(19) 대한민국특허청(KR) (12) 공개특허공보(A) - Questel
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(19) 대한민국특허청(KR) (12) 공개특허공보(A) - Questel

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(51) Int. Cl. (19) 대한민국특허청(KR) (12) 공개특허공보(A) A61K 39/385 (2006.01) A61K 39/116 (2006.01) A61K 39/09 (2006.01) A61P 37/00 (2006.01) (21) 출원번호 10-2009-7004799 (22) 출원일자 2009년03월06일 심사청구일자 없음 번역문제출일자 2009년03월06일 (86) 국제출원번호 PCT/US2007/017528 국제출원일자 2007년08월07일 (87) 국제공개번호 WO 2008/021076 국제공개일자 2008년02월21일 (30) 우선권주장 60/835,944 2006년08월07일 미국(US) 60/933,764 2007년06월08일 미국(US) 전체 청구항 수 : 총 113 항 (54) 단백질 매트릭스 백신 및 그의 제조방법 및 백신 투여방법 (57) 요 약 (11) 공개번호 10-2009-0066272 (43) 공개일자 2009년06월23일 (71) 출원인 프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지 미합중국, 메사추세츠 02138, 캠브리지, 퀸시스트 리트17 (72) 발명자 메칼라노스, 존, 제이. 미합중국 메사추세츠 02129 찰스타운 유니트 디-108, 워렌스트리트 1 (74) 대리인 양부현, 김승진 본 발명은 수송단백질 및 복합체에 포획된 항원을 포함하는 백신 조성물, 이의 제조 방법 및 상기 백신의 투여방 법에 관한 것이다. 대 표 도 - 도1 - 1 - 공개특허 10-2009-0066272

(51) Int. Cl.<br />

(<strong>19</strong>) <strong>대한민국특허청</strong>(<strong>KR</strong>)<br />

(<strong>12</strong>) <strong>공개특허공보</strong>(A)<br />

A61K 39/385 (2006.01) A61K 39/116 (2006.01)<br />

A61K 39/09 (2006.01) A61P 37/00 (2006.01)<br />

(21) 출원번호 10-2009-7004799<br />

(22) 출원일자 2009년03월06일<br />

심사청구일자 없음<br />

번역문제출일자 2009년03월06일<br />

(86) 국제출원번호 PCT/US2007/017528<br />

국제출원일자 2007년08월07일<br />

(87) 국제공개번호 WO 2008/021076<br />

국제공개일자 2008년02월21일<br />

(30) 우선권주장<br />

60/835,944 2006년08월07일 미국(US)<br />

60/933,764 2007년06월08일 미국(US)<br />

전체 청구항 수 : 총 113 항<br />

(54) 단백질 매트릭스 백신 및 그의 제조방법 및 백신 투여방법<br />

(57) 요 약<br />

(11) 공개번호 10-2009-0066272<br />

(43) 공개일자 2009년06월23일<br />

(71) 출원인<br />

프레지던트 앤드 펠로우즈 오브 하바드 칼리지<br />

미합중국, 메사추세츠 02138, 캠브리지, 퀸시스트<br />

리트17<br />

(72) 발명자<br />

메칼라노스, 존, 제이.<br />

미합중국 메사추세츠 02<strong>12</strong>9 찰스타운 유니트<br />

디-108, 워렌스트리트 1<br />

(74) 대리인<br />

양부현, 김승진<br />

본 발명은 수송단백질 및 복합체에 포획된 항원을 포함하는 백신 조성물, 이의 제조 방법 및 상기 백신의 투여방<br />

법에 관한 것이다.<br />

대 표 도 - 도1<br />

- 1 -<br />

공개특허 10-2009-0066272

특허청구의 범위<br />

청구항 1<br />

항원 및 수송단백질을 포함하는 백신 조성물에 있어서, (ⅰ) 상기 항원의 50% 이하는 상기 수송단백질과 크로스<br />

링크 되어있고, (ⅱ) 상기 항원은 상기 수송단백질에 포획(entrapped)되어 복합체를 형성하는 것을 특징으로 하<br />

는 백신 조성물.<br />

청구항 2<br />

제 1 항에 있어서, 상기 복합체는 10 nm-100 μm의 직경을 가지는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.<br />

청구항 3<br />

제 2 항에 있어서, 상기 복합체는 약 100 nm-100 μm의 직경을 가지는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.<br />

청구항 4<br />

제 2 항에 있어서, 상기 복합체는 약 100 nm-10 μm의 직경을 가지는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.<br />

청구항 5<br />

제 1 항에 있어서, 상기 복합체는 포유류에 투여된 경우 상기 포유류에서 T- 세포 의존성 면역반응을 유발하는<br />

것을 특징으로 하는 백신 조성물.<br />

청구항 6<br />

제 1 항에 있어서, 상기 항원과 상기 수송단백질의 몰 비율은 1:10 내지 10:1인 것을 특징으로 백신 조성물.<br />

청구항 7<br />

제 1 항에 있어서, 상기 수송단백질은 멀티머인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.<br />

청구항 8<br />

제 7 항에 있어서, 상기 멀티머는 최소 5개의 서브유닛을 포함하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.<br />

청구항 9<br />

제 7 항에 있어서, 상기 멀티머는 호모멀티머인 것을 특징으로 하는 백신조성물.<br />

청구항 10<br />

제 1 항에 있어서, 상기 수송단백질은 적어도 1개의 다른 수송단백질과 공유결합 되어있는 것을 특징으로 하는<br />

백신 조성물.<br />

청구항 11<br />

제 10 항에 있어서, 상기 공유결합은 라이신 측쇄의 1차 아미노기와 아스파르테이트 또는 글루타메이트 측쇄의<br />

카르복실기 사이의 펩타이드 결합을 포함하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.<br />

청구항 <strong>12</strong><br />

제 10 항에 있어서, 상기 공유결합은 화학식 의 화합물을 포함하고, 상기 화학식에서 Rn은 탄소수 1<br />

내지 <strong>12</strong>의 선형 또는 분쇄형 알킬, 1 내지 <strong>12</strong>개 원자의 선형 또는 분쇄형 헤테로알킬, 탄소수 2 내지 <strong>12</strong>의 선형<br />

또는 분쇄형 알켄, 탄소수 2 내지 <strong>12</strong>의 선형 또는 분쇄형 알킨, 탄소수 5 내지 10의 방향족 잔기, 3 내지 10개<br />

의 원자의 고리형 시스템, -(CH2CH2O)qCH2CH2-, 상기 q는 1 내지 4 또는 두 개의 알데히드기를 연결하는 화학결합<br />

이다.<br />

- 2 -<br />

공개특허 10-2009-0066272

청구항 13<br />

제 10 항에 있어서, 상기 공유결합은 글루타르알데히드, m-말레이미도벤조일-N-하이드록시숙시니미드 에스테르,<br />

카보디이미드 또는 비스-비아조타이즈드 벤지딘을 포함하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.<br />

청구항 14<br />

제 10 항에 있어서, 상기 공유결합은 이중작용기성 크로스링커(bifunctional cross linker)를 포함하는 것을 특<br />

징으로 하는 백신 조성물.<br />

청구항 15<br />

제 14 항에 있어서, 상기 이중작용기성 크로스링커는 글루타르알데히드, 비스[설포닐숙시니미딜]수베레이트 또<br />

는 디메틸아디피미데이트인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.<br />

청구항 16<br />

제 1 항에 있어서, 상기 수송단백질들은 비공유 결합된 것을 특징으로 하는 백신 조성물.<br />

청구항 17<br />

제 16 항에 있어서, 상기 비공유 결합은 소수성 상호작용, 이온성 상호작용, 반데르발스 상호작용 또는 수소결<br />

합을 포함하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.<br />

청구항 18<br />

제 1 항에 있어서, 상기 수송단백질은 디프테리아 톡신(diphtheria toxin) 또는 그 변이체, 디프테리아 톡소이<br />

드(diphtheria toxoid), 데타누스 톡신(tetanus toxin) 또는 그 변이체, 테타누스 톡소이드(tetanus toxoid),<br />

녹농균 엑소톡신 A(Pseudomonas aeruginosa exotoxin A) 또는 그 변이체, 콜레라 톡신 B 서브유닛, 테타누스<br />

톡신 절편 C, 박테리아 편모, 뉴몰리신(Pneumolysin), 나이세리아 수막염균(Neisseria menningitidi)의 외막단<br />

백질, 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)의 Hcp1 단백질, 대장균의 이열성 엔테로톡신(enterotoxin), 쉬가-유사<br />

톡신(shiga-like toxin), 인간 LTB 단백질, 리스테리올리신 O(또는 관련 단백질), 총박테리아 세포의 단백질 추<br />

출물, 탄저균(Bacillus anthracis)의 방어항원에 대한 DNI(dominant negative mutant) 또는 대장균 베타-갈락<br />

토시다아제인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.<br />

청구항 <strong>19</strong><br />

제 18 항에 있어서, 상기 총박테리아 세포는 녹농균 또는 스트렙토코커스 세포인 것을 특징으로 하는 백신조성<br />

물.<br />

청구항 20<br />

제 18 항에 있어서, 상기 박테리아 편모는 비브리오 콜레라균(Vibrio cholerae)의 편모 단백질인 것을 특징으로<br />

하는 백신 조성물.<br />

청구항 21<br />

제 18 항에 있어서, 상기 쉬가-유사 톡신은 쉬겔라(Shigella) SltB2 단백질인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.<br />

청구항 22<br />

제 18 항에 있어서, 상기 수송단백질은 뉴몰리신인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.<br />

청구항 23<br />

제 18 항에 있어서, 상기 수송단백질은 리스테리올리신 O인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.<br />

청구항 24<br />

- 3 -<br />

공개특허 10-2009-0066272

제 18 항에 있어서, 상기 수송단백질은 디프테리아 톡신인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.<br />

청구항 25<br />

제 18 항에 있어서, 상기 수송단백질은 디프테리아 톡소이드인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.<br />

청구항 26<br />

제 18 항에 있어서, 상기 수송단백질은 테타누스 톡신인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.<br />

청구항 27<br />

제 18 항에 있어서, 상기 수송단백질은 테타누스 톡소이드인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.<br />

청구항 28<br />

제 1 항에 있어서, 상기 항원은 다당류, 폴리알콜 또는 폴리 아미노산인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.<br />

청구항 29<br />

제 28 항에 있어서, 상기 다당류는 최소 18개 잔기를 포함하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.<br />

청구항 30<br />

제 28 항에 있어서, 상기 다당류는 폐렴연쇄상구균(Streptococcus pneumoniae)의 다당류, 야토균(Francisella<br />

tularensis) 다당류, 탄저균(Bacillus anthracis) 다당류, 인플루엔자간균(Haemophilus influenzae) 다당류,<br />

살모넬라 티피(Salmonella typhi) 다당류, 살모넬라 종 다당류, 쉬겔라(Shigella) 다당류 또는 나이세리아 수막<br />

염균(Neisseria meningitidis) 다당류인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.<br />

청구항 31<br />

제 30 항에 있어서, 상기 폐렴연쇄상구균 다당류는 캡슐 타입 3, 4, 6B, 7A, 7C, 7F, 9A, 9L, 9N, 9V, <strong>12</strong>A,<br />

<strong>12</strong>B, <strong>12</strong>F, 14, 15A, 15B, 15C, 15F, 17, 18B, 18C, <strong>19</strong>F, 23F, 25A, 25F, 33F, 35, 37, 38, 44 또는 46인 것을<br />

특징으로 하는 백신 조성물.<br />

청구항 32<br />

제 30 항에 있어서, 상기 야토균 다당류는 O 항원인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.<br />

청구항 33<br />

제 1 항에 있어서, 상기 항원은 미생물 캡슐 중합체인 것을 특징으로 하는 백신 조성물.<br />

청구항 34<br />

제 33 항에 있어서, 상기 미생물 캡슐 중합체는 탄저균의 폴리-감마-D-글루타민산인 것을 특징으로 하는 백신<br />

조성물.<br />

청구항 35<br />

제 1 항에 있어서, 상기 항원은 최소 3개의 원자들을 가지는 단량체들로 구성된 군으로부터 선택되는 유기 중합<br />

체이고, 상기 원자들 각각은 탄소, 산소, 수소, 질소, 인 및 황산으로 구성된 군으로부터 서로 독립적으로 선택<br />

되는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.<br />

청구항 36<br />

제 35 항에 있어서, 상기 유기 중합체는 미생물로부터 유래한 것을 특징으로 하는 백신 조성물.<br />

청구항 37<br />

- 4 -<br />

공개특허 10-2009-0066272

제 35 항에 있어서, 상기 유기 중합체는 자연계에 존재하지 않는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.<br />

청구항 38<br />

제 1 항에 있어서, 상기 백신 조성물은 제2항원을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물,<br />

청구항 39<br />

제 38 항에 있어서, 상기 백신 조성물은 제3항원을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 백신 조성물.<br />

청구항 40<br />

다음의 단계를 포함하는 백신 조성물의 제조방법: (ⅰ) 항원과 수송단백질의 혼합물을 제조하기 위하여 항원<br />

을 수송단백질과 혼합하는 단계 및; (ⅱ) 상기 항원을 수송 단백질에 포획시키는 단계로써 상기 항원의 50% 이<br />

하가 백신 조성물 내에서 상기 수송단백질과 크로스링크 되는 것을 특징으로 하는 단계.<br />

청구항 41<br />

제 40 항에 있어서, 상기 백신 조성물은 약제학적으로 허용가능한 부형제를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로<br />

하는 제조방법.<br />

청구항 42<br />

제 40 항에 있어서, 상기 포획 단계는 상기 항원과 상기 수송단백질을 상기 혼합물로부터 침전시키는 단계를 포<br />

함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.<br />

청구항 43<br />

제 42 항에 있어서, 상기 침전단계는 상기 혼합물의 pH를 변화시키는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방<br />

법.<br />

청구항 44<br />

제 42 항에 있어서, 상기 침전단계는 상기 혼합물에 TCA(trichloroacetic acid) 또는 황산암모늄을 첨가하는 단<br />

계를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.<br />

청구항 45<br />

제 42 항에 있어서, 상기 침전단계는 혼합물 내의 무기염의 농도를 증가시키거나 감소시킴으로써 혼합물의 이온<br />

세기를 변화시키는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.<br />

청구항 46<br />

제 42 항에 있어서, 상기 침전단계는 혼합물을 가열함으로써 수송단백질 또는 항원을 응고시키는 단계를 포함하<br />

는 것을 특징으로 하는 제조방법.<br />

청구항 47<br />

제 42 항에 있어서, 상기 침전단계는 크로스링크를 유발시키기 위해 혼합물에 충분한 양의 이온화 방사선을 조<br />

사하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.<br />

청구항 48<br />

제 40 항에 있어서, 상기 백신 조성물 내에서 상기 항원 대 상기 수송단백질의 몰 비율은 1:10 내지 9:10인 것<br />

을 특징으로 하는 제조방법.<br />

청구항 49<br />

제 40 항에 있어서, 상기 수송단백질은 멀티머인 것을 특징으로 하는 제조방법.<br />

청구항 50<br />

- 5 -<br />

공개특허 10-2009-0066272

제 49 항에 있어서, 상기 멀티머는 적어도 5개의 서브유닛을 가지는 것을 특징으로 하는 제조방법.<br />

청구항 51<br />

제 49 항에 있어서, 상기 멀티머는 호모 멀티머인 것을 특징으로 하는 제조방법.<br />

청구항 52<br />

제 40 항에 있어서, 상기 수송단백질은 비공유 결합으로 연결된 것을 특징으로 하는 제조방법.<br />

청구항 53<br />

제 52 항에 있어서, 상기 비공유 결합은 소수성 상호작용, 이온성 상호작용, 반데르발스 상호작용 또는 수소결<br />

합을 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.<br />

청구항 54<br />

제 40 항에 있어서, 상기 수송단백질은 디프테리아 톡신(diphtheria toxin) 또는 그 변이체, 디프테리아 톡소이<br />

드(diphtheria toxoid), 데타누스 톡신(tetanus toxin) 또는 그 변이체, 테타누스 톡소이드(tetanus toxoid),<br />

녹농균 엑소톡신 A(Pseudomonas aeruginosa exotoxin A) 또는 그 변이체, 콜레라 톡신 B 서브유닛, 테타누스<br />

톡신 절편 C, 박테리아 편모, 뉴몰리신(Pneumolysin), 나이세리아 수막염균(Neisseria menningitidi)의 외막단<br />

백질, 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)의 Hcp1 단백질, 대장균의 이열성 엔테로톡신(enterotoxin), 쉬가-유사<br />

톡신(shiga-like toxin), 인간 LTB 단백질, 리스테리올리신 O(또는 관련 단백질), 총박테리아 세포의 단백질 추<br />

출물, 탄저균(Bacillus anthracis)의 방어항원에 대한 DNI(dominant negative mutant) 또는 대장균 베타-갈락<br />

토시다아제인 것을 특징으로 하는 제조방법.<br />

청구항 55<br />

제 54 항에 있어서, 상기 총박테리아 세포는 녹농균 또는 스트렙토코커스 세포인 것을 특징으로 하는 제조방법.<br />

청구항 56<br />

제 54 항에 있어서, 상기 박테리아 편모는 비브리오 콜레라균(Vibrio cholerae)의 편모 단백질인 것을 특징으로<br />

하는 제조방법.<br />

청구항 57<br />

제 54 항에 있어서, 상기 쉬가(shiga) 유사 톡신은 쉬겔라(Shigella) SltB2 단백질인 것을 특징으로 하는 제조<br />

방법.<br />

청구항 58<br />

제 54 항에 있어서, 상기 수송단백질은 뉴몰리신인 것을 특징으로 하는 제조방법.<br />

청구항 59<br />

제 54 항에 있어서, 상기 수송단백질은 리스테리올리신 O 인 것을 특징으로 하는 제조방법.<br />

청구항 60<br />

제 54 항에 있어서, 상기 수송단백질은 디프테리아 톡신인 것을 특징으로 하는 제조방법.<br />

청구항 61<br />

제 54 항에 있어서, 상기 수송단백질은 디프테리아 톡소이드인 것을 특징으로 하는 제조방법.<br />

청구항 62<br />

- 6 -<br />

공개특허 10-2009-0066272

제 54 항에 있어서, 상기 수송단백질은 테타누스 톡신인 것을 특징으로 하는 제조방법.<br />

청구항 63<br />

제 54 항에 있어서, 상기 수송단백질은 테타누스 톡소이드인 것을 특징으로 하는 제조방법.<br />

청구항 64<br />

제 40 항에 있어서, 상기 항원은 다당류, 폴리알코올 또는 폴리 아미노산인 것을 특징으로 하는 제조방법.<br />

청구항 65<br />

제 64 항에 있어서, 상기 다당류는 적어도 18개 잔기를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.<br />

청구항 66<br />

제 64 항에 있어서, 상기 다당류는 폐렴연쇄상구균 다당류, 야토균 다당류, 탄저균 다당류, 인플루엔자간균 다<br />

당류, 살모넬라 티피 다당류, 살모넬라 종 다당류, 쉬겔라 다당류 또는 나이세리아 수막염균 다당류인 것을 특<br />

징으로 하는 제조방법.<br />

청구항 67<br />

제 66 항에 있어서, 상기 폐렴연쇄상구균 다당류는 캡슐 3, 4, 6B, 7A, 7C, 7F, 9A, 9L, 9N, 9V, <strong>12</strong>A, <strong>12</strong>B,<br />

<strong>12</strong>F, 14, 15A, 15B, 15C, 15F, 17, 18B, 18C, <strong>19</strong>F, 23F, 25A, 25F, 33F, 35, 37, 38, 44 또는 46 타입인 것을<br />

특징으로 하는 제조방법.<br />

청구항 68<br />

제 67 항에 있어서, 상기 야토균 다당류는 O 항원인 것을 특징으로 하는 제조방법.<br />

청구항 69<br />

제 40 항에 있어서, 상기 항원은 미생물 캡슐 단량체인 것을 특징으로 하는 제조방법.<br />

청구항 70<br />

제 69 항에 있어서, 상기 미생물 캡슐 단량체는 탄저균의 폴리-감마-D-글루타민산인 것을 특징으로 하는 제조<br />

방법.<br />

청구항 71<br />

제 40 항에 있어서, 상기 항원은 탄소, 산소, 수소, 질소, 인 및 황산으로 구성된 군으로부터 각각 독립적으로<br />

선택된 적어도 3개 이상의 원자를 가지는 단량체들로 구성된 유기 단량체인 것을 특징으로 하는 제조방법.<br />

청구항 72<br />

제 71 항에 있어서, 상기 유기 단량체는 미생물로부터 유래한 것을 특징으로 하는 제조방법.<br />

청구항 73<br />

제 71 항에 있어서, 상기 유기 단량체는 자연계에 존재하지 않는 것을 특징으로 하는 제조방법.<br />

청구항 74<br />

제 40 항에 있어서, 상기 백신 조성물은 제 2 항원을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.<br />

청구항 75<br />

제 74 항에 있어서, 상기 백신 조성물은 제 3 항원을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.<br />

청구항 76<br />

다음의 단계를 포함하는 백신 조성물의 제조방법: (ⅰ) 항원을 수송단백질과 혼합하는 단계; 및 (ⅱ) 상기 수<br />

- 7 -<br />

공개특허 10-2009-0066272

송 단백질을 크로스링킹 시키는 링커를 첨가하는 단계로써 상기 항원의 50% 이하가 백신 조성물 내에서 수송단<br />

백질과 크로스링크되는 것을 특징으로 하는 단계.<br />

청구항 77<br />

제 76 항에 있어서, 상기 백신 조성물은 약제학적으로 허용가능한 부형제를 추가적으로 포함하는 것을 특징으로<br />

하는 제조방법.<br />

청구항 78<br />

제 76 항에 있어서, 상기 백신 조성물 내에서 상기 항원과 상기 수송단백질의 몰 비율은 1:10 에서 9:10 사이인<br />

것을 특징으로 하는 제조방법.<br />

청구항 79<br />

제 76 항에 있어서, 상기 수송단백질은 멀티머인 것을 특징으로 하는 제조방법.<br />

청구항 80<br />

제 79 항에 있어서, 상기 멀티머는 적어도 5개의 서브유닛을 가지는 것을 특징으로 하는 제조방법.<br />

청구항 81<br />

제 79 항에 있어서, 상기 멀티머는 호모 멀티머인 것을 특징으로 하는 제조방법.<br />

청구항 82<br />

제 76 항에 있어서, 상기 방법은 상기 수송단백질 내에서 쉬프 염기의 환원단계를 포함하는 것을 특징으로 하는<br />

제조방법.<br />

청구항 83<br />

제 76 항에 있어서, 상기 수송단백질은 적어도 1개 이상의 다른 수송단백질과 공유결합 되어있는 것을 특징으로<br />

하는 제조방법.<br />

청구항 84<br />

제 83 항에 있어서, 상기 공유결합은 라이신 측쇄의 1차 아미노기와 아스파르테이트 또는 글루타메이트 측쇄의<br />

카르복실기간의 펩타이드 결합을 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.<br />

청구항 85<br />

제 83 항에 있어서, 상기 공유결합은 이중작용기성 크로스링커를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.<br />

청구항 86<br />

제 85 항에 있어서, 상기 이중작용기성 크로스링커는 글루타르알데히드, 비스[설포닐숙시니미딜]수베레이트 또<br />

는 디메틸아디피미데이트인 것을 특징으로 하는 제조방법.<br />

청구항 87<br />

제 76 항에 있어서, 상기 공유결합은 화학식 의 화합물을 포함하고, 상기 화학식에서 Rn은 탄소수 1<br />

내지 <strong>12</strong>의 선형 또는 분쇄형 알킬, 1 내지 <strong>12</strong>개 원자의 선형 또는 분쇄형 헤테로알킬, 탄소수 2 내지 <strong>12</strong>의 선형<br />

또는 분쇄형 알켄, 탄소수 2 내지 <strong>12</strong>의 선형 또는 분쇄형 알킨, 탄소수 5 내지 10의 방향족 잔기, 3 내지 10개<br />

의 원자의 고리형 시스템, -(CH2CH2O)qCH2CH2-, 상기 q는 1 내지 4 또는 두 개의 알데히드기를 연결하는 화학결합<br />

이다.<br />

청구항 88<br />

- 8 -<br />

공개특허 10-2009-0066272

제 76 항에 있어서, 상기 링커는 글루타르알데히드, m-말레이미도벤조일-N-하이드록시숙시니미드 에스테르, 카<br />

보디이미드 또는 비스-비아조타이즈드 벤지딘인 것을 특징으로 하는 제조방법.<br />

청구항 89<br />

제 76 항에 있어서, 상기 수송단백질은 디프테리아 톡신 또는 그 변이체, 디프테리아 톡소이드, 데타누스 톡신<br />

또는 그 변이체, 테타누스 톡소이드, 녹농균 엑소톡신 A 또는 그 변이체, 콜레라 톡신 B 서브유닛, 테타누스 톡<br />

신 절편 C, 박테리아 편모, 뉴몰리신, 나이세리아 수막염균의 외막단백질, 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)의<br />

Hcp1 단백질, 대장균의 이열성 엔테로톡신, 쉬가-유사 톡신, 인간 LTB 단백질, 리스테리올리신 O(또는 관련 단<br />

백질), 총박테리아 세포의 단백질 추출물, 탄저균의 방어항원에 대한 DNI 또는 대장균 베타-갈락토시다아제인<br />

것을 특징으로 하는 제조방법.<br />

청구항 90<br />

제 89 항에 있어서, 상기 전체 박테리아 세포는 녹농균또는 스트렙토코커스인 것을 특징으로 하는 제조방법.<br />

청구항 91<br />

제 89 항에 있어서, 상기 박테리아 편모는 비브리오 콜레라균의 편모 단백질인 것을 특징으로 하는 제조방법.<br />

청구항 92<br />

제 89 항에 있어서, 상기 쉬가-유사 독소는 쉬겔라 SltB2 단백질인 것을 특징으로 하는 제조방법.<br />

청구항 93<br />

제 76 항에 있어서, 상기 항원은 다당류, 폴리 알코올 또는 폴리 아미노산인 것을 특징으로 하는 제조방법.<br />

청구항 94<br />

제 93 항에 있어서, 상기 다당류는 적어도 18개 이상의 잔기를 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.<br />

청구항 95<br />

제 93 항에 있어서, 상기 다당류는 페렴연쇄구균 다당류, 야토균 다당류, 탄저균 다당류, 인플루엔자간균 다당<br />

류, 살모넬리 티피 다당류, 시겔라 종 다당류 또는 수막구균 다당류인 것을 특징으로 하는 제조방법.<br />

청구항 96<br />

제 66 항에 있어서, 상기 페렴연쇄구균 다당류는 캡슐 타입 3, 4, 6B, 7A, 7C, 7F, 9A, 9L, 9N, 9V, <strong>12</strong>A, <strong>12</strong>B,<br />

<strong>12</strong>F, 14, 15A, 15B, 15C, 15F, 17, 18B, 18C, <strong>19</strong>F, 23F, 25A, 25F, 33F, 35, 37, 38, 44 또는 46인 것을 특징<br />

으로 하는 제조방법.<br />

청구항 97<br />

제 95 항에 있어서, 상기 야토균 다당류는 O 항원인 것을 특징으로 하는 제조방법.<br />

청구항 98<br />

제 76 항에 있어서, 상기 항원은 미생물 캡슐 단량체인 것을 특징으로 하는 제조방법.<br />

청구항 99<br />

제 98 항에 있어서, 상기 미생물 캡슐 단량체는 탄저균의 폴리-감마-D-글루타민산인 것을 특징으로 하는 제조<br />

방법.<br />

청구항 100<br />

제 76 항에 있어서, 상기 항원은 탄소, 산소, 수소, 질소, 인 및 황산으로 구성된 군으로부터 각각 독립적으로<br />

선택된 적어도 3개의 원자를 가지는 단량체들로 구성된 유기 중합체인 것을 특징으로 하는 제조방법.<br />

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공개특허 10-2009-0066272

청구항 101<br />

제 100 항에 있어서, 상기 유기 중합체는 미생물로부터 유래한 것을 특징으로 하는 제조방법.<br />

청구항 102<br />

제 100 항에 있어서, 상기 유기 중합체는 자연계에 존재하지 않는 것을 특징으로 하는 제조방법.<br />

청구항 103<br />

제 76 항에 있어서, 상기 백신 조성물은 제 2 항원을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.<br />

청구항 104<br />

제 103 항에 있어서, 상기 백신 조성물은 제 3 항원을 추가적으로 포함하는 것을 특징으로 하는 제조방법.<br />

청구항 105<br />

대상체에서 항체생성을 유도하기에 충분한 양의 상기 제1항의 백신 조성물을상기 대상체에 투여하는 단계를 포<br />

함하는 감염물에 대한 상기 대상체의 백신화 방법.<br />

청구항 106<br />

제 105 항에 있어서, 상기 방법은 제 2 차 투여단계를 포함하며, 상기 대상체에서 항체생성을 부스팅 시키기에<br />

충분한 양의 상기 제1항의 백신조성물을 상기 대상체에 투여하는 것을 특징으로 하는 백신화 방법.<br />

청구항 107<br />

제 106 항에 있어서, 상기 항체의 생성은 T-세포 의존성인 것을 특징으로 하는 방법.<br />

청구항 108<br />

제 105 항에 있어서, 상기 항체의 생성은 상기 대상체이 감염성 물질에 의한 감염을 막거나 감소시키기에 충분<br />

한 양의 항체의 생산인 것을 특징으로 하는 백신화 방법.<br />

청구항 109<br />

제 105 항에 있어서, 상기 감염물질은 페렴연쇄구균, B형 인플루엔자간균, 녹농균, 야토균, 시겔라 종, 살모넬<br />

라 종, 아시네토박터 종, 버크홀데리아 종 및 대장균인 것을 특징으로 하는 백신화 방법.<br />

청구항 110<br />

제 105 항에 있어서, 상기 접종방법은 제 2 백신 조성물을 상기 대상체이 항체생산을 부스팅시키기에 충분한<br />

양만큼 제 2 투여를 하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 백신화 방법.<br />

청구항 111<br />

제 110항에 있어서, 상기 항체의 생산은 상기 대상체이 제2차 감염성 물질에 의한 감염을 막거나 감소시키기에<br />

충분한 양의 항체의 생산인 것을 특징으로 하는 백신화 방법.<br />

청구항 1<strong>12</strong><br />

제 105 항 또는 제 110 항에 있어서, 상기 항체는 IgG 항체인 것을 특징으로 하는 백신화 방법.<br />

청구항 113<br />

제 105 항에 있어서, 상기 대상체는 인간인 것을 특징으로 하는 백신화 방법.<br />

명 세 서<br />

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공개특허 10-2009-0066272

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기 술 분 야<br />

본 출원은 2006년 8월 7일자 출원된 미국 가출원 60/835,944, 2007년 6월 8일자 출원된 60/933,764에 대하여<br />

우선권을 주장하며, 이들 출원의 명세서는 본 명세서에 참조로서 삽입된다.<br />

본 발명은 NIH(National Institutes of Health)에서 허여된 U54AI057159 하에서의 정부 지원으로 이루어진 것<br />

이다. 정부는 본 발명에 대하여 권리를 갖는다.<br />

본 발명은 백신 조성물, 백신의 제조방법 및 백신 투여방법에 관한 것이다.<br />

배 경 기 술<br />

많은 항원들, 특히 병원균의 캡슐 레이어와 연관된 항원들은 면역반응을 거의 또는 전혀 촉진시키지 않음으로써<br />

이러한 항원들에 대한 효과적인 항체 개발은 어려움을 겪었다. 캡슐은 전형적으로 탄수화물, 아미노산 또는<br />

알콜 등의 유기물 중합체로 구성된 미생물의 표면 성분을 말한다. 캡슐은 화학적으로 매우 다양하다. 캡슐<br />

을 이루는 단일 유니트(예 : 탄수화물)는 다양한 분자 배열속에서 연결될 수 있고, 인, 질소, 황 및 다른 화학<br />

적 변형물들로 치환될 수 있다. 이러한 화학적 다양성으로 인해 캡슐은 미생물 표면의 수많은 항원 타겟을 제<br />

공함으로써 이러한 타겟에 대한 숙주의 면역체계를 피해갈 수 있다. 캡슐은 또한 미생물이 숙주의 대식세포<br />

(macrophage)나 다형핵 백혈구(polymorphonuclear leukocyte)의 식균 작용에 의해 죽는 것을 막는 독성 요소일<br />

수도 있다. 캡슐에 대한 항체는 캡슐로 둘러싸인 유기체를 그 표면에 보체를 고정시켜 숙주 면역세포가 라이<br />

시스, 옵소닌 작용, 흡수, 식세포작용을 하게 함으로써 강력한 방어를 한다. 캡슐에 대한 가장 강력한 항체는<br />

Ig G 항체이다. 유효 수준의 Ig G 를 유도하지 못하는 캡슐을 T-비의존성 항원(T-independent antigen)이라<br />

한다. 단백질과 캡슐간의 공유결합이 이들 항원을 T-비의존성으로 만들며, 이러한 항원은 Ig G의 반응을 이끌<br />

어낼 수 있다.<br />

따라서 Ig G의 강력한 면역반응을 유도하지 않는 캡슐이나 다른 T-비의존성 항원에 대한 안전하고 합성이 쉬우<br />

며 저렴한 백신에 대한 요구가 절실하다. 이러한 백신은 탄저열, 폐렴쌍구균, B형 독감, 수막염 및 연쇄구균<br />

과 같은 다양한 감염성 질병에 대한 보호를 위해 필요하다.<br />

발명의 상세한 설명<br />

본 발명은 수송단백질에 포획된 항원을 포함하는 백신 조성물, 상기 백신의 제조방법 및 백신의 투여방법에 관<br />

한 것이다.<br />

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 항원과 수송단백질을 포함하는 백신조성물을 제공한다. 상기 백신조성<br />

물은 (i) 50 % 이하의 항원만이 수송단백질과 크로스링크되며, (ii) 항원은 수송단백질에 포획되어 복합체를 이<br />

룬다.<br />

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 복합체는 10 nm 내지 100 μm 사이의 직경을 가진다. 본 발명의 보<br />

다 바람직한 구현P에 따르면, 상기 복합체는 100 nm 내지 100 μm 사이의 직경을 가진다. 본 발명의 보다 더<br />

바람직한 구현예에 따르면, 상기 복합체는 10 nm 내지 10 μm 사이의 직경을 가진다.<br />

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 복합체는 포유류에 투여되었을 때 T-세포 의존성 면역반응을 나타내<br />

는 것을 특징으로 한다.<br />

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 항원과 수송단백질의 몰 비율은 1:10 내지 10:1 이다. 본 발명의 바람직<br />

한 구현예에 따르면, 수송단백질은 멀티머, 예를 들어 최소 5개의 서브유닛을 가지는 구현예에 따르면, 항원과<br />

수송단백질의 몰 비율은 상기 복합체는 10 nm 내지 100 μm 사이의 직경을 가진다. 본 발명의 바람직한 구현예<br />

에 따르면 상기 멀티머는 호모 멀티머이다.<br />

본 발명의 보다 바람직한 구현예에 따르면 상기 수송단백질은 적어도 한 개 의 다른 수송단백질을과 공유 결합<br />

을 한다. 보다 더 바람직하게는 상기 공유결합은 라이신 측쇄의 1차 아미노기와 아스파르테이트 또는 글루타민<br />

산 측쇄의 카르복실기 사이에서의 펩타이드 결합을 포함한다.<br />

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 공유결합은 화학식 를 가지는 물질을 포함하고, Rn은 탄<br />

소 1개 내지 <strong>12</strong>개로 구성된 선형 또는 분쇄형 알킬, 1개 내지 <strong>12</strong>개의 원자로 구성된 선형 또는 분쇄형 헤테로알<br />

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공개특허 10-2009-0066272

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킬, 2개 내지 <strong>12</strong>개의 탄소원자로 구성된 선형 또는 분쇄형 알켄, 2개 내지 <strong>12</strong>개의 탄소원자로 구성된 선형 또는<br />

분쇄형 알킨, 5개 내지 10개의 탄소로 구성된 방향족 잔기, 3개 내지 10개의 원자로 구성된 고리형 잔기,<br />

-(CH2CH2O)qCH2CH2- (q는 1내지 4의 정수), 또는 두 개의 알데히드기를 연결하는 화학결합이다.<br />

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면 상기 공유 결합은 글루타르알데히드, m-말레이미도벤조일-N-하이드록시숙<br />

시니미드 에스테르, 카보디이미드 또는 비스-비아조타이즈드 벤지딘을 포함한다.<br />

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 공유결합은 이중작용기성 크로스링커를 포함한다.<br />

보다 바람직하게는 상기 이중작용기성 크로스링커는 글루타르알데히드, 비스[설포닐숙시니미딜]수베레이트 또는<br />

디메틸아디피미데이트이다.<br />

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 수송단백질은 비공유 결합으로 링크된 것이다.<br />

보다 바람직하게는 상기 비공유 결합은 소수성 상호작용, 이온 상호작용 반데르발스 상호작용 또는 수소결합을<br />

포함한다.<br />

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 수송단백질은 디프테리아 톡신(diphtheria toxin) 또는 그 변이체,<br />

데타누스 톡신(tetanus toxin)또는 그 변이체, 테타누스 톡소이드(tetanus toxoid) 또는 그 변이체, 녹농균 엑<br />

소톡신 A(Pseudomonas aeruginosa exotoxin A) 또는 그 변이체, 콜레라 톡신 B 서브유닛, 테타누스 톡신<br />

C절편, 박테리아 편모, 뉴몰리신(Pneumolysin), 리스테리올리신O (listeriolysin O) 나이세리아 수막염균<br />

(Neisseria menningitidi)의 외막단백질, 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)의 Hcp1 단백질, 대장균의 내열성 엔<br />

테로톡신(enterotoxin), 쉬가 유사 톡신(shiga-like toxin), 인간 LTB 단백질, 전체 박테리아 세포에서 추출한<br />

단백질, 탄저균(Bacillus anthracis)의 방어적 항원에 대한 DNI(dominant negative mutant) 또는 대장균 베타-<br />

갈락토시다아제이다.<br />

본 발명의 보다 바람직한 구현예에 따르면, 상기 수송단백질은 뉴몰리신, 리스테리오신 O, 디프테리아 톡신, 디<br />

프테리아 톡소이드, 테타누스 톡신, 또는 테타누스 톡소이드이다.<br />

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 항원은 다당류, 폴리알콜 또는 폴리 아미노산이다.<br />

보다 바람직하게는 상기 다당류는 적어도 18개 이상의 잔기를 포함한다.<br />

본 발명의 보다 바람직한 구현예에 따르면 상기 다당류는 폐렴연쇄상구균(Streptococcus pneumoniae)의 다당류,<br />

야토균(Francisella tularensis) 다당류, 탄저균(Bacillus anthracis) 다당류, 인플루엔자간균(Haemophilus<br />

influenzae) 다당류, (Salmonella typhi) 다당류, 살모넬라 종 다당류, 쉬겔라(Shigella) 다당류 또는 나이세<br />

리아 수막염균(Neisseria meningitidis) 다당류이다.<br />

본 발명의 보다 더 바람직한 구현예에 따르면 상기 폐렴연쇄상구균의 다당류는 타입 1-48, 예를 들어 캡슐 3,<br />

4, 6B, 7A, 7C, 7F, 9A, 9L, 9N, 9V, <strong>12</strong>A, <strong>12</strong>B, <strong>12</strong>F, 14, 15A, 15B, 15C, 15F, 17, 18B, 18C, <strong>19</strong>F, 23F, 25A,<br />

25F, 33F, 35, 37, 38, 44 또는 46 타입이다.<br />

본 발명의 보다 더 바람직한 구현예에 따르면 상기 야토균(Francisella tularensis) 다당류는 O 항원이다.<br />

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면 상기 항원은 미생물 캡슐 중합체이다.<br />

보다 바람직하게는 상기 미생물 캡슐 단량체는 탄저균(Bacillus anthracis)의 폴리-감마-D-글루타민산이다.<br />

본 발명의 보다 바람직한 구현예에 따르면 상기 항원은 탄소, 산소, 수소, 질소, 인 및 황산으로 구성된 군으로<br />

부터 각각 독립적으로 선택된 적어도 3개 이상의 원자를 가지는 단량체들로 구성된 유기 중합체이다.<br />

보다 바람직하게는 상기 유기 중합체는 미생물로부터 유래한 것이다.<br />

보다 바람직하게는 상기 유기 중합체는 자연계에 존재하지 않는 것이다.<br />

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면 상기 백신 조성물은 제 2 항원을 추가적으로 포함한다.<br />

보다 바람직하게는 상기 백신 조성물은 제 2 항원을 추가적으로 포함한다.<br />

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 백신 조성물의 제조방법을 제공한다.<br />

(a) 항원을 수송단백질과 혼합하여 혼합물을 만드는 단계 및;<br />

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공개특허 10-2009-0066272

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(b) 상기 항원을 수송 단백질에 포획시키는 단계로써 상기 항원의 50 % 이하가 백신 조성물내에서 수송단백질과<br />

크로스링크되는 것을 특징으로 하는 단계.<br />

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면 상기 백신 조성물은 약제학적으로 허용가능한 부형제를 추가적으로 포함한<br />

다.<br />

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 포획 단계는 상기 항원과 상기 수송단백질을 상기 혼합물로부터 침<br />

전시키는 단계를 포함한다.<br />

본 발명의 보다 바람직한 구현예에 따르면, 상기 침전단계는 상기 혼합물내에서 pH가 변화하거나, 상기 혼합물<br />

에 TCA(trichloroacetic acid) 또는 황산암모늄을 첨가하거나, 혼합물 내의 무기염의 농도를 증가시키거나 감소<br />

시킴으로써 혼합물의 이온세기를 변화시키거나, 혼합물을 가열함으로써 수송단백질 또는 항원을 응고시키거나,<br />

크로스링크를 유발시키기 위해 혼합물에 충분한 양의 이온화 방사선을 조사하는 단계를 포함한다.<br />

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 백신 조성물 내에서 상기 항원과 상기 수송단백질의 몰 비율은 1:10<br />

내지는 9:10 사이이다.<br />

본 발명의 보다 바람직한 구현예에 따르면, 상기 수송단백질은 멀티머이다.<br />

본 발명의 보다 더 바람직한 구현예에 따르면, 상기 멀티머는 적어도 5개의 서브유닛을 가진다.<br />

보다 바람직하게는 상기 멀티머는 호모 멀티머이다.<br />

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 수송단백질은 비공유 결합으로 연결된 것이다.<br />

본 발명의 보다 바람직한 구현예에 따르면, 상기 비공유 결합은 소수성 상호작용, 이온 상호작용, 반데르발스<br />

상호작용 또는 수소결합을 포함한다.<br />

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 수송단백질은 디프테리아 톡신(diphtheria toxin) 또는 그 변이체,<br />

데타누스 톡신(tetanus toxin)또는 그 변이체, 테타누스 톡소이드(tetanus toxoid) 또는 그 변이체, 녹농균 엑<br />

소톡신 A(Pseudomonas aeruginosa exotoxin A) 또는 그 변이체, 콜레라 톡신 B 서브유닛, 테타누스 톡신<br />

C절편, 박테리아 편모, 뉴몰리신(Pneumolysin), 리스테리올리신O (listeriolysin O) 나이세리아 수막염균<br />

(Neisseria menningitidi)의 외막단백질, 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)의 Hcp1 단백질, 대장균의 내열성 엔<br />

테로톡신(enterotoxin), 쉬가 유사 톡신(shiga-like toxin), 인간 LTB 단백질, 전체 박테리아 세포에서 추출한<br />

단백질, 탄저균(Bacillus anthracis)의 방어적 항원에 대한 DNI(dominant negative mutant) 또는 대장균 베타-<br />

갈락토시다아제이다.<br />

보다 바람직하게는 상기 수송단백질은 뉴몰리신, 리스테리오신 O, 디프테리아 톡신, 디프테리아 톡소이드, 테타<br />

누스 톡신, 또는 테타누스 톡소이드이다.<br />

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 항원은 다당류, 폴리알콜 또는 폴리 아미노산이다.<br />

보다 바람직하게는 상기 다당류는 적어도 18개 이상의 잔기를 포함한다.<br />

본 발명의 보다 바람직한 구현예에 따르면 상기 다당류는 폐렴연쇄상구균(Streptococcus pneumoniae)의 다당류,<br />

야토균(Francisella tularensis) 다당류, 탄저균(Bacillus anthracis) 다당류, 인플루엔자간균(Haemophilus<br />

influenzae) 다당류, (Salmonella typhi) 다당류, 살모넬라 종 다당류, 쉬겔라(Shigella) 다당류 또는 나이세<br />

리아 수막염균(Neisseria meningitidis) 다당류이다.<br />

본 발명의 보다 더 바람직한 구현예에 따르면 상기 폐렴연쇄상구균의 다당류는 타입 1-48, 예를 들어 캡슐 3,<br />

4, 6B, 7A, 7C, 7F, 9A, 9L, 9N, 9V, <strong>12</strong>A, <strong>12</strong>B, <strong>12</strong>F, 14, 15A, 15B, 15C, 15F, 17, 18B, 18C, <strong>19</strong>F, 23F, 25A,<br />

25F, 33F, 35, 37, 38, 44 또는 46 타입이다.<br />

본 발명의 보다 더 바람직한 구현예에 따르면 상기 야토균(Francisella tularensis) 다당류는 O 항원이다.<br />

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면 상기 항원은 미생물 캡슐 중합체이다.<br />

보다 바람직하게는 상기 미생물 캡슐 단량체는 탄저균(Bacillus anthracis)의 폴리-감마-D-글루타민산이다.<br />

본 발명의 보다 바람직한 구현예에 따르면 상기 항원은 탄소, 산소, 수소, 질소, 인 및 황산으로 구성된 군으로<br />

부터 각각 독립적으로 선택된 적어도 3개 이상의 원자를 가지는 단량체들로 구성된 유기 중합체이다.<br />

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공개특허 10-2009-0066272

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보다 바람직하게는 상기 유기 중합체는 미생물로부터 유래한 것이다.<br />

보다 바람직하게는 상기 유기 중합체는 자연계에 존재하지 않는 것이다.<br />

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면 단계(i)에서의 혼합과정은 제 2 항원 추가적으로, 나아가 제 3 항원을 추<br />

가적으로 포함한다.<br />

보다 바람직하게는 상기 백신 조성물은 제 2 항원을 추가적으로 포함한다.<br />

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 백신 조성물의 제조방법을 제공한다.<br />

(a) 항원을 수송단백질과 혼합하여 혼합물을 만드는 단계 및;<br />

(b) 상기 수송 단백질과 크로스 링크하는 링커를 첨가하는 단계로써 상기 항원의 50 % 이하가 백신 조성물 내에<br />

서 수송단백질과 크로스링크되는 것을 특징으로 하는 단계.<br />

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면 상기 백신 조성물은 약제학적으로 허용가능한 부형제를 추가적으로 포함한<br />

다.<br />

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면 상기 백신 조성물 내에서 상기 항원과 상기 수송단백질의 몰 비율은 1:10<br />

에서 9:10 사이이다.<br />

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면 상기 수송단백질은 멀티머이다.<br />

보다 바람직하게는, 상기 멀티머는 적어도 5개의 서브유닛을 가진다.<br />

보다 바람직하게는, 상기 멀티머는 호모 멀티머이다.<br />

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면 상기 방법은 상기 수송단백질 내에서 쉬프 염기의 환원단계를 포함한다.<br />

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 수송단백질은 적어도 1개 이상의 다른 수송단백질과 공유결합 되어<br />

있다.<br />

보다 바람직하게는, 상기 공유결합은 라이신 측쇄의 1차 아미노기와 아스파르테이트 또는 글루타메이트 측쇄의<br />

카르복실기간의 펩타이드 결합을 포함한다.<br />

보다 바람직하게는, 상기 공유결합은 이중작용기성 크로스링커를 포함한다.<br />

보다 더 바람직하게는제 상기 이중작용기성 크로스링커는 글루타르알데히드, 비스[설포닐숙시니미딜]수베레이트<br />

또는 디메틸아디피미데이트이다.<br />

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면 상기 링커는 화학식 를 가지는 물질을 포함하고; Rn은 탄소 1개<br />

내지 <strong>12</strong>개로 구성된 선형 또는 분쇄형 알킬, 1개 내지 <strong>12</strong>개의 원자로 구성된 선형 또는 분쇄형 헤테로알킬, 2개<br />

내지 <strong>12</strong>개의 탄소원자로 구성된 선형 또는 분쇄형 알켄, 2개 내지 <strong>12</strong>개의 탄소원자로 구성된 선형 또는 분쇄형<br />

알킨, 5개 내지 10개의 탄소로 구성된 방향족 잔기, 3개 내지 10개의 원자로 구성된 고리형 잔기,<br />

-(CH2CH2O)qCH2CH2- (q는 1-4), 또는 두 개의 알데히드기를 연결하는 화학결합이다.<br />

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면 상기 링커는 글루타르알데히드, m-말레이미도벤조일-N-하이드록시숙시니미<br />

드 에스테르, 카보디이미드 또는 비스-비아조타이즈드 벤지딘을 포함한다.<br />

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 수송단백질은 디프테리아 톡신(diphtheria toxin) 또는 그 변이체,<br />

데타누스 톡신(tetanus toxin)또는 그 변이체, 테타누스 톡소이드(tetanus toxoid) 또는 그 변이체, 녹농균 엑<br />

소톡신 A(Pseudomonas aeruginosa exotoxin A) 또는 그 변이체, 콜레라 톡신 B 서브유닛, 테타누스 톡신<br />

C절편, 박테리아 편모, 뉴몰리신(Pneumolysin), 리스테리올리신O (listeriolysin O) 나이세리아 수막염균<br />

(Neisseria menningitidi)의 외막단백질, 녹농균(Pseudomonas aeruginosa)의 Hcp1 단백질, 대장균의 내열성 엔<br />

테로톡신(enterotoxin), 쉬가 유사 톡신(shiga-like toxin), 인간 LTB 단백질, 전체 박테리아 세포에서 추출한<br />

단백질, 탄저균(Bacillus anthracis)의 방어적 항원에 대한 DNI(dominant negative mutant) 또는 대장균 베타-<br />

갈락토시다아제이다.<br />

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 항원은 다당류, 폴리알콜 또는 폴리 아미노산이다.<br />

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보다 바람직하게는 상기 다당류는 적어도 18개 이상의 잔기를 포함한다.<br />

본 발명의 보다 바람직한 구현예에 따르면 상기 다당류는 폐렴연쇄상구균(Streptococcus pneumoniae)의 다당류,<br />

야토균(Francisella tularensis) 다당류, 탄저균(Bacillus anthracis) 다당류, 인플루엔자간균(Haemophilus<br />

influenzae) 다당류, (Salmonella typhi) 다당류, 살모넬라 종 다당류, 쉬겔라(Shigella) 다당류 또는 나이세<br />

리아 수막염균(Neisseria meningitidis) 다당류이다.<br />

본 발명의 보다 더 바람직한 구현예에 따르면 상기 폐렴연쇄상구균의 다당류는 타입 1-48, 예를 들어 캡슐 3,<br />

4, 6B, 7A, 7C, 7F, 9A, 9L, 9N, 9V, <strong>12</strong>A, <strong>12</strong>B, <strong>12</strong>F, 14, 15A, 15B, 15C, 15F, 17, 18B, 18C, <strong>19</strong>F, 23F, 25A,<br />

25F, 33F, 35, 37, 38, 44 또는 46 타입이다.<br />

본 발명의 보다 더 바람직한 구현예에 따르면 상기 야토균(Francisella tularensis) 다당류는 O 항원이다.<br />

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면 상기 항원은 미생물 캡슐 중합체이다.<br />

보다 바람직하게는 상기 미생물 캡슐 단량체는 탄저균(Bacillus anthracis)의 폴리-감마-D-글루타민산이다.<br />

본 발명의 보다 바람직한 구현예에 따르면 상기 항원은 탄소, 산소, 수소, 질소, 인 및 황산으로 구성된 군으로<br />

부터 각각 독립적으로 선택된 적어도 3개 이상의 원자를 가지는 단량체들로 구성된 유기 중합체이다.<br />

보다 바람직하게는 상기 유기 중합체는 미생물로부터 유래한 것이다.<br />

보다 바람직하게는 상기 유기 중합체는 자연계에 존재하지 않는 것이다.<br />

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면 단계(i)에서의 혼합과정은 제 2 항원 또는 추가적으로 나아가 제 3 항원을<br />

추가적으로 포함한다.<br />

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 백신 조성물을 대상체의 항체생산을 유도하기에 충분한 양만큼 상기 대<br />

상체에 투여하는 단계를 포함하는 감염된 시료에 대한 백신화 방법을 제공한다.<br />

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면 상기 백신화 방법은 백신조성물을 상기 대상체가 항체생산을 부스팅시키기<br />

에 충분한 양만큼 제 2 투여를 하는 단계를 포함한다.<br />

보다 바람직하게는 상기 항체의 생산은 T-세포 의존성이다.<br />

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 상기 항체의 생산은 상기 대상체의 감염성 물질에 의한 감염을 막거나 감<br />

소시키기에 충분한 양의 항체의 생산이다.<br />

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면 상기 감염물질은 페렴연쇄구균(pneumococcus), B형 인플루엔자간균<br />

(Haemophilus influenzae type B), 녹농균(Pseudomonas aeruginosa),야토균(Francisella tularensis), 시겔라<br />

(Shigella)종, 살모넬라 종(Salmonella species), 아시네토박터 종(Acinetobacter species), 버크홀데리아 종<br />

(Burkholderia species) 또는 대장균이다.<br />

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면 상기 백신화 방법은 제 2 백신조성물을 상기 대상체가 항체생산을 부스팅<br />

시키기에 충분한 양만큼 제 2 투여를 하는 단계를 포함한다.<br />

바람직하게는 상기 항체의 생산은 상기 대상체가 제 2 감염성 물질에 의한 감염을 막거나 감소시키기에 충분한<br />

양의 항체의 생산이다.<br />

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면 상기 항체는 면멱글로불린 G 항체이다.<br />

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면 상기 대상체는 인간이다.<br />

본 발명의 모든 양태에 대한 바람직한 구현예에 따르면, 폐렴연쇄상구균 다당류는 Kong 등이 서술한 캡슐 타입<br />

중의 하나이다(J. Med. Microbiol. 54:35-356 (2005)). 예를 들면, 폐렴연쇄상구균 다당류는 바람직하게는<br />

타입 1 (예를 들어, 1-g or 1-q), 2 (예를 들어, 2-g, 2-q, 또는 2-41 A), 3 (예를 들어, 3-g, 3-q, 3-c, 또는<br />

3-nz), 4, 5 (예를 들어, 5-q, 5-c, 5-qap, 또는 5-g), 6A (예를 들어, 6A-g, 6A-cl, 6A-c2, 6A-n, 6A-qap,<br />

6A-6B-g, 6A-6B-q, 또는 6A-6B-s), 6B (예를 들어, 6B-c, 6A-6B-g, 6A-6B- q, 또는 6A-6B-s), 7F (예를 들어,<br />

7F-7A), 7A (예를 들어, 7A-cn 또는 7F-7A), 7B (예를 들어, 7B-40), 7C (예를 들어, 7C-<strong>19</strong>C-24B), 8 (예를 들<br />

어, 8-g 또는 8-s), 9A (예를 들어, 9A-9V), 9L, 9N, 9V (예를 들어, 9A-9V), 9V and 14, 1OF (예를 들어,<br />

10F-q, lOF-ca, 또는 lOF-lOC), 1OA (예를 들어, 10A-17A 또는 10A-23F), 1OB (예를 들어, lOB-lOC), HF, l lA<br />

(예를 들어, l lA-nz 또는 11A-11D-18F), HB (예를 들어, 1 IB-11C), HC (예를 들어, 1 IB-11C 또는 HC-cn),<br />

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공개특허 10-2009-0066272

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HD (예를 들어, 11A-11D-18F), <strong>12</strong>F (예를 들어, <strong>12</strong>F-q 또는 <strong>12</strong>F-<strong>12</strong>A-<strong>12</strong>B), <strong>12</strong>A (예를 들어, <strong>12</strong>A-cn, <strong>12</strong>A-46,<br />

또는 <strong>12</strong>F-<strong>12</strong>A-<strong>12</strong>B), <strong>12</strong>B (예를 들어, <strong>12</strong>F-<strong>12</strong>A-<strong>12</strong>B), 13 (예를 들어, 13-20), 14(예를 들어, 14-g, 14-q, 14-v,<br />

또는 14-c), 15F (예를 들어, 15F-cnl 또는 15F-cn2), 15A (예를 들어, 15A-cal, 15A-ca2, 또는 l5A-chw), 15B<br />

(예를 들어, 15B-C, 15B-15C, 15B-15C-22F-22A), 15C (예를 들어, 15C- ca, 15C-ql, 15C-q2, 15C-q3, 15C-S,<br />

15B-15C, 또는 15B-15C-22F-22A), 16F (예를 들어, 16F-q 또는 16F-nz), 16A, 17F (예를 들어, 17F-n and 17F-<br />

35B-35C-42), 17A (예를 들어, 17A-ca 또는 10A-17A), 18F (예를 들어, 18F-ca, 18F-W, 또는 1 IA-I ID- 18F),<br />

18A (예를 들어, 18A-nz 또는 18A-q), 18B (예를 들어, 18B-18C), 18C (예를 들어, 18B-18C), <strong>19</strong>F (예를 들어,<br />

<strong>19</strong>F-gl, <strong>19</strong>F-g2, <strong>19</strong>F-g3, <strong>19</strong>F-q, <strong>19</strong>F-n, 또는 <strong>19</strong>F-C), <strong>19</strong>A (예를 들어, <strong>19</strong>A-g, <strong>19</strong>A-, 또는 <strong>19</strong>A-ca), <strong>19</strong>B, <strong>19</strong>C<br />

(예를 들어, <strong>19</strong>C-cnl, <strong>19</strong>C-cn2, 또는 7C- <strong>19</strong>C-24B), 20 (예를 들어, 13-20), 21 (예를 들어, 21-ca 또는 21-<br />

cn), 22F (예를 들어, 15B-15C-22F-22A), 23F (예를 들어, 23F-C, 10A-23F, 또는 23F-23A), 23B (예를 들어,<br />

23B-C 또는 23B-q), 24F (예를 들어, 24F-cnl, 24F- cn2, 또는 24F-cn3), 24A, 24B (예를 들어, 7C-<strong>19</strong>C-24B),<br />

25F (예를 들어, 25F-38), 25A, 27, 28F (예를 들어, 28F-28A 또는 28F-cn), 28A (예를 들어, 28F-28A), 29<br />

(예를 들어, 29-ca 또는 29-q), 31, 32F (예를 들어, 32F- 32A), 32A (예를 들어, 32A-cn 또는 32F-32A), 33F<br />

(예를 들어, 33F-g, 33F-q, 33F-chw, 33F-33B, 또는 33F-33A-35A), 33A (예를 들어, 33F-33A-35A), 33B (예를<br />

들어, 33B-q, 33B-s, 또는 33F-33B), 33D, 34 (예를 들어, 34-ca 또는 34s), 35F (예를 들어, 35F-47F), 35A<br />

(예를 들어, 33F-33A-35A), 35B (예를 들어, 17F- 35B-35C-42), 36, 37 (예를 들어, 37-g 또는 37-ca), 38 (예<br />

를 들어, 25F-38), 39 (예를 들어, 39-cnl 또는 39-cn2), 40 (예를 들어, 7B-40), 41F (예를 들어, 41F-cn 또<br />

는 41F-s), 41A (예를 들어, 2-41A), 42 (예를 들어, 17B-35B-35C- 42), 43, 44, 45, 46 (예를 들어, 46-s 또<br />

는 <strong>12</strong>A-46), 47F (예를 들어, 35F-47F), 47 A, 48 (예를 들어, 48-cnl 또는 48-cn2), 또는 Genebank 접근번호<br />

AF532714 또는 AF532715이다.<br />

본 명세서에서 "투여(administering)"는 대상체에 면역반응을 유발시키는데 충분한 양의 백신을 제공하는 것을<br />

말하며, 면역반응이란 백신에 포함된 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하는 것을 말한다. 투여는 바람<br />

직하게는 적합한 면역 보조제와 함께 근육내 주사, 피내 주사, 경피성 주사를 포함하고, 바람직하게는적합한 면<br />

역 보조제의 투여도 포함한다. 투여는 백신의 단일 투여 또는 다중투여를 포함할 수 있다. 바람직하게는,<br />

대상체에서 항체의 부스팅을 유발하여 감염성 물질에 의한 감염을 막기 위해 2차 투여가 계획된다.<br />

백신 투여의 빈도 및 양은 백신의 고유의 활성에 의해 좌우되며, 관례적인 실험에 의해 쉽게 결정된다.<br />

본 명세서에서 "크로스링크(cross-link)"는 두개의 분자, 고분자, 분자들의 조합 간의 공유결합의 형성을 의미<br />

한다. 예를 들어 각각 1개 또는 2개의 다른 분자와 공유결합을 형성할 수 있는 작용기가 동일 분자 내에 2개<br />

가 존재하는 수송단백질- "zero-length" 링커를 사용하여 직접 결합하거나, 제3의 분자, 즉 화학적 링커를 사용<br />

하는- (이는 중합체 주위를 감싸는 루프(loop)를 형성할 수 있다). 예시적인 링커는 두 개의 수송단백질을<br />

크로스링크 시킬 수 있는 이중작용기성 링커가 포함된다. 크로스링킹은 항원과 수송단백질 사이에서 일어날<br />

수도 있다.<br />

본 명세서에서 "항원(antigen)"은 항체나 항체 절편에 의해 특이적으로 결합되는 여하한 분자 또는 분자들의 조<br />

합을 말한다.<br />

본 명세서에서 "이중작용기성 링커(bifunctional linker)" 는 각각 분리된 두 분자, 원자, 분자들의 집합 간의<br />

공유결합을 형성할 수 있는 작용기를 2개 가진 물질을 말한다. 예시적인 이중작용기성 링커는 G. T.<br />

Hermanson (Bioconjugate Techniques, Academic Press, <strong>19</strong>96)와 Dick 과 Beurret (Conjugate Vaccines.<br />

Contribu. Microbiol. Immunol. Karger, Basal 10:48-114 (<strong>19</strong>89))에 의해 기술되었다. 바람직하게는 이중작<br />

용기성 링커는 그루타르알데히드, 비스[설포숙시니미딜]수베레이트 (bis[sulfosuccinimidyl]suberate) 또는 디<br />

메틸 아디피미데이트(dimethyl adipimidate)이다.<br />

본 명세서에서 "링커(linker)"는 두 개 이상의 분자들을 공유 결합시키는 화합물 또는 화학결합을 말한다. 바<br />

람직하게는 링커는 글루타르알데히드 또는 화학식 의 화합물로서, 상기 화학식에서 Rn은 탄소수 1 내<br />

지 <strong>12</strong>의 선형 또는 분쇄형 알킬, 1 내지 <strong>12</strong>개 원자의 선형 또는 분쇄형 헤테로알킬, 탄소수 2 내지 <strong>12</strong>의 선형<br />

또는 분쇄형 알켄, 탄소수 2 내지 <strong>12</strong>의 선형 또는 분쇄형 알킨, 탄소수 5 내지 10의 방향족 잔기, 3 내지 10개<br />

의 원자의 고리형 시스템, -(CH2CH2O)qCH2CH2-, 상기 q는 1 내지 4 또는 두 개의 알데히드기를 연결하는 화학결합<br />

이다. 링킹은 링킹 분자 없이 직접적으로 일어날 수 있다. 예를 들면, 단백질의 카르복시기는 카보디이미드<br />

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공개특허 10-2009-0066272

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를 화학적으로 또는 상기한 종류의 크로스링크를 촉진시키는 트랜스글루타미다제 (transglutamidase)를 이용하<br />

여 효소적으로 아미노기와 직접 링크될 수 있다.<br />

본 명세서에서 "항체 생성의 부스팅(boost the production of antibodies)"은 항원에 대한 이차 노출 동안에<br />

나타나는 메모리 B-세포의 활성화를 말하며, 이는 “부스터 반응”이라 불리고, 장기간 “이차” 메모리 면역반<br />

응의 지표가 되며 항체의 장기간 생성을 초래한다.<br />

본 명세서에서 "수송단백질(carrier protein)" 은 자기 자신에 대해 또는 수송단백질과 복합체를 이루는 항원에<br />

대한 면역반응을 유발하는 백신에 사용되는 단백질을 말한다. 바람직하게는, 상기 항원은 복합체 내에서 포획<br />

되어 수송단백질과 비공유 결합을 이룬다. 그러나, 항원과 수송단백질은 서로 공유결합 할 수도 있다. 바람<br />

직하게는, 수송단백질은 T-세포가 인식하는 에피토프를 포함한다. 수송단백질에는 분쇄형 펩타이드인 다중 항<br />

원성 펩타이드 [multi-antigepeptide (MAP)]가 포함된다. 바람직하게는 MAP는 라이신을 포함한다. 예시적인<br />

바람직한 수송단백질은 디프테리아 톡신(diphtheria toxin) 또는 그 변이체, 디프테리아 톡소이드(diphtheria<br />

toxoid), 데타누스 톡신(tetanus toxin) 또는 그 변이체, 테타누스 톡소이드(tetanus toxoid), 녹농균 엑소톡<br />

신 A(Pseudomonas aeruginosa exotoxin A) 또는 그 변이체, 콜레라 톡신 B 서브유닛, 테타누스 톡신 절편 C,<br />

박테리아 편모, 뉴몰리신(Pneumolysin), 나이세리아 수막염균(Neisseria menningitidi)의 외막단백질, 녹농균<br />

(Pseudomonas aeruginosa)의 Hcp1 단백질, 대장균의 이열성 엔테로톡신(enterotoxin), 쉬가-유사 톡신(shiga-<br />

like toxin), 인간 LTB 단백질, 리스테리올리신 O (또는 관련 단백질), 총박테리아 세포의 단백질 추출물, 탄저<br />

균(Bacillus anthracis)의 방어항원에 대한 DNI(dominant negative mutant) 또는 대장균 베타-갈락토시다아제<br />

또는 링커에 의해 크로스링크 될 수 있는 그 밖의 모든 단백질이다.<br />

본 명세서에서 "DNl"는 Benson 등이 서술한 탄저균의 방어항원의 변이형태인 DNI(dominant negative mutant)단<br />

백질을 말한다(Biochemistry 37:3941-3948 (<strong>19</strong>98)).<br />

본 명세서에서 "포획된(entrapped)"은 항원에 있어 항원이 수송단백질과의 복합체 내에서 생리적인 상태로 머물<br />

러 있음을 말한다. 바람직하게는 항원은 수송단백질과의 중요한 공유결합 없이 복합체 내에 포획된다. 여기<br />

서 중요한 공유결합이 없다함은 50 % 이하의 항원만이 수송단백질에 공유결합함을 말한다. 바람직하게는 40<br />

%, 30 %, 10 %, 또는 5 % 이하의 항원이 수송단백질에 공유결합한다.<br />

본 명세서에서 "감염(infection)"은 미생물이 대상체에 침투하는 것을 말한다. 미생물의 예로는 박테리아, 곰<br />

팡이, 기생충 또는 바이러스가 있다. 감염은 예를 들어, 대상체의 몸 내부 또는 표면에 일반적으로 존재하는<br />

미생물이 과도한 증식을 하거나, 대상체의 몸 내부 또는 표면에 일반적으로 존재하지 않는 미생물이 증식하는<br />

것을 말한다. 대상체는 몸 내부 또는 표면의 미생물이 과도하게 증식하거나, 미생물의 존재가 세포를 손상시<br />

키거나 대상체의 조직에 병리학적 증상을 일으킬 경우 고통을 받는다.<br />

본 명세서에서 "감염성 물질(infectious agent)"은 감염을 일으키는 미생물을 말한다.<br />

본 명세서에서 "면역원(immunogenic)"이란 대상체에서 면역반응을 유도하는 물질을 말한다. 바람직하게는, 면<br />

역반응은 IgG 항체의 생산을 포함하는 T-세포 의존성 면역반응이다.<br />

본 명세서에서 "미생물(microbe)"은 박테리아, 곰팡이, 기생충 또는 대상체의 감염을 유발할 수 있는 바이러스<br />

를 말한다.<br />

본 명세서에서 "미생물 캡슐 중합체(microbial capsular polymer)"는 미생물의 캡슐 코팅에 존재하는 중합체를<br />

말한다. 바람직하게는, 미생물 캡슐 중합체는 다당류, 인다당류(phosphopolysaccharide), N-아세틸 치환된 아<br />

미노 슈가를 가진 다당류, 설펀화 슈가(sulfanylated sugar)를 가진 다당류, 그밖의 황산-변성(sulfate-<br />

modified)슈가, 인산-변성(phosphate-modified)슈가, 폴리 알콜, 폴리 아미노산, 테이콘산 및 지질다당류<br />

(lipopolysaccharide)의 O 측쇄이다.<br />

본 명세서에서 "단량체(monomer)"는 동종 단량체들과 2개 또는 그 이상의 결합을 형성하여 반복적인 단량체 구<br />

조들의 사슬이나 여러개의 분쇄로써 중합체의 일부를 형성할 수 있는 분자구조를 말한다.<br />

본 명세서에서 "유기중합체(organic polymer)"는 단량체들이 공유결합한 구조로 구성된 중합체로서, 각각의 단<br />

량체들이 3개 이상의 탄소, 산소, 수소, 인산, 질소 및 황산 원자 중 3개 이상의 원자를 가진다. 바람직스럽<br />

게는, 유기 중합체는 다당류, 인다당류(phosphopolysaccharide), N-아세틸 치환된 아미노 슈가를 가진 다당류,<br />

설펀화 슈가(sulfanylated sugar)를 가진 다당류, 그밖의 황산-변성(sulfate-modified)슈가, 인산-변성<br />

(phosphate-modified)슈가, 폴리 알콜, 폴리 아미노산, 테이톤산, 및 지질다당류의 O 측쇄이다.<br />

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본 명세서에서 "폴리알콜(polyalcohol)"은 카보닐기가 1차 또는 2차 하이드록시기로 환원된 탄수화물의 수소화<br />

형태를 말한다. 예시적인 폴리알콜은 폴리알킬렌 글리콜(PAG)과 같은 폴리알킬렌 옥사이드(PAO)로서 폴리메틸<br />

렌 글리콜(PMG), 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 메톡시폴리에틸렌글리콜(mPEG) 및 폴리프로필렌글리콜이 이에<br />

속하고, 폴리비닐알콜 (PVA); 폴리에틸렌-코-말레산 무수물; 폴리스티렌-코-말레산무수물; 카복시메틸-덱스트란<br />

을 포함하는 덱스트란; 메틸셀룰로오스, 카복시메틸셀룰로오스, 에틸셀룰로오스, 하이드록시에틸세룰로오스, 카<br />

복시에틸셀룰로오스 및 하이드록시프로필셀룰로오스를 포함하는 셀룰로스; 치토산의 (chitosan)의<br />

가수분해산물; 하이드로에틸-스타치 및 하이드록시 프로필- 스타치 같은 전분; 글리코겐; 아가로스 및 그 유도<br />

체; 구아 검(guar gum); 풀루란(pullulan); 이눌린; 잔탄 검(xanthan gum); 카라지난(carrageenan); 펙틴; 알<br />

진산 가수분해물; 소르비톨(sorbitol); 글루코스, 만노오스, 갈락토스, 아라비노스, 글루코스, 자일로스, 쓰레<br />

오스(threose), 소르보스(sorbose), 프럭토스, 글리세롤, 말토스셀로비오스(maltose cellobiose), 수크로스,<br />

아밀로스, 아밀로펙틴의 알콜; 또는 모노프로필렌글리콜(MPG).<br />

본 명세서의 "폴리아미노산(poly amino acid)"는 최소 2개의 아미노산들이 펩타이드 결합으로 연결된 것을 말한<br />

다. 바람직하게는, 폴리아미노산은 아미노산 시퀀스의 반복 또는 동일한 아미노산의 사슬(예; 호모 중합체)을<br />

포함하는 펩타이드이다.<br />

본 명세서에서 "쉬프 염기의 환원(reducing a Schiff base)"은 아조메틴(azomethine) 또는 화학식 R1R2C=N-R3의<br />

화합물(R1, R2 및 R3는 전형적으로 탄소를 포함하는 화학구조이다)을 쉬프 염기의 이중결합을 수소원자로 포화시키<br />

는 환원제에 노출시키는 것을 말한다. 환원 방법은 당업계에 공지되어 있다.<br />

본 명세서에서 항체 또는 항체의 절편에 "특이적으로 결합(specifically binds)"한다 함은 항체 또는 항체의<br />

절편이 특정단백질, 예를 들어 항원,에 대해 동량의 다른 단백질에 대해서보다 증가된 친화력을 가짐을 말한다.<br />

바람직하게는, 항체 또는 항체의 절편은 그들의 항원에 대해 연관된 항원들을 포함하여 동량의 다른 항원에 대<br />

해서보다 2배, 5배, 10배, 30배 또는 100배의 친화력을 가지며, 이는 ELISA(enzyme linked immunosorbent<br />

assay)분석을 이용하여 결정되었다.<br />

본 명세서에서 "대상체(subject)"라 함은 미생물에 의해 감염될 수 있는 동물을 말한다. 바람직하게는, 대상<br />

체는 인간, 원숭이, 개, 고양이, 마우스, 랫트,소, 양, 염소 또는 말일 수 있다. 바람직한 구현예에 따르면,<br />

대상체는 인간 어린이와 같은 인간이다. 바람직하게는 대상체는 인간 갓난아기, 유아 또는 사춘기 이전의 어<br />

린이이다.<br />

본 명세서에서 "T세포-비의존성 항원(T-cell independent antigen)"은 T 림프구의 도움 없이 항체를 생산하는<br />

항원을 말한다. 바람직하게는 T세포-비의존성 항원은 T 림프구의 도움 없이 B 림프구를 직접 자극한다. 예<br />

시적인 T세포-비의존성 항원은 바람직하게는 캡슐 항원 폴리-감마-D-글루타민산(PGA), 알진산(algenate), 덱스<br />

트란, 다당류(PS), 폴리아미노산, 폴리알콜, 및 핵산을 포함한다.<br />

발명의 이점<br />

본 발명은 종래의 백신 기술에 비해 제조가 더 간단하고, 화학적 문제가 적고, 면역학적 문제가 적으며, 더 저<br />

렴하며, 다양한 항원 및 수송단백질에 대한 적응성이 접합 기술에 비해 더 뛰어나며, 다가 항원의 생성을 위한<br />

유연성이 더 뛰어난 백신을 제공한다.<br />

본 발명의 백신은 면역반응을 유발시키는 항원과 수송단백질 사이에 공유 결합을 필요로 하지 않으므로 접합<br />

백신 기술에 비해 백신의 제조 방법이 단순하고 비용이 절감된다. 다당류-단백질 접합 백신은 생산단가가 매<br />

우 높아 선진국에서만 판매되어 왔다; 종래의 접합 백신은 각각의 백신에 요구되는 특화된 화학구조와 다당류<br />

및 단백질의 생산 및 순화를 위한 비용으로 인해 낮은 가격으로 생산하기가 어려웠다.<br />

또한, 본 발명의 백신은 종전에 다루기 어려운 항원에 대한 면역반응을 안전하게 유도한다. 이러한 백신은 모<br />

노밸런트(면역반응을 유도하는 단일의 항원을 가짐) 혹은 멀티밸런트(다중의 면역반응을 유도하는 다중의 항원<br />

을 가짐)일 수 있다. 다루기 어려운 항원에 대한 면역반응을 유도하는 것으로 알려진 TLR(Toll-like<br />

receptor) 리간드를 가지는 백신은 안전하지 못한바, 그 이유는 본 발명의 백신과 비교하여 TLR 리간드가 종종<br />

친염증성이고, 소량에 의해서도 독성을 나타내며, 반응성이 크며, 부작용을 유발하는 경향이 있기 때문이다.<br />

본 발명의 다른 특성 및 이점은 이하의 발명의 상세한 설명과 도면, 청구항을 통해 명확해진다.<br />

본 발명은 백신 조성물, 그 제조방법 및 T-세포 비의존성 항원 또는 약한 면역반응을 유발하는 다당류, 폴리알<br />

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콜, 폴리아미노산 및 다른 유기 중합체들과 같은 항원에 대한 면역을 제공하는 상기 백신의 투여방법에 관한<br />

것이다. 본 발명의 백신은 종래의 다당류-단백질 접합 백신의 유효한 면역학적 특성을 가지지만 접합백신과<br />

비교하여 바람직한 차이점이 있다. 즉, 다당류 또는 캡슐 유기중합체와 같은 항원과 수송단백질을 연결함에<br />

있어 중요한 원자공유결합을 필요로 하지 않는다. 대신 다당류 또는 캡슐 유기중합체와 같은 항원은 수송단백<br />

질에 포획된다. 예를 들어, 단백질 매트릭스는 다당류 또는 캡슐 유기중합체와 같은 용해성 항원의 존재 하에<br />

서 수송단백질 분자와 공유 크로스링크를 함으로서 형성될 수 있다 : 이들 백신은 단백질 매트릭스 백신으로 불<br />

린다. 수송단백질은 서로 매우 잘 크로스링크되어 항원을 포획하고 항원의 수용을 촉진하며 면역세포에서의<br />

항체생산을 유발할 수 있는 매트릭스를 형성할 수 있다. 수송단백질 매트릭스는 항원을 에워싸는 "망사<br />

(mesh)" 형태 또는 항원이 "실(string)"이고 단백질 또는 크로스링크된 단백질 복합체가 "구슬(bead)"인 "실 위<br />

의 구슬(beads on a string)"형태일 수 있다. 수송단백질이 상기 항원을 둘러싸 링을 형성하거나 3차원적 망<br />

사를 형성하여 그안에 항원이 빠져들게되면서 항원이 수송단백질에 포획된다. 또한, 수송단백질과 항원은 크<br />

로스링크될 수 있다. 예를 들어, 항원사슬과 수송단백질의 사슬 내 크로스링크(intra-chain cross-links)가<br />

이루어진다. 바람직한 구현예에 따르면, 항원과 수송단백질은 비공유결합을 한다. 이러한 비공유 결합은 소<br />

수성 상호작용, 이온성 상호작용, 반데르 발스 상호작용 또는 수소결합을 포함할 수 있다. 비공유결합은 항원<br />

과 단백질 복합체가 비공유적으로 결합된 물리적인 기하구조일 수 있다(상기 "실 위의 구슬형태(bead on a<br />

string" analogy above)참조).<br />

수송단백질은 항원을 포획하기 위해 스스로와 크로스링크될 필요는 없다. 항원은, 예를 들어, 수송단백질과<br />

항원을 액체용제에서 혼합한 뒤 수송단백질을 침전시켜, 결과적으로 항원과 단백질을 동반침전시킴으로서 포획<br />

될 수 있다. 항원은 항원과 수송단백질의 혼합물로부터의 화합물(예를 들어 알부민, 소듐<br />

헥사메타포스페이트, 폴리포스파젠 또는 그 밖의 소수성 또는 이온성 상호작용에 의해 유발된 단백질에 대한 친<br />

화력을 가지는 중합체)을 침전시켜 수송단백질에 포획시킬 수 있다. 단백질을 침전시키는 방법은 공지된 기술<br />

이며, 예를 들어 다음의 단계를 포함한다; (1) 혼합물의 pH를 변화시키는 단계; (2) 혼합물의 이온염의 농도를<br />

증가 또는 감소시킴으로써 용액의 이온세기를 변화시키는 단계; (3) 또는 TCA(trichloroacetic acid) 또는 황산<br />

암모늄을 용액에 첨가하는 단계; (4) 혼합물을 가열하여 단백질을 응고시킴으로써 침전 또는 젤 등을 형성하는<br />

단계; (5) 혼합물 내의 단백질을 화학적으로 변형시켜 불용성으로 만드는 단계; 및 (6) 단백질 용액을 이온화<br />

방사선(자외선, 감마선 또는 베타선)으로 충분히 조사하여 단백질을 크로스링크시키거나 침전시키는 단계.<br />

병원균의 캡슐 단백질이 사용되면, 이러한 백신은 PCMV(protein capsular matrix vaccines)라 불린다. 실시<br />

예에서 기재한 것처럼, PCMV는 T-세포 비의존성 캡슐 항원, PGA(poly-gamma-D-glutamic acid), 알진산<br />

(algenate), 덱스트란 및 예시적인 수송단백질인 DNI에 기초한 백신들을 포함하여 생산된다. PGA PCMV는 대량<br />

생산이 간단하고 종래의 전형적인 PGA-단백질 접합백신의 면역반응을 유발한다는것이 밝혀졌다. 본 발명의 백<br />

신은 항원의 존재 하에서 모든 가능한 수송단백질을 크로스링크시키는 모든 가능한 링커를 사용함으로써 제조될<br />

수 있다. 선호되는 예시적 링커, 수송단백질 및 항원에 대해 서술한다.<br />

다당류(PS)는 당류(saccharide)의 중합체이다. 캡슐로부터 유래된 다당류는 나이세리아 수막염균, 폐렴연쇄상<br />

구균, 살모넬라 티피, 인플루엔자간균 B와 같은 캡슐화 된 박테리아 병원균에 대한 방어면역에 포함된 1차 항원<br />

성 물질이다. 미생물 다당류에 기초한 백신을 이용한 청년과 성인에 대한 면역접종은 질병치료에 효과적이었<br />

으나, 유아나 어린 아이들(예를 들어 24개월 미만의 어린이)에게 방어면역을 제공하는 데에는 덜 효과적임이 입<br />

증되었다. 어린 아이들은 성숙하고 적응력있는 면역 창고를 발달시키지 못하고, 이러한 어린 백신 피투여자에<br />

서의 캡슐 다당류 같은 T-세포 비의존성 항원은 면역원성이 떨어지고 장기적 방어면역 반응(예를 들어 면역학적<br />

기억 반응)을 유발하지 못한다. 다당류같은 T-세포 비의존성 항원은 다당류와 단백질간의 화학적 결합에 의해<br />

T-세포 의존성 항원으로 전환될 수 있다. 이러한 과정은 "접합(conjugation)"이라 불리며, 다당류 구조내의<br />

원자와 수송단백질내의 아미노산 측쇄 원자와의 공유결합 형성단계를 포함한다. 이러한 접합백신은 B-세포의<br />

성숙 및 항체생산의 양을 증가시키는 아이소타입(isotype) 스위치를 더 효율적으로 촉진한다. 방어항체는 그<br />

들의 다당류 항원에 대해 높은 친화력을 보이며, 전형적으로 상보적 고정활성 및 옵소닌화 이펙터(opsonic<br />

effector) 활성을 가지는 면역글로불린 G(IgG)의 서브클래스이다. 예로서, 다당류와 수송단백질 테타누스 톡<br />

소이드와의 접합에 의한 항-다당류 IgG 면역반응의 유도의 비제한적인 과정을 도 1에 나타내었다. 이 모델에<br />

서, 다당류를 인식하는 항체 수용체를 가지는 B-세포만이 다당류-단백질 접합체와 결합한다. 따라서, 수송단<br />

백질은 올바른 다당류 결합 특이성을 가진 B-세포 표면에 결합한다. 단백질-다당류 복합체는 이러한 B-세포에<br />

의해 세포내 액포(vacuolar)구획으로 가져가진 후 단백질 분해과정(proteolytic degradation)에 의해 수송이 행<br />

해진다. 수송단백질에서 유래된 펩타이드는 운반되고 MHC-Ⅱ(MHC-Class Ⅱ receptor)의 제시 그루브<br />

(presentation groove)에 로딩된다. 이 MHC-Ⅱ-수송 펩타이드 복합체는 B-세포 표면에 놓여진다. T-세포<br />

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수용체(TCR)가 MHC-Ⅱ-펩타이드 복합체를 인식하는 즉시, T-세포는 활성화되어 B-세포의 분화를 돕는 사이토카<br />

인을 분비한다. B-세포는 많은 숫자로 증가하고 항체를 분비하는 플라즈마 세포로 분화한다. Ig M은 처음에<br />

플라즈마 세포에 의해 생산되지만 나중엔 플라즈마 세포가 클래스 스위치를 하여 Ig G와 같은 다른 아이소타입<br />

클래스의 항체를 생산하도록 T-세포가 돕는다. 이러한 과정은 플라즈마 세포가 변이를 일으킴으로써 다당류-<br />

단백질 접합체에 대한 더 높은 친화력을 가지는 항체 수용체의 생산을 유도하면서 진행된다. 항원이 제거되면<br />

서, 더 높은 친화력의 플라즈마 세포만이 남겨진 다당류-단백질 접합체에 의해 활성화된다. T-세포에 의한<br />

플라즈마 세포의 성숙과정은 계속되어 플라즈마 세포의 숫자는 증가하고 Ig G 클래스의 항체에 높은 친화력을<br />

가지게 된다. 플라즈마 세포의 숫자의 증가는 면역접종된 인간 등의 대상체 혈청 내의 항-다당류 Ig G 항체의<br />

숫자를 측정함으로써 쉽게 탐지할 수 있다.<br />

결국 성숙 및 스위치 과정은 다당류에 특이적이며 수명이 긴 메모리 B-세포의 생산을 가져온다. 메모리 B-세포<br />

는 다당류에 노출되었을 때 즉시 활성화되는 독특한 특성이 있다. 활성화로 인해 메모리 B-세포는 항-다당류<br />

Ig G를 다중적이고 빠르게 생산한다. 다당류 항원에 대한 2차 노출에서 야기되는 메모리 B-세포의 활성화는<br />

"부스터 반응(booster response)"라고 불리며, 장기 2차 기억 면역반응의 척도가 된다. 1차 면역접종은 Ig M<br />

항체 및 약간의 Ig G 항체의 생산을 촉진시킬 수 있다. 2차 면역접종과 동시에, 메모리 세포는 이미 1차 접종<br />

에서 프로그램되었으므로 대량의 Ig G를 생산하는 기억 면역 반응을 유도한다.<br />

T-세포 비의존성 항원은 대계 Ig G항체의 생산과 같은 지속적인 면역반응을 촉진시키진 않지만, 덜 강력하고 더<br />

일시적인 Ig M 항체의 생산을 촉진한다. 다당류 항원 단독으론 Ig G의 부스터 반응을 유발시키지 못하며, 다<br />

당류-단백질 접합체로 1차 면역접종이 되어 메모리 세포들이 Ig G를 생산하도록 유도된 경우에만 부스터 반응을<br />

일으킨다. 백신접종된 동물이나 인간에서의 부스터 반응은 다당류를 가지는 미생물에 노출된 경우의 방어반응<br />

을 모방한 것이라 여겨진다. 이런 장기기억은 백신이 면역접종된 대상체에서 수년 후 작용하는데 있어 중요하<br />

다. 따라서, 다당류-단백질 접합체는 (1) 다당류 항원에 대한 Ig G항체를 다량 유도하는 능력 및 (2) 다당류<br />

항원에 대한 기억 면역반응을 유도하는 능력으로 인해 가치가 있다. 다당류 항원은 전형적으로 이러한 특성을<br />

보이지 않으며 따라서 열등한 항원이다. 접합 백신의 합성의 어려움 및 그 생산비용으로 인해 많은 박테리아<br />

질병에 대한 접합백신의 발전은 더뎠다. 다른 T-세포 비의존성 항원들은 폴리-감마-D-글루타민산(PGA)같은 아<br />

미노산의 호모중합체 또는 폴리알콜을 포함한다. 대부분의 생물학적 중합체는 T-세포 비의존성 항원이다.<br />

중합체는 B-세포의 Ig 수용체와 크로스링크 할 수 있으며, 중합체의 반복적인 화학구조로 인해 B-세포가 이들을<br />

인식한다(따라서 에피토프가 된다). 중합체들은 다당류처럼 B-세포를 활성화하여 항-중합체 Ig M을 생산하도<br />

록 할 수 있다. 예를 들어, 아미노산 호모중합체인 탄저균의 PGA는 면역원성이 떨어지는 캡슐 폴리머이자 T-<br />

세포 비의존성 항원이다. 수송단백질과 접합된 PGA로 구성된 백신은 면역원성이 매우 높고, 항-PGA Ig G 및<br />

PGA에 대한 면역학적 기억를 유도할 수 있다. 그러므로, 대부분의 중합체들은 MHC-Ⅱ 에 포함되어 반응이 진<br />

행되지 않고 T-세포의 도움도 받을 수 없기 때문에 면역원성의 측면에 있어서 다당류처럼 반응한다. 자연계에<br />

서 TRL(Toll-like receptor)이라고 불리는 새로운 클래스의 수용체와 반응하는 몇몇 예외적인 중합체가 있다.<br />

일단 활성화되면, TLR은 숙주세포에서의 사이토카인 생산을 유도하고 적합한 면역 반응의 변화를 만들어낸다.<br />

몇몇 다당류는 TLR 리간드에 공유결합되어있거나 이러한 리간드들에 의해 오염되어있다. 예를 들어,<br />

LPS(lipopolysaccharide)는 매우 면역원성이 강하며 Ig G와 기억반응을 유도한다; LPS의 지방부분 A(lipid A<br />

moiety)는 TLR 리간드이며 면역학적 특성의 원인부일 수 있다.<br />

또 다른 예를 들면, 몇몇 폐렴구균(pneumococcal)의 다당류는 수송단백질과 결합하지 않고도 Ig G로의 아이소토<br />

프 스위치를 유발한다는 점에서 접합백신의 면역학적 특성을 가짐이 밝혀졌다. 최근에, 폐렴연쇄상구균의 개<br />

개의 다당류 뿐 아니라 상업적 다당류 백신인 Pneumovax-23도 TLR 리간드에 의해 오염된다는 사실이 밝혀졌<br />

다.(Sen et al. J. Immunol. 175:3084-3091(2005)). 이 발견은 왜 이러한 다당류 시료가 단백질과의 접합 없<br />

이도 Ig G로의 스위치를 유도하는지를 설명해준다. 이 폐렴상구균 다당류는 대식세포에 의한 IL-6 및 TNF-α<br />

의 분비를 유도한다. 그러나, 다당류를 페놀추출법으로 더 순화시키면 사이토카인의 분비가 일어나지 않는다.<br />

페놀이 추출된 다당류는 면역원성이 낮고 더 이상 항-다당류 Ig G를 유도하지 않는다. 따라서, 페놀 추출은<br />

다당류의 이런 비정상적인 면역원성의 원인인 오염분자를 제거한다. 오염분자는 대식세포에서 TLR-의존성 사<br />

이토카인 반응을 활성화하는 능력을 가진 TLR 리간드인 것으로 보인다. 다당류를 페놀추출에 의해 좀 더 순화<br />

하면 TLR 리간드를 제거하고 다당류가 완전한 T-세포 비의존성이 되도록 한다.<br />

이상의 예시는 다당류 항원이 단백질과 탄수화물 간 공유결합 없이도 다당류-단백질 접합항원처럼 행동한다는<br />

사실을 말해준다. 불행하게도, TLR 리간드는 대계 인화성이다. 예를 들면, LPS는 소량으로도 독성을<br />

갖는다. 따라서, TLR 리간드를 다당류와 혼합하면 다당류에 대한 면역반응이 확장될 수 있으며, 이러한 접근<br />

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은 반응성이 있고 부작용을 유발하는 백신을 생성하는 경향이 있다. 접합 백신 기술은 면역원성과 안정성에서<br />

바람직한 다당류 백신을 생산하는 방법에 있어 여전히 하나의 선택으로 남아있다.<br />

다당류-단백질 접합백신의 발달은 박테리아 병원균에 의한 소아 질병을 크게 감소시켰다. 인플루엔자간균 B,<br />

수막염구균 및 스트렙토코커스에 대한 백신을 포함한 이러한 소량의 백신은 선진국에서 상업적으로 구입가능하<br />

다. 이러한 다당류-단백질 접합 백신은 개발도상국에서는 생산과 판매가 매우 고가에서 이루어진다. 예를 들<br />

어, 상업적으로 구입 가능한 7가-폐렴상구균 접합백신은 1hl 복용량당 약 58불 (2006 U.S. dollars)이며 4회 복<br />

용을 요한다. 가격만으로도 이들 백신은 개발도상국에서 접하기가 어렵다. 종래의 접합 백신은 저가로 생상<br />

하기가 어려운데, 이는 다당류와 단백질 모두에 대한 생산 및 순화과정이 포함되기 때문이다. 대개 두 물질<br />

모두 접합 반응 이전에 합리적 접합 효율성을 가지기 위해 높은 순도를 가질 것을 요한다. 전형적으로, 접합반<br />

응은 선택된 다당류와 수송단백질의 화학구조에 특이적인 다양한 다당류에 대해 진행되어야 한다. 이러한 결합<br />

반응은 전형적으로 라이신 잔기의 입실론(epsilon)아미노 측쇄를 통해 수송단백질과의 결합을 형성할 수 있는<br />

다당류의 작용기가 도입된다. 이러한 커플링 그룹을 도입하기 위한 다당류의 화학적 변형은 다당류의 에피토프<br />

를 파괴할 수 있고, 새로운 에피토프(예를 들면 링커나 변형된 당류 그룹과 결합된)가 도입되는데, 그 중요성은<br />

신중한 면역학적 분석을 통해서만 평가될 수 있다. 더 나아가, 종래의 다당류-단백질 접합백신에 있어 다당류의<br />

크기, 수송단백질 분자당 다당류의 숫자, 선택된 수송단백질의 특성 및 결합 구조의 타입은 모두 접합백신의 면<br />

역원성에 영향을 주었다. 이를테면 90개 이상의 알려진 혈청형 각각이 다른 PS 구조를 가지는 폐렴구균병<br />

(Bentley et al. PLOS Genetics 31:262-269(2006))의 경우에, 하나의 단일 접합 방법으로는 모든 혈청형에 대<br />

응할 수 없다. 재현성 있는 면역적 특성을 갖는 접합 백신의 재현성 있는 합성을 위해서는, 다당류의 크기,<br />

수송단백질 분자 당 다당류의 숫자 및 선택된 수송단백질의 특성 및 결합 구조의 타입을 신중히 조절하여야 하<br />

며, 이로 인해 접합백신의 생산 비용이 크게 증가한다. 항생물질에 대한 저항성이 나타남으로서 안전하고 효율<br />

적인 백신의 개발이 시급해졌다. 특히 개발도상국에 있어서 범용성있는 백신을 생산하는 데는 비용의 효율성도<br />

요구된다. 1개 또는 그 이상의 박테리아 종에서 유래한 다양한 항원성의 많은 다당류 항원에 대해 접합백신의<br />

합동 작용은 소아기의 면역화에 있어 백신투여를 단순화 할 것이다. 그러나, 현재의 접합백신 기술은 비용면에<br />

서 효율적이지 않아 합동 접합백신(ombination conjugate vaccines)을 개발도상국에 공급하는 것은 불가능하다.<br />

안정된 시장이 구축된 개발도상국가에서도 복잡한 접합백신 기술을 필요로 하는 Wyeth의 7가 접합 폐렴구균 백<br />

신의 공급 상황은 접합백신 기술을 요하는 백신의 생산 및 비축이 얼마나 어려운지를 보여준다.<br />

바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 백신은 1개 또는 그 이상의 박테리아 캡슐 물질이 다가 수송단백질에 포<br />

획된 다가 캡슐 매트릭스 백신(PCMV)이다. PCMV는 캡슐과 같은 적당한 순도의 항원을 출발물질로서 필요로 하기<br />

때문에 쉽게 생산할 수 있다. 예를 들어, Vedan의 폴리-감마-D-글루타민산(PGA)은 언급한 바와 같이 순도가 낮<br />

다(이것은 DNI에서 활성을 가지는 프로테아제를 운반한다). 이것은 T-세포 비의존성 항원에게서 기대되는 똑같<br />

은 작용을 한다(실시예 1). PGA를 PCMV에 결합시키는 것은 단백질 대 PGA의 비율이 7배 범위에서 차이가 나는<br />

세가지 PCMV시료들 모두에 있어서 성공적이었다.<br />

본 발명의 백신을 만드는 방법에 있어 캡슐 다당류 등의 항원에 대한 어떠한 화학적 지식도 요하지 않기 때문에<br />

상기 방법은 항원과 수송단백질의 화학구조에 적합한 크로스링크 화학의 개발에 대한 필요가 중요하지 않다.<br />

어떤 항원들이 링커와 반응할 수 있으나, 이는 백신의 효율성을 떨어뜨리지 않는다. 이는 항원과 수송단백질<br />

의 의도하지 않은 크로스링크도 면역원성을 가지기 때문이다. 본 발명의 백신에서 항원과 수송단백질의 크로<br />

스링크는 백신의 효율성을 위해 요구되는 사항이 아니다. 이는 생산과 개발이 어려웠던 종래의 접합백신과의<br />

중요한차이점이다. 본 발명의 백신은 바람직하게는 적어도 1 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %,<br />

70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 98 %, 또는 심지어 100 % 의 크로스링크된 수송단백질을 가지며, 1 %, 5 %, 10 %, 15<br />

%, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 또는 90 % 이하의 항원이 수소단백질과 크로스링크된다. 바<br />

람직하게는 10 % 이하의 항원이 수송단백질에 크로스링크되고, 최소 50 %의 수송단백질이 크로스링크된다.<br />

여기서 서술된 백신의 제조방법은 캡슐 중합체와 같은 항원의 과도한 변형을 가져오지 않는다. 일반적으로 항<br />

원은 가능한 변형, 예컨대 중합체 사슬의 말단에서 환원당을 포함하는 PS 캡슐의 환원당의 환원과 같은 변형을<br />

가짐면서 동일한 상태로 남는다. 이러한 소수의 변형은 대부분의 캡슐 다당류의 면역원성에 영향을 미치지 못<br />

하는데, 이는 말단의 슈가는 중합체 내부에서보다 100-1000배 더 숫자가 적기 때문이다. 반대로, 종래의 접합<br />

백신에 있어 캡슐 중합체 등의 항원 내에 수송단백질과의 공유적 유착을 위한 링커 그룹을 도입하는 것이 필수<br />

적이었다. 카르복시기나 아미노기 같은 반응성 있는 작용기가 없는 캡슐 중합체 등의 항원에 있어 링커가 필<br />

요했다. 예를 들어, 다당류에 링커를 도입하면 캡슐 에피토프가 파괴되고 숙주 자신의 에피토프와의 알려지지<br />

않은 면역학적 교차 반응성으로 인해 바람직스럽지 않은 새로운 에피토프가 생성된다.<br />

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여기서 서술한 백신의 제조방법은 접합백신 기술보다 간단한데, 이는 상기 방법의 화학적 특성이 수송단백질(예<br />

를 들어 DNI, 콜레라 톡신B 서브유닛, 디프테리아 톡신, 테타누스 톡신 C절편 또는 대장균 베타-갈락토시다제)<br />

의 크로스링크 화학구조에만 좌우되기 때문이다. 예를 들어, 캡슐 중합체가 DNI와 혼합된 경우 크로스링크 비<br />

율에 영향을 미치지만, 크로스링크의 패턴 및 범위는 사용되는 단백질, 그 농도 및 글루타르알데히드 등의 크로<br />

스링크 시약의 농도에 더 영향을 받을 뿐 캡슐 중합체의 영향을 받지 않는다. 이러한 변수는 쉽게<br />

조정되므로, 백신을 만드는 시간, 노력 및 비용이 절감될 수 있다.<br />

여기서 서술한 PCMV 백신의 제조방법은 어떠한 캡슐 중합체, 아미노기가 포함된 중합체등의 어떤 항원에도 적용<br />

될 수 있으며. 보로화 수소의 환원에 의해 파괴될 수 있는 중요한 에피토프를 가지지 않는 수송단백질 등의 어<br />

떤 수송단백질에도 적용될 수 있다. 본 방법에서 사용되는 수송단백질은 바람직하게는 적어도 2개의 라이신<br />

잔기 또는 블록되지 않고 화학적 변형에 의하여 크로스링크를 할 수 있는 다른 잔기를 가진다. 테타누스 톡소<br />

이드는 가능한 수송단백질의 하나이다. 이 독소는 단백질의 아미노기와 반응하는 포름알데히드에 의해 해독된<br />

다. 다른 바람직한 수송단백질에는 코레라 톡신 B 서브유닛(SBL Vaccin AB에서 구입가능), 디프테리아 톡신,<br />

테타누스 톡신 C절편 (Sigma Aldrich에서 구입가능), DNI 또는 대장균의 베타-갈락토시다제(Sigma Aldrich에서<br />

구입 가능)이 있다.<br />

현재 다가(multivalent) 접합백신은 각각의 접합백신을 만든 후, 이들을 혼합하여 "칵테일(cocktail)" 접합백신<br />

을 형성함으로써 제조된다(예를 들어 Wyeth 7가 폐렴구균 백신, Prevnar). 본 발명에서의 백신 제조방법은 수<br />

송단백질과 크로스링크되기 전에 화학적으로 다른 백신들(예를 들어 캡슐 유기 중합체)을 혼합함으로써 또는 개<br />

별적으로 합성된 본 발명의 특이적 백신을 혼합함으로써 다가 백신을 만드는 데에 사용될 수 있다. 이러한 유<br />

연성은 현재의 다가 백신 제조법에 비해 중요한 이점을 제공한다. 본 발명의 실시예에서 논의된 예시적인 백<br />

신인 PCMV 백신 #1-3은 이들 백신이 PGA 분자와 DNI 단백질을 이루는 원자들간 공유결합을 형성하지 않을 것으<br />

로 예상되었음에도 접합백신처럼 작용했다. 글루타르알데히드는 라이신 잔기의 입실론 아미노기를 가지는 단<br />

백질의 아미노 측쇄와 주로 잘 반응한다. PGA 중합체는 자유로운 아미노기를 가지지 않고, 글루타르알데히드<br />

와 반응하지 않는 카르복실 측쇄만을 가지고 있다. 따라서, PCMV에 의해 유발된 접합-유사 면역반응은 긴 PGA<br />

분자가 DNI 단백질 분자의 크로스링크된 매트릭스 내에서 분자적으로 포획되어 있음을 말해준다.<br />

무제한 모델에 의하면, 포획은 DNI 단백질과 PGA를 B-세포내로 운반하기 위해 일어나며, B-세포는 PGA를 면역학<br />

적으로 인식하는 Ig 수용체를 경유하여 이러한 매트릭스에 결합한다. B-세포들이 수용되면, 매트릭스는 종래<br />

의 접합백신에서와 비슷한 방법으로 분해되며 이로써 MHC-Ⅱ 분자에 나타나는 DNI-유래 펩타이드가 된다. 이후<br />

T-세포의 도움으로 B-세포는 확장하고 Ig G를 생산하는 플라즈마 세포 및 PGA 특이적 기억 세포가 된다. 따라<br />

서, 무제한 모델에 의하면 PCMV는 단백질-접합 캡슐 백신과 면역학적으로 유사하게 작용하지만 PCMV는 수송단백<br />

질과 캡슐 중합체간의 공유결합이 없다는 점에서 차이가 난다.<br />

PCMV를 포함한 본 발명의 백신들은 소아 백신등에서 조합으로서 사용될 수 있다. 뿐만 아니라, 본 발명의 백<br />

신은 폐렴상구균 감염, 스트렙토코커스(A 및 B그룹)감염, 인플루엔자간균 B("HiB") 감염, 수막염균(예를 들어<br />

나이세리아 수막염균) 감염 및 그람 네거티브 박테리아(예를 들어 녹농균, 야토균) (Thirumalapura et al. J.<br />

Med. Microbiol. 54:693-695 (2005); Vinogradov and Perry, Carbohydr. Res.339:1643-1648 (2004);<br />

Vinogradov et al. Carbohydr. Res. 214:289-297 (<strong>19</strong>91)), 쉬겔라 종, 살모넬라 종, 아시네토박터 종, 버크홀<br />

데리아 종 및 대장균에 대한 백신으로 사용될 수 있다.<br />

본 발명의 백신을 생산하는 데 있어 하나 또는 그 이상의 항원(예를 들어 여기서 언급한 항원)의 존재하에서 수<br />

송단백질(예를 들어 여기서 언급한 단백질)을 크로스링크시키기 위해 어떠한 링커(예를 들어 여기서 언급한 링<br />

커)도 사용할 수 있다. 만약 하나의 항원이 사용된다면, 본 발명의 단백질 매트릭스 백신은 1가라고 불린다.<br />

만약 1개가 넘는 항원이 사용된다면, 본 발명의 단백질 매트릭스 백신은 다가라고 불린다. 만약 미생물 캡슐<br />

중합체가 항원이라면, 본 발명의 단백질 매트릭스 백신은 단백질 캡슐 매트릭스 백신(PCMV)이라고 불린다.<br />

링커<br />

크로스링킹 수송단백질은 당업계에 잘 알려져 있고 글루타르알데히드, m-말레이미도벤조일-N-하이드록시숙시니<br />

미드에스테르(m-maleimidobenzoyl-N-hydroxysuccinimide ester), 카보디이미드 및 비스-비아조타이즈드 벤지딘<br />

을 포함한다.<br />

수송단백질에의 직접 크로스링크하는 일반적 방법 및 반응 부분은 호모 이중작용기 또는 헤테로 이중작용기 링<br />

커를 이용하는 방법이 기술된다. (G. T. Hermanson. Bioconjugate Techniques, (<strong>19</strong>96)); Dick and Beurret.<br />

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Conjugate Vaccines. Contribu. Microbiol. Immunol. 10:48-114 (<strong>19</strong>89)). 예를 들어, 수송단백질에 라이신이<br />

많으면 이론적으로 크로스링커의 카르복실기와 반응할 수 있는n+1개의 1차 아민(말단 아민을 포함하여)이 있다.<br />

따라서, 이러한 직접적인 접합과정을 이용하면 생성물은 n+1개의 아미드 결합을 가지는 것으로 제한된다.<br />

본 발명의 바람직한 구현예에서 채택한 링커는 두 개의 단백질을 연결하는 결합이다. 링커는 두 개의 수송단<br />

백질 (A) 및 (B)와 공유결합하는 부속기가 있는 선형, 고리형 또는 분쇄형 분자 골격을 가질 수 있다. 어떤<br />

수송단백질도 1개 가 넘는 수송단백질과 결합할 수 있으며, 이에 의해 수송단백질들이 교차결합된 매트릭스가<br />

만들어져 항원이 여기에 포획될 수 있다. 결합기란 작용기(A) 또는 (B)를 가지는 링커(L)의 반응 부위의 조합<br />

으로 만들어진 공유 결합을 말한다. 링커 그룹은 에스터, 카바메이트, 사이오에스터(thioester), 이민, 다이<br />

설파이드, 아마이드, 에테르, 사이오에테르(thioether), 설폰아미드, 아이소우레아, 이미도에스터, 아미딘, 포<br />

스포아미데이트(phosphoramidate), 포스포다이에스터 및 하이드라존을 제한없이 포함한다.<br />

(A)와 (B)의 링크는 공유적 수단에 의해 이뤄지는데, 여기엔 (A) 및 (B)에 위치한 1개 또는 그 이상의 작용기와<br />

의 결합(결합기)형성을 포함한다.<br />

이러한 목적을 위한 화학적 반응성을 가지는 작용기의 예는 많은 수송단백질에 포함된 자연계의 아미노산에 존<br />

재하는 아미노, 하이드록시, 설피드릴 (sulfhydryl), 카복시, 카보닐, 사이오에테르, 구아니딜, 이미다졸 및 페<br />

놀기를 제한없이 포함한다.<br />

(A)와 (B)간의 공유결합은 이들 내의 작용기와 반응할 수 있는 부분을 가진 (L)링커를 사용함으로써 효율적일<br />

수 있다. 반응의 생성물은 (L)과 (A)를 그리고 (L)과 (B)를 연결하는 새로운 결합을 포함하는 결합기이다.<br />

예를 들어, (A)의 하이드록시기는 (L)이나 그 활성화 된 유도체의 카복시기와 반응하여(아래 참조) 에스터 결합<br />

기를 형성할 수 있다.<br />

설피드릴기와의 반응을 할 수 있는 부분의 예에는 XCH2CO-(X=Br, Cl, or I)타입의 α-할로아세틸(α-<br />

haloacetyl)이 있으며, 이는 설피드릴기와 특별한 반응성을 보이지만, 이미다졸, 사이오에테르, 페놀 및 아미노<br />

기와도 반응한다.(Gurd, Methods Enzymol. 11:532 (<strong>19</strong>67). N-말레이미드(N-Maleimide) 유도체도 설피드릴기<br />

에 대해 선택성이 있는 것으로 생각되지만, 특정 조건하에서 아미노기들을 결합시키는데 더 유용할 수 있다.<br />

2-이미노사이올란(2-iminothiolane)같은 시약은 아미노기를 변형하여 사이오기(thiol group)를 도입하는데, 다<br />

이설파이드 브릿지(disulphide bridge)를 형성하면서 크로스링크가 일어난다면 이는 설피드릴기로 간주될 수 있<br />

다.<br />

아미노기와 반응할 수 있는 반응성 있는 부분의 예로는, 알킬화 및 아실화 시약이 있다. 대표적인 알킬화 시<br />

약은 다음과 같다:<br />

(i)α-할로아세틸(α-haloacetyl)로서, 이는 반응성있는 사이올기가 없을 때 아미노기에 대한 특이성을 보이며,<br />

XCH2CO-(X=Br, Cl, or I) 타입이다(Wong. Biochemistry 24:5337 (<strong>19</strong>79));<br />

(ii) N-말레이미드 (N-maleimide derivative) 유도체로서, 이는 마이클 반응(Michael type reaction) 또는 고<br />

이구조에 카보닐기를 첨가하는 아실화 반응을 톨해 아미노기와 반응할 수 있다(Smyth et al. Chem. Soc.<br />

82:4600 (<strong>19</strong>60): Biochem. J. 91:589 (<strong>19</strong>64));<br />

(iii) 반응성 있는 니트로할로아로마틱 (nitrohaloaromatic)화합물과 같은 아릴 할라이드;<br />

(iv) 알칼할라이드 (McKenzie et al. J. Protein Chem. 7:581 <strong>19</strong>88);<br />

(v) 아미노기와 함께 쉬프(Schiff)염기를 형성할 수 있는 알데히드 및 케톤으로서, 이들 아미노기는 환원을 통<br />

해 안정된 아민을 형성한다;<br />

(vi)에피크로로하이드린(epichlorohydrin) 및 비속시란(bisoxirane)과 같은 에폭사이드(epoxide) 유도체로서,<br />

이들은 아마노기, 설피드릴기, 페놀릭하이드록시기와 반응할 수 있다;<br />

(vii) s-트리아진(s-triazines)의 염소 함유 유도체로서, 이들은 아미노, 설피드릴, 하이드록시기와 같은 친핵<br />

체에 대해 매우 반응성이 크다;<br />

(viii) 상기의 s-트리아진에 기초한 아지리딘(aziridines)으로서 (Ross. J. Adv. Cancer Res. 2: 1 (<strong>19</strong>54)),<br />

이는 아미노기와 같은 친핵체와 고리열림을 통한 반응성이 크다;<br />

(ix) 스권린산 디에틸 에스터(squaric acid diethyl ester) (Tietze. Chem. Ber.<strong>12</strong>4:<strong>12</strong>15 (<strong>19</strong>91)); 및<br />

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(x) α-할로알킬 에테르(α-haloalkyl ether)로서, 이들은 활성화가 에테르의 산소원자에 의해 일어나므로, 더<br />

반응성이 높은 알킬화 시약이다(Benneche et al. Eur. J. Med. Chem. 28:463 (<strong>19</strong>93)).<br />

아미노기와 잘 반응하는 아실화 시약으로는 다음의 것이 있다.<br />

(i) 이소사이아네이트(isocyanates) 및 이소티오사이아네이트(isothiocyanates) 중 특히 방향성 유도체로서, 이<br />

들은 각각 안정된 우레아(urea) 및 사이오우레아(thiourea) 유도체를 형성한다;<br />

(ii) 설포닐 클로라이드(sulfonyl chloride)( Herzig et al. Biopolymers 2:349 (<strong>19</strong>64));<br />

(iii) 아실할라이드;<br />

(iv) 니트로페닐에스터(nitrophenylester) or N-하이드록시숙시니미딜 에스터(N-hydroxysuccinimidyl ester)와<br />

같은 반응성 있는 에스터;<br />

(v) 혼합되거나, 대칭형이거나, N-카복시언하이드라이드(N-carboxyanhydrides)인 무수물산(acid anhydride);<br />

(vi) 그 밖에 아마이드 결합의 형성에 유용한 시약 (M.Bodansky. Principles of Peptide Synthesis, Springer-<br />

Verlag (<strong>19</strong>84));<br />

(vii) 아실아자이드(acylazide)로서, 아자이드기는 소듐니트라이트를 이용하여 만들어진 하이드라자이드<br />

(hydrazide) 유도체로부터 합성된다(Wetz et al. Anal. Biochem. 58:347 (<strong>19</strong>74)); 및<br />

(viii) 이미도에스터로서, 이는 아미노 그룹과 반응하여 안정된 아미딘을 형성한다 (Hunter and Ludwig J. Am.<br />

Chem. Soc. 84:3491 (<strong>19</strong>62)).<br />

글루타르알데히드와 같은 알데히드 및 케톤은 아민과 반응하여 쉬프 염기를 만들 수 있으며, 이는 환원적 아민<br />

화 반응을 통해 안정화될 수 있다. 알콕시아미노기(Alkoxylamino) 부분은 케톤 및 알데히드와 쉽게 반응하여<br />

안정한 알콕사민(alkoxamine)을 생성한다(Webb et al. Bioconjugate Chem. 1 :96 (<strong>19</strong>90)).<br />

카복시기와 반응할 수 있는 반응성 있는 부분은 디아조아세테이트에스터(diazoacetate ester) 및 디아조아세트<br />

아마이드(diazoacetamides)와 같은 디아조 화합물을 포함하며. 이들은 높은 특이성으로 반응하여 에스터르 생<br />

성한다 (Herriot Adv. Protein Chem. 3:169 (<strong>19</strong>47)). O-아실우레아(O-acylurea)형성을 통해 반응하여 아마이<br />

드 결합을 형성하는 카보디이미드같은 카복시산 변환시약도 쓰일 수 있다.<br />

(A)또는 (B)의 작용기는 원하는 바에 따라, 예를 들어 추가적인 반응성과 선택성을 부여하기 위해, 반응 전에<br />

다른 작용기로 변환될 수 있다. 이러한 목적을 위한 예시적인 유용한 방법은 디카복실릭 언하이드라이드<br />

(dicarboxylic anhydride)를 이용한 아민의 카복시산으로의 변환; N-아세틸호모시스테인 사이오아세톤(N-<br />

acetylhomocysteinethiolactone), S-아세틸머캅토숙시닉언하이드라이드(S-acetylmercaptosuccinic anhydride),<br />

2-이미노사이올란(2-iminothiolane) 또는 사이올-함유 숙시니미딜(thiol-containing succinimidyl)유도체를 이<br />

용한 아민의 사이올(thiol)로의 변환; α-할로아세테이트를 이용한 사이올의 카복시산으로의 변환; 에틸렌이민<br />

(ethylenimine) 또는 2-브로모에틸라민(2-bromoethylamine)을 이용한 사이올의 아민으로의 변환; 카보디이민<br />

(carbodiimide)과 디이민(diamine)을 차례로 이용한 카복시산의 아민으로의 변환; 및 토실 클로라이드를 이용한<br />

뒤 사이오아세테이트로 트랜스에스터화 한 후 소듐아세테이트로 가수분해하여 알콜을 사이올로 변환하는 과정을<br />

포함한다.<br />

소위 말하는 무-길이 링커(zero-length linker)는 추가적인 결합물질 없이 (A)화학기의 반응성 있는 부분과<br />

(B)화학기의 반응성 있는 부분간의 직접적인 공유결합을 포함하며, 본 발명에서처럼 사용될 수 있다. 예로서,<br />

(L)은 (A)의 산소원저와 (B)의 카보닐 또는 사이오카보닐 부분간의 화학결합에 해당한다. 예를 들어 아미노기<br />

(A)는 카보닐기(B)에 A-L-B(L은 아마이드 결합) 또는 N-R에 결합된 R-C=O(R은 동일하거나 서로 다른 두 개의 단<br />

백질 분자 의 아미노산 측쇄에서 유래한 탄소사슬)의 형태가 되는 카보디이미드 구조를 이용하여 결합할 수 있<br />

다.<br />

그러나 가장 일반적으로, 링커는 스페이서(spacer)에 의해 연결된 두 개나 그 이상의 반응성 있는 부분을 가지<br />

고 있다. 스페이서의 존재는 이중작용기성 링커가 (A) 및 (B)내의 특정 작용기와 반응할 수 있게 하여 두 화<br />

합물간 공유결합이 형성될 수 있도록 한다. 링커(L)의 반응성 있는 부분은 같을 수도 있고(호모 이중작용기성<br />

링커), 다를 수도 있어(헤테로 이중작용기성 링커 혹은 여러개의 비유사한 반응부분이 있는 경우 헤테로 다중기<br />

능성 링커), (A)와 (B)사이에 공유결합을 유발하는 다양한 가능한 시약을 제공한다.<br />

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스페이서 엘리먼트는 전형적으로 탄소수 1-10의 선형 또는 분쇄형 알킬, 탄소수 1-10의 선형 또는 분쇄형 헤테<br />

로알킬, 탄소수 2-10의 선형 또는 분쇄형 알켄, 탄소수 2-10의 선형 또는 분쇄형 알킨, 탄소수 5-10의 방향성<br />

잔기, 탄소수 5-10의 고리계 또는 -(CH2CH2O)nCH2CH2-(n은 1-4)를 포함한다.<br />

링크 시약에 의해 도입된 외부시약의 특성은 한<br />

링크 시약에 의해 도입된 외부시약의 특성은 약동학적 특성 및 최종의 백신 생산물의 활성을 가져올 수 있다.따<br />

라서 생분해가 가능하거나, 화학적으로 민감하거나, 효소의 절단부위에 결합하는 스페이서 암(spacer arm)을 가<br />

지는 절단 가능한 링커를 도입하는 것이 바람직하다.<br />

이러한 절단 가능한 링커는 예를 들어 PCT 국제출원 공보 WO92/17436 에 참고문헌과 함께 서술되어 있으며, 생<br />

체 내에서 쉽게 생분해된다.몇몇 경우에, 링크그룹은 에스터라아제 (esterase)의 존재 하에 절단되지만, 이런<br />

효소가 없을 때는 안정하다.(A) 및 (B)는따라서 유리하게 링크되어 발병 부위의 효소 활성에 의해 천천히 방출<br />

될 수 있다.링커는 생분해가 가능한 디에스터, 디아마이드 또는 화학식 I의 디카바메이트기와 링크그룹을 형성<br />

할 수 있다.<br />

화학식 1:<br />

-(Z 1<br />

)0-(Y 1<br />

)u-(Z)s-(R11)-(Z 3<br />

)t-(Y 2<br />

)v-(Z 4<br />

)p-<br />

각각의 Z 1<br />

, Z 2<br />

, Z 3<br />

및 Z 4<br />

는 O, S 및 NR<strong>12</strong>(R<strong>12</strong>는 수소 또는 알킬기)로부터 독립적으로 선택되었다; 각각의 Y 1<br />

는 카보닐, 사이오카보닐, 설포닐, 포스포릴 또는 유사한 산-생성기로부터 독립적으로 선택되었다; o, p, s, t,<br />

u 및 v는 각각 독립적으로 o 또는 1이다; R11은 탄소수 1-10의 선형 또는 분쇄형 알킬, 탄소수 1-10의 선형 또는<br />

분쇄형 헤테로알킬, 탄소수 2-10의 선형 또는 분쇄형 알켄, 탄소수 2-10의 선형 또는 분쇄형 알킨, 탄소수 5-10<br />

의 방향족 잔기, 탄소수 3-10의 고리계, -(CH2CH2O)qCH2CH2- (q는 1-4) 또는 -(Z I<br />

)O-(Y 1<br />

)U-(Z 2<br />

)S- 를 -(Z 3<br />

)t-(Y 2<br />

)v-<br />

(Z 4<br />

)p-에 결합시키는 화학결합이다.<br />

본 발명에서 사용된 예시적인 바람직한 링커(L)를 화학식 2-3에 나타내었다.<br />

화학식 2<br />

화학식 3<br />

링커는 (A) 및 (B)의 탄소와 모두 공유결합 한다.따라서, 화학식 2-3의 링커(L)은 수송단백질 (A) 및 (B)와 디<br />

피란(dipyran), 에스터 또는 카바메이트 결합기를 통해 결합한다.이들 구현예에 있어서, R13은 탄소수 1-10의 선<br />

형 또는 분쇄형 알킬, 탄소수 1-10의 선형 또는 분쇄형 헤테로알킬, 탄소수 2-10의 선형 또는 분쇄형 알켄, 탄<br />

소수 2-10의 선형 또는 분쇄형 알킨, 탄소수 5-10의 방향족 잔기, 탄소수 3-10의 고리계, -(CH2CH2O)nCH2CH2 (n은<br />

1-4) 또는 두 개의 질소나 2개의 카보닐을 연결하는 화학결합이다.<br />

하이드라존(hydrazone) 결합을 형성하도록 설계된 링커는 화학식 4의 구조를 가진다.<br />

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공개특허 10-2009-0066272<br />

및 Y 2

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화학식 4<br />

Z 5<br />

는O, S, 또는 NR16(R16은 수소 또는 알킬기이다; R15는 수소, 알킬 또는 헤테로알킬로부터 선택되었다; Y 3<br />

는 카<br />

보닐, 사이오카보닐, 설포닐, 포스포릴 또는 (A)의 산소와 공유결합 하는 유사한 산-생산기이다; w 는 0 또는 1<br />

이다; R14는 탄소수 1-10의 선형 또는 분쇄형 알킬, 탄소수 1-10의 선형 또는 분쇄형 헤테로알킬, 탄소수 2-10의<br />

선형 또는 분쇄형 알켄, 탄소수 2-10의 선형 또는 분쇄형 알킨, 탄소수 5-10의 방향족 잔기, 탄소수 3-10의 고<br />

리계, -(CH2CH2O)nCH2CH2 (n은 1-4) 또는 -(Y 3<br />

)-(Z 5<br />

)w-를 에 연결시키는 화학결합이다; X4는 하이드<br />

라진기를 가지면서 X4가 케톤 또는 알데히드의 산소원자인 링커 2의 전구체 (B)의 축합반응에 의해 만들어진 하<br />

이드라존이다.<br />

수송단백질<br />

일반적으로, 본 발명에서는 생리학적으로 항원에 의해 포획될 수 있는 수송단백질이 사용될 수 있다.바람직하게<br />

는, 항원은 수송단백질과의 중요한 공유결합 없이 복합체 내에서 수송단백질에 포획된다.중요한 공유결합이 없<br />

다 함은 50 % 가 넘지 않는 항원이 수송단백질에 공유적으로 결합한 것을 말한다.바람직한 구현예에 의하면,<br />

40%, 30%, 10%, 또는 5%가 넘지 않는 항원이 수송단백질에 공유적으로 결합한다.항원/수송단백질 복합체는 알룸<br />

(alum) 같은 다른 화합물을 포함할 수 있으며, 이러한 다른 화합물은, 바람직하게는 항원과 수송단백질을 포획<br />

할 수 있다.<br />

본 발명의 백신에서 사용된 수송단백질은 바람직하게는 홀로이거나 항원과 결합된 형태로서 대상체에서의 면역<br />

반응을 유발한다.바람직하게는, 수송단백질은 T-세포에 의해 인식되는 적어도 한개의 에피토프를 가진다.<br />

바람직하게는, 에피토프는 대상체에서 T-세포 반응을 유도할 수 있고, B-세포를 자극하여 중요한 전체 항원에<br />

대한 항체생산을 유도할 수 있다.본 발명에서 언급된 에피토프는 특정 항체분자나 그 절편에 대한 특이적 반응<br />

의 원인이 되는 항원에 대한 어떠한 결정자도 포함한다.에피토프 결정자는 대개 화학적 활성을 가지는<br />

아미노산, 당 측쇄 등의 표면 분자의 집합으로 구성되며, 특이적 전하 특성 뿐 아니라 특이적 3차원 구조를 가<br />

진다.면역원성 특성을 가지기 위해서는 단백질이나 다당류는 T-세포를 자극할 수 있어야 한다.그러나 T-세포에<br />

의해 인식되는 에피토프를 가지지 않는 수송단백질도 역시 면역원성이 있다.<br />

강력한 면역반응을 유발하는 것으로 알려진 수송단백질을 선택함으로써, 다양한 집단의 대상체가 여기서 언급한<br />

PCMV에 의해 치료될 수 있다.수송단백질은 바람직하게는 백신에 대한 강력한 면역반응을 유발할 수 있도록 충분<br />

히 외래적인 물질이다.전형적으로, 사용되는 수송단백질은 중요한 항원에 대한 면역원성을 부여할 수 있는 분자<br />

이다.바람직한 구현예에 따르면, 수송단백질은 본래 높은 면역원성을 가지는 단백질이다.따라서 높은 면역원성<br />

을 가지고 항원에 대한 항체생산을 최대화 할 수 있는 수송단백질이 바람직하다.<br />

본 발명에서의 다양한 수송단백질에는, 예를 들어 톡신과 (화학적 또는 유전적)톡소이드가 있으며, 이들은 변이<br />

체일 수도 그렇지 않을 수도 있는 바, 여기에는안트락스 톡신, PA 및 DNI (PharmAthene, Inc.), 디프테리아 톡<br />

소이드 (Massachusetts State Biological Labs; Serum Institute of India, Ltd.) 또는 CRM <strong>19</strong>7, 테타누스 톡<br />

신, 테타누스 톡소이드(Massachusetts State Biological Labs; Serum Institute of India, Ltd.),테타누스 톡<br />

신 절편 Z, 녹농균 엑소톡신 A 또는 그 변이체, 박테리아 편모, 뉴몰리신, 나이세리아수막염균의 외막단백질<br />

(American Type Culture Collection, Manassas, VA)), 녹농균 Hcpl 단백질, 대장균의 이열성 엔테로톡신, 쉬가<br />

-유사 톡신, 인간 LTB 단백질, 총 박테리아 세포 추출 단백질 및 그 밖에 링커에 의해 크로스 링크될 수 있는<br />

모든 단백질이 포함된다.바람직스럽게는, 수송단백질은 콜레라 톡신 B 서브유닛(SBL 백신B에서 얻을 수 있다),<br />

디프테리아 톡신, 테타누스 톡신 절편 C(Sigma Aldrich로부터 구입할 수 있다), DNI 및 대장균의 베타-갈락토시<br />

다아제(Sigma Aldrich로부터 구입할 수 있다)이다.다른 바람직한 수송단백질은 BSA(bovine serum albumin),<br />

P40 및 치킨 리보플라빈(다른 기재가 없는 수송단백질은 Sigma Aldrich에서 구입항 수 있다)이다.다른 예시적인<br />

수송단백질로 분쇄형 펩타이드인 MAP(multi-antigenic peptide)가 있다.MAP를 사용함으로써, 다중 분쇄 아미노<br />

산 잔기에 의해 크로스링크 밀도는 최대화되었다.MAP를 형성하는 아미노산의 예시로서 라이신이 있으나 이에 한<br />

정되지 않는다.<br />

BSA와 KLH(keyhole limpet hemocyanin)는 모두 동물을 이용한 백신의 개발과정에서 수송체로 쓰였다.치료용 백<br />

신의 합성에 이용되는 수송단백질에는 수많은 병원성 박테리아의 톡신과 그들의 톡소이드가 포함되나 이에 한정<br />

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공개특허 10-2009-0066272

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되지 않는다.그 예로는 티프테리아와 테타누스 톡신과 이들의 의학적으로 허용되는 톡소이드가 포함된다.다른<br />

가능한 수송단백질에는 CRM(cross-reacting material)이라 불리는 박테리아 톡신과 유사한 항원성을 가지는 단<br />

백질이 있다.본 발명의 수송단백질은 인간에게서 유래하지 않고 인간의 음식에 존재하지 않는 모든 단백질도 포<br />

함된다.<br />

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 고리-유사 구조를 형성하는 단백질은 PCMV를 만드는데 사용된다.이러한<br />

단백질에는 녹농균의 Hcp 단백질, 콜레라 톡신 B 서브유닛, 대장균의 이열성 엔테로톡신 및 쉬가-유사 톡신이<br />

있다.이러한 고리-유사 구조는 선형 다당류 사슬이 링 모양의 단백질 복합체를 관통하는 염주(beads on a<br />

string)형태를 형성할 수 있다.단백질이 크로스링크된 후에, 이러한 복합체는 매우 안정할 것으로 예측되었다.<br />

단백질의 구조적 데이터는 이러한 중앙 채널이 다당류 사슬이 쉽게 들어갈 수 있을 만큼 넓음을 보여준다.에를<br />

들어, Hcp1 헥사고리의 중앙 채널은 42 옹스트롬으로 5.5 옹스트롬의 다당류 사슬 몇개를 수용하기에 충분한 너<br />

비이다(Mougous et al., Science 3<strong>12</strong>(5779) 1526- 1530, (2006)).다른 한편, 단백질 고리는 다당류 주위를 둘<br />

러쌀 수도 있다(예를 들어, 특정 물리적 화학적 환경 하에서 자연적으로 링에 합쳐지는 모노머 수송단백질의 서<br />

브유닛으로부터).이러한 링 안에 합쳐져 들어갈 수 있는 모노머 단백질은 당업계에 공지되어 있으며, 뉴몰리신<br />

(Walker et al. Infect.. Immun. 55(5): 1184-1189 (<strong>19</strong>87); Kanclerski and Mollby, J. Clin. Microbiol.<br />

25(2):222-225 (<strong>19</strong>87)), 리스테리올리신 O(Kayal and Charbit. FEMS Microbiol. Rev. 30:514- 529 (2006);<br />

Mengaud et al. Infect. Immun. 55(<strong>12</strong>):3225-3227 (<strong>19</strong>87)), DNI, 안트락스 PA, Hcp1, 콜레라 톡신 B 서브유닛,<br />

쉬가 톡신 B 서브유닛, 편모 및 당업계에 알려진 많은 관련 단백질을 포함한다.<br />

또 다른 바람직한 구현예에 의하면, TLR(Toll-like receptor) 아고니스트가 수송단백질로 사용될 수 있다.TLR의<br />

활성화는 적합한 면역반응을 형성하는데 있어 중요하며, 친화력의 성숙, 아이소타입 스위치, 면역학적 기억에<br />

있어 핵심적 역할을 한다.콜레라균(Vibrio cholerae)의 편모(FLA)는 TLR 아고니스트이다.20 mg 이상의 FLA 단백<br />

질이 재조합 대장균으로부터 추출되었으며, 이는 IL-6 대식세포의 유도 분석에서 강력한 TLR 활성인자임이 밝혀<br />

졌다.뿐만 아니라, 잘 보존된 폐렴연쇄상구균의 단백질인 뉴몰리신 또한 TLR4를 활성화시키는 것으로 밝혀졌으<br />

며, 또한 방어항원이기도 하다.따라서, 이 단백질은 PCMV 수송단백질로 이용될 수 있다.<br />

더 나아가, 나이세리아 수막염균 등의 외막단백질(OMP)은 HIB 접합백신(Merck)의 수송단백질로 이용되며, 폐렴<br />

연쇄상구균의 총 박테리아 세포에서 추출한 단백질은 동물 감염 모델에서 적어도 부분적인 보호역할을 함아 밝<br />

혀졌다.본 발명의 바람직한 구현예에 있어서, 이러한 단백질 혼합물은 PCMV 수송단백질의 원천임이 밝혀졌다.<br />

바람직한 구현예에 따르면, PCMV 방법은적어도 2개의 라이신 잔기 또는 블록되지 않고 화학적 변형에 의해 크로<br />

스링크 할 수 있는 다른 잔기를 가지는 수송단백질이 사용된다. 또 다른 바람직한 구현예에 따르면, 수송단백<br />

질은 멀티머(예를 들어 적어도 5개의 서브유닛을 포함하는)이다. 바람직하게는, 멀티머는 호모멀티머이다.<br />

또 다른 구현예에 의하면, DNI는 사용전 해독이 필요없는 비독성 물질이므로 수송단백질로 사용된다. 나아가,<br />

DNI가 중요한 항원에 대한 면역반응 뿐 아니라탄저균에 대한 방어면역 반응도 유도하기 때문에 DNI의 사용은<br />

바람직하다. 또한 DNI는 내부에 설파이드 결합이 없다. 이러한 결합은 단백질을 변성시켜 에피토프를 파괴<br />

할 수도 있는 보로화수소 환원에 민감하다<br />

목적의 항원<br />

본 발명의 백신 조성물과 그 제조 및 투여 방법은 어떠한 중요 항원, 예를 들어 다당류, 폴리 알콜 또는 폴리<br />

아미노산에 대해서도 사용될 수 있다. 바람직하게는, 중요 항원은 백신의 제조 과정에서 일어나는 화학반응에<br />

의해 파괴되는 1차 그룹을 가지지 않는다. 예를 들어 보로화수소의 환원을 통해 항원의 다이설파이드 결합을<br />

파괴함으로써 항원을 변성시키는 경우가 그것이다. 예시적인 중요 항원으로 다당류같은 유기중합체(예를 들어<br />

적어도 18개의 잔기를 가지는 다당류), 인다당류(phosphopolysaccharide), N-아세틸 치환된 아미노 당을 가진<br />

다당류, 설펀화 슈가(sulfanylated sugar)를 가진 다당류, 그밖의 황산-변성(sulfate-modified)슈가, 인산-변<br />

성(phosphate-modified)슈가, 폴리 알콜, 폴리 아미노산, 테이콘산, 및 지질다당류의 O 측쇄이다. 예시적인<br />

중요 항원은 캡슐 유기 중합체를 포함하며, 여기엔 박테리아, 곰팡이, 기생충 및 바이러스 등의 미생물이 합성<br />

하는 것과 일반적인 방법으로 생물학적 원천에서 채취한 것이 있다. 예시적인 중요 항원은 미생물 캡슐 유기<br />

중합체를 포함하며, 여기에는 탄저균과 같은 바실러스 종(Wang and Lucas. Infect. Immun. 72(9): 5460-5463<br />

(2004)), 폐렴연쇄상구균(Bentley et al. PLoS Genet. 2(3):e31, Epub (2006); Kolkman et al. J.<br />

Biochemistry <strong>12</strong>3:937-945 (<strong>19</strong>98); and Kong et al. J. Med. Micorbiol. 54:351-356 (2005)), 쉬겔라(Zhao et<br />

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공개특허 10-2009-0066272

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al. Carbohydr. Res. 342(9): <strong>12</strong>75- <strong>12</strong>79 Epub (2007)), 인플루엔자간균, 나이세리아 수막염균, 스타필로코커<br />

스 아우레우스, 살모넬라 티피, 스트렙토코커스 피오진(Streptococcus pyogenes), 대장균(Zhao et al.<br />

Carbohydr. Res. 342(9): <strong>12</strong>75- <strong>12</strong>79 Epub (2007)) 및 녹농균같은 박테리아로부터 채취한 것, 크립토코커스 및<br />

칸디다같은 곰팡이로부터 채취한 것(Ovodov, Biochemistry (Mosc)) 71(9):937-954 (2006); Lee et al. Adv.<br />

Exp. Med. Biol. 491:453-471 (2001); Lee, Mol. Immunol. 24(10): 1005- 10<strong>19</strong> (<strong>19</strong>87))을 포함한다. 예시적<br />

인 중요 항원은 또한 자연계에 나타나지 않는 비생물학적 물질도 또한 포함된다.<br />

백신 조성물<br />

본 발명의 백신 조성물은 소아 백신과 같이 조합하여 사용되어질 수 있다. 뿐만 아니라, 본 발명의 백신은 예<br />

를 들어 폐렴구균 감염, 인플루엔지간균 B 감염, 스트렙토코커스 감염(A 및 B그룹), 수막염균 감염에 대한 백신<br />

으로 사용될 수 있고, 그람 네거티브 박테리아(예를 들어 녹농균, 야토균, 쉬겔라 종, 살모넬라 종, 아시네토박<br />

터 종, 버크홀데리아 종 및 대장균)에 대한 백신으로 사용될 수 있다.<br />

백신의 구성에는 바람직하게는 적어도 한 개의 수송단백질, 1개 또는 그 이상의 중요 항원 및 약제학적으로 허<br />

용 가능한 수송체나 첨가제(예를 들어 알루미늄 포스페이트, 염화나트륨 및 살균수)를 포함한다. 백신 조성물<br />

은 면역원성을 증가시키는 보조체계(물 속의 오일 및 그밖의 당업계에 알려진 체계 또는 약제학적으로 허용 가<br />

능한 첨가제)가 포함될 수도 있다. 생리학적 환경에서 불용성인 수송체/항원 복합체는 대상체에 항원을 투여<br />

한 후 천천히 방출되기 때문에 바람직하다. 이런 복합체는 바람직하게 약제학적으로 허용 가능한 첨가제를 함<br />

유하는 현탁액에서 수송된다. 그러나, 수송체/항원 복합체는 생리학적 상태에서 가용성일 수도 있다.<br />

전형적으로 백신은 약 0.5 mL의 부피로 피하 주사되거나, 0.1 mL 부피로 피내 주사되거나, 0.002-0.02 mL부피로<br />

경피 투여된다. 0.5ml 의 백신은 약 2-500 μg 의 수송단백질에 포획된 2-500 μg 의 항원을 함유한다. 바<br />

람직한 구현예에 따르면, 0.5 ml 의 투여량에, 약 10 μg 의 항원이 약 10 μg 의 수송단백질에 포획되어 있다.<br />

항원과 수송단백질간의 몰 비율은 1:10(예를 들어 한 부분의 항원 대 두 부분의 수송체 또는 한 부분의 항원<br />

대 세 부분의 수송체) 내지 10:1(예를 들어 세 부분의 항원 대 한 부분의 수송체 또는 두 부분의 항원 대 한 부<br />

분의 수송체)이다. 바람직한 구현예에 따르면, 항원과 수송단백질간의 몰 비율은 1:1이다. 한편, 항원과 수<br />

송단백질 간의 건조 중량비는 바람직하게는 1:10 내지 10:1이다(예를 들어 건조 중량 1:1).<br />

펩타이드 또는 접합체는 위에서 분해될 수 있으므로, 백신은 바람직하게는 비경구(예를 들어 피하, 피내, 경피<br />

또는 정맥주사)로 투여된다. 피부층을 물리적으로 관통하는 전달이 바람직하지만(예를 들어 바늘, 에어건 또<br />

는 침식), 본 발명의 백신은 피부 흡착에 의해 투여할 수도 있다.<br />

특히, 본 발명의 백신은 적합한 면역 보조제와 함께 근육내 주사, 피내 주사, 경피성 접종을 함우로써 대상체에<br />

투여될 수 있다. 본 발명의 백신은 한번 또는 그 이상 투여될 수 있으며, 감염성 물질에 의한 감염을 막기 위<br />

해 항체의 생산을 부스팅 시키는 2차 투여가 종종 포함된다. 백신 투여의 빈도 및 양은 백신의 고유의 활성<br />

에 의해 좌우되며, 관례적인 실험에 의해 쉽게 결정된다.<br />

예를 들어, 유아에게 있어, 접종계획은 약 4-8주 간격(생후 2개월에 시작하여)으로 0.5 ml씩 3회투여 후 4회째<br />

투여는 생후 <strong>12</strong>-15주가 되었을때 이루어지는 것일 수 있다. 몇몇 백신에 있어서 5번째 투여는 생후 4-6년이<br />

지났을 때 이루어지는 것이 바람직하다.<br />

첫 번째 투여를 하는 나이는 일반적으로 생후 2개월이며, 백신은 생후 6주된 유아에게 투여될 수 있다. 관례<br />

적인 유아 백신 접종시기가 지난 어린이에 있어서 본 발명의 백신이 아래의 스케쥴에 따라 투여될 수 있다.<br />

첫 번째 투여 연령<br />

투여 계획<br />

<br />

<br />

7-11개월 총 3번의 0.5 ml 투여; 첫 두 번은 적어도 4주 간격으<br />

로, 세 번째 투여는 두 번째 투여 후 적어도 2개월 후<br />

투여<br />

<strong>12</strong>-23개월 적어도 2개월 간격으로 2번 0.5 ml 투여<br />

24개월-9년 0.5 ml 한번 투여<br />

성인에 있어서, 0.5 ml 의 투여가 2-8주 간격으로 두 번 행해지며, 이는 장기 방어를 제공하기에 충분하다.<br />

부스터 투여는 접종받은 적이 있는 11세 이상의 성인 및 어린이에게 10년마다 행해지는 것이 바람직하다.<br />

단일 투여나 다중 투여를 위한 조제가 가능한데, 예를 들어 밀봉된 앰플이나 유리병에 냉동-건조하여 보관될 수<br />

있고, 사용 직전에 즉시 살균 액상 수송액만을 첨가한다. 본 발명의 백신은 약제학적으로 허용 가능한 부형액<br />

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공개특허 10-2009-0066272

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에서 조제될 수 있으며,알룸 하이드록사이드 겔, 보조제 시료 또는 살린이 이에 해당한다. 그런 뒤 적합한 면<br />

역 보조제와 함께 근육내 주사, 피내 주사, 경피성 주사를 한다.<br />

본 발명은 여기서 서술한 백신이 포함된 키트도 포함한다(예를 들어 PCMV). 본 발명의 키트는 백신 접종을 위<br />

해 키트를 사용하는 방법의 설명서를 포함한다.<br />

면역 접종계획의 효율성은 대상체에서 항원 타이터를 측정하는 방법에 의해서 결정될 수 있다. 일반적으로 약<br />

1 μg/ml 인 소량의 항원 타이터(바람직하게는 Ig G 타이터)가 장기 방어면역의 지표가 된다.<br />

항원/수송단백질 복합체는 바람직하게는 10 nm -100 μm의 직경을 가진다. 바이러스는 100 nm 의 직경을 가지<br />

며 면역원성을 가진다. 총 박테리아 세포 1-10 μm 의 직경을 가지며 역시 면역원성을 가진다. 작은 덩어리<br />

의 박테리아는 약 100 μm 의 직경을 가진다. 특정한 구현예에 있어서, 백신 조성물에서의 항원/수송 단백질<br />

복합체는 바람직하게는 100 nm - 10 μm 의 직경을 가진다. 이러한 복합체는 불용성일 수 있다.<br />

이하 본 발명을 구체적 실시예, 구현예, 특성을 통해 서술한다. 이는 발명을 설명하기 위한 목적일 뿐 발명의<br />

범위를 제한하기 위함이 아니다. 이하의 실시예는 발명의 한정으로 해석되어서는 아니 된다.<br />

실 시 예<br />

실시예 1 : 백신과 대조군의 제작<br />

캡슐형 폴리 감마-D-글루타민산(PGA)은 Vedan(Taiwan)으로부터 구입하거나 Rhie 등의 방법(Prod. natl. Acad.<br />

Sci 100: 10925-10930(2003))에 의해 정제하였다. DNI(dominent negative mutant)는 탄저균(B. anthracis)의<br />

PA(protective antigen)의 변이형태로써 Benson 등의 방법(Biochemistry 37 : 3941-3948 (<strong>19</strong>98))에 의해 대장<br />

균으로부터 생산되었다. PGA 및 DNI 단백질은 사용 전에 pH 7.4(SP 7.4)의 0.05 M 의 인산나트륨 완충액에 충<br />

분히 투석하였다. DNI 스톡 용액은 30 mg/ml의 농도를 가진다. PGA 스톡용액은 134 mg/ml의 농도를 가진다.<br />

링커 글루타르알데히드는 Pierce에서 25% 스톡액으로 구입하였다. PCMV(Protein Capsular Matrix Vaccine)<br />

과 대조군은 반응에서 표 1과 같이 조합되었다.<br />

표 1<br />

PCMV 표본 1-3, 대조군 4 및 5의 제작을 위한 반응의 조합<br />

반응# DNI PGA dH2O 25% 글루타르알데히드<br />

ml ml ml ml 명칭<br />

1 20 1 3 0.8 PCMV1<br />

2 <strong>12</strong> 4 8 0.8 PCMV1<br />

3 16 2 6 0.8 PCMV1<br />

4 16 2 6 0 P+C대조군<br />

5 16 0 8 0.8 P만의 대조군<br />

상온(22℃)에서 글루타르알데히드 없이 다섯 개의 반응이 조합되었다. T=0의 조건에서 0.1 ml 의 글루타르알데<br />

히드(G25)가 지시된 반응에 첨가하였다. 30초 후에 다시 0.1 ml의 G25를 첨가하였고 지시된 반응에 G25가 총<br />

0.8ml를 첨가할때까지 상기 과정을 반복한다. 하기의 순서로 다양한 탁도와 불용성 젤-유사 입자(particle)<br />

를 조성함으로써 이중작용기성 글루타르알데히드분자에 의한 DNI 분자의 크로스링크를 육안으로 관찰할 수 있<br />

었다 : 탁도 및 젤 형성 정도의 순서가 반응1>반응2>반응3>반응4 이고 반응 5는 완전히 투명하고 가용성인 상<br />

태이다. 1시간 뒤에, pH 9.3의 0.5 M 의 붕산염(sodium borate) 완충액(SBH)내에 혼합된 2 ml 의 보로수소화<br />

나트륨(sodium borohydride) 1 M 을 6개의 반응 모두에 첨가시켜 DNI 분자의 아미노 측쇄와 이중작용기성 글루<br />

타르알데히드 분자간에 형성된 쉬프 염기를 환원시켰다. 실리콘 소포제(0.01ml)를 각각의 반응에 첨가하여<br />

반응 동안 발생하는 거품을 제어하였다. 반응물을 4℃에서 72시간동안 보관하였다. 모든 반응물을 SP7.4에<br />

대해 48시간동안 충분히 투석하였다. 불용성 물질은 최종 생성물의 원심분리를 통해 제거하였으며 사용시까<br />

지 4℃에서 보관하였다.<br />

종래의 우태아혈청(BSA)과 PGA간의 접합체는 하기의 방법에 따라 수용성 카보디이미드인 EDAC(1-에틸-3-(3-디<br />

메틸아미노프로필)카보디이미드)를 이용한 BSA의 아미노기와 PGA의 카르복실기간의 커플링을 통해 합성하였다<br />

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: 물에서 30 mg/ml BSA 5 ml 를 NP7.5에서 134 mg/ml PGA 1 ml 와 혼합한다. EDCA 50 mg 을 첨가하여 실온에서<br />

반응을 3시간동안 진행시킨다. 반응은 활성화기를 차단하기 위한 1 mM 의 글리신이 포함된 SP7.4에 대해 18<br />

시간동안 4℃에서 투석하였다. 그리고 나서 SP7.4에 대해서만 24시간동안 4℃에서 투석하였다. 최종산물은<br />

PGA-BSA 접합체라고 불린다.<br />

PCMV와 대조군 표본을 합성하고 투석한 뒤, DNI 단백질의 분자 상태를 시험하여 다양한 양의 PGA의 존재 혹은<br />

부존재하에서 글루타르알데히드가 분자 단계에서 정말로 단백질과 크로스링크 되었는지 확인하였다. PCMV와<br />

대조군표본은 SDS (sodium dodecyl sulphate) 폴리아크릴아마이드 젤 전기영동(PAGE)과 항-PA 항혈청을 이용한<br />

웨스턴 블로팅에 의해 모니터링한다. 도 2에서 보듯이 DNI 단백질은 글루타르알데히드의 크로스링크 이전에<br />

84kDa에서 이동한다. PCVMl-PCMV3(레인1-3)은 220kDa 이상의 분자량에서 밴드가 이동함으로써 DNI 단백질이<br />

광범위한 크로스링크를 함을 보여준다. PGA가 없이 홀로 크로스링크되는 DNI 단백질도 높은 분자량을 나타낸<br />

다(레인 5). 반대로, PGA와 혼합하였으나 글루타르알데히드를 처리하지 않은 DNI는 DNI 또는 더 낮은 분자<br />

량의 물질과 함께 이동한다. Vedan(Taiwan)에서 구입한 PGA 표본은 DNI에 대한 활성을 가지는 프로테아제에<br />

의해 오염된 것으로 보인다. 그러나 6번 레인의 Vedan PGA의 샘플은 항-PA 항혈청과 반응하는 오염단백질의<br />

함유량이 낮아 관찰된 밴드는 다양한 반응을 통해 DNI로부터 유래된 생성물임을 보여준다.<br />

뿐만 아니라, 콜레라균(Vibrio cholerae)의 편모(FLA)가 PCMV에 포함되는 DNI보다 나은 수송단백질인지 여부를<br />

알아보기 위해 PGA 와 하나 이상의 폐구균(pneumococcal) 다당류를 항원으로 사용하였다. 수송단백질의 효과<br />

는 PGA에 작용하는 Ig G 의 양과 다양한 PCMV 및 이들의 단백질에 의한 면역과정을 톨해 얻어지는 다당류의 양<br />

에 의해 측정한다.<br />

PCMV는 아미노기를 이중작용기성 크로스링커를 사용하지 않고 카르복시기에 직접 크로스링크시켜 만들 수<br />

있다. 특히 PCMV는 카보디이마드를 이용하여 아미노기와 수송단백질의 카르복시기를 크로스링크시킴으로써 만<br />

들 수 있다. 이 화학구조는 라이신 측쇄의 1차 아미노기와 아스파르테이트 및 글루타민산 측쇄의 카르복시기<br />

간의 펩타이드 결합을 형성한다. 아미노기는 톡소이드로 처리된 포르말린에 대부분 차단되지만 포르말린은 카<br />

르복시기와 전혀 반응하지 않는다. 따라서, 카보디이미드는 글루타르알데히드에 저항할 수 있는 포르말린 톡<br />

소이드를 이용한 PCMV 함성에 유용할 수 있다. 크로스링킹은 SDS-PAGE에 의해 쉽게 탐지된다. 글루타르알데<br />

히드와 같은 크로스링커의 첨가에 따른 고분자량의 단백질“얼룩”의 존재는 크로스 링크가 일어났음을 알려준<br />

다.<br />

표 2<br />

SDS-PAGE에 의해 탐지된 수송단백질의 크로스링크<br />

글루타르알데히드 부존재 존재 존재 존재 존재<br />

캡슐 중합체 -PGA -PGA +PGA +PS6B +PS23F<br />

BSA - + + + +<br />

디프테리아 톡신 - + + n.d. n.d<br />

디프테리아 톡소이드 - - - n.d. n.d<br />

테타누스 톡소이드 - + + n.d. n.d<br />

+표시는 SDS-PAGE에서 크로스 링크가 탐지되었음을 나타내고, -표시는 글루타르알데히드가 없는 대조군에서 단<br />

백질 이동의 변동이 없음을 나타낸다. n.d.는 분석이 행해지지 않아 알 수 없음을 나타낸다.<br />

표 2에 나타난 실험을 위해 200 마이크로리터의 반응을 pH 7.5의 50 mM HEPES(4-(2- hydroxyethyl)-1-<br />

piperazineethane sulfonic acid)에서 수행하고 2시간동안 분위기온도(Ambient Temperature)에서 배양하였다.<br />

반응은 <strong>12</strong>0M의 보로수소화나타륨에 의해 종료되었다. 글루타르알데히드는 64 mM 를 첨가하였고, BSA( bovine<br />

serum albumin) 15mg/ml를 사용하였으며, 디프테리아 톡신,디프테리아 톡소이드 및 테타누스 톡소이드가 약 5<br />

mg/ml 로 사용되었다. PGA는 13.4 mg/ml, 폐 다당류(pneumo PS) 6B 및 23F가 4 mg/ml 첨가되었다.<br />

표 2에서 보는 바와 같이, 포르말린이 처리된 몇몇 단백질(예;디프테리아 톡소이드)은 글루타르알데히드와 잘<br />

크로스링크되지 않으며, 따라서 PCMV 합성을 위해서 다른 크로스링크 화학구조가 필요하다. 테타누스 톡소이<br />

드와 같은 다른 단백질들은 글루타르알데히드와 크로스링크되기는 하나 디프테리아 톡신이나 BSA같은 비변형 단<br />

백질만큼 광범위하게 크로스링크되지는 않는다.<br />

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실시예 2 : 면역화와 항-DNI 및 항-PGA 면역반응의 분석<br />

표 1에 게재된 5개 반응의 가용성 생성물을 흡광도 280 nm 의 동일한 단백질 농도로 조절하였다. 생후 약 5-7<br />

주 된 BALB/c 마우스(Charles River)를 그림 2에 나타낸 면역화 연구에 사용하였다. 마우스들을 실험 첫날<br />

PCMV 백신1-3 과 DNI 단백질 20 μg의 항원 표본 대조군 4 및 5 를 복강주사 함으로써 면역 접종시켰다. 모든<br />

마우스들은 7일째에 출혈을 보였고 10일째에 같은 양의 항원표본을 투여하자 면역반응이 부스팅되었다. 마우<br />

스들은 30일째에 다시 출혈을 하며 사망했다.<br />

혈액 표본의 혈청은 응고가 일어난 후 수집한 후 -20℃에서 저장하였다. ELlSA(Enzyme-linked immunosorbent<br />

assay) 분석을 통해 항-PGA 및 항-DNI 혈청 항체의 양을 측정하였다. 요약하자면, Immulon 2HB ELISA (VWR)<br />

마이크로티터 디쉬를 pH 9.6, 0.5 μg/well, 100 μl/well의 탄산나트륨 완충액에서 BSA-PGA 또는 DNI 로 코<br />

팅하였다. 밤새 4℃에서 배양한 후, 항원으로 코팅된 플레이트는TBST(TBS-0.1% Tween)에 첨가된 3% BSA<br />

(w/v)와 함께 1시간동안 실온 또는 하룻밤동안 4℃에서 배양함으로써 차단하였다. 면역 촉진 이후의 각각의<br />

시점에서의 4마리 마우스로부터 추출한 혈청표본은 TBST로 순차적으로 희석한 후, 항원으로 코팅한 플레이트에<br />

첨가한 후 최소 1시간동안 배양하였다. 항-DNI 및 항-PGA 항체 반응은 알칼린 포스페이타제(Zymed)와 접합된<br />

마우스 Ig G 또는 Ig M에 대한 레빗 항-혈청을 이용하여 측정하였다. p-니트로페닐 포스페이트(PNPP)기질을<br />

각각의 웰에 첨가하고 각각의 반응에 대하여 405 nm에서의 흡광도를 결정하였다. 데이터는 상호 최종 타이터<br />

(reciprocal endpoint titer)로 기재되어 있고, 이는 음성대조군의 흡광도보다 높은 두 개의 표준편차인 OD405<br />

리딩을 얻기 위한 최대 희석치로 정의된다.<br />

세 개의 PCMV 표본 1-3과 두 개의 항원 대조군 표본 4 및 5(그림 3-5)로 면역 접종한 마우스의 Ig M과 Ig G 특<br />

이 항-DNI 및 항-PGA 면역반응을 측정하기 위해 ELISA 분석을 실시하였다. 그림 3에서 보듯이 DNI 단백질은<br />

글루타르알데히드와 크로스링크되지 않은 대조군 표본 4를 제외하고 모든 표본에서 매우 면역반응을 잘 일으킨<br />

다. 그러나, 이런 DNI 특이 면역반응은 전적으로 Ig G에 기초한다. 어떤 항-DNI Ig M 도 면역접종 후 7일째<br />

까지 검출하지 못했으나, PCMV 표본들 또는 DNI로만 크로스링크 된 표본(5번 표본)으로 면역접종한 마우스에서<br />

중요한 항-DNI Ig G 의 반응은 17일째에 검출하였다.<br />

항-PGA Ig M 의 반응은 캡슐중합체의 전형적인 패턴을 보인다(그림 4). 대조군 표본 4는 7일째에 탐지 가능한<br />

항-PGA Ig M 반응을 보이지만, 이 반응은 17일 또는 30일째에 상승되지 않는다. 모든 PCMV 표본은 7일째에 항<br />

-PGA Ig M 반응을 유도하였고, 더 강한 항-PGA Ig M 반응을 17일째 및 30일째에 생성하였다. 예상했듯이, 대<br />

조군 표본 5(DNI와만 크로스 링크된)는 Ig M 또는 Ig G 에 기초한 항-PGA 반응을 생성하지 않았다. 반대로,<br />

PCMV 1-3(표본 1-3)은 17일째에 명확히 나타나고, 30일째에 확연히 부스팅하는 강한 Ig G 에 의한 항-PGA 반응<br />

을 생성하였다(그림 5). PCMV 1-3에 의한 Ig G 의 항-PGA 반응은 Aulinger 등이 보고한 종래의 PGA-DNI 접합<br />

백신에서 관찰된 PGA에 대한 반응(Infect. Immun. 73:3408-3414(2005)) 및 Rhie 등이 보고한 폴리아미노산<br />

(PA)-PGA에 대한 반응(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 100:10925-10930(2003))과 유사하다. 따라서 PCMV백신<br />

#1, #2 및 #3은 알려진 탄저균의 T-의존성 방어항원인 캡슐 PGA에 대한 면역그로불린 G의 반응을 유도함으로써<br />

모두 종래의 PGA 접합백신과 동일한 작용을 한다(Wang et al. Infect. Immun. 72:5460-5463(2004)). PGA와<br />

혼합된 DNI(크로스링크되지 않는)를 함유한 대조군 표본 5는 PGA에 대해 탐지 가능한 Ig G 반응을 유발시키지<br />

않아 PCMV 표본 1-3에서 DNI가 Ig G 의 항-PGA 반응을 촉진시키는데 있어 TLR 리간드로 작용하지 않음을 보여준<br />

다. 이 결과로 또한 PGA는 낮은 면역원성을 가지는 T-세포 비의존성 면역원이라는 사실을 확인하였다. 그렇<br />

지 않으면 단백질과 공유결합을 통해 결합하였을 것이기 때문이다(Rhie et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA<br />

100:10925-10930 (2003)). PCMV 방법은 상기 방법이 결과적으로 DNI 단백질을 PGA 분자와 직접적으로 크로스<br />

링크시키지 않음에도 불구하고 명확히 PGA를 T-세포 의존성 면역원으로 변환시킨다.<br />

이러한 데이터는 PCMV 방법이 종래의 접합백신과 유사한 특성의 면역원을 생산할 수 있음을 보여준다. PGA<br />

PCMV는 여기서 서술한 방법을 이용하여 쉽게 만들 수 있고, 전형적인 PGA-단백질 접합백신에 의한 면역반응을<br />

유도한다는 것을 발견하였다. 표 1에 개시된 작은 스케일의 반응들은 도 3에 요약된 도식에 따라 1000마리의<br />

마우스를 면역접종하기에 충분한 양의 PCMV를 만든다. 본 데이터는 PGA와 DNI로부터 만들어진 PCMV가 탄저균<br />

에 의해 유발된 탄저병을 예방하는 백신으로 쓰일 수 있음을 뒷받침한다.<br />

실시예 3 : 추가적 PCMVs의 생성 및 특성<br />

PCMV 기술은 다양한 구조와 이온 극성의 캡슐 항원에 적용될 수 있다. 23 개 타입의 폐렴연쇄상구균<br />

(Streptococcus pneumonia) 다당류는 ATCC(American Type Culture Collection)에서 구입하였고, Merck, Inc.에<br />

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서 생산하였다. 이들 다당류는 분자구조에 있어서 매우 다양하고, 매우 음이온성이거나, 부분적으로 양이온성<br />

이거나, 전기적으로 중성이거나, 인산화 되어있거나, 선형이거나, 가지구조를 가지고 있고, 그밖의 많은 변형을<br />

가지는 다당류를 포함한다. 예비적인 실험에서 일곱 개의 캡슐 타입의 Wyeth product Prevnar (4, 6B, 9V,<br />

14, 18C, <strong>19</strong>F, 및 23F)과 일치하는 이들 다당류의 소량을 마우스의 매크로파지에 의한 IL-6 생산을 유도하는 능<br />

력을 측정하기 위해 분석하였다. 타입 4 다당류는 이 분석에서 활성을 보였다 ; lipopolysaccharide(LPS)는<br />

TLR 길항제를 위한 대조군이다. 다른 다당류들(예를 들어 타입 3), PGA-DNI 및 크로스링크하지 않는 대조군에<br />

서 만들어진 PCMV 백신 뿐 아니라 PGA, 야토균(Francisella tularensis)의 O 항원 다당류도 분석하였다. 이<br />

실험은 타입 3 폐렴연쇄상구균 다당류와 PGA의 적은 범위가 (and to a lesser extent PGA) TLS 아고니스트 에<br />

오염되었음을 보여준다. 야토균 및 PCMV의 다당류는 분석에서 비교적 깨끗하였다. 페놀 추출물과 에탄올 침<br />

전물은 알려지지 않은 잔여 TRL 아고니스트를 제거함으로써 연속적인 두가지 처리를 한 후에 폐렴쌍구균 다당류<br />

타입 3을 정화할 수 있다. 따라서, 여섯가지 폐렴쌍구균 다당류들과 야토균 O 항원 다당류는 IL-6 생산을 위<br />

해 정화됨이 밝혀졌다.<br />

IL-6 생산을 위해 정화되는 일곱가지 다당류를 위한 PCMV들은 실시예 1에서와 비슷한 방법으로 DNI를 수송단백<br />

질로 이용함으로써 합성하였다. 예비적인 면역원성 실험은 일곱가지 PCMV 모두가 다양한 정도의 면역원성을<br />

가짐을 뒷받침한다. 폐렴쌍구균의 DNI-기초 “1가 ”PCMV 다당류 14 (14-PCMV)는 세 번째 면역접종에서 크게<br />

부스팅하는 항-PPS14 Ig G를 높은 타이터로 유도함을 발견하였다.<br />

놀랍게도 14-PCMV가 다른 여섯가지 PCMV들과 혼합되어 “칵테일A”면역원을 만들 경우에 동일한 면역 반응이<br />

일어났다. Prevnar는 알룸(alum)이 흡수된 “보조적”백신이기 때문에 6가의 PCMV 칵테일이 알룸 보조제에 흡<br />

착될 수 있을 것인지가 결정되었다. PCMV 또는 DNI 단백질과 혼합된 (그러나 글루타르알데히드와는 크로스링<br />

크되지 않은) 다당류의 대조군 혼합물에 노출된 후 알룸에 흡착된 다량의 폐렴쌍구균 다당류의 측정을 통한 면<br />

역 분석의 결과는 PCMV의 다당류들이 대조군(다당류+ 크로스링크되지 않은 DNI 단백질)의 다당류보다 알룸에 흡<br />

착된다는 사실을 보여주었다(면역검정(immunoassay)에서 더 희석된 PCMV의 높은 면역반응성에 의해 알 수 있듯<br />

이).<br />

마우스의 면역화를 이용하여 알룸 보조제에 흡착시키거나 또는 흡착시키지 않은 상태에서 헵타밸런시 PCMV의 면<br />

역원성을 평가하였다. 알룸 보조제는 PS14에 대한 면역반응의 속도론적 특성을 개선시켰고 보조제로 처리되지<br />

않은 백신보다 7일 빨리 상기 다당류에 대한 Ig G를 유도하였다. 그러나 헵타밸런시 PCMV는 알룸의 부존재 하<br />

에서 면역원성이 대조군 크로스링되지 않은 다당류+DNI 조합이 알룸의 존재 하에서 보여주는 면역원성 보다 높<br />

게 나타났다. 이러한 결과는, PCMV 과정이 다당류들을 마우스에 대한 면역원성을 보다 높게 한다는 것을 보여<br />

주며, 접합 백신의 칵테일과 유사하게 면역반응을 유도할 수 있는 칵테일의 제조에 PCMV 과정이 이용될 수 있다<br />

는 것을 뒷받침한다.<br />

추가 실험에서, 페놀 추출 및 에탄올 침전을 실시하여, 상업적으로 구입한 23개 폐렴연쇄상구균 다당류로부터<br />

TLR 아고니스트 오염물을 제거한다. 표준방법에 따라 페리토니얼 대식세포에 의한 IL-6의 유도에 대하여 처리<br />

된 다당류들을 시험함으로써, 오염물의 제거를 확인한다. IL-6 유도 활성이 없는 다당류들을 이용하여 PCMV의<br />

제조한다. PCMVs에 이용된 다른 다당류는 야토균으로부터 정제된 O 항원 PS 및 탄저균으로부터 얻는 PGA 캡슐<br />

을 포함한다. 총 25종 캡슐을 가지고 실험한다(23종 폐렴연쇄상구균 타입, 야토병 및 탄저병 타입 각각 1종).<br />

25종의 캡슐 타입이 실시예 1에서의 방법에 의해 DNI 단백질을 이용하여 PCMV를 만들기 위해 사용되었다. 초<br />

기의 PCMV 시료를 만들기 위해 다당류 대 단백질을 1:1비율(대략 1:1의 건조중량 비율)로 하였다. 예비적인<br />

실험에서 다양한 PCMV 시료의 면역원성과 완벽히 연관되는 크로스링크를 하는 단백질에 대한 증거를 찾기 위해<br />

각각의 시료를 SDS-PAGE로 특징지웠다. 같은 캡슐 타입(예;6B 및 23F)에 있어서 택일적 크로스링킹이 이용될<br />

수 있다. SDS-PAGE 등에서 단백질 크로스링킹의 증거를 보여주는 모든 PCMV 시료에 대해 면역원성 실험을 수<br />

행한다. 예를 들면, 다섯 개의 각각 다른 매트릭스 단백질 및 두 개의 다른 항원을 사용하는 열 개의 다른<br />

PCMV를 다음과 같이 만든다. 5개의 매트릭스 단백질은 그들이 FDA 승인 백신에서 현재 사용되는지 여부 또는<br />

그밖에 PCMV시료의 안정성을 측정하기 위한 탐침으로써 사용될 수 있는 특성이 있는지를 기초로 선택한다. 사<br />

용되는 매트릭스 단백질은 (1)콜레라 톡신 B 서브유닛(SBL 백신B에서 얻을 수 있다),(2)디프테리아 톡신<br />

(diphtheria toxin),(3)테타누스 톡신(tetanus toxin)절편 C("Frag C")(Sigma Aldrich로부터 구입할 수 있<br />

다),(4)DNI 및 (5)대장균의 베타-갈락토시다아제(Sigma Aldrich로부터 구입할 수 있다)이다. 탄저균 또는 폐<br />

렴연쇄상구균 캡슐 타입 14에서 추출한 폴리-D-글루타민산(Suarez et al. Appl. Environ. Micobiol. 67:969-<br />

971 (2001))을 캡슐 항원으로 사용한다. 이들 두가지 캡슐 항원은 DNI를 상응하는 PCMV에서 매트릭스 단백질<br />

로 함께 사용할 경우 매우 고 면역원성이 된다. 각각의 캡슐 항원은 각각 5개의 선택된 매트릭스 단백질과 결<br />

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합하여 10개의 다른 PCMV를 만든다.<br />

PCMV에 대해 종래의 접합 백신에서 관찰되는 것처럼 마우스에서 아이소타입 항체가 Ig G 로 스위치(switch)되는<br />

것을 유도하는 능력을 시험할 수 있다. 모든 항원은 알룸에 흡착될 수 있고 일반적으로 PCMV 시료당 5마리의<br />

마우스가 사용된다. 마우스는 시험대상의 항원에 대한 면역반응의 기준선을 얻기 위해 미리 출혈시킨다. 마<br />

우스는 이후 표준 IP 주사 프로토콜에 따라 3번(실험전날, 7일째, 14일째) 면역접종시키며, 1차 접종 후 10일째<br />

20일째, 30일째, 60일째에 각각 수집한다. 마우스 혈청은 다당류 및 수송단백질에 대한 Ig G의 표준 ELISA<br />

에세이에 의해 분석한다. 이 실험에서, 다양한 PCMV 시료의 항-다당류 Ig G를 유도하는 능력을 거의 면역원성<br />

이 없는 비접합 다당류와 비교하여 측정하기 위해 다당류만으로 면역 접종된 마우스로 구성된 대조군을 사용한<br />

다. 유망한 PCMV(예를 들면 다당류에 대해 많은 양의 Ig G를 유도하는)에 대해선 더 신중한 면역학적 분석을<br />

하여 쥐에서의 PCMV에 대한 면역 반응의 속도론적 및 양적 반응의 측면을 확립한다. 또는, 유망한 PCMV와 그<br />

들의 상응하는 대조군은 레빗 항-혈청의 생산을 위해 상업적 판매자에게 제공될 수 있다. 유사한 면역분석이<br />

레빗에서의 면역원성, 유도된 항원의 분류 및 면역반응의 속도론을 측정하기 위해 행해진다. 이 실험에서 대<br />

조군은 디프테리아 톡신과 연관된 비독성 변이 단백질인 CRMl 97에 결합된 7개의 각기 다른 종래의 접합 다당<br />

류 백신의 혼합물에 흡착된 알룸의 상업적 생산품인 Prevnar이다.<br />

PCMV에 의해 유도된 항체 반응의 기능성을 측정할 수 있다. 예를 들어, 항-다당류 항체가 포집된<br />

(encapsulated) 폐렴연쇄상구균을 옵소닌화하여 대식세포가 식균작용을 하게 하는 능력을 측정함으로써 그 기능<br />

성을 가늠한다. 폐렴연쇄상구균의 위협으로부터 동물을 지키는 것은 면역접종된 동물에서의 백신의 효과를 증<br />

명하는 또다른 방법이다.<br />

실시예 4 : PCMV와 Prevnar의 비교<br />

Merck 을 통해 혹은 Serum Institute of India (SII)에서 직접 구한 ATCC에서 얻은 폐렴연쇄상구균 다당류<br />

(pps) 6B, 14, 23F 의 상대적 청결성을 결정하였다. IL-6 발현은 pps의 청결성의 척도로 사용하였고, LPS는“<br />

더러움”의 양성대조군으로 사용되었다. 도 9A에서 보듯이, Merck pps 6B, 14, 및 23F는 청결하나, 도 9B에서<br />

보듯이 SIl의 pps 6B는 더럽다. 도 10에 나타난 바와 같이 처리 2 (1M 수산화나트륨에서 80℃로 1시간 배<br />

양)는 SII pps 6B를 제거한다. 청결한 pps 6B를 접합 백신과 PCMV의 면역원성의 비교에 사용한다. 표 3에서<br />

보는 바와 같이 오염물은 LPS가 아니다.<br />

표 3<br />

다당류의 엔도톡신 분석<br />

다당류 엔도톡신 unit/mg 다당류<br />

SII pps 6B-무처리 0.75<br />

SII pps 6B-무처리 0.85<br />

SII pps 6B-처리 2 0.24<br />

다양한 Merck pps 0.1-0.4<br />

도 11 및 13은 알룸 보조제인 Prevnar가 pps 6B에 대한 Ig G 항체를 유도하는 것과 알룸으로 보조되는 PCMV(BSA<br />

와 pps 6B; 디프테리아 톡신과 pps 6B; 디프테리아 톡소이드와 pps 6B; 및 테타누스 톡소이드와 pps 6B)가<br />

Prevnar에서 관찰되는 것보다 더 잘 유도함을 보여준다. 도 <strong>12</strong>에서 보듯이, 알룸으로 보조되는 PCMV에 대한<br />

Ig M 의 반응은 Prevnar의 그것과 유사하다.<br />

뿐만 아니라, 도 14-16에서 보듯이, Prevnar의 대부분의 면역원성 pps인 pps 14 에 있어, 디프테리아 톡소이드<br />

와 pps 14 또는 테타누스 톡소이드와 pps 14를 포함하는 알룸으로 보조되는 PCMV는 대략 Prevnar과 동일한 Ig G<br />

의 유도 효과를 보인다.<br />

실시예 5 : 다가(Multivalent) PCMVs<br />

다가(Multivalent) 면역원은 DNI 수송단백질과 글루타르알데히드가 크로스링크하기 전에 각각 다른 캡슐 유기<br />

중합체를 화학적으로 혼합하는 PCMV 방법을 사용하여 만들어진다("one pot synthetic reaction"). 이들 종류<br />

의 3가 면역원은 DNI를 수송단백질로 이용하여 3개의 유기 중합체 - PGA, 알긴산 및 덱스트란 - 로부터 만들어<br />

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공개특허 10-2009-0066272

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진다. 이들 3가 백신은 면역원성을 가지고 상기 세 종류의 유기 중합체에 대한 면역반응을 생성한다. 도 6<br />

에 혼주혈청(pooled serum) Ig M을 면역접종 전 및 접종 30일 후에 분석한 결과를 나타내었다. 도 7에선 항원<br />

특이적 혈청 Ig GG 항원 타이터의 접종 60일후를, 도 8에선 항-다당류 혈청 항체 타이터의 접종 <strong>12</strong>8일 후를 각<br />

각 보여준다. 도 6-8에서 보듯이, 단가 알긴산 PCMV 시료는 마우스에서도 면역반응을 생성한다. 다가 PCMV<br />

면역원도 각각 별개로 합성되는 특정 PCMV들을 혼합하여 “칵테일” 백신을 형성함으로써 만들어질 수 있다.<br />

본 명세서에 인용되고 참조된 모든 특허, 특허출원 및 특허출원 공개 및 다른 공개문헌들은, 각각의 특허, 특허<br />

출원 및 특허출원 공개 및 다른 공개문헌이 특이적으로 그리고 개별적으로 본 명세서에 참조로서 삽입된 것과<br />

동일한 정도로 본 명세서에 참조로서 삽입된다.<br />

도면의 간단한 설명<br />

도 1은 다당류와 수송단백질인 테나우스 톡소이드(tenaus toxoid)간의 접합체에 대한 접합 백신의 항-다당류 Ig<br />

G의 무제한 면역반응 유도과정을 도식화 한 것이다. 이 모델에서, 다당류를 인식하는 항체 수용체를 가지는 B<br />

세포만이 다당류-단백질 접합체와 결합한다. 따라서 수송단백질은 정확한 다당류 결합 특성을 가지는 B세포<br />

표면에 결합한다.<br />

도 2는 PCMV와 대조군의 크로스 링킹(cross-linking)을 탐지하기 위한 SDS PAGE의 웨스턴 블롯 분석 및 항-PA<br />

항혈청의 웨스턴 블로팅 결과이다. DNI 단백질은 글루타르알데히드의 크로스 링킹 이전에 84kDa 지점에서 이<br />

동하였다. PVCM1-PVCM3(레인 1-3)에서 분자량이 220kDa 이상의 밴드가 이동함으로써 DNI 단백질이 폭넓은 크<br />

로스 링킹을 하고 있음을 보여준다. PGA가 없느 경우에 홀로 크로스 링킹되는 DNI 단백질 역시 높은 분자량을<br />

보여준다(레인 5). 반대로 PGA와 혼합하고 글루타르알데히드를 처리하지는 않은 DNI 단백질은 DNI 혹은 더 작<br />

은 분자량의 물질과 함께 이동함을 확인하였다(레인 4).<br />

도 3은 세가지 PCMV (PCMV1-PCMV3)와 두가지 대조군 항원 4 및 5로 면역화된 마우스에서의 Ig M 및 Ig G 에 의<br />

한 항-DNI 면역반응을 측정하기 위한 ELISA 분석 결과를 나타낸 그래프이다. DNI 단백질은 글루타르알데히드<br />

와 크로스링크되지 않은 대조군 4를 제외한 모든 표본에서 매우 면역원성이 높았다. 그러나, 이러한 DNI에 대<br />

한 면역반응은 전적으로 Ig G에 기초한다. 어떤 항-DNI Ig M 도 면역화 반응 7일째까지 제거되지 않는 동안<br />

중요한 항-DNI Ig G의 반응은 PCMV로 면역화 된 마우스 및 크로스링크된 DNI로만 면역화 된 마우스 에서 17일간<br />

관찰되었다. 4번 표본을 포함한 모든 표본에서 30일째에 DNI에 대한 강력한 면역촉진반응이 관찰되었다.<br />

도 4는 세가지 PGMV (PGMV1-PGMV3) 및 두가지 항원 대조군 4번 및 5번으로 면역화 된 마우스에서의 Ig M에 의한<br />

항-PGA 면역반응을 측정하기 위한 ELISA 분석 결과를 나타낸 그래프이다. 항-PGA Ig M의 반응은 캡슐 단량체<br />

의 전형적인 형태를 보여준다. 4번 대조군은 7일째에 탐지 가능한 항-PGA Ig M 반응을 보였으나, 이 반응은<br />

17인째 혹은 30일째에 부스팅되지 않았다. 모든 PCMV 표본은 7일째에 항-PGA Ig M의 반응을 유도하였으며, 17<br />

일과 30일째엔 더 강력한 항-PGA Ig M의 반응을 이끌어냈다. 예상했듯이 5번대조군(크로스링크된 DNI로만 구<br />

성된)은 Ig M 또는 Ig G 어느 것에 의한 항-PGA반응도 유발시키지 않았다.<br />

도 5는 세가지 PGMV (PGMV1-PGMV3) 및 두가지 항원 대조군 4번 및 5번으로 면역화 된 마우스에서 Ig G가 나타내<br />

는 항-PGA 면역 반응을 측정하기 위해 ELISA 분석을 한 결과를 나타낸 그래프이다. PCMV1-3은 17일째에 나타<br />

나고 30일째에 명확히 부스팅하는 Ig G에 의한 강력한 항-PGA 면역반응을 보인다.<br />

도 6은 면역화 이전과 DNI, 알지네이트(DNI-ALG C,DNI_ALG A) 및 DNI,알지네이트(ALG), 덱스트란(DEX) 및 PGA<br />

로 구성된 one pot trivalent PCMV를 포함하는 PCMV에 의한 면역화 이후 30일째의 혈청 Ig M 항체의 농도를 나<br />

타낸 그래프이다.<br />

도 7은 DNI, 알지네이트(DNI-ALG C,DNI_ALG A) 및 DNI,알지네이트(ALG), 덱스트란(DEX) 및 PGA로 구성된 one<br />

pot trivalent PCMV를 포함하는 PCMV에 의한 면역화 이후 60일째의 혈청 Ig G 항체의 농도를 나타낸<br />

그래프이다.<br />

도 8은 DNI, 알지네이트(DNI-ALG C,DNI_ALG A) 및 DNI,알지네이트(ALG), 덱스트란(DEX) 및 PGA로 구성된 one<br />

pot trivalent PCMV를 포함하는 PCMV에 의한 면역화 이후 <strong>12</strong>8일째의 항-다당류 Ig G 항체의 농도를 나타낸 그래<br />

프이다.<br />

도 9a 및 9b는 폐렴구균 다당류(S. pneumoniae pss)[American Type Culture Collection, Merk or SII(Serum<br />

Institute of India)]를 이용한 인터루킨(IL)-6 에세이 그래프이다.<br />

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도 10은 SII에서 얻은 pss 6B의 오염물이 처리 2(trt 2; 1M 수산화나트륨에서 80℃로 한시간 배양)를 통해 지워<br />

질 수 있음을 보여주는 그래프이다. 처리 1(trt1)은 다당류로부터 단백질을 제거하기 위한 다섯 번의 연속된<br />

페놀 추출과정이다.<br />

도 11은 pss 6B를 함유하는 PCMV가 Prevnar보다 Ig G 생산을 유도하는데 더 효과적임을 보여주는 그래프이다<br />

(BSA = Bovine Serum Albumine, DT = Diphtheria toxin; DTx = Diphtheria toxoid; and TTx = tetanus<br />

toxoid).<br />

도 <strong>12</strong>는 pss 6B를 함유하는 PCMV가 Ig M 생산을 유도하는데 Prevnar와 동일한 효율성을 가짐을 보여주는 그래프<br />

이다.<br />

도 13은 pss 6B를 함유하는 PCMV가 Prevnar보다 Ig G 생산을 유도하는데 더 효과적임을 보여주는 그래프이다.<br />

도 14-16은 pss 14를 함유하는 PCMV가 Prevnar와 비교하여 Ig G 생산을 유도하는데 대략 동일한 효율성을 가짐<br />

을 보여주는 그래프이다(DTx = Diphtheria toxonoid; TTx = Tetanus toxoid).<br />

도면<br />

도면1<br />

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도면2<br />

도면3<br />

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도면4<br />

도면5<br />

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도면6<br />

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도면7<br />

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도면8<br />

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도면11<br />

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도면<strong>12</strong><br />

도면13<br />

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도면14<br />

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도면15<br />

도면16<br />

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