이 간단하고 종래의 전형적인 PGA-단백질 접합백신의 면역반응을 유발한다는것이 밝혀졌다. 본 발명의 백 신은 항원의 존재 하에서 모든 가능한 수송단백질을 크로스링크시키는 모든 가능한 링커를 사용함으로써 제조될 수 있다. 선호되는 예시적 링커, 수송단백질 및 항원에 대해 서술한다. 다당류(PS)는 당류(saccharide)의 중합체이다. 캡슐로부터 유래된 다당류는 나이세리아 수막염균, 폐렴연쇄상 구균, 살모넬라 티피, 인플루엔자간균 B와 같은 캡슐화 된 박테리아 병원균에 대한 방어면역에 포함된 1차 항원 성 물질이다. 미생물 다당류에 기초한 백신을 이용한 청년과 성인에 대한 면역접종은 질병치료에 효과적이었 으나, 유아나 어린 아이들(예를 들어 24개월 미만의 어린이)에게 방어면역을 제공하는 데에는 덜 효과적임이 입 증되었다. 어린 아이들은 성숙하고 적응력있는 면역 창고를 발달시키지 못하고, 이러한 어린 백신 피투여자에 서의 캡슐 다당류 같은 T-세포 비의존성 항원은 면역원성이 떨어지고 장기적 방어면역 반응(예를 들어 면역학적 기억 반응)을 유발하지 못한다. 다당류같은 T-세포 비의존성 항원은 다당류와 단백질간의 화학적 결합에 의해 T-세포 의존성 항원으로 전환될 수 있다. 이러한 과정은 "접합(conjugation)"이라 불리며, 다당류 구조내의 원자와 수송단백질내의 아미노산 측쇄 원자와의 공유결합 형성단계를 포함한다. 이러한 접합백신은 B-세포의 성숙 및 항체생산의 양을 증가시키는 아이소타입(isotype) 스위치를 더 효율적으로 촉진한다. 방어항체는 그 들의 다당류 항원에 대해 높은 친화력을 보이며, 전형적으로 상보적 고정활성 및 옵소닌화 이펙터(opsonic effector) 활성을 가지는 면역글로불린 G(IgG)의 서브클래스이다. 예로서, 다당류와 수송단백질 테타누스 톡 소이드와의 접합에 의한 항-다당류 IgG 면역반응의 유도의 비제한적인 과정을 도 1에 나타내었다. 이 모델에 서, 다당류를 인식하는 항체 수용체를 가지는 B-세포만이 다당류-단백질 접합체와 결합한다. 따라서, 수송단 백질은 올바른 다당류 결합 특이성을 가진 B-세포 표면에 결합한다. 단백질-다당류 복합체는 이러한 B-세포에 의해 세포내 액포(vacuolar)구획으로 가져가진 후 단백질 분해과정(proteolytic degradation)에 의해 수송이 행 해진다. 수송단백질에서 유래된 펩타이드는 운반되고 MHC-Ⅱ(MHC-Class Ⅱ receptor)의 제시 그루브 (presentation groove)에 로딩된다. 이 MHC-Ⅱ-수송 펩타이드 복합체는 B-세포 표면에 놓여진다. T-세포 - 19 - 공개특허 10-2009-0066272
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콜, 폴리아미노산 및 다른 유기 중합체들과 같은 항원에 대한 면역을 제공하는 상기 백신의 투여방법에 관한<br />
것이다. 본 발명의 백신은 종래의 다당류-단백질 접합 백신의 유효한 면역학적 특성을 가지지만 접합백신과<br />
비교하여 바람직한 차이점이 있다. 즉, 다당류 또는 캡슐 유기중합체와 같은 항원과 수송단백질을 연결함에<br />
있어 중요한 원자공유결합을 필요로 하지 않는다. 대신 다당류 또는 캡슐 유기중합체와 같은 항원은 수송단백<br />
질에 포획된다. 예를 들어, 단백질 매트릭스는 다당류 또는 캡슐 유기중합체와 같은 용해성 항원의 존재 하에<br />
서 수송단백질 분자와 공유 크로스링크를 함으로서 형성될 수 있다 : 이들 백신은 단백질 매트릭스 백신으로 불<br />
린다. 수송단백질은 서로 매우 잘 크로스링크되어 항원을 포획하고 항원의 수용을 촉진하며 면역세포에서의<br />
항체생산을 유발할 수 있는 매트릭스를 형성할 수 있다. 수송단백질 매트릭스는 항원을 에워싸는 "망사<br />
(mesh)" 형태 또는 항원이 "실(string)"이고 단백질 또는 크로스링크된 단백질 복합체가 "구슬(bead)"인 "실 위<br />
의 구슬(beads on a string)"형태일 수 있다. 수송단백질이 상기 항원을 둘러싸 링을 형성하거나 3차원적 망<br />
사를 형성하여 그안에 항원이 빠져들게되면서 항원이 수송단백질에 포획된다. 또한, 수송단백질과 항원은 크<br />
로스링크될 수 있다. 예를 들어, 항원사슬과 수송단백질의 사슬 내 크로스링크(intra-chain cross-links)가<br />
이루어진다. 바람직한 구현예에 따르면, 항원과 수송단백질은 비공유결합을 한다. 이러한 비공유 결합은 소<br />
수성 상호작용, 이온성 상호작용, 반데르 발스 상호작용 또는 수소결합을 포함할 수 있다. 비공유결합은 항원<br />
과 단백질 복합체가 비공유적으로 결합된 물리적인 기하구조일 수 있다(상기 "실 위의 구슬형태(bead on a<br />
string" analogy above)참조).<br />
수송단백질은 항원을 포획하기 위해 스스로와 크로스링크될 필요는 없다. 항원은, 예를 들어, 수송단백질과<br />
항원을 액체용제에서 혼합한 뒤 수송단백질을 침전시켜, 결과적으로 항원과 단백질을 동반침전시킴으로서 포획<br />
될 수 있다. 항원은 항원과 수송단백질의 혼합물로부터의 화합물(예를 들어 알부민, 소듐<br />
헥사메타포스페이트, 폴리포스파젠 또는 그 밖의 소수성 또는 이온성 상호작용에 의해 유발된 단백질에 대한 친<br />
화력을 가지는 중합체)을 침전시켜 수송단백질에 포획시킬 수 있다. 단백질을 침전시키는 방법은 공지된 기술<br />
이며, 예를 들어 다음의 단계를 포함한다; (1) 혼합물의 pH를 변화시키는 단계; (2) 혼합물의 이온염의 농도를<br />
증가 또는 감소시킴으로써 용액의 이온세기를 변화시키는 단계; (3) 또는 TCA(trichloroacetic acid) 또는 황산<br />
암모늄을 용액에 첨가하는 단계; (4) 혼합물을 가열하여 단백질을 응고시킴으로써 침전 또는 젤 등을 형성하는<br />
단계; (5) 혼합물 내의 단백질을 화학적으로 변형시켜 불용성으로 만드는 단계; 및 (6) 단백질 용액을 이온화<br />
방사선(자외선, 감마선 또는 베타선)으로 충분히 조사하여 단백질을 크로스링크시키거나 침전시키는 단계.<br />
병원균의 캡슐 단백질이 사용되면, 이러한 백신은 PCMV(protein capsular matrix vaccines)라 불린다. 실시<br />
예에서 기재한 것처럼, PCMV는 T-세포 비의존성 캡슐 항원, PGA(poly-gamma-D-glutamic acid), 알진산<br />
(algenate), 덱스트란 및 예시적인 수송단백질인 DNI에 기초한 백신들을 포함하여 생산된다. PGA PCMV는 대량<br />
생산이 간단하고 종래의 전형적인 PGA-단백질 접합백신의 면역반응을 유발한다는것이 밝혀졌다. 본 발명의 백<br />
신은 항원의 존재 하에서 모든 가능한 수송단백질을 크로스링크시키는 모든 가능한 링커를 사용함으로써 제조될<br />
수 있다. 선호되는 예시적 링커, 수송단백질 및 항원에 대해 서술한다.<br />
다당류(PS)는 당류(saccharide)의 중합체이다. 캡슐로부터 유래된 다당류는 나이세리아 수막염균, 폐렴연쇄상<br />
구균, 살모넬라 티피, 인플루엔자간균 B와 같은 캡슐화 된 박테리아 병원균에 대한 방어면역에 포함된 1차 항원<br />
성 물질이다. 미생물 다당류에 기초한 백신을 이용한 청년과 성인에 대한 면역접종은 질병치료에 효과적이었<br />
으나, 유아나 어린 아이들(예를 들어 24개월 미만의 어린이)에게 방어면역을 제공하는 데에는 덜 효과적임이 입<br />
증되었다. 어린 아이들은 성숙하고 적응력있는 면역 창고를 발달시키지 못하고, 이러한 어린 백신 피투여자에<br />
서의 캡슐 다당류 같은 T-세포 비의존성 항원은 면역원성이 떨어지고 장기적 방어면역 반응(예를 들어 면역학적<br />
기억 반응)을 유발하지 못한다. 다당류같은 T-세포 비의존성 항원은 다당류와 단백질간의 화학적 결합에 의해<br />
T-세포 의존성 항원으로 전환될 수 있다. 이러한 과정은 "접합(conjugation)"이라 불리며, 다당류 구조내의<br />
원자와 수송단백질내의 아미노산 측쇄 원자와의 공유결합 형성단계를 포함한다. 이러한 접합백신은 B-세포의<br />
성숙 및 항체생산의 양을 증가시키는 아이소타입(isotype) 스위치를 더 효율적으로 촉진한다. 방어항체는 그<br />
들의 다당류 항원에 대해 높은 친화력을 보이며, 전형적으로 상보적 고정활성 및 옵소닌화 이펙터(opsonic<br />
effector) 활성을 가지는 면역글로불린 G(IgG)의 서브클래스이다. 예로서, 다당류와 수송단백질 테타누스 톡<br />
소이드와의 접합에 의한 항-다당류 IgG 면역반응의 유도의 비제한적인 과정을 도 1에 나타내었다. 이 모델에<br />
서, 다당류를 인식하는 항체 수용체를 가지는 B-세포만이 다당류-단백질 접합체와 결합한다. 따라서, 수송단<br />
백질은 올바른 다당류 결합 특이성을 가진 B-세포 표면에 결합한다. 단백질-다당류 복합체는 이러한 B-세포에<br />
의해 세포내 액포(vacuolar)구획으로 가져가진 후 단백질 분해과정(proteolytic degradation)에 의해 수송이 행<br />
해진다. 수송단백질에서 유래된 펩타이드는 운반되고 MHC-Ⅱ(MHC-Class Ⅱ receptor)의 제시 그루브<br />
(presentation groove)에 로딩된다. 이 MHC-Ⅱ-수송 펩타이드 복합체는 B-세포 표면에 놓여진다. T-세포<br />
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