laboratorium Bioveiligheid in het

VLAAMS INTERUNIVERSITAIR INSTITUUT
VOOR BIOTECHNOLOGIE
UNIVERSITEIT
GENT
Universiteit Antwerpen
Bioveiligheid
in het
laboratorium

Bioveiligheid
in het
laboratorium
1e editie, april 2000
Uitgave van VIB,
Vlaams Interuniversitair Instituut
voor Biotechnologie
Redactie:
René Custers,
regulatory affairs manager, VIB
Verkrijgbaar bij:
VIB
Rijvisschestraat 120
9052 Zwijnaarde
tel.: (09) 244 66 11
fax: (09) 244 66 10
e-mail: vib@vib.be
web: http://www.vib.be
Verantwoordelijke uitgever:
Jo Bury, VIB
Rijvisschestraat 120
9052 Zwijnaarde
Niets uit deze brochure mag worden
verveelvoudigd en/of openbaar gemaakt
voor commerciële doeleinden.
Voor educatieve doeleinden dient steeds
de bron vermeld te worden.
© April 2000

VOORWOORD
De moderne biotechnologie is niet meer weg te denken uit de onderzoekslaboratoria.
Duizenden onderzoekers maken gebruik van micro-organismen, planten of dieren om relevante
onderzoeksvragen te beantwoorden. Steeds vaker gaat het daarbij om genetisch
gewijzigde organismen (GGO’s).
Het is de onderzoekswereld zelf die in het verleden gewezen heeft op het belang van het
veilig werken met GGO’s. Dit heeft geleid tot de ontwikkeling van regels en richtlijnen die
tot doel hebben bij te dragen tot de bescherming van mens en milieu. Inmiddels zijn er
heel wat van deze regels in wetgeving omgezet.
Het behoort tot de maatschappelijke verantwoordelijkheid van de onderzoeker om deze
veiligheidsregels na te leven. Daarnaast behoort het tot de verantwoordelijkheid van de
onderzoeker om studenten, of andere mensen die nog weinig werkervaring hebben, op te
leiden in de theoretische en praktische aspecten van de bioveiligheid.
We hopen dat deze brochure, aangevuld met praktische instructies en begeleiding, een
nuttig werkinstrument blijkt om iedereen op een veilige wijze de boeiende wereld van de
biotechnologische onderzoekslaboratoria te laten induiken.
Jo Bury en Rudy Dekeyser
algemene directie VIB
VIB brochure bioveiligheid in het laboratorium 3

4
INHOUDSOPGAVE
1. INLEIDING . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .5
2. BIOVEILIGHEID . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .6
3. INDELING IN RISICOKLASSEN EN RISICO-ANALYSE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .9
4. VERSPREIDING VAN EN BESMETTING MET ORGANISMEN
IN HET LABORATORIUM . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .13
5. INPERKING: EEN COMBINATIE VAN INFRASTRUCTUUR
EN WERKVOORSCHRIFTEN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .19
6. BESMETTING, ACCIDENTEN, ONTSMETTING EN INACTIVERING . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .26
7. WERKEN MET ENKELE VEELGEBRUIKTE LABORATORIUM-ORGANISMEN . . . . . . . . . .31
8. REFERENTIES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .41
9. VERKLARENDE WOORDENLIJST . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .42
BIJLAGE 1:
INPERKINGSEISEN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .43
BIJLAGE 2:
VIB RICHTLIJNEN VOOR INSCHALING VAN ACTIVITEITEN MET GGO’S . . . . . . . . . . . . . .52
BIJLAGE 3 :
DE BIOLOGISCHE RISICOKLASSE VAN ENKELE RELEVANTE PATHOGENEN . . . . . . . .60
BIJLAGE 4:
LEESCOMMISSIE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .64
BIJLAGE 5:
INFORMATIEBLAD . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .64
VIB brochure bioveiligheid in het laboratorium

1. INLEIDING
In veel biotechnologisch en biomedisch onderzoek wordt gewerkt met biologisch materiaal.
In steeds grotere mate wordt daarbij gebruik gemaakt van moderne moleculair biologische
technieken zoals recombinant-DNA technologie. In dit boekje wordt een kort overzicht
gegeven van de basisprincipes die van belang zijn voor het veilig werken met genetisch
gemodificeerde en/of ziekteverwekkende organismen. Daarbij zijn drie typen van
beschermende veiligheidsmaatregelen te onderscheiden:
a. bescherming van de onderzoeker,
b. bescherming van het experiment, en
c. bescherming van mens en milieu.
De verschillende maatregelen zullen in dit boekje zowel worden uitgewerkt voor microorganismen
(onder meer bacteriën, virussen en schimmels), als voor planten en dieren.
Iedereen die in een laboratorium met deze organismen werkt moet de basisbegrippen van
bioveiligheid kennen en er in de dagelijkse laboratoriumpraktijk naar handelen. Alleen op
die manier kan een werksituatie worden gecreëerd die veilig is voor uzelf, voor de medemens
en voor het milieu.
Het veilig werken met biologisch materiaal wordt bovendien vereist vanuit twee typen van
wetgeving die aan de basis liggen van de voorschriften zoals deze in dit boekje worden
uitgewerkt:
1. De wetgeving voor de bescherming van de medewerker bij de uitvoering van zijn werk.
2. De milieuwetgeving voor het werken met genetisch gemodificeerde organismen.
Voor beide bestaat een Europese wetgeving die in de nationale wetgeving is omgezet.
Figuur 1: Het biohazard teken. Dit teken geeft aan dat er met biologisch risicohoudend
materiaal wordt gewerkt (vanaf risicoklasse 2)
VIB brochure bioveiligheid in het laboratorium 5

6
VIB brochure bioveiligheid in het laboratorium
2. BIOVEILIGHEID
Wat is bioveiligheid?
De bioveiligheid van laboratoriumwerk staat centraal in dit boekje. Daarbij gaat het om de
intrinsieke gevaren van levende organismen en hoe deze veilig te hanteren. Ook genetisch
materiaal zoals ‘naakt’ DNA kan gevaarlijk zijn. Voordat werk met pathogene of genetisch
gemodificeerde organismen (GGO’s) in een laboratorium wordt gestart moet stilgestaan
worden bij de eigenschappen van die organismen en moeten waar nodig maatregelen
worden getroffen om eventuele risico’s voor mens of milieu tot een minimum te beperken.
...’Safety first!’...
Welke gevaren?
Biologisch materiaal is noch intrinsiek gevaarlijk, noch intrinsiek veilig. Eventueel gevaar
hangt af van de eigenschappen van een organisme. Eigenschappen van organismen die
gevaar inhouden, zijn de volgende:
• Pathogeniteit
De pathogeniteit geeft aan of een organisme - bijvoorbeeld een bacterie, virus, schimmel,
of parasiet - in staat is een ziekte te veroorzaken bij een plant, dier of mens. Factoren
zoals infectiedosis, virulentie en productie van toxines door de ziekteverwekker spelen
een rol in de mate waarin het organisme in staat is een ziekte te veroorzaken.
Infectiedosis
Besmetting met één pathogeen betekent nog niet automatisch een infectie.
De infectiedosis verschilt van pathogeen tot pathogeen. Hieronder volgen
voorbeelden van enkele voor de mens relevante infectiedosissen van
pathogenen wanneer zij via hun natuurlijke verspreidingsweg verspreid
worden:
pathogeen Infectieuze dosis
adenovirus > 150 pfu (intranasaal)
influenza virus 790 pfu (nasopharyncheaal)
tuberculose bacteriën 10 bacillen (inhalatie)
typhus bacteriën 105 bacteriën (ingestie)
pfu = plaque forming units
Bron: Material Safety Data Sheets, Health Canada
• Toxiciteit
Toxiciteit is vergiftiging. De meeste stoffen zijn bij normaal gebruik niet in staat een
vergiftiging te veroorzaken. De mate van toxiciteit wordt meestal aangegeven in een

LD50 waarde voor vertebraten uitgedrukt in gewichtseenheden per kg lichaamsgewicht.
De LD50 (LD staat voor: Lethal Dose) is de waarde waarbij blootstelling aan het agens tot
gevolg heeft dat 50% van de blootgestelde proefdieren dood gaat. Als het gaat om
levende organismen, dan gaat toxinevorming vaak gepaard met pathogeniteit.
• Allergeniteit
Allergeniteit is een niet-toxische, door het immuunsysteem gemedieerde, ongewenste
reactie van het lichaam op een stof of agens. Immuunglobuline E (IgE) en mestcellen
(cellen van het immuunsysteem die onder meer heparine produceren) spelen vaak een
rol in de allergische reactie. Een allergische reactie kan zich onder meer uiten in huidirritaties,
niezen, astmatische aanvallen, chronische longaandoeningen en kan soms zelfs
leiden tot een levensbedreigende shock.
Ter voorkoming van long- en huidaandoeningen bij laboratoriumpersoneel
dient de mogelijkheid van een allergische reactie mee in overweging genomen
te worden en dient ernaar gestreefd te worden om rechtstreeks contact
(inademen, huidcontact) van het personeel met allergene stoffen te
vermijden.
• Verstoring van ecologische evenwichten
Hier is het met name van belang om mogelijke verstoringen van ecologische evenwichten
die verband houden met activiteiten met GGO’s te bespreken. Verstoring van een
ecologisch evenwicht zou kunnen gebeuren wanneer een GGO met een bepaalde eigenschap
zich ongewenst naar het milieu verspreidt, of wanneer er vanuit dat organisme
verspreiding van genetisch materiaal plaatsheeft naar andere organismen in het milieu.
Aan de potentiële gevaren die verbonden zijn aan recombinant-DNA technologie en de
risico-inschatting daarrond zal verderop in dit boekje dieper worden ingegaan.
• Andere schadelijke effecten
Soms zijn er ook andere ongewenste effecten die maken dat extra voorzichtigheid geboden
is bij het hanteren van biologisch materiaal. Het is niet mogelijk een limitatieve
lijst te maken van dergelijke effecten. Waar het echter om gaat is dat men stil moet
staan bij de eigenschappen van materiaal voor ermee te gaan werken. Als belangrijke
categorie kunnen misschien de genen aangeduid worden die immuunmodulerende
eigenschappen bezitten. Daarbij is echter lang niet elke immuunmodulatie schadelijk.
Om uitsluitsel te geven over het gevaar moeten de eventuele effecten worden nagegaan
en is vaak overleg aangewezen. Ter illustratie kan het voorbeeld gegeven worden van
het werken met een vacciniavirus waarin een gen gekloneerd is dat voor immuunsuppressie
zorgt. De immuunsuppressie zou ervoor kunnen zorgen dat het lichaam een mogelijke
infectie met dat virus niet goed kan bestrijden. Infecties met vacciniavirus kunnen
in uitzonderlijke gevallen leiden tot een dodelijke encephalitis.
VIB brochure bioveiligheid in het laboratorium 7

8
Werken met ‘naakt’ DNA
We worden in onze leefomgeving dagelijks geconfronteerd met DNA. In
het laboratorium wordt vooral gewerkt met DNA in de vorm van plasmiden,
gedigesteerd DNA, of primers. DNA op zich is ongevaarlijk. Maar toch
is het werken met DNA niet altijd ongevaarlijk. Met name wanneer het
DNA codeert voor een cellulair oncogen. Met een oncogen wordt in dit
geval een ‘dominant transformerend’ gen bedoeld: een gen dat na incorporatie
in het genoom de transformatie* van de cel als directe gevolg heeft.
Transformatie - de omvorming naar een snel- en oneindig delende cel - is
de belangrijkste eerste stap in tumorvorming. Een prikaccident met dergelijk
materiaal brengt een risico met zich mee. Medewerkers die met dit
materiaal werken dienen zich bewust te zijn van het risico, dienen handschoenen
te dragen en moeten het werken met scherpe voorwerpen (scalpels,
injectienaalden) tot een minimum beperken. Eénmaal dit DNA in een
bacterie of een cel geïncorporeerd is, brengt het niet langer een verhoogd
risico met zich mee. Tenzij de cel een packagingcel is waarin het oncogen
door een virale vector kan worden opgenomen die het oncogen verder kan
verspreiden.
Oncogenen en virale vectoren
Het kloneren van DNA dat codeert voor een dominant transformerend cellulair
oncogen brengt met name een extra risico met zich mee wanneer het
in een virale vector wordt gezet die in het genoom integreert. Daarbij
wordt onderscheid gemaakt tussen amphotrope en ecotrope virale vectoren
aangezien de laatste alleen muizencellen kunnen infecteren. Amphotrope
vectoren kunnen ook menselijke cellen infecteren en brengen dus een
hoger risico met zich mee dan ecotrope.
*zie verklarende woordenlijst
VIB brochure bioveiligheid in het laboratorium

3. INDELING IN RISICOKLASSEN
EN RISICO-ANALYSE
Pathogene organismen
Organismen worden ingedeeld in vier risicoklassen. Organismen die geen ziekten verwekken
horen thuis in risicoklasse 1. Ziekteverwekkers horen thuis in de klassen 2, 3 of 4, afhankelijk
van de mate van ziekteverwekkendheid en de mate waarin therapieën beschikbaar
zijn. Om een onderscheid aan te kunnen geven met de risicoklassen voor GGO’s
wordt de risicoklasse van een natuurlijk pathogeen vaak aangeduid als de biologische risicoklasse.
Hieronder volgt een beknopt overzicht waarin is aangegeven welk type van organisme
in de betreffende klasse thuishoort:
klasse 1 niet-pathogeen zeer onwaarschijnlijk dat het agens een
ziekte veroorzaakt
klasse 2 zwak pathogeen laag infectievermogen en goed
te bestrijden
klasse 3 matig pathogeen zeer infectieus, maar goed te bestrijden,
of matig infectieus maar nauwelijks
te bestrijden
klasse 4 zwaar pathogeen zeer infectieus, vaak dodelijk, en niet
of nauwelijks te bestrijden
Naast de indeling van een pathogeen in een klasse is het altijd van belang te vermelden
welke gastheer het pathogeen heeft. Infectieziekten zijn namelijk een wisselwerking tussen
pathogeen en gastheer. Bepaalde pathogenen hebben een breed gastheerbereik, andere kunnen
slechts één of enkele gastheren infecteren. Ook kan de pathogeniteitsklasse van een bepaald
pathogeen dat zowel de mens als het dier kan infecteren, per gastheer verschillen. Zo
is voor de mens de pathogeniteitsklasse van Herpes virus B klasse 3 en voor het dier klasse 2.
Van de indeling van pathogenen in de biologische risicoklassen zijn lijsten gepubliceerd,
waarin de biologische risicoklasse van de verschillende organismen kan worden opgezocht.
In België zijn de volgende lijsten relevant:
• bijlage 5.51.8 aan Vlarem II (http://biosafety.ihe.be/NL/Arr.Vl.NL/MenuVL.html), en
• bijlage 1 aan het Koninklijk Besluit van 4 augustus 1996 betreffende de bescherming
van de werknemers tegen de risico’s bij blootstelling aan biologische agentia op het
werk (alleen humaan pathogenen; Belgisch Staatsblad 01/10/1996).
In bijlage 3 is de biologische risicoklasse weergegeven van enkele relevante pathogenen.
Opportunistische pathogenen zijn organismen die alleen een ziekte kunnen veroorzaken in
mensen of dieren waarvan het immuunsysteem onvoldoende functioneert. Deze organismen
worden ingedeeld in klasse 1.
VIB brochure bioveiligheid in het laboratorium 9

10
Aan het werken met niet-genetisch gemodificeerde klasse 1 organismen worden in de
wetgeving geen eisen gesteld. Toch is het voor niet-genetisch gemodificeerde klasse 1
micro-organismen en cellen sterk aanbevolen om de basisprincipes van Veilige Microbiologische
Technieken (VMT) te hanteren (zie hst 5). Het werken met klasse 2, 3 en 4 agentia
mag alleen in speciaal daarvoor uitgeruste laboratoria.
Genetisch gemodificeerde organismen (GGO’s)
Recombinant-DNA technologie is niet meer uit moderne biologische en biomedische
onderzoekslaboratoria weg te denken. Escherichia coli K12 is daarbij het paradepaardje
onder de laboratoriumorganismen en wordt door bijna iedereen gebruikt als middel om
DNA te kloneren of tot expressie te brengen.
Definitie van een GGO
GGO’s zijn organismen waarvan het genetisch materiaal is gewijzigd op een
wijze die niet mogelijk is door voortplanting of natuurlijke recombinatie.
Technieken die leiden tot de vorming van een GGO zijn in ieder geval:
• recombinant DNA- en RNA- technieken waarbij gebruik wordt gemaakt
van gastheer/vectorsystemen,
• technieken waarbij genetisch materiaal dat buiten het organisme is geprepareerd,
rechtstreeks in een organisme wordt gebracht, daaronder begrepen
micro-injectie, macro-injectie en micro-encapsulatie,
• celfusie- of hybridisatietechnieken waarbij levende cellen met nieuwe
combinaties van genetisch materiaal worden gevormd die van nature
niet voorkomen.
De volgende technieken worden niet geacht te leiden tot genetische modificatie,
op de voorwaarde dat bij de technieken geen gebruik gemaakt
wordt van recombinant DNA moleculen of GGO’s:
• in vitro bevruchting,
• conjugatie, (faag)transductie, virale infectie, transformatie of elk ander
natuurlijk proces,
• polyploïde-inductie.
Inmiddels kan een groot aantal organismen genetisch gemodificeerd worden, bijvoorbeeld:
bacteriën, gisten, schimmels, insecten (fruitvlieg), parasieten (malaria), nematoden (bijv.
Caenorhabditis elegans), planten, kikkers (Xenopus) of zoogdieren (muizen, ratten, konijnen,
geiten, schapen, varkens, runderen). Bij genetische modificatie zijn altijd de volgende
componenten betrokken:
1. Een gastheer (het te modificeren organisme);
N.B. De term ‘gastheer’ heeft hier een andere betekenis dan in de context van pathogenen (zie verklarende
woordenlijst)
2. Een vector (die afhankelijk van het gebruikte systeem al dan niet in het uiteindelijke
GGO aanwezig zal zijn);
3. Een donorsequentie (of insert), afkomstig uit een bepaald organisme (het donororga-
VIB brochure bioveiligheid in het laboratorium

nisme). Ook wordt steeds vaker gewerkt met een synthetisch vervaardigde sequentie.
Deze sequentie kan ofwel van nature in een bepaald organisme voorkomen, ofwel volledig
nieuw zijn.
De risico-analyse
GGO’s zijn (net als niet-GGO’s) noch intrinsiek gevaarlijk, noch intrinsiek veilig. Daarom
wordt per geval een risico-analyse uitgevoerd. De risico-analyse is een drietrapsproces
waarin achtereenvolgens:
1. De eigenschappen van de gastheer, vector en donorsequenties die gevaar met zich
meebrengen zoals pathogeniteit, toxiciteit, mogelijkheden tot verspreiding van het
organisme en overdracht van genetisch materiaal worden geïdentificeerd. Dit leidt tot
een eerste identificatie van het niveau van risico.
2. Vervolgens wordt vastgesteld welke maatregelen nodig zijn om het organisme veilig te
kunnen hanteren. Daarbij wordt rekening gehouden met:
• De eigenschappen van het milieu dat aan het GGO zou kunnen worden blootgesteld.
• Het type en de schaal van de activiteit.
• Eventuele niet-standaard handelingen.
3. Aan de hand van de uitkomst van de stappen 1 en 2 wordt dan de risicoklasse vastgesteld.
Net als bij pathogenen worden GGO’s ingedeeld in vier risicoklassen, en wel als volgt:
risicoklasse 1 GGO’s die geen of een activiteiten waarvoor inperkingsniveau 1
verwaarloosbaar risico inhouden voldoende is om zowel de mens als het milieu
te beschermen
risicoklasse 2 GGO’s die weinig risico activiteiten waarvoor inperkingsniveau 2
inhouden voldoende is om zowel de mens als het milieu
te beschermen
risicoklasse 3 GGO’s die een matig risico activiteiten waarvoor inperkingsniveau 3
inhouden voldoende is om zowel de mens als het milieu
te beschermen
risicoklasse 4 GGO’s die veel risico activiteiten waarvoor inperkingsniveau 4
inhouden voldoende is om zowel de mens als het milieu
te beschermen
Er is inmiddels al heel wat ervaring met de risico-analyse van GGO’s. Dit heeft geleid tot
richtlijnen voor het indelen van GGO’s. Deze richtlijnen zijn weergegeven in bijlage 2. Ze
geven een goede indicatie van het benodigde inperkingsniveau. Afhankelijk van het type
en de schaal van de activiteit dient nog nagegaan te worden of er bijzondere aanvullende
maatregelen nodig zijn of dat er maatregelen van het basisinperkingsniveau achterwege
kunnen blijven. De vier inperkingsniveaus voor laboratoria, animalaria en serres zijn beschreven
in bijlage 1.
VIB brochure bioveiligheid in het laboratorium 11

12
Hieronder wordt een vergelijk gemaakt tussen de indeling van pathogenen en GGO’s in
risicoklassen en de bijbehorende basisinperkingsniveaus.
Klasse pathogenen GGO’s basisinperking
risicoklasse 1 niet-pathogenen geen of verwaarloosbaar niveau 1 voor GGO’s, VMT voor
risico niet-gemodificeerde micro-organismen
of cellen*
risicoklasse 2 zwak pathogenen weinig risico niveau 2
risicoklasse 3 matig pathogenen matig risico niveau 3
risicoklasse 4 zware pathogenen veel risico niveau 4
* N.B.: niveau 1 omschrijft vereisten voor zowel de infrastructuur als werkvoorschriften, ook al zijn
de eisen aan de infrastructuur zeer beperkt. VMT (Veilige Microbiologische Technieken) omschrijft
alleen een werkwijze.
VIB brochure bioveiligheid in het laboratorium

4. VERSPREIDING VAN EN
BESMETTING MET ORGANISMEN
IN HET LABORATORIUM
Natuurlijke besmettingswegen
Pathogenen hebben elk hun eigen besmettingsweg via welke ze van het ene naar het
andere organisme overgedragen worden. Hieronder volgen enkele belangrijke besmettingswegen:
besmettingsweg voorbeeld
huidcontact schimmels
via de lucht of via aërosolen mazelenvirus
griepvirus
prikken (insecten, injectienaalden) malariaparasiet
gele koorts parasiet
bloed-bloed contact HIV-virus
hepatitis B virus
via wonden staphylococcen
via faecaal materiaal typhus bacteriën
poliovirus
Al deze besmettingswegen kunnen, afhankelijk van het type werk dat gedaan wordt, in
het laboratorium voorkomen. Bij organismen die zich via de lucht kunnen verspreiden,
spelen kleine druppeltjes of druppelkernen een rol, maar kan verspreiding ook plaatsvinden
via direct contact met bijvoorbeeld de handen, zakdoeken en kleren.
Figuur 2: Verspreiding van micro-organismen via de lucht
VIB brochure bioveiligheid in het laboratorium 13

14
Verspreidingswegen
Blootstelling van laboratoriummedewerkers aan organismen kan op verschillende manieren
gebeuren. In principe kan elke open bron van organismen (bijv. een geopende petrischaal
of fles) een bron van verspreiding van deze organismen zijn. Nu zal een houder in de praktijk
alleen geopend worden wanneer er geen besmetting van het materiaal in de houder
kan plaatsvinden, dus bij een vlam, of in een veiligheidskabinet. De praktijk laat zien dat
van de meeste laboratoriuminfecties de oorzaak onbekend is. In de gevallen dat de oorzaak
wel bekend is gaat het om prikaccidenten, morsen, kapot glaswerk, met de mond pipetteren
en om het bijten of krabben door een proefdier.
Aërosolen
Binnen de verschillende verspreidingswegen verdienen aërosolen bijzondere aandacht.
Aërosolen zijn zeer fijne vloeistofdruppeltjes die zich via de lucht kunnen verspreiden.
Aërosolen ontstaan bijvoorbeeld bij het openen van flesjes met vloeistoffen waarop een
natte stop zit, of bij vortexen, blenden, bij het leegblazen van een pipet of het uitgloeien
van een natte entnaald. Aërosolvorming moet zoveel mogelijk worden vermeden. Bij werk
met organismen die een bepaald gevaar inhouden (vanaf risicoklasse 2) moeten aërosolproducerende
werkzaamheden zoveel mogelijk in een veiligheidskabinet worden uitgevoerd.
VIB brochure bioveiligheid in het laboratorium
Figuur 3: aërosolproducerende handelingen
Ongewenste verspreiding van organismen of
van genetisch materiaal
Zoals hierboven duidelijk mag zijn geworden betekent de verspreiding van voor de mens
gevaarlijke organismen een risico voor de medewerker (uzelf of uw collega’s). Wanneer
verspreiding naar een medewerker mogelijk is, is ook verspreiding naar het milieu niet uit-

gesloten. Verspreiding van organismen of van genetisch materiaal naar het milieu toe is
vaak ongewenst omdat dit een risico met zich mee kan brengen in de zin van verspreiding
van pathogeniteit, toxiciteit of verstoring van een ecologisch evenwicht. Dit geldt zeker
voor de pathogenen en de GGO’s die in de risicoklassen 2, 3 en 4 thuishoren. Voor de
GGO’s die thuishoren in risicoklasse 1 - zij brengen geen of een verwaarloosbaar risico met
zich mee - geldt ook dat de verspreiding van het organisme of van het genetisch materiaal
naar het milieu toe moet worden beperkt.
Bacteriën, gisten, schimmels
Bacteriën zijn in veel gevallen in staat genetisch materiaal over te dragen. Zeker wanneer
gewerkt wordt met vectoren die makkelijk overdraagbaar zijn (makkelijk mobiliseerbaar, of
zelfs zelfoverdraagbaar). Om te voorkomen dat genetisch materiaal makkelijk wordt overgedragen
wordt daarom in de praktijk in de meeste gevallen gewerkt met vectoren die
moeilijk mobiliseerbaar zijn. Gisten en schimmels bezitten niet de eigenschap om gemakkelijk
genetisch materiaal over te dragen. Bij deze organismen gaat het voornamelijk om
het tegengaan van de verspreiding van het organisme zelf.
Het plasmide
bevat genen
die coderen
voor de sex
pili-eiwitten
sex pili chromosoom
Enkelstreng DNA wordt
door de sex pilus
overgedragen naar
de ontvanger.
Figuur 4: Overdracht van een zelfoverdraagbaar plasmide via conjugatie
Zelfoverdraagbaarheid
Natuurlijke plasmiden uit bacteriën bezitten soms de eigenschap om zichzelf
over te kunnen dragen naar verwante bacteriën. Dit betekent dat zij ondermeer
de genen dragen die zorgen voor de aanmaak van de structuren (‘pilli’)
waarmee de ene bacterie een verbinding legt met de andere bacterie. Het
plasmide wordt dan door dit kanaal overgedragen. De frequentie van overdracht
van zelfoverdraagbare plasmiden ligt ook relatief hoog (10 -3 tot 10 -5 ).
VIB brochure bioveiligheid in het laboratorium 15

16
Dierlijke en menselijke cellen
Dierlijke en menselijke cellen kunnen zich niet zomaar naar het milieu verspreiden. Nietbesmette
cellen kunnen ook geen genetisch materiaal ongewenst naar het milieu overdragen.
Dierlijke en menselijke cellen zijn ten dode opgeschreven wanneer zij aan een nietsteriele
omgeving worden blootgesteld. Een uitzondering wordt gevormd door cellen die
van nature in een niet-steriele omgeving moeten overleven, zoals bijvoorbeeld vissen- of
kikkereicellen. In het geval van niet-besmette cellen zijn de maatregelen die getroffen
worden om de celkweek te beschermen ook voldoende om het milieu te beschermen. De
overdracht van genetisch materiaal vanuit dierlijke en menselijke cellen naar de omgeving
kan alleen wanneer de cellen besmet zijn met biologische agentia - bijv. virussen - die in
staat zijn het genetisch materiaal te mobiliseren. De vraag of cellen al dan niet geïnfecteerd
zijn is uit oogpunt van bioveiligheid belangrijk. Eventueel aanwezige virussen kunnen
een gevaar vormen voor de medewerker of het milieu en maatregelen dienen daarop
afgestemd te zijn.
‘Besmette’ dierlijke cellen
Bij activiteiten met dierlijke cellen kan onderscheid gemaakt worden
tussen primaire celculturen en ‘established cell lines’. Primaire
celculturen worden gemaakt door een biopt van een dier of mens
in cultuur te brengen. Vaak kan van dergelijke cellen niet op voorhand
uitgesloten worden dat ze besmet zijn met een ziekteverwekker,
bijv. een virus. Daarom dient met primaire cellen altijd enige
voorzichtigheid te worden betracht. Established cell lines zijn culturen
die al langer in kweek zijn en die geïmmortaliseerd zijn zodat
ze oneindig blijven delen. Meestal is gekend of ze vrij zijn van
ongewenste besmettingen. De immortalisatie van dergelijke cellen
kan op verschillende manieren tot stand zijn gekomen:
• spontaan (zoals bijv. bij NIH-3T3 cellen),
• als gevolg van een natuurlijke virale infectie (bijv. HELA cellen,
waarin enkele genen van het HPV virus aanwezig zijn),
• of door de cellen te transfecteren met een factor die immortalisatie
tot gevolg heeft.
Bij het hanteren van viraal geïmmortaliseerde cellijnen in combinatie
met vectoren waarin virale componenten aanwezig zijn, moet
altijd nagegaan worden of het mogelijk is dat er viruspartikels
gevormd worden. Als dat zo is dient de cellijn ingeschaald te worden
in de risicoklasse van het betreffende virus.
Virussen
Bij virussen kan onderscheid gemaakt worden tussen wild type virussen en virale vectoren
(van virus afgeleide virale constructies). Het gebruik van virussen of virale vectoren impliceert
ook altijd het gebruik van gastheercellen. Zonder gastheercellen geen vermenigvuldi-
VIB brochure bioveiligheid in het laboratorium

ging van het virus. In de praktijk komen er drie typen handelingen voor: (1) celkweek om
een virus te produceren, (2) het hanteren van virus bevattende supernatanten (voor kwaliteitscontrole,
etc...) en (3) het transduceren van een te onderzoeken cellijn, proefdier of
plant. Zeker in de virussupernatanten kan het virus in grote hoeveelheden en geconcentreerd
aanwezig zijn. Voorzichtigheid bij het hanteren van de supernatanten is geboden.
Na infectie van cellen, plant of proefdier hangt het gevaar af van de mogelijkheden van
het virus of de virale vector om zich nog te kunnen vermenigvuldigen. Soms wordt
gewerkt met replicatiedefectief virus, wat betekent dat het virus wel de cellen kan infecteren,
maar zich niet meer kan vermenigvuldigen. De verspreidings- en overlevingsmogelijkheden
verschillen van virus tot virus. Sommige viruspartikels kunnen zich via de lucht verspreiden
en kunnen soms buiten de gastheer lang overleven. Andere virussen, zoals bijvoorbeeld
HIV, zijn buiten de gastheer zeer kwetsbaar. Plantenvirussen hebben soms een
‘vector’ nodig om zich te kunnen verspreiden: vaak een insect die het virus opzuigt en zo
de verspreiding naar andere planten bewerkstelligt.
Transgene planten
Transgene planten worden in-vitro gekweekt, in fytotrons/kweekcellen en in serres en ze
lopen niet zomaar weg. Toch verdient de ongewenste verspreiding naar het milieu bijzondere
aandacht. Zonder de juiste maatregelen kunnen pollen (stuifmeel) zich via de lucht of
met behulp van insecten naar het milieu verspreiden. Of dit een reëel risico vormt hangt af
van de vraag of de plant een zelfbevruchter is of een kruisbevruchter. Bij een zelfbevruchter
blijft de verspreiding van pollen immers zonder effect. In het geval van een kruisbevruchter
is van belang na te gaan of er bloeiende verwante planten in het milieu voorkomen
waarmee de plant zou kunnen hybridiseren (kruisbevruchten). Daarnaast kunnen
zaden van transgene planten zich soms gemakkelijk ongewenst verspreiden. Zaden kunnen
heel fijn of kleverig zijn en worden dan gemakkelijk meegenomen.
pollen
zaad
stengelbasis
Figuur 5: de reproductieve delen van Brassica
VIB brochure bioveiligheid in het laboratorium 17

18
Niet alleen pollen en zaden kunnen aanleiding geven tot de ongewenste verspreiding van
genetisch materiaal van planten. Ook bepaalde plantendelen kunnen soms, afhankelijk van
de plant, nog gemakkelijk uitgroeien tot een hele plant. Zo kan een takje van een wilg
nog uitgroeien tot een hele boom en kan de stronk van kool nog wortel schieten. Dit betekent
dat bij het hanteren van transgene planten of transgeen plantenmateriaal speciale
aandacht moet worden besteed aan de mogelijke verspreiding van de delen van de plant
die (nog) reproductief zijn. Indien er een reële kans bestaat dat de plant zich in het milieu
kan vestigen of indien uitkruising naar (bloeiende) verwanten mogelijk is, dient reproductief
plantenmateriaal eerst gedood te worden voordat het als afval wordt afgevoerd.
Transgene dieren
Bij transgene dieren moet voorkomen worden dat de dieren zich ongewenst verspreiden.
Afhankelijk van het dier is dit gemakkelijk of soms moeilijker te voorkomen. Kleine knaagdieren
zoals de muis dienen in degelijke kooien gehuisvest te worden en de dierverblijven
dienen zo ontworpen te zijn dat ontsnapping niet zomaar mogelijk is. Bij toepassing van
een genetisch gemodificeerd micro-organisme of een wildtype pathogeen in een dier dient
per geval bepaald te worden op welke wijze het micro-organisme of het pathogeen zich
zou kunnen verspreiden vanuit het proefdier en dienen de inperkende maatregelen daarop
afgestemd te worden. Het kan dan soms nodig zijn de dieren in individueel geventileerde
kooien te huisvesten en al het materiaal dat in aanraking is geweest met de dieren te ontsmetten.
Bij gebruik van cellen of ander biologisch materiaal in dieren dient bijzondere
aandacht besteed te worden aan de mogelijke aanwezigheid van pathogene virussen in dit
materiaal. Sommige cellijnen zijn besmet met virussen. Zijn dergelijke virussen aanwezig,
dan dienen de inperkende maatregelen aangepast te worden indien de mogelijkheid bestaat
dat het virus zich verspreidt.
VIB brochure bioveiligheid in het laboratorium

5. INPERKING: EEN COMBINATIE
VAN INFRASTRUCTUUR EN
WERKVOORSCHRIFTEN
Aan de vier risicoklassen voor activiteiten met pathogene of genetisch gemodificeerde
organismen zijn vier basisinperkingsniveaus gekoppeld. Inperking van de gevaren wordt
bereikt door de toepassing van een combinatie van maatregelen van infrastructuur en het
hanteren van speciale werkvoorschriften.
Inperking van gevaren
=
Infrastructuur + werkvoorschriften
Wanden, deuren, veiligheidskabinet, Niet eten, drinken of roken,
werkoppervlakken, etc... handen wassen, etc...
Elke trede in de inperkingsniveaus voegt een aantal eisen toe aan de eisen aan infrastructuur
en werkvoorschriften van het voorgaande niveau. Niet alleen voor laboratoria zijn
deze inperkingsniveaus gedefinieerd. Ook voor serres, proefdierverblijven en grootschalige
procesinstallaties zijn de verschillende niveaus van inperking uitgeschreven. Een overzicht
van de eisen aan de inperkingsniveaus van laboratoria, animalaria en serres zijn te vinden
in de bijlagen aan dit boekje. De eisen voor grootschalige procesinstallaties zijn op te vragen
bij de milieucoördinator.
gesloten
deur
wastafel
ventilatie
desinfectie
werkoppervlakken
laboratoriumjas
Figuur 6: inperking in een laboratorium
VIB brochure bioveiligheid in het laboratorium 19

20
Inperking aan de bron
Zoals bij elke activiteit die een risico kan inhouden, dient een risico zoveel mogelijk bij de bron
te worden aangepakt. Dit betekent onder meer dat wanneer hetzelfde bereikt kan worden
met een organisme, gastheer of vector die minder risico’s met zich meebrengt, dit altijd de
voorkeur heeft. Enkele belangrijke voorbeelden van biologische inperking aan de bron zijn:
• Neem een ingeperkte laboratoriumstam in plaats van een wild type stam;
• neem een moeilijk mobiliseerbare vector in plaats van een zelfoverdraagbare;
• neem replicatiedefectief virus in plaats van replicatiecompetent virus.
Fysische inperking
Bij fysische inperking gaat het om alle fysieke maatregelen die genomen worden om een
organisme van de buitenwereld af te schermen. Dit begint met de houder waarin het organisme
zich bevindt maar daarnaast gaat het om een laboratoriumconstructie met een
vloer, wanden en een plafond, en deuren en ramen die dicht kunnen. Ook gaat het om
werkoppervlakken die geschikt zijn voor het werken met de betreffende pathogenen of
GGO’s. Om te kunnen werken met micro-organismen moeten de werkoppervlakken glad
zijn afgewerkt en goed ontsmet kunnen worden. Een wasbak moet aanwezig zijn om na
de werkzaamheden de handen te kunnen wassen. Voor de hogere inperkingsniveaus 2, 3
en 4 worden er afhankelijk van het risico van de activiteit fysieke maatregelen toegevoegd
aan het basisniveau zoals bijvoorbeeld:
• veiligheidskabinet (klasse I, II of III)
• onderdruk in het lokaal
• een sas (sluis)
• een douche
• HEPA-filtering van de afgevoerde lucht
• speciale bekers en apparatuur om de verspreiding van aërosolen tegen te gaan
• gasdichtheid van het lokaal om het met een gas te kunnen ontsmetten
• etc...
Een overzicht van de fysische inperkingseisen is opgenomen in de bijlage 1.
Veiligheidskabinetten
Een veiligheidskabinet is een belangrijke vorm van fysische inperking. In feite wordt hiermee
een veilige werkplaats in een laboratorium gecreëerd. Veiligheidskabinetten zijn in
eerste instantie ontworpen met het oog op de bescherming van de medewerker en in
tweede instantie met het oog op de bescherming van het milieu. Er wordt een onderscheid
gemaakt in drie klassen: I, II en III. Een klasse I veiligheidskabinet is een afzuigkast,
waarbij de afgezogen lucht over een HEPA-filter wordt geleid. Dit kabinet geeft alleen bescherming
aan de medewerker, maar niet aan het experiment.
VIB brochure bioveiligheid in het laboratorium

Room air
Contaminated air
HEPA-filtered air
Figuur 7: Veiligheidskabinet klasse I
Klasse II
Een veiligheidskabinet van klasse II (een ‘downflow’kast) beschermt zowel de medewerker
als het experiment en het milieu. Deze kasten hebben een neerwaartse laminaire luchtstroom.
Van dit type kabinet bestaan er heel veel verschillende uitvoeringen.
Room air
Contaminated air
HEPA-filtered air
Figuur 8: Veiligheidskabinet klasse II
A front opening
B sash
C exhaust HEPA
D exhaust plenum
A front opening
B sash
C exhaust HEPA filter
D supply HEPA filter
E rear plenum
F blower
De goede werking van een klasse II veiligheidskabinet
De bescherming die een veiligheidskabinet van klasse II aan de medewerker, het experiment
en het milieu geeft, staat of valt met de goede werking van het kabinet.
VIB brochure bioveiligheid in het laboratorium 21

22
Hiervoor is het noodzakelijk dat de luchtstromen in het kabinet zo min mogelijk verstoord
worden. Dit betekent het volgende:
1. Bereid een experiment terdege voor en verzamel alle benodigde spullen
vooraleer te starten;
2. Voordat het experiment gestart kan worden moet het kabinet al minimaal
10 minuten in werking zijn;
3. Ontsmet het werkoppervlak en de luchtaanzuigroosters met een desinfectans
(bijvoorbeeld 70% alcohol);
4. Zet alleen de noodzakelijke spullen in het kabinet;
5. Zet nooit materialen op de luchtaanzuigroosters aan weerszijden van het
werkoppervlak;
6. Werk van links naar rechts of omgekeerd, maar zorg in ieder geval voor
een ‘schone’ kant en een ‘vuile’ kant (met kleine houder voor biologisch
besmet afval zoals pipetpunten);
7. Zorg voor afvalbakken voor besmet en niet-besmet materiaal en zet deze
aan weerszijden van de stoel, buiten het veiligheidskabinet;
8. Maak rustige, beheerste bewegingen om de luchtstromen zo min mogelijk
te verstoren;
9. Werk diep genoeg in het kabinet, niet er half buiten;
10. Werk nooit met een bunzenbrander, omdat deze de luchtstroom te veel
verstoort, maar gebruik wegwerp-entnaalden voor het overenten;
11. Ontsmet na het experiment de materialen (aan de buitenzijde) voordat
deze uit het kabinet worden verwijderd;
12. Ontsmet het werkoppervlak en de luchtaanzuigroosters;
13. Laat het kabinet na het experiment nog minimaal 5 minuten in werking;
14. Sluit de opening van het kabinet af.
Klasse III
Een veiligheidskabinet van klasse III geeft een optimale bescherming aan zowel medewerker
als milieu, maar geeft een iets minder goede bescherming aan het experiment vanwege
het ontbreken van de neerwaartse luchtstroom in het kabinet. De klasse III kast is volledig
afgesloten en manipulaties in het kabinet geschieden via afgesloten rubber manchetten.
Materiaal wordt in de kast gebracht via een kleine goederensas.
Room air
Contaminated air
HEPA-filtered air
VIB brochure bioveiligheid in het laboratorium
Figuur 9: Veiligheidskabinet klasse III
A glove ports with O-ring
for attaching armlenght
gloves to cabinet
B sash
C exhaust HEPA filter
D supply HEPA filter
E double-ended autoclave
or pass-through box

Bescherming
veiligheidskabinet medewerker milieu experiment
klasse I goed goed slecht
klasse II goed goed goed
klasse III uitstekend uitstekend goed
Horizontale laminaire flowkasten en crossflowkasten
In laboratoria waar met dierlijke cellen of met in-vitro plantenkweek wordt gewerkt, wordt
veel gebruik gemaakt van horizontale laminaire flow- en crossflowkasten. Dit zijn kasten
waarin een steriele luchtstroom horizontaal of verticaal de kast in wordt geblazen maar
waar de ‘vuile’ lucht de laboratoriumruimte in wordt geblazen. Dit betekent dat de medewerker
in de luchtstroom zit. Dergelijke kasten geven dus geen enkele bescherming aan de
medewerker en ook niet aan het milieu. Het zijn dus geen ‘veiligheidskabinetten’ en het
gebruik ervan moet in de meeste gevallen afgeraden worden. Dergelijke kasten kunnen
niet gebruikt worden voor werk dat een risico voor de medewerker of voor het milieu
inhoudt. Het gebruik van dergelijke kasten is uitzonderlijk toegestaan zolang er niet
gewerkt wordt met open bronnen van GGO’s of met pathogenen, zoals bijvoorbeeld open
petrischalen met gemodificeerde of pathogene bacteriën of geopende erlenmeyers met
bacteriekweken.
crossflowkast
Room air
Contaminated air
HEPA-filtered air
A front opening
B sash
C supply HEPA filter
D blower
Figuur 10
horizontale
laminaire
flowkast
VIB brochure bioveiligheid in het laboratorium 23

24
HEPA filters
HEPA staat voor ‘High Efficiency Particulate Air’ filter. Dit is een filter
waarin een matrix vele keren opgevouwen zit zodat een heel groot oppervlak
teruggebracht wordt tot een relatief klein volume. Een HEPA filter kan
met zeer grote efficiëntie deeltjes afvangen: slechts maximaal 0.03% van
de deeltjes met een doorsnee van 0.3 micrometer mogen door de filter
passeren. De eigenschappen van de filter zijn zodanig dat zowel de deeltjes
die groter zijn als de deeltjes die kleiner zijn dan 0.3 micrometer, met een
grotere efficiëntie worden afgevangen.
Werkvoorschriften
Fysieke maatregelen alleen zijn niet voldoende om een veilige werksituatie te creëren. Het
gaat juist om de combinatie met een speciale werkwijze. Dit betekent dat voor elk niveau
ook specifieke werkvoorschriften zijn uitgeschreven.
Basiswerkvoorschriften: Veilige Microbiologische Technieken
Voor het basisinperkingsniveau vormen de werkvoorschriften de belangrijkste bijdrage aan
de inperking. Deze basisvoorschriften vormen de principes van “Veilige Microbiologische
Technieken” (VMT). Iedereen die in een laboratorium met micro-organismen en cellen
werkt moet deze voorschriften tot de dagelijkse routine maken.
VMT:
1. Deuren en ramen zijn gesloten tijdens de werkzaamheden.
2. Tijdens het werk wordt een laboratoriumjas gedragen.
3. Eten, drinken, roken en de opslag van eet- en drinkwaren in het laboratorium
zijn verboden.
4. Draag geen sieraden of horloges en houd de handen schoon en de nagels
kort.
5. Na het morsen van GGO’s wordt direct ontsmet.
• Neem vloeistoffen op met tissues of papier en gooi dit in de bak voor
biologisch afval.
• Ontsmet met bijv. 70% alcohol het oppervlak waarop gemorst is.
Gebruik hiervoor een tissue of papier.
• Was de handen na afloop.
6. Het ontstaan en verspreiden van aërosolen wordt geminimaliseerd.
• Centrifugeer alleen met dichte buizen.
• Voorkom dat doppen van buizen nat zijn.
• Gloei natte entnaalden op de juiste manier uit; d.w.z. eerst de steel en
dan pas het entoog.
• Laat entnaalden eerst afkoelen voor ze weer in cultuurvloeistof te steken.
• Druk pipetten niet met kracht leeg, maar laat ze leeglopen.
• Giet vloeistoffen geleidelijk (en nooit van grote hoogte) uit.
7. Met de mond pipetteren is verboden.
• Gebruik altijd een pipetteerballon of een mechanische pipet.
VIB brochure bioveiligheid in het laboratorium

• Voor kleine hoeveelheden wordt een mechanische micropipet
gebruikt.
8. Gebruikte materialen worden ontsmet voordat ze worden gewassen of
hergebruikt.
• Dit kan door ze te autoclaveren, door ze af te nemen met 70%
alcohol of door ze in ontsmettende vloeistof te dompelen (bv.
decontamine).
9. Biologisch afval wordt geïnactiveerd.
• Deponeer hiertoe het afval in de verzamelbak voor biologisch afval.
Dit moet worden afgevoerd naar de autoclaaf of naar een verbrandingsoven
die geschikt is voor de verbranding van ziekenhuisafval.
10. De handen worden gewassen voordat het laboratorium wordt verlaten.
• Gebruik hierbij desinfecterende zeep.
Naast het hanteren van deze basiswerkvoorschriften zijn ook belangrijk:
1. Het bijhouden van een gedetailleerd labjournaal, waarin per dag beschreven wordt met
welk biologisch materiaal u heeft gewerkt en welke handelingen u heeft verricht;
2. Het controleren van het biologisch materiaal waarmee gewerkt wordt. Wanneer materiaal
van collega-onderzoekers wordt verkregen dient eerst gecontroleerd te worden
dat het inderdaad om het bedoelde materiaal gaat (stamcontrole, controle (van restrictiepatronen)
van vectoren), en bovendien dienen ook de eigen stammen regelmatig
gecontroleerd te worden. Een alternatief is om regelmatig vanuit een schone stock te
werken of stammen regelmatig opnieuw in te kopen.
Elk eenvoudig laboratorium waarin de VMT-werkwijze wordt toegepast, voldoet aan het
inperkingsniveau 1. Het laboratorium hoeft niet meer dan de simpele basisvoorzieningen
te hebben als een vloer, wanden, plafond, glad afgewerkte, goed te reinigen werkoppervlakken
en een wasbak. Voor de inperkingsniveaus 2, 3 en 4 worden aan de basisvoorschriften
eisen toegevoegd zoals bijvoorbeeld:
• Tijdens de uitvoering van de werkzaamheden worden handschoenen gedragen.
• Toegang tot de werkruimte is voorbehouden aan bevoegden.
• Er is een controleprogramma voor insecten en knaagdieren.
• Inactivering van de effluenten van wasbakken en douches.
• Specifieke maatregelen om de vorming van aërosolen tegen te gaan, bijvoorbeeld het
uitvoeren van mogelijks aërosolproducerende handelingen in een veiligheidskabinet.
• Een strikt regime van het aantrekken van speciale beschermende werkkleding.
• Ontsmetting van kleren vooraleer men de inperkingszone verlaat.
• etc...
Een overzicht van de eisen aan werkvoorschriften van de inperkingsniveaus 1 t/m 4 is
gegeven in de bijlage 1.
VIB brochure bioveiligheid in het laboratorium 25

26
6. BESMETTING, ACCIDENTEN,
ONTSMETTING EN
INACTIVERING
Een besmetting is gauw gebeurd. Er kan gemorst worden bij het overgieten van vloeistof
of er kunnen een paar druppels wegspatten. Het is zaak een besmetting direct
ongedaan te maken. Ook andere ongelukjes zoals het stukvallen van een glazen houder,
een prikaccident met een naald of een snijwond van een mes of scalpel zitten in
een klein hoekje. Bij elke besmetting of elk ongeluk is blootstelling aan het organisme
het gevolg. Dit is niet meteen een direct gevaar wanneer het om onschadelijke organismen
gaat. Toch dient ook dan een besmetting opgeruimd te worden. Gebeurt dit niet,
dan betekent dit dat resten van micro-organismen zich in het laboratorium ophopen
en zo een potentiële bron van besmetting vormen voor het werk van anderen.
Er kan echter ook sprake zijn van ongelukjes met organismen die ofwel direct voor de
medewerker (alle humane pathogenen), ofwel voor het leefmilieu (GGO’s van risicoklassen
2, 3 en 4) een risico inhouden. Dan is het zeker zaak gemorst materiaal snel op te
ruimen en oppervlakken te ontsmetten. Het morsen op niet-intacte huid of het morsen
van bijvoorbeeld pathogeen-virusconcentraat op de intacte blote huid mag niet onopgemerkt
voorbijgaan.
Voorkoming
Het is zaak om ongelukjes zoveel mogelijk te voorkomen. Dit kan alleen door voorzichtig
en doordacht te werken. Experimenten dienen zorgvuldig van tevoren te worden
gepland, materialen van tevoren verzameld en na afloop dient alles weer te worden
opgeruimd. Slordigheid is de belangrijkste oorzaak van ongelukjes. Scalpels niet rond
laten slingeren, maar opbergen in een veilige houder. Op injectiespuiten de naalden
niet herkappen, maar de naalden deponeren in een speciaal daarvoor voorziene container.
Melding
Het is zaak om accidenten waarbij medewerkers aan gevaarlijke menselijke pathogenen
zijn blootgesteld te melden. En niet alleen wanneer het bloed eruit spuit. Ook wanneer
er een kans op besmetting is geweest, of wanneer er twijfels zijn over de karakterisatie
van het materiaal (denk aan niet-getest patiëntenbloed) moet een melding gedaan
worden. De verantwoordelijke personen voor de bioveiligheid en/of de interne dienst
voor preventie en bescherming en indien nodig ook de arbeidsgeneesheer en de verze-
VIB brochure bioveiligheid in het laboratorium

keringsdienst (in verband met de eventuele terugbetaling van dure geneesmiddelen)
dienen op de hoogte te worden gesteld. Na het ongeluk dienen meteen passende
maatregelen te worden genomen. Antivirale geneesmiddelen moeten bijvoorbeeld waar
nodig kort na de besmetting worden ingenomen.
Handelen na prik- of snijaccident
Bij een prik- of snijaccident, of een spat in het oog of op de mucose met materiaal dat
infectieus is voor de mens moet het volgende worden gedaan:
1. De wonde laten bloeden.
2. Uitwassen.
3. Ontsmetten.
4. Eventuele verdere verzorging.
5. Noteren in het EHBO register.
Afhankelijk van het type agens waaraan men is blootgesteld dienen eventueel aanvullende
maatregelen te worden genomen. Bij opname van ongekarakteriseerd menselijk
bloed dient bijvoorbeeld bepaald te worden of er besmetting geweest is met Hepatitis
B, Hepatitis C of HIV en moet bepaald worden hoe dit te bestrijden.
Ontsmetting van werkoppervlakken en dergelijke
Voor de ontsmetting van materialen en werkoppervlakken zijn verschillende middelen
beschikbaar die elk hun eigen werkingsmechanisme hebben. De meest belangrijke ontsmettingsmiddelen
zijn:
• Alcohol
Alcoholen zijn effectief tegen vegetatieve bacteria, schimmels en virussen met een
lipide membraan, maar niet tegen sporen. De werkzaamheid tegen non-lipide virussen
is sterk variabel. Het moet als een 70% oplossing gebruikt worden. Mengsels met
andere agentia zijn effectiever dan alcohol alleen, bijvoorbeeld 70% alcohol met
100g formaldehyde per liter of alcohol met 2g/liter chlorine. N.B.: de ontaarde alcohol
die in laboratoria wordt gebruikt is giftig. Ook alcoholoplossingen vergaan en
daarom dienen ze minimaal één keer per maand ververst te worden.
• Natrium hypochloriet
Het vrijkomende chlorine werkt sterk oxiderend en is effectief tegen alle typen van
micro-organismen. Natrium hypochloriet moet toegepast worden in een concentratie
van 20 ml/l tot 100ml/l afhankelijk van de vraag of het gaat om ‘vuile condities’.
Oplossingen met chlorine vergaan snel. Om er zeker van te zijn dat ze goed werken
dienen de oplossingen één keer per week ververst te worden.
VIB brochure bioveiligheid in het laboratorium 27

28
• Formaldehyde
Formaldehyde is een gas dat werkzaam is tegen alle micro-organismen, mits gebruikt bij
een temperatuur hoger dan 20°C en een luchtvochtigheid van 70%. Het is geschikt voor
het ontsmetten van vloeistoffen en voor de decontaminatie van veiligheidskabinetten of
van hele ruimten via verneveling. N.B.: formaldehyde is een vermoed carcinogeen.
Bovendien is het irriterend en mag het niet worden ingeademd. Formaldehyde wordt
alleen in uitzonderlijke gevallen gebruikt wanneer een lokaal of een veiligheidskabinet
in zijn geheel ontsmet moet worden, bijvoorbeeld een luchtdicht L3 laboratorium waar
een besmetting heeft plaatsgevonden of een luchtdicht proefdierverblijf waar gevaarlijke
micro-organismen op de vloeren en wanden kunnen zitten. Ontsmetting met formaldehyde
is een tijdrovende en gevaarlijke onderneming die alleen door specialisten veilig
kan worden uitgevoerd. Overleg met de preventiedienst is daarom aangewezen alvorens
op te starten.
• Waterstofperoxide
Net als hypochloriet werkt dit tegen alle typen van micro-organismen vanwege zijn oxiderende
werking. Het wordt gebruikt als een oplossing van 6%. Het is niet geschikt voor
gebruik op aluminium, koper, zink of brons.
• Moderne breedspectrum ontsmettingsmiddelen
Superdecontamine
Dit is een serie van schoonmaak- en ontsmettingsmiddelen voor laboratoriumapparatuur
en -gereedschappen. Superdecontamine 11 en 77 zijn sterk alkalische detergenten,
die vooral geschikt zijn voor het ontsmetten van gebruiksvoorwerpen door onderdompeling
gedurende 2 - 12 uur, afhankelijk van de aard en de graad van de verontreiniging.
Na uitlekken van de gebruiksvoorwerpen dienen ze meteen afgespoeld te worden
en als laatste liefst met gedemineraliseerd of gedestilleerd water.
RBS SR 80
Dit is ontsmettingsproduct aanbevolen voor geneeskunde, veeartsenijkunde en ziekenhuizen
en bestaat uit een mengsel van oppervlakte-actieve stoffen, formaldehyde, dialhyde,
synergische complexe van quaternair ammoniumderivaten, amfoteer. Het heeft
een bacterie-, virus-, fungi- en algidodend vermogen met ruim spectrum. Het dient
gebruikt te worden in een concentratie van 25 tot 50 mg per liter water (warm of
koud). Een oplossing moet minimaal één keer per week ververst worden.
Er zijn van meerdere fabrikanten diverse vergelijkbare producten op de markt.
Ontsmetting, zeker als het gaat om de ontsmetting van oppervlakken, geschiedt nooit
voor de volle 100%. Ontsmetting leidt slechts tot een sterke reductie van het aantal kiemen
(bij goede ontsmetting van een bacteriële besmetting om en nabij de 90%, virale
besmetting is meestal beter te verwijderen). Ook is het zo dat bij het gebruik van ontsmet-
VIB brochure bioveiligheid in het laboratorium

tingsmiddelen de lijken van de micro-organismen en het vuil vaak achterblijven. Daarom is
het van belang dat bij de (wekelijkse) schoonmaak van de ruimten de werkoppervlakken,
vloeren en deurknoppen worden afgenomen met warm water en zeep. Twee keer ontsmetten
leidt dus eigenlijk pas tot een echt goede ontsmetting.
De werkzaamheid van verschillende ontsmettingsmiddelen
schimmels bacteriën mycobacteria sporen lipide non-lipide
virussen virussen
alcohol - +++ +++ - + V
hypochloriet + +++ ++ ++ + +
formaldehyde +++ +++ +++ +++* + +
peroxide + +++ ++ ++ + +
* boven de 40 °C v = variabel
Inactivatie
De doding van biologisch materiaal is vaak niet eenvoudig. Bacteriesporen zijn bijvoorbeeld
resistent tegen temperaturen van 100°C. Autoclaveren is dan aangewezen: verhitting
van water onder druk bij 121°C gedurende 20 minuten. Soms worden ook temperaturen
van 134°C gehanteerd. De doding van micro-organismen is zeer goed, op de voorwaarde
dat de hete stoom overal goed bij kan. Luchtzakken zijn een bekend probleem. Cellen zijn
soms in staat in een luchtzak de autoclavering levend te doorstaan. Het beladen van een
autoclaaf dient daarom zorgvuldig te gebeuren en deksels dienen losgedraaid te worden.
Autoclavering is de aangewezen methode om bacteriën, gisten en schimmels te doden.
Voor andere organismen zoals cellen van planten en dieren en soms ook van virussen zijn
eenvoudiger alternatieven beschikbaar. Verhitting tot 80°C of de blootstelling aan een
zeepoplossing zijn vaak voldoende om de cellen te doden. Het is van belang om na te
gaan of de toe te passen methode een gevalideerde methode is: dat wil zeggen dat nagegaan
moet worden dat de doding effectief is. Inactivatie geeft een veel betere doding dan
ontsmetting: een juist uitgevoerde inactivatie geeft een doding van 100%.
Vaak wordt voor de doding van vloeistoffen met bacteriën gebruik gemaakt van Natrium
hypochloriet. Daarbij moet opgelet worden dat de finale concentratie chlorine in de oplossing
voldoende is om de bacteriën te doden. Opgemerkt moet worden dat autoclavering
nog altijd een veel milieuvriendelijker methode van inactivatie is. De vloeistoffen met
chloor worden in de praktijk (te) vaak door de gootsteen gegooid. Er mogen in principe
geen stoffen in het bedrijfsafvalwater terechtkomen die de werking van een afvalwaterzuiveringsstation
negatief zouden kunnen beïnvloeden.
Voor een goede doding van micro-organismen is ook belangrijk dat het ontsmettingsmiddel
voldoende lang in contact is met de micro-organismen. Over het algemeen geldt dat
een blootstelling van 10 tot 30 minuten vereist is.
VIB brochure bioveiligheid in het laboratorium 29

30
Biologisch afval
Tegenwoordig worden biologisch gevaarlijke stoffen (pathogenen, GGO’s) steeds vaker afgevoerd
via de systemen voor ziekenhuisafval. Het afval wordt dan niet eerst gedood, maar
wordt verzameld in speciale houders voor ‘biohazard’ afval, en wordt met enige regelmaat
afgevoerd naar een vuilverbrandingsoven die geschikt is voor de behandeling van ziekenhuisafval.
Voor vast- en laag-risicomateriaal zijn er kartonnen houders waarin een plastic
zak zit. Voor de afvoer van vloeistoffen, vochtig materiaal en hoog-risico afval bestaan er
polyethyleen tonnetjes (30 liter). Grote hoeveelheden vloeistof en materialen die worden
hergebruikt dienen altijd in-huis te worden geïnactiveerd of ontsmet.
Onder biologisch afval wordt verstaan:
Wel:
• alle genetisch gewijzigd en/of pathogeen biologisch materiaal: celculturen, culturen van
micro-organismen, weefsel, bloed, ...
• typisch labo-afval van organische aard: gels, ...
• alle mogelijks biologisch besmet materiaal: handschoenen, doekjes of papier, wegwerp
kweekrecipiënten, pipetten, ...
• en alle zaken die niet noodzakelijk besmet zijn, maar die niet in een gewone vuilzak
mogen worden geworpen omdat ze scherp zijn, of er vies uitzien (beenderen, bloed,...)
Niet:
• radio-actief besmet afval (dit dient apart te worden afgevoerd).
De aangewezen ontsmetting en inactivatiemethode voor enkele relevante organismen
Ontsmetting Inactivatie
1% NaOCl 2% 70% formal- natte hitte droge hitte verhitting
glutaraldehyd
ethanol dehyd 121°C, 20’ 160 °C, 60’ 60 °C,
E. coli x x x x x x
Lactobacillus x x x x x x
Salmonella x x x x x x
Aspergillus x x x x
Adenovirus x x x
Influenzavirus x x x x x, 30’
HIV x x x x, 30’*
Vaccinia x x x x**
* geldt alleen voor kleine volumina serum
** alleen voor heat-labile antigen vaccinia
VIB brochure bioveiligheid in het laboratorium

7. WERKEN MET ENKELE
VEELGEBRUIKTE
LABORATORIUM-ORGANISMEN
Werken met genetisch gemodificeerde Escherichia coli
en met fagen
Inschaling
Genetisch gemodificeerde E.coli K12, B en C stammen en alle fagen kunnen onder L1
omstandigheden (zie bijlage 1) gehanteerd worden op de voorwaarde dat:
• de gebruikte vectoren niet zelfoverdraagbaar zijn
• de gekloneerde genen geen schadelijke genproducten aanmaken (bijv. een toxine).
Deze K12, B en C stammen zijn geattenueerde (verzwakte) laboratoriumstammen die ten
opzichte van de wildtype E.coli stammen biologisch ingeperkt zijn. Een uitzondering vormt de
stam E.coli BL21. Hiervoor is een L2 inschaling aangewezen. Hieronder zijn enkele inschalingen
gegeven, waarbij ter illustratie is aangegeven volgens welke inschalingsregel uit bijlage 2
deze inschaling tot stand is gekomen. Omdat deze inschalingen uitgaan van onschadelijke
inserts is uit bijlage 2 steeds het subartikel e of j van toepassing (afhankelijk van de vraag of
het DNA al gekarakteriseerd is). Het spreekt voor zich dat het insert sterk medebepalend is
voor de inschaling. Dit betekent dat in het geval met inserts gewerkt wordt die niet-onschadelijk
zijn, bijvoorbeeld wanneer het insert codeert voor de productie van een toxine, een ander
subartikel van toepassing wordt en dan gaat de inschaling minimaal één trede omhoog.
Stam vectoren inschaling* inschalingsregel**
Opmerkingen
behorend tot niet-zelfoverdraagbare L1 1.e of j bijna alle gebruikte coli
E. coli K12, vectoren (tra - B of C
) systemen vallen hieronder
behorend tot zelfoverdraagbare L2 2.e of j een voorbeeld is sommige
E. coli K12, vectoren (tra + B of C
) miniTn5 systemen
E. coli BL21 niet-zelfoverdraagbare L2 2.e of j de biologische inperking
vectoren van deze stam is onvoldoende
om een verlaging
van de inschaling van L2
naar L1 mogelijk te maken
Overige E. coli niet-zelfoverdraagbare L2 3.e of j er moet vanuit worden
stammen vectoren gegaan dat deze stammen
nog pathogeen zijn
* uitgaande van onschadelijke inserts, schadelijke inserts verhogen de risicoklasse
** het gaat hierbij om de uit de schema’s in bijlage 2 van toepassing zijnde inschalingsregel
VIB brochure bioveiligheid in het laboratorium 31

32
Laboratoriumvoorzieningen
In veel gevallen wordt met E.coli K12, B of C stammen gewerkt in combinatie met nietzelfoverdraagbare
vectoren en dan is een eenvoudig L1 laboratorium met basisvoorzieningen
voldoende. Vanzelfsprekend moeten de werkoppervlakken goed ontsmet kunnen worden.
Open handelingen met E. coli kunnen op een bench gebeuren, mits de vorming van
aërosolen geminimaliseerd wordt (zie VMT voorschriften). Enten en dergelijke kunnen bij
een vlam. Een alternatief voor het werken met open bronnen op de bench is om deze
handelingen in een veiligheidskabinet uit te voeren. De voorschriften van Veilige
Microbiologische Technieken dienen te worden nageleefd.
Afval
Alle vaste materialen (voedingsbodems) en alle vloeistoffen die gemodificeerde coli’s
bevatten en alle met coli’s besmette materialen dienen geïnactiveerd of ontsmet te worden.
Er mag geen levende coli in het huishoudelijk afval terechtkomen. Zorg daarom voor
afvalbakken die duidelijk gemarkeerd zijn voor biologisch afval. Vloeistoffen dienen geautoclaveerd
te worden voordat ze door de gootsteen verdwijnen. Een alternatief is inactivatie
met hypochloriet, maar dit is een minder milieuvriendelijk alternatief. Een uitzondering
op deze regel zijn E.coli K12 stammen die een vector dragen die niet mobiliseerbaar (mob - )
en goed gekarakteriseerd is, een gen dragen dat goed gekarakteriseerd is (herkomst, grootte,
genproduct, functie, etc...) en bovendien een genproduct aanmaken dat gekend is en
volstrekt onschadelijk is. In dat geval is inactivering niet nodig. Dit behoort echter tot de
uitzonderingsgevallen die in een researchsetting nauwelijks voorkomen.
Bijzonderheden
Met enige regelmaat (2x per jaar) dienen de gebruikte stammen gecontroleerd te worden
(stamcontrole). Een alternatief is om regelmatig opnieuw te starten vanuit een schone cultuurstock.
VIB brochure bioveiligheid in het laboratorium
Voorbeeld van een risico-analyse
Om de bepaling van de risicoklasse en de inperkingsmaatregelen te illustreren en tevens
aan te geven hoe dit boekje kan worden gebruikt worden hieronder enkele concrete praktijkvoorbeelden
van risico-inschattingen uitgewerkt.
Een voorbeeld van de bepaling van de inschaling in de praktijk
1. De klonering van een chymosine-gen in pUC18 met E. coli stam JM109 als gastheer, waarbij
alleen kleinschalige standaardlaboratoriumhandelingen zullen worden uitgevoerd
Stap 1: Is de combinatie van gastheer en vector geschikt voor risicoklasse 1? Daarvoor moet eerst
nagegaan worden of de gebruikte E.coli stam geschikt is voor risicoklasse 1. Alle E. coli K12, B of C-

stammen zijn geschikt voor risicoklasse 1 en dus is het voldoende om in catalogi, bij de leveranciers,
of in stammendatabases (bijv. ATCC of DSMZ) na te gaan of JM109 tot deze stammen
behoort. Het antwoord is in dit geval: ja, JM109 is een E.coli K12.
Daarna moet nagegaan worden of de vector geschikt is voor risicoklasse 1. PUC18 is een goed
gekarakteriseerde vector zonder schadelijke eigenschappen die bovendien niet-zelfoverdraagbaar is.
De vector is geschikt voor risicoklasse 1. (Een gedetailleerde beschrijving van de eisen aan vectoren
is te vinden in bijlage 2 aan deze brochure, in hst A. Ook is daar te vinden wat ´goed gekarakteriseerd´
inhoudt).
De gastheer-vector combinatie is dus geschikt voor risicoklasse 1.
Stap 2: Nu kan in bijlage 2 het bijbehorende inschalingsartikel worden opgezocht. In dit geval is
uit hst A van bijlage 2, in de ‘eerste richting’ de categorie 1 van toepassing (gastheer-vectorsysteem
voldoen immers aan de criteria voor indeling in risicoklasse 1). Maar voor de inschaling dient
eerst nog het risico van het insert ingeschat te worden.
Stap 3: In dit geval wordt gewerkt met een stukje erfelijk materiaal uit rund dat verantwoordelijk is
voor de productie van chymosine, een eiwit dat zorgt voor de stremming van kaas. Het is in dit
geval goed gekarakteriseerd, is geen toxine, heeft niets te maken met virussen of met pathogeniteit,
en is ook niet op een andere wijze schadelijk. Dus is uit hst A van bijlage 2, in de ‘tweede richting’,
categorie j van toepassing, hetgeen een eerste identificatie van het inschalingsniveau oplevert: L1
Stap 4: Zijn er nog bijzonderheden in verband met: (1) het milieu dat zou kunnen worden blootgesteld,
(2) het type en de schaal van de activiteit, en (3) eventuele niet-standaard handelingen. In
dit geval worden er bijvoorbeeld alleen kleinschalige, reguliere handelingen gedaan zoals: transformatie,
kleinschalige kweek in erlenmeyers, centrifugatie, eiwitisolatie, gelelectroforese. Een activiteit
wordt pas als grootschalig gezien als het gaat om grote kweekvolumes in een productiefaciliteit.
Toch vereisen ook kleine fermentoren vaak bijzondere aandacht als het gaat om afdichting en fysische
inperking van de down-stream processing. Er zijn in dit geval geen bijzondere handelingen die
ofwel een extra risico met zich meebrengen ofwel een bijzondere vorm van additionele inperking
vereisen. De finale inschaling komt daarom neer op het hanteren van de standaard L1-voorschriften.
Hierover kan het volgende in dit boekje worden teruggevonden:
• L1-inperkingseisen: bijlage 1 van dit boekje
• Gedetailleerde VMT-basisvoorschriften: hst 5 van dit boekje
• Hoe te ontsmetten en te inactiveren: hst 6 van dit boekje
Een mogelijke variatie op dit voorbeeld:
1a. De klonering van het chymosine gen in een zelfoverdraagbaar plasmide in E. coli JM109 en
het aanbrengen van de gemodificeerde bacteriën op een kunststof matrix waarbij niet vermeden
kan worden dat aërosolen ontstaan.
In dit geval verandert de inhoud van stap 2: de vector voldoet niet aan de eisen voor risicoklasse 1.
Dit betekent dat van hst A, bijlage 2, in de ‘eerste richting’ nu categorie 2 van toepassing wordt.
Het genproduct is nog steeds goed gekend en niet schadelijk, dus blijft in de ‘tweede richting’ j van
toepassing, wat een L2 inschaling oplevert.
Er wordt bovendien een bijzondere aërosolproducerende handeling uitgevoerd. Hiervoor is een
additionele inperkende maatregel nodig, bovenop de standaard L2 voorschriften: er moet een veiligheidskabinet
van klasse II aanwezig zijn waarin de aërosolproducerende handeling wordt uitgevoerd.
Finaal wordt de inschaling dus L2 mét gebruik van veiligheidskabinet. Hierover kan het
volgende in dit boekje worden teruggevonden:
• L2-inperkingseisen: bijlage 1 van dit boekje
VIB brochure bioveiligheid in het laboratorium 33

34
• Beschrijving hoe te handelen in een veiligheidskabinet: hst 5 van dit boekje
• Hoe te ontsmetten en te inactiveren: hst 6 van dit boekje
Zijn er gevallen aan te wijzen waarin er bijzondere aandacht nodig is voor eventueel extra te
nemen maatregelen? Hieronder volgen enkele voorbeelden:
1. Het ontstaan en de verspreiding van aërosolen kan niet worden geminimaliseerd (dit is het
voorbeeld hierboven beschreven onder 1a). Het gebruik van een veiligheidskabinet van klasse II
is dan al gauw noodzakelijk.
2. GGO´s of pathogenen worden in een niet-destructieve meting gedurende langere tijd open en
bloot gehanteerd. Als de organismen gevaarlijk zijn, dient nagegaan te worden of ze zich zouden
kunnen verspreiden. Zo ja, dan dienen in veel gevallen de ruimte en de medewerker extra
beschermd te zijn (bijv. onderdruk en HEPA-filtering op afgevoerde lucht en/of handschoenen
en gelaatsbescherming).
3. GGO´s of pathogenen worden in fermentoren gehanteerd en in een downstream-proces opgezuiverd.
Sommige fermentoren zijn dichter dan andere en dit geldt zeker ook voor downstream-procesapparatuur.
Bij organismen van klasse 2 en hoger dient er bijvoorbeeld ook een
hydrofoob absoluut filter of een HEPA-filter aanwezig te zijn op de fermentorgasafvoer.
4. GGO´s of pathogenen worden in of op een plant of proefdier gebracht. Er dient per geval
zorgvuldig te worden nagegaan of verspreiding van het GGO of het pathogeen moet worden
tegengegaan. De maatregelen hangen sterk af van plant tot plant en van dier tot dier. Vaak
bepaalt de toedieningswijze of en hoe een micro-organisme zich kan verspreiden.
Wat te doen bij twijfel over de inschaling of eventueel toe te passen maatregelen?
In achtereenvolgende stappen, indien de voorgaande stap geen uitsluitsel heeft gegeven:
1. Zoek eventueel ontbrekende informatie op om een betere inschatting te kunnen maken.
2. Raadpleeg uw hiërarchische overste.
3. Raadpleeg uw groepsleider.
4. Win eventueel advies in bij interne experts op het terrein van bioveiligheid (zie bijlage 4 van dit
boekje), of win anders eventueel extern advies in bij de sectie bioveiligheid en biotechnologie
van het WIV (http://biosafety.ihe.be).
Werken met niet-pathogene genetisch gemodificeerde gisten
Inschaling
Niet-pathogene genetisch gemodificeerde gisten zoals Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces
pombe en Pichia pastoris kunnen allemaal onder L1 condities gehanteerd
worden op voorwaarde dat er geen genen in zijn gekloneerd die gevaarlijke producten
aanmaken. De in laboratoria gebruikte stammen van gist zijn allemaal op de één of andere
wijze deficiënt en hebben een speciaal voedingsmedium nodig waaraan een bepaalde
essentiële stof is toegevoegd. Vaak gaat het om aminozuurdeficiënties.
Laboratoriumvoorzieningen
Dezelfde standaard laboratoriumvoorzieningen als voor E.coli zijn voldoende. Het verdient
echter aanbeveling open handelingen met gisten uit te voeren in een veiligheidskabinet.
VIB brochure bioveiligheid in het laboratorium

Gisten kunnen gedurende lange tijd in de lucht overleven en kunnen op deze wijze allerlei
kweken besmetten. Daarnaast is er bij gesensibiliseerde mensen kans op een allergische
reactie na blootstelling aan gist of zijn sporen. Daarom wordt gistwerk vaak in een apart
lokaal gedaan.
Afval
Op dezelfde manier als voor E. coli dient alle afval dat genetisch gemodificeerde gisten
bevat geïnactiveerd of ontsmet te worden.
Bijzonderheden
Ook hier geldt dat bij het kloneren van een gen dat codeert voor een schadelijk genproduct
zoals een toxine, de risicoklasse omhoog gaat en dat alle bijbehorende maatregelen
moeten worden opgetrokken naar dat niveau.
Werken met genetisch gemodificeerde cellijnen
Inschaling
De inschaling van dierlijke of menselijke cellijnen is niet eenvoudig. De bepalende factor is
of de cellen schadelijke biologische agentia kunnen produceren, en dan met name virussen.
Ten eerste dient een onderscheid te worden gemaakt tussen primaire cellen en ‘established
cell lines’. De minimum inschaling van primaire cellen is L2. Bij established cell
lines moet vastgesteld worden of ze eventueel een virus zouden kunnen produceren.
Daarbij moet rekening gehouden worden met virale sequenties die in de vector aanwezig
zijn. Enkele voorbeelden:
cellijn virale vector (dient inschaling* inschalings- opmerking
sequenties slechts als regel**
in cellijn voorbeeld)
primaire onbekend niet relevant L2 - inschaling kan pas
muizencellijn omlaag als aangetoond
is dat de cellen
geen schadelijke
biologische agentia
produceren
NIH-3T3 geen SV40ori vector L1 4.e of j kans op vorming van
virus is nul
HELA E6E7 genen SV40ori vector L1 4.e of j combinatie virale
uit HPV sequenties in cellijn en
vector kunnen geen
virus opleveren
VIB brochure bioveiligheid in het laboratorium 35

36
293 E1 en E1 L2 8.e of j recombinatie tussen
stuk E4 gedeleteerde sequenties in cellijn
uit adenovirale en vector kan replicatie
adenovirus vector competente virus-
deeltjes geven
EBV geïm- cellen niet relevant L2 - de inschaling van de
mortaliseerde bevatten cellen volgt de
lymfocyten compleet inschaling van het
EBV virus virus dat erin
aanwezig is
* uitgaande van onschadelijke inserts, schadelijke inserts verhogen de risicoklasse!
** het gaat hierbij om de uit de schema’s in bijlage 2 van toepassing zijnde inschalingsregel
Laboratoriumvoorzieningen
De benodigde laboratoriumvoorzieningen variëren naargelang de inschaling. Eenvoudige L1
laboratoria voldoen voor cellen zoals NIH-3T3. In de praktijk is het zo dat voor het enten
en opgroeien van dergelijke cellen goed uitgeruste celkweeklaboratoria worden gebruikt die
qua inrichting veel meer zijn dan een L1 laboratorium. Er is meestal een veiligheidskabinet
aanwezig om bij de open handelingen met de cellen de cellen te beschermen tegen infecties
van buitenaf. In plaats van een veiligheidskabinet wordt vaak gebruik gemaakt van een
horizontale laminaire flowkast. Een dergelijke kast is geschikt voor L1 activiteiten met celkweken.
Voor cellen die een L2 inschaling vereisen, is een horizontale laminaire flowkast
niet geschikt. In dat geval is alleen een veiligheidskabinet van klasse II geschikt om zowel
de medewerker, het milieu en de celkweek te beschermen. De eisen van L2 in vergelijking
met die van L1 zijn vooral strenger voor wat betreft de toegang tot het laboratorium en de
uitvoering van werkzaamheden waarbij aërosolen gevormd kunnen worden.
Afval
Al het biologisch afval van genetisch gemodificeerde cellen dient te worden geïnactiveerd.
Er is echter een onderscheid tussen de celkweken van L1 niveau en die van L2 niveau.
Voor celculturen van L1 niveau is het voldoende om ze bloot te stellen aan een zeepoplossing
en vervolgens door de gootsteen te spoelen. Ook besmette materialen kunnen op
deze manier behandeld worden. Voor celculturen op L2 niveau dienen meer rigoureuze
maatregelen te worden genomen om ervan verzekerd te zijn dat ook mogelijke schadelijke
biologische agentia gedood zijn. Autoclaveren is daarvoor de meest aangewezen methode.
Bijzonderheden
Werk nooit met autologe cellen. Zeker wanneer daar groeifactoren of oncogenen in gekloneerd
zouden worden bestaat het gevaar dat een besmetting leidt tot ongewenste gevolgen.
De cellen worden immers niet door het immuunsysteem als vreemd herkend.
VIB brochure bioveiligheid in het laboratorium

Werken met genetisch gemodificeerde virussen of
virale vectoren
Inschaling
De indeling van genetisch gemodificeerde virussen in risicoklassen volgt in het algemeen
de biologische risicoklassen van de virussen (zie bijlage 5.51.8 aan Vlarem II), tenzij het
insert zorgt voor een verhoging van het risico. In dat geval dient de inschaling hoger uit te
vallen dan de biologische risicoklasse van het virus. Het gebruik van virussen kan niet los
gezien worden van het gebruik van cellijnen. En dit betekent dat ook hier gekeken moet
worden naar de combinatie van virussequenties in de vector en in de cellijn. Bij de productie
van replicatiedefectieve viruspartikels wordt gebruik gemaakt van cellijnen die de
ontbrekende virale sequenties bezitten die nodig zijn om viruspartikels gevormd te krijgen.
Pas wanneer er in dergelijke systemen geen kans bestaat op vorming van replicatiecompetente
partikels kan de inschaling een trede omlaag.
packaging virale sequenties vector (dient als inschaling* inschalings- opmerking
cellijn in cellijn voorbeeld) regel**
293 E1 gen en stuk E1 gedeleteerde L2 8 e of j combinatie virale
van E4 gen uit adenovirale sequenties in cellijn
adenovirus vector en vector kunnen
virus opleveren
PER.C6 E1 gebied van E1 gedeleteerde L1 9 e of j kans op vorming van
adenovirus adenovirale vector virus is verwaarlooszonder
sequentie- baar klein vanwege
overlap ontbreken van
sequentie-overlap
PA317 gag-pol-env van retrovirale vector L2 8 e of j kans op vorming van
amfotroop zonder RCR’s is klein, maar
muizen-retrovirus gag-pol-env niet nul. Er is vaak
genen nog wat
sequentie-overlap
Y-CRE gag-pol en env retrovirale vector L1 7 e of j kans op vorming van
genen van ecotroop zonder RCR’s is kleiner dan
muizen-retrovirus gag-pol-env bij PA317 en bovenals
twee gescheiden genen dien is het virus ecoconstructen
troop dus kan het de
mens niet infecteren
fNX-ampho E1/E4 van retrovirale vector L2 8 e of j kans op vorming van
adenovirus, largeT zonder RCR’s kleiner dan bij
van SV40, en gag-pol-env PA317, maar door
episomaal gag-pol genen episomale aanwezigen
env genen van heid van gag-pol en
amfotroop retrovirus env in meerdere
kopieën is de kans
op vorming van
RCR’s niet nul
* uitgaande van onschadelijke inserts, schadelijke inserts verhogen de risicoklasse!
** het gaat hierbij om de uit de schema’s in bijlage 2 van toepassing zijnde inschalingsregel
VIB brochure bioveiligheid in het laboratorium 37

38
Laboratoriumvoorzieningen
Voor het opgroeien van adenovirale of muizenretrovirale partikels, of ze nu replicatiedefectief
zijn of niet, is een laboratorium met inperkingsniveau 2 aangewezen. Bovendien is een
veiligheidskabinet van klasse II nodig, een horizontale laminaire flowkast geeft onvoldoende
bescherming aan de medewerker en het milieu. Strikte toegangsregels gelden voor de
toegang tot de ruimte.
Afval
Al het vast, vloeibaar en besmet materiaal dient geïnactiveerd of ontsmet te worden voordat
het wordt weggegooid of hergebruikt. Autoclaveren is hiervoor de aangewezen
methode, of afvoeren van het materiaal in speciale biohazardafvalcontainers naar een vuilverbranding
die geschikt is voor de verbranding van ziekenhuisafval.
Bijzonderheden
Werkzaamheden met de verschillende virale vectoren kunnen niet gelijktijdig in eenzelfde
ruimte, laat staan in eenzelfde veiligheidskabinet worden uitgevoerd. Na beëindiging van
werkzaamheden met een bepaald virus dienen de werkoppervlakken en het veiligheidskabinet
te worden opgeruimd en ontsmet voordat het wordt vrijgegeven voor werkzaamheden
met een ander virus.
In het bovenstaande wordt uitgegaan van onschadelijke inserts. Bij het gebruik van virale
vectoren, zeker wanneer het gaat om vectoren die hun erfelijk materiaal in het genoom
van de cel inbouwen, moet extra opgepast worden met bijvoorbeeld het gebruik van
oncogenen. De inschaling gaat dan een klasse omhoog. Ook genen voor sommige
immuunmodulerende eiwitten kunnen in virale vectoren als schadelijk worden aangemerkt.
Een risicoklasse 3 inschaling is in sommige gevallen nodig en daarvoor gelden
strikte inperkingsvoorzieningen en werkvoorschriften die in de praktijk nogal wat met zich
meebrengen.
Er zijn steeds meer systemen voor de productie van virale vectoren waarbij het partikel dat
geproduceerd wordt bestaat uit componenten afkomstig van verschillende virussen. Het
meest bekende voorbeeld is de pseudotypering van retrovirale vectoren met het VSV-G
eiwit. Dergelijke combinaties van virale componenten verdienen bijzondere aandacht.
Gastheerspecificiteit kan veranderen, bijvoorbeeld van niet-infectieus voor de mens naar
wel-infectieus voor de mens. De risicoklasse dient aangepast te worden aan het actuele
risico.
VIB brochure bioveiligheid in het laboratorium

Werken met genetisch gemodificeerde Agrobacterium
Inschaling
Over het algemeen wordt gewerkt met A. tumefaciens stammen die ‘disarmed’ zijn, dat wil
zeggen dat ze niet langer oncogeen zijn. Ze veroorzaken geen ‘crown galls’ meer. Deze
stammen vallen in risicoklasse 1. Dit geldt niet voor wildtype stammen of voor A. rhizogenes.
stam vectoren inschaling* inschalingsregel**
opmerkingen
disarmed A. binaire en andere L1 1 e of j de stammen zijn biologisch
tumefaciens plant ingeperkt ten opzichte van
stammen transformatie
vectoren
de wildtype stammen
niet-disarmed A. binaire en andere L2 3 e of j deze stammen zijn pathogeen
tumefaciens plant transformatie
stammen vectoren
A. rhizogenes binaire en andere
plant transformatie
vectoren
L2 3 e of j deze stammen zijn pathogeen
* uitgaande van onschadelijke inserts
** het gaat hierbij om de uit bijlage 2 van toepassing zijnde inschalingsregel
Laboratoriumvoorzieningen
Standaard L1 laboratoriumvoorzieningen volstaan voor disarmed A. tumefaciens stammen.
Dezelfde regels kunnen gevolgd worden voor E. coli K12. Voor de niet-disarmed of A. rhizogenes
stammen volstaat een standaard L2 laboratorium. In geval van L2 werkzaamheden
waarbij de vorming van aërosolen niet kan worden vermeden, dient een veiligheidskabinet
aanwezig te zijn.
Afval
Al het materiaal, vast of vloeibaar, dient ontsmet te worden net als voor E. coli. Autoclaveren
is daarvoor de meest aangewezen methode.
Bijzonderheden
Vaak worden kleine, recent getransformeerde plantjes overgezet op verse media. Deze
plantjes zijn (nog) niet vrij van A. tumefaciens. Meestal wordt dit gedaan in horizontale
laminaire flowkasten. Dit is toegestaan zolang er niet gewerkt wordt met echte open
bronnen van Agrobacterium.
VIB brochure bioveiligheid in het laboratorium 39

40
Werken met transgene planten
Bij het werken met transgene planten kunnen de volgende vuistregels gehanteerd worden:
1. Kweek in fytotrons of kweekcellen:
• Kweekcellen moeten dicht zijn en mogen niet direct op de buitenlucht openen.
• Plantenmateriaal moet geautoclaveerd worden voordat het als restafval wordt afgevoerd
(in het geval het nog niet vrij is van genetisch gemodificeerde Agrobacterium
tumefaciens).
• De verspreiding van zaden moet worden tegengegaan en reproductieve delen van
planten moeten geïnactiveerd worden voordat ze als afval worden afgevoerd.
2. Kweek in serres:
• Bij gebruik van bloeiende insectenbestuivers moeten openingen voorzien zijn van
insectengaas en mag de serre niet direct op de buitenlucht openen (er moet een sas
zijn); bij gebruik van bloeiende zelfbevruchters, apomicten of windbestuivers hoeft
er geen insectengaas op de openingen en is een sas niet echt nodig.
• Ook hier geldt dat de verspreiding van zaden tegengegaan moet worden. Zaden
moeten zorgvuldig worden verzameld. Grond die zaden kan bevatten mag pas na
inactivering worden afgevoerd als afval. Reproductieve delen van planten moeten
geïnactiveerd worden voordat ze als afval worden afgevoerd.
VIB brochure bioveiligheid in het laboratorium

8. REFERENTIES
Begrip voor Veilige Microbiologische Techniek; theoretische inleiding voor de practische
cursus, Commissie ad hoc recombinant-DNA werkzaamheden, 1987
Veilig werken met micro-organismen en cellen in laboratoria en werkruimten; theorie en
praktijk; concept, oktober 1997; Nederlandse Vereniging voor Microbiologie.
Laboratory Biosafety Manual, second edition, WHO, Geneva, 1993
Richtlijn 90/219/EEG, zoals gewijzigd door richtlijn 98/81/EEG
Vlarem I en II, rubriek 51
Biosafety cabinets, CDC, Atlanta, USA
http://biosafety.ihe.be
http://www.hc-sc.qc.ca/hpb/lcdc/biosafty/msds/index.html
http://www.ebsa.be
http://www.cdc.gov/od/ohs
VIB brochure bioveiligheid in het laboratorium 41

42
9. VERKLARENDE WOORDENLIJST
Aërosol: minuscule vloeistofdruppeltjes die zich door de lucht kunnen verplaatsen
Biologisch agens: in zijn wettelijke definitie betekent dit ziekteverwekker (zie welzijnswetgeving)
Donorsequentie: het stukje erfelijk materiaal dat uit een bepaald organisme - de donor -
wordt overgebracht naar een ander organisme, ook wel insert genaamd. In veel gevallen is
echter geen sprake meer van het overbrengen van een sequentie uit een ‘donor’, maar
wordt een stuk erfelijk materiaal synthetisch aangemaakt
Gastheer:
(1) in de context van natuurlijke pathogenen betekent gastheer het organisme dat van
nature door de ziekteverwekker wordt geïnfecteerd,
(2) in de context van genetische modificatie betekent gastheer het te modificeren organisme:
het organisme waarin het nieuwe stukje erfelijk materiaal wordt ondergebracht.
HEPA: High Efficiency Particulate Air (filter)
Pathogeniteit: ziekteverwekkendheid
Reproductief: in staat uit te groeien tot een zelfstandig functionerend organisme
Toxiciteit: vergiftiging
Transductie: staat in feite gelijk aan virale infectie. Wordt in de praktijk vooral gebruikt
om de infectie van bacteriën door fagen en om de infectie van cellen door een virale vector
aan te duiden
Transformatie:
(1) in de context van tumoren betekent transformatie de omvorming van een normale cel
naar een oneindig delende tumorcel,
(2) transformatie wordt in de genetische modificatie ook als algemene term gebruikt om
het proces van genetische modificatie aan te duiden (transformeren is dan gelijk aan
genetisch modificeren).
Vector: letterlijk betekent dit ‘drager’
(1) in het kader van genetische modificatie is dit het plasmide, cosmide, artificial chromosome
of ander genetisch element dat de genetische modificatie - het insert - draagt en
binnenbrengt in het te modificeren organisme,
(2) in de context van virale infectie van planten duidt het begrip vector het organisme aan
dat zorgdraagt voor de overdracht van het virus van de ene naar de andere plant. In
sommige gevallen zijn dit bladluizen.
Virale vector: een van een wild-type virus afgeleide virale constructie dat een vreemd
DNA-fragment kan opnemen of in zich heeft en zich ofwel autonoom kan gedragen,
indien hij de sequenties bezit die nodig zijn voor zijn verspreiding van cel tot cel, ofwel
defectief, indien hij één of meer sequenties mist voor zijn verspreiding
VIB brochure bioveiligheid in het laboratorium

BIJLAGE 1: INPERKINGSEISEN
Deze bijlage geeft enkel de eisen voor latoratoria, animalaria en serres. De inperkingseisen voor grootschalige
fermentoractiviteiten zijn te vinden in bijlage 2 aan Vlarem II.
(zie http://biosafety.ihe.be).
Inperkingseisen van de niveaus 1 t/m 4 voor laboratoria (L1 t/m L4)
Enkele basiseisen voor alle inperkingsniveaus:
• Bioveiligheidsopleiding van het personeel voor het risiconiveau waarin hij/zij werkt.
• Bijhouden van de werkzaamheden in een labjournaal of logboek.
Risicoklasse 1, inperkingsniveau L1:
Basiseisen fysische inperking L1
• Het laboratorium bestaat uit een permanente structuur van wanden, deur(en), vloer en plafond.
• De werkoppervlakken zijn glad afgewerkt, waterondoordringbaar, bestand tegen zuren, basen, organische
oplosmiddelen, en gemakkelijk te reinigen.
• Er is een wasbak aanwezig.
Werkvoorschriften L1 (= VMT)
• Deuren en ramen zijn gesloten tijdens de werkzaamheden.
• Tijdens het werk wordt een laboratoriumjas gedragen.
• Eten, drinken, roken en de opslag van eet- en drinkwaren in het laboratorium zijn verboden.
• Na het morsen wordt direct ontsmet.
• Het ontstaan en verspreiden van aërosolen wordt geminimaliseerd.
• Met de mond pipetteren is verboden.
• Gebruikte materialen worden ontsmet voordat ze worden gewassen of hergebruikt.
• Biologisch afval wordt geïnactiveerd.
• De handen worden gewassen voordat het laboratorium wordt verlaten.
Risicoklasse 2, inperkingsniveau L2:
Basiseisen fysische inperking L2
• Het laboratorium bestaat uit een permanente structuur van wanden, deur(en), vloer en plafond.
• De werkoppervlakken zijn glad afgewerkt, waterondoordringbaar, bestand tegen zuren, basen, organische
oplosmiddelen, en gemakkelijk te reinigen.
• Er is een wasbak aanwezig.
• Vergrendelbare toegangsdeuren.
• Biohazard symbool en het inperkingsniveau evenals de coördinaten van de verantwoordelijke op de
toegangsdeur.
Afhankelijk van de werkzaamheden kan hier nog worden aan toegevoegd:
• De toegangsdeur is voorzien van automatische sluiting.
• Er is een kijkvenster aanwezig.
• Wasbakken met niet-manuele bediening
• Er is een veiligheidskabinet aanwezig (klasse I of II)
Werkvoorschriften L2
• Deuren en ramen zijn gesloten tijdens de werkzaamheden.
• Tijdens het werk wordt een laboratoriumjas gedragen.
VIB brochure bioveiligheid in het laboratorium 43

44
• Eten, drinken, roken en de opslag van eet- en drinkwaren in het laboratorium zijn verboden.
• Na het morsen wordt direct ontsmet.
• Het ontstaan en verspreiden van aërosolen wordt geminimaliseerd.
• Met de mond pipetteren is verboden.
• Gebruikte materialen worden ontsmet voordat ze worden gewassen of hergebruikt.
• Biologisch afval wordt geïnactiveerd.
• De handen worden gewassen voordat het laboratorium wordt verlaten.
• De toegang is voorbehouden aan bevoegde personen.
• Aërosolproducerende handelingen worden in een veiligheidskabinet uitgevoerd.
Afhankelijk van de werkzaamheden kan hier nog worden aan toegevoegd:
• Er is een controleprogramma voor insecten en knaagdieren.
Risicoklasse 3, inperkingsniveau L3:
Basiseisen fysische inperking L3
• Het laboratorium bestaat uit een permanente structuur van wanden, deur(en), vloer en plafond.
• De werkoppervlakken en de vloer zijn glad afgewerkt, waterondoordringbaar, bestand tegen zuren,
basen, organische oplosmiddelen, en gemakkelijk te reinigen.
• Er is een wasbak met niet-manuele bediening aanwezig in de luchtsluis nabij de uitgang.
• Vergrendelbare toegangsdeuren met een automatische sluiting.
• Biohazard symbool, het inperkingsniveau, aard van het biologisch risico, lijst van toegelaten personen,
criteria voor toegang evenals de coördinaten van de verantwoordelijke op de toegangsdeur.
• Toegang via luchtsluis of enige toegang via L2.
• Vaste ramen.
• Luchtdicht lokaal zodat fumigatie mogelijk is.
• Er is een brandalarmsysteem aanwezig.
• Er is een systeem voor communicatie met de buitenwereld aanwezig.
• Luchttoevoer en -afvoer zijn onderling verbonden om accidentele overdruk te vermijden.
• Luchttoevoer en -afvoersysteem afsluitbaar met kleppen.
• Onderdruk in de gecontroleerde zone ten opzichte van de omliggende zone voorzien van controle en
alarmsysteem.
• HEPA-filtratie van de afvoerlucht.
• Systeem dat toelaat filters te vervangen en daarbij besmetting te vermijden.
• Er is een veiligheidskabinet aanwezig (klasse II).
• Er is een centrifuge in de ingeperkte zone.
• Er is een autoclaaf in het gebouw.
Afhankelijk van de werkzaamheden kan hier nog worden aan toegevoegd:
• Het laboratorium is gescheiden van andere werkzones in het gebouw of is in een afzonderlijk gebouw
gelegen.
• Er is een kijkvenster aanwezig.
• Toevoerbuizen voor vloeistoffen zijn voorzien van een terugvloeibeveiliging.
• Er is een noodstroomvoorziening.
• Er is een autoclaaf in de ingeperkte zone.
• Luchttoevoer en/of -afvoer gescheiden van die van aangrenzende lokalen.
Werkvoorschriften L3:
• Deuren en ramen zijn gesloten tijdens de werkzaamheden.
• Tijdens het werk wordt een laboratoriumjas gedragen.
VIB brochure bioveiligheid in het laboratorium

• De laboratoriumjassen zijn specifiek voor de inperkingszone en worden ontsmet vooraleer ze de inperkingszone
verlaten.
• Eten, drinken, roken en de opslag van eet- en drinkwaren in het laboratorium zijn verboden.
• Na het morsen wordt direct ontsmet.
• Het ontstaan en verspreiden van aërosolen wordt geminimaliseerd. Hiervoor worden specifieke maatregelen
getroffen (gesloten buizen, etc.).
• Met de mond pipetteren is verboden.
• Gebruikte materialen worden ontsmet voordat ze worden gewassen of hergebruikt.
• Biologisch afval wordt geïnactiveerd.
• De handen worden gewassen voordat het laboratorium wordt verlaten.
• De toegang is voorbehouden aan bevoegde personen.
• Aërosolproducerende handelingen worden in een veiligheidskabinet uitgevoerd.
• Er worden handschoenen gedragen.
• Er is een controleprogramma voor insecten en knaagdieren.
• Laboratoriumuitrusting is specifiek voor de inperkingszone.
Afhankelijk van de werkzaamheden kan hier nog worden aan toegevoegd:
• Ontsmettingsmiddelen in de hevels.
• Inactivering van de effluenten van de wasbakken en douches volgens een geschikte methode vóór
eindafvoer.
Risicoklasse 4, inperkingsniveau L4:
Basiseisen fysische inperking L4
• Het laboratorium bestaat uit een permanente structuur van wanden, deur(en), vloer en plafond.
• Het laboratorium is gescheiden van andere werkzones in het gebouw of is in een afzonderlijk gebouw
gelegen.
• De werkoppervlakken, vloer, wanden en plafond zijn glad afgewerkt, waterondoordringbaar, bestand
tegen zuren, basen, organische oplosmiddelen, en gemakkelijk te reinigen.
• Er is een wasbak met niet-manuele bediening aanwezig in de luchtsluis nabij de uitgang.
• Toevoerbuizen voorzien van een terugvloeibeveiliging.
• Vergrendelbare toegangsdeuren met een automatische sluiting.
• Biohazard symbool, het inperkingsniveau, aard van het biologisch risico, lijst van toegelaten personen,
criteria voor toegang evenals de coördinaten van de verantwoordelijke op de toegangsdeur.
• Toegang via luchtsluis.
• Vaste onbreekbare ramen.
• Luchtdicht lokaal zodat fumigatie mogelijk is.
• Er is een brandalarmsysteem aanwezig.
• Er is een systeem voor communicatie met de buitenwereld aanwezig met niet-manuele bediening.
• Kijkvenster of gelijkwaardig systeem dat toelaat te zien wie er zich in het lokaal bevindt.
• Luchttoevoer is gescheiden van aangrenzende lokalen.
• Luchttoevoer en -afvoer zijn onderling verbonden om accidentele overdruk te vermijden.
• Luchttoevoer en -afvoersysteem afsluitbaar met kleppen.
• Onderdruk in de gecontroleerde zone ten opzichte van de omliggende zone (voorzien van controle en
alarmsysteem).
• HEPA-filtratie van de toevoer- en afvoerlucht (dubbel bij de afvoer).
• Systeem dat toelaat filters te vervangen en daarbij besmetting te vermijden.
VIB brochure bioveiligheid in het laboratorium 45

46
• Er is een veiligheidskabinet aanwezig (klasse III, of II mits gebruik gemaakt wordt van isolatiepak dat
onder overdruk staat).
• Er is een centrifuge in de ingeperkte zone.
• Er is een noodstroomvoorziening.
• Doorgeef-autoclaaf in de ingeperkte zone.
• Vacuümgenerator voorzien van HEPA filter.
Werkvoorschriften L4:
• Deuren en ramen zijn gesloten tijdens de werkzaamheden.
• Tijdens het werk wordt een laboratoriumjas gedragen.
• De laboratoriumjassen zijn specifiek voor de inperkingszone en worden ontsmet vooraleer ze de inperkingszone
verlaten.
• Eten, drinken, roken en de opslag van eet- en drinkwaren in het laboratorium zijn verboden.
• Na het morsen wordt direct ontsmet.
• Het ontstaan en verspreiden van aërosolen wordt geminimaliseerd. Hiervoor worden specifieke maatregelen
getroffen (gesloten buizen, etc.).
• Met de mond pipetteren is verboden.
• Gebruikte materialen worden ontsmet voordat ze worden gewassen of hergebruikt.
• Biologisch afval wordt geïnactiveerd.
• De handen worden gewassen voordat het laboratorium wordt verlaten.
• De toegang is voorbehouden aan bevoegde personen.
• Aërosolproducerende handelingen worden in een veiligheidskabinet uitgevoerd.
• Er worden handschoenen gedragen.
• Er is een controleprogramma voor insecten en knaagdieren.
• Laboratoriumuitrusting is specifiek voor de inperkingszone.
• Ontsmettingmiddel in de hevels.
• Inactivering van de effluenten van de wasbakken en douches volgens een geschikte methode vóór
eindafvoer.
Inperkingseisen voor de niveaus 1 t/m 4 voor kweekcellen en serres (G1 t/m G4)
Risicoklasse 1, inperkingsniveau G1
Basiseisen fysische inperking G1:
• Er is een wasbak aanwezig.
Werkvoorschriften G1:
• Voorbehouden toegang.
• Er wordt beschermende kleding gedragen.
• Eten, drinken, roken en de opslag van eet- en drinkwaren is verboden.
Afhankelijk van de werkzaamheden kan hier nog worden aan toegevoegd:
• Controleprogramma van insecten en knaagdieren.
• Vernietiging of sterilisatie van (reproductieve delen van) planten vóórdat deze worden afgevoerd.
• Sterilisatie van ondergrond en potten vóór hergebruik of verwijdering.
Risicoklasse 2, inperkingsniveau G2
Basiseisen fysische inperking G2:
• De kweekcel of serre is een permanente structuur.
• Rondom de serre een zone van 1.5 m breed in beton of gezuiverd van plantengroei.
VIB brochure bioveiligheid in het laboratorium

• Gangpaden van hard materiaal.
• Vergrendelbare toegangsdeuren.
• Er is een wasbak aanwezig.
• Signalisatie van het biologisch risico.
Afhankelijk van de werkzaamheden kan hier nog worden aan toegevoegd:
• Toegang via een luchtsluis.
• Materiaal van wanden, vloer, zoldering waterondoordringbaar en gemakkelijk schoon te maken.
• Materiaal van werkoppervlakken, vloer bestand tegen zuren of basen, organische oplosmiddelen
en ontsmettingsmiddelen.
• Brandalarmsysteem.
• Een systeem voor communicatie met de buitenwereld.
• Luchttoevoer- en afvoersysteem onderling verbonden om accidentele overdruk te vermijden.
• Luchttoevoer- en luchtafvoersysteem afsluitbaar d.m.v. kleppen.
Werkvoorschriften G2:
• Voorbehouden toegang
• Er wordt beschermende kleding gedragen.
• Vernietiging of sterilisatie van (reproductieve delen van) planten vóórdat deze worden afgevoerd.
• Sterilisatie van ondergrond en potten vóór hergebruik of verwijdering.
• Transport van zichzelf verspreidende organismen tussen de inperkingszones in containers.
• Decontaminatie van containers vóór transport.
Afhankelijk van de werkzaamheden kan hier nog worden aan toegevoegd:
• Handschoenen.
• Vermelding van gebruikte organismen op het register.
Risicoklasse 3, inperkingsniveau G3
Basiseisen fysische inperking G3:
• De serre is een permante structuur.
• De serre/kweekkamer is gescheiden van andere werkzones in het gebouw of is in een afzonderlijk
gebouw gelegen.
• Rondom de serre een zone van 1.5 m breed in beton of gezuiverd van plantengroei.
• Gangpaden van hard materiaal.
• Vergrendelbare toegangsdeuren.
• Er is een wasbak aanwezig bij de uitgang of in de luchtsluis.
• Signalisatie van het biologisch risico.
• Toegang via een luchtsluis.
• Materiaal van wanden, vloer, zoldering waterondoordringbaar en gemakkelijk schoon te maken.
• Materiaal van werkoppervlakken, vloer bestand tegen zuren of basen, organische oplosmiddelen
en ontsmettingsmiddelen.
• Verzamelen en steriliseren van water afkomstig van de vloer.
• Brandalarmsysteem.
• Er is een systeem voor communicatie met de buitenwereld.
• Luchttoevoer- en afvoersysteem onderling verbonden om accidentele overdruk te vermijden.
• Luchttoevoer- en luchtafvoersysteem afsluitbaar d.m.v. kleppen.
• HEPA filtratie van toevoer- en afvoerlucht.
• Systeem dat toelaat filters te vervangen en daarbij besmetting te vermijden.
• Automatisch systeem bij panne.
VIB brochure bioveiligheid in het laboratorium 47

48
• Serre of kweekcel met eigen specifieke uitrusting.
Afhankelijk van de werkzaamheden kan hier nog worden aan toegevoegd:
• Onderdruk in de gecontroleerde zone ten opzichte van de omliggende zones.
• Autoclaaf of equivalente uitrusting in de inperkingszone.
• Doorgeefautoclaaf.
• Fumigatiekamer of immersietank voor transfer van levend materiaal.
Werkvoorschriften G3:
• Voorbehouden toegang.
• Er wordt beschermende kleding gedragen, specifiek voor de inperkingszone en deze wordt
ontsmet voordat deze de inperkingszone verlaat.
• Vernietiging of sterilisatie van (reproductieve delen van) planten vóórdat deze worden afgevoerd.
• Sterilisatie van ondergrond en potten vóór hergebruik of verwijdering.
• Transport van zichzelf verspreidende organismen tussen de inperkingszones in dubbele containers.
• Decontaminatie van containers vóór transport.
• Vermelding van gebruikte organismen op het register.
Afhankelijk van de werkzaamheden kan hier nog worden aan toegevoegd:
• Handschoenen.
• Inactivatie van de effluenten van wasbakken en douches vóór eindafvoer.
Risicoklasse 4, inperkingsniveau G4:
Een G4 serre behoort tot de hoge uitzonderingen. De beschrijving ervan wordt hier beperkt tot
de vermelding dat het om een serre gaat die aan dezelfde inperkingseisen voldoet als een L4laboratorium.
Inperkingseisen van de niveaus 1 t/m 4 voor animalaria (A1 t/m A4)
Risicoklasse 1, inperkingsniveau A1:
Basiseisen fysische inperking A1:
• Het animalarium bestaat uit een permanente structuur van wanden, deur(en), vloer en plafond.
• Er is een wasbak aanwezig.
• Vergrendelbare toegangsdeuren.
• Werkoppervlakken, muren, vloeren, zoldering en kooien zijn waterondoordringbaar, gemakkelijk
schoon te maken en bestand tegen ontsmettingsmiddelen.
• Er is een wasplaats voor kooien.
• Inperkingsniveau, aard van het biologisch risico, coördinaten van verantwoordelijke, lijst van
toegelaten personeel en criteria voor toegang tot de inperkingszone staan op de toegangsdeur
vermeld.
Werkvoorschriften A1:
• De toegang is voorbehouden aan bevoegde personen.
• Alle activiteiten worden in een register vermeld.
• Isolatie van proefdieren gebruikt bij de proefneming.
• Tijdens het werk wordt een laboratoriumjas gedragen, die specifiek is voor de inperkingszone.
• Eten, drinken, roken en de opslag van eet- en drinkwaren in het animalarium zijn verboden.
VIB brochure bioveiligheid in het laboratorium

Risicoklasse 2, inperkingsniveau A2:
Basiseisen fysische inperking A2:
• Het animalarium bestaat uit een permanente structuur van wanden, deur(en), vloer en plafond.
• Er is een wasbak aanwezig.
• Vergrendelbare toegangsdeuren met een automatische sluiting.
• Werkoppervlakken, muren, vloeren, zoldering en kooien zijn waterondoordringbaar, gemakkelijk
schoon te maken en bestand tegen ontsmettingsmiddelen.
• Afzonderlijke ruimte voor het opslaan van propere kooien, voeder en strooisel.
• Er is een wasplaats voor kooien.
• Biohazardsymbool, inperkingsniveau, aard van het biologisch risico, coördinaten van de verantwoordelijke,
lijst van toegelaten personeel en criteria voor toegang tot de inperkingszone staan
op de toegangsdeur vermeld.
Afhankelijk van de werkzaamheden kan hier nog worden aan toegevoegd:
• Het animalarium is gescheiden van andere werkzones in hetzelfde gebouw of is in een afzonderlijk
gebouw gelegen.
• Toegang via een luchtsluis.
• Luchtdicht lokaal zodat fumigatie mogelijk is en/of de aanwezigheid van een fumigatiesysteem
of ontsmettingsbad.
• Gebouw dusdanig ontworpen dat accidentele ontsmetting van dieren vermeden wordt.
• Kijkvenster.
• Wasbakken met niet-manuele bediening.
• Luchtafvoersysteem gescheiden van aangrenzende lokalen.
• Luchttoevoer- en afvoersysteem onderling verbonden om accidentele overdruk te vermijden.
• Onderdruk in de gecontroleerde zone ten opzichte van omliggende zone.
• Veiligheidskabinet.
• Dieren huisvesten in isolatieruimten.
Werkvoorschriften A2:
• De toegang is voorbehouden aan bevoegde personen.
• Alle activiteiten worden in een register vermeld.
• Isolatie van proefdieren gebruikt bij de proefneming.
• Tijdens het werk wordt een laboratoriumjas gedragen, die specifiek is voor de inperkingszone.
• Eten, drinken, roken en de opslag van eet- en drinkwaren in het animalarium zijn verboden.
• Er is een controleprogramma voor insecten en knaagdieren.
Afhankelijk van de werkzaamheden kan hier nog worden aan toegevoegd:
• Eliminatie door verbranding.
• Handschoenen voor manipulatie van proefdieren.
• Ontsmettingsmiddelen in de hevels.
• Ademhalingsmasker voor manipulatie van geïnfecteerde dieren.
• Animalarium met eigen specifieke uitrusting.
• Inactivering van biologisch afval.
• Besmet materiaal wordt ontsmet voordat het wordt schoongemaakt, hergebruikt of vernietigd.
Risicoklasse 3, inperkingsniveau A3:
Basiseisen fysische inperking A3:
• Het animalarium bestaat uit een permanente structuur van wanden, deur(en), vloer en plafond.
VIB brochure bioveiligheid in het laboratorium 49

50
• Het animalarium is gescheiden van de andere werkzones in het gebouw of is in een afzonderlijk
gebouw gelegen.
• Toegang via een luchtsluis.
• Er is een wasbak met niet-manuele bediening aanwezig nabij de uitgang of in de sas.
• Vergrendelbare toegangsdeuren met een automatische sluiting.
• Vaste ramen.
• Luchtdicht lokaal zodat fumigatie mogelijk is, fumigatiesysteem, en/of ontsmettingsbad.
• Gebouw dusdanig ontworpen dat accidentele ontsnapping van dieren vermeden wordt.
• Kijkvenster.
• Werkoppervlakken, muren, vloeren, zoldering en kooien zijn waterondoordringbaar, gemakkelijk
schoon te maken en bestand tegen ontsmettingsmiddelen.
• Afzonderlijke ruimte voor het opslaan van propere kooien, voeder en strooisel.
• Er is een wasplaats voor kooien.
• Biohazardsymbool, inperkingsniveau, aard van het biologisch risico, coördinaten van de verantwoordelijke,
lijst van toegelaten personeel en criteria voor toegang tot de inperkingszone staan
op de toegangsdeur vermeld.
• Brandalarmsysteem.
• Er is een systeem voor communicatie met de buitenwereld aanwezig.
• Luchttoevoer- en luchtafvoersysteem onderling verbonden om accidentele overdruk te vermijden.
• Luchttoevoer- en luchtafvoersysteem afsluitbaar d.m.v. kleppen.
• Onderdruk in de gecontroleerde zone ten opzichte van omliggende zones, voorzien van controle
en alarmsysteem.
• HEPA-filtratie van de afgevoerde lucht.
• Systeem dat toelaat filters te vervangen en daarbij besmetting te vermijden.
• Specifieke maatregelen om dusdanig te ventileren opdat de luchtbesmetting tot een minimum
wordt herleid.
Afhankelijk van de werkzaamheden kan hier nog worden aan toegevoegd:
• Er is een douche aanwezig (als enige doorgang van ‘vuile’ naar ‘schone’ deel van de sas).
• Toevoerbuizen van vloeistoffen voorzien van een terugvloeibeveiliging.
• Autonoom elektrisch systeem bij panne.
• Luchttoevoersysteem gescheiden van de aangrenzende lokalen.
• Luchtafvoersysteem gescheiden van de aangrenzende lokalen.
• HEPA-gefilterde lucht mag opnieuw in omloop worden gebracht.
• Er is een veiligheidskabinet aanwezig.
• Huisvesting van dieren in isolatieruimten.
• Autoclaaf in de inperkingszone.
• Doorgeefautoclaaf.
Werkvoorschriften A3:
• De toegang is voorbehouden aan bevoegde personen.
• Alle activiteiten worden in een register vermeld.
• Isolatie van proefdieren gebruikt bij de proefneming.
• Tijdens het werk wordt een laboratoriumjas gedragen, die specifiek is voor de inperkingszone.
• Eten, drinken, roken en de opslag van eet- en drinkwaren in het animalarium zijn verboden.
• Er is een controleprogramma voor insecten en knaagdieren.
• Eliminatie door verbranding.
• Handschoenen voor manipulatie van dieren.
VIB brochure bioveiligheid in het laboratorium

• Ontsmetting van kleding vooraleer ze de inperkingszone verlaat.
• Ontsmettingsmiddelen in de hevels.
• Animalarium met eigen specifieke uitrusting.
• Biologisch afval wordt geïnactiveerd.
• Besmet materiaal wordt ontsmet voordat het wordt schoongemaakt, hergebruikt of vernietigd.
Afhankelijk van de werkzaamheden kan hier nog worden aan toegevoegd:
• Ademhalingsmasker voor manipulatie van geïnfecteerde dieren.
• Periode waarbinnen elk contact van personeel met het gastheerdier moet worden vermeden.
• Inactivering van de effluenten van de wasbakken en douches vóór eindafvoer.
Risicoklasse 4, inperkingsniveau A4
Een A4 proefdierverblijf behoort, net als een L4 laboratorium tot de hoge uitzonderingen. De
beschrijving van dit A4-verblijf wordt daarom beperkt tot de opmerking dat de inperkingseisen
gelijk zijn aan die van een L4-laboratorium aangevuld met enkele bijzondere eisen voor de hantering
van de proefdieren en de inactivering van de proefdieren.
VIB brochure bioveiligheid in het laboratorium 51

52
BIJLAGE 2: VIB RICHTLIJNEN VOOR
INSCHALING VAN
ACTIVITEITEN MET GGO’S
Situering
Deze richtlijnen hebben tot doel hulp te bieden bij de vaststelling van de benodigde inperkingsniveaus
bij activiteiten met genetisch gemodificeerde organismen. In deze bijlage wordt onderscheid gemaakt
tussen activiteiten met micro-organismen en cellen (hst. A), activiteiten met planten (hst. B) en activiteiten
met dieren (hst. C). De transformatie van planten met behulp van Agrobacterium stammen wordt
ingeschaald als een activiteit met het micro-organisme.
Gebruik van deze richtlijnen
Deze richtlijnen bieden met name hulp bij de inschatting van de benodigde inperkingsmaatregelen voor
activiteiten met micro-organismen en cellen (hst A van deze richtlijnen). In dit hoofdstuk A staat een
beschrijving hoe de inschalingsschema’s te gebruiken. Daarnaast zijn de benodigde definities van toxines
en de eisen aan gastheren en vectoren voor risicoklasse 1 weergegeven. Indien het gaat om activiteiten
met transgene planten, dan geeft hst. B een leidraad. Activiteiten met transgene dieren en vooral activiteiten
waarin het gebruik van genetisch gemodificeerde micro-organismen of cellen gecombineerd wordt
met dieren zijn niet eenvoudig in te schalen. Hst C geeft hierin een leidraad.
Er zijn natuurlijk gevallen waarin deze richtlijnen niet voorzien. In een dergelijk geval is het voor advies
raadzaam contact op te nemen met de bioveiligheidsexperten intern en extern zoals weergegeven in bijlage
4 van dit boekje.
Bronnen
De richtlijnen zijn afgeleid van de Richtlijnen van de Nederlandse Commissie Genetische Modificatie
(COGEM) voor zover die toepasbaar zijn in België. Daarnaast is gebruik gemaakt van de inschalingsvoorschriften
zoals deze zijn opgenomen in de bijlagen bij hoofdstuk 5.51 van Vlarem II.
HST A. RICHTLIJNEN VOOR INSCHALING VAN ACTIVITEITEN MET
GENETISCH GEMODIFICEERDE MICRO-ORGANISMEN EN CELLEN
Inschalingsregels
Op de volgende pagina’s zijn schema’s weergegeven waarin een eerste identificatie van het inperkingsniveau
kan worden afgeleid. Zoals aangegeven in hoofdstuk 3 en in het voorbeeld in hoofdstuk 7, dient
daarna nog gekomen te worden tot een finale vaststelling van de benodigde maatregelen waarbij rekening
gehouden wordt met (1) de eigenschappen van het milieu dat aan het GGO zou kunnen worden
blootgesteld, (2) het type en de schaal van de activiteit, en (3) eventuele niet-standaard handelingen.
Het inschalingsschema is in vier stukken verdeeld:
• Deel 1: Activiteiten met gastheer/vectorsystemen die al dan niet voldoen aan risicoklasse 1 en activiteiten
met pathogene gastheren.
• Deel 2: Activiteiten met animale cellen zonder virale vectoren en met baculovirussen.
• Deel 3: Activiteiten met animale cellen in combinatie met virussen of virale vectoren.
• Deel 4: Vervaardiging in plantencellen.
VIB brochure bioveiligheid in het laboratorium

De schema’s werken als volgt: Eerst worden de vier deelschema’s in de ‘eerste richting’ langsgelopen en
wordt bepaald welk type van gastheer en vector van toepassing is. In tweede instantie wordt in de
‘tweede richting’ bepaald of het gaat om activiteiten met ongekarakteriseerd of gekarakteriseerd genetisch
materiaal. In derde instantie wordt dan binnen de van toepassing zijnde categorie (gekarakteriseerd
of ongekarakteriseerd) bepaald welk type van insertie van toepassing is. In het geval van ongekarakteriseerd
genetisch materiaal is het een keuze tussen een van de categorieën a t/m e, in het geval van gekarakteriseerd
genetisch materiaal is het een keuze tussen de categorieën f t/m j. Uit de combinatie van de
van toepassing zijnde categorie van gastheer/vector en van toepassing zijnde categorie van insert kan
dan de inschaling worden afgelezen.
Definitie van klassen van toxines
a. Een toxine van klasse T-3 is een toxine met een LD50 voor vertebraten van minder dan 100 nanogram
per kg lichaamsgewicht.
b. Een toxine van klasse T-2 is een toxine met een LD50 voor vertebraten van 100 nanogram tot 1
microgram per kg lichaamsgewicht.
c. Een toxine van klasse T-1 is een toxine met een LD50 voor vertebraten van 1 tot 100 microgram per
kg lichaamsgewicht.
Eisen aan gastheer/vector systemen voor indeling in risicoklasse 1
Eisen voor kleinschalige laboratoriumhandelingen
(kleinschalig is < 100 liter effectief kweekvolume)
1. De gastheer is niet pathogeen.
2. De gastheer is vrij van gekende biologische agentia die potentieel schadelijk zijn.
3. De vector is goed gekarakteriseerd, dit wil zeggen: het type vector moet gedefinieerd zijn (plasmide,
cosmide, minichromosoom, etc.), grootte moet gekend zijn, functie en herkomst van structurele
genen en merkergenen moeten gekend zijn, evenals restrictiesites, en replicon. Commercieel verkrijgbare
vectoren zijn in het algemeen goed gekarakteriseerd.
4. De vector mag geen schadelijke gevolgen hebben (geen virulentie- en toxinebepalende elementen
overbrengen).
5. De omvang van de vector is zoveel mogelijk beperkt tot die elementen die noodzakelijk zijn.
6. De vector mag de stabiliteit van het GGO in het milieu niet doen toenemen.
7. De vector moet moeilijk te mobiliseren zijn (Tra - ).
8. De vector mag geen resistentiemerkers overdragen naar micro-organismen die deze niet van nature
opnemen, indien dergelijke opname het gebruik van geneesmiddelen ter bestrijding van ziekteverwekkers
in gevaar brengt.
Biologische risicoklassen
Met organismen van biologische risicoklassen 4, 3 en 2 wordt bedoeld organismen die respectievelijk
ingedeeld zijn in de pathogeniteitsklassen 4, 3 en 2 als weergegeven in bijlage 5.51.8 van Vlarem II.
VIB brochure bioveiligheid in het laboratorium 53

54
1: Activiteiten met gastheer/vectorsystemen die al dan niet voldoen aan risicoklasse 1
en activiteiten met pathogene gastheren
tweede richting
Activiteiten waarbij ongekarakteriseerd genetisch
materiaal is toegevoegd
Activiteiten waarbij gekarakteriseerd genetisch
materiaal is toegevoegd
eerste richting
a. De donor produceert een toxine van T3 L4 L4 De gastheer is Klasse 4 L4
respectievelijk klasse T2 L3 L4 een pathogeen van: Klasse 3 L3
T1 L2 L3 Klasse 2 L2
b. De donor is een voor eukaryote cellen Klasse 4 L3 L4 De gastheer is Klasse 4 L4
infectieus virus van respectievelijk Klasse 3 L2 L3 een pathogeen Klasse 3 L3
Klasse 2 L1 L2 van: Klasse 2 L2
c. De donor is een defect voor eukaryote Klasse 4 L2 L2 De gastheer is Klasse 4 L4
cellen infectieus virus van Klasse 3 L1 L2 een pathogeen Klasse 3 L3
respectievelijk: Klasse 2 L1 L2 van: Klasse 2 L2
d. De donor is een niet-viraal pathogeen Klasse 4 L3 L3 De gastheer is Klasse 4 L4
van respectievelijk Klasse 3 L2 L2 een pathogeen Klasse 3 L3
Klasse 2 L1 L2 van: Klasse 2 L2
e. De donor is een organisme van L1 L2 De gastheer is Klasse 4 L4
biologische risicoklasse 1, of een plant een pathogeen Klasse 3 L3
of een dier van: Klasse 2 L2
f. De sequentie bevat genetische T3 L4 L4 De gastheer is Klasse 4 L4
informatie die codeert voor een toxine T2 L3 L4 een pathogeen Klasse 3 L3
van respectievelijk klasse T1 L2 L3 van: Klasse 2 L2
g. De sequentie bevat genetische Klasse 4 L3 L4 De gastheer is Klasse 4 L4
informatie voor de vorming van een Klasse 3 L2 L3 een pathogeen Klasse 3 L3
voor eukaryote cellen infectieus Klasse 2 L1 L2 van: Klasse 2 L2
virus, van respectievelijk
h. De sequentie bevat genetische Klasse 4 L2 L2 De gastheer is Klasse 4 L4
informatie voor de vorming van een Klasse 3 L1 L2 een pathogeen Klasse 3 L3
defect, voor eukaryote cellen Klasse 2 L1 L2 van: Klasse 2 L2
infectieus virus, van respectievelijk:
i. De sequentie bevat genetische L1 L2 De gastheer is Klasse 4 L4
informatie die codeert voor een een pathogeen Klasse 3 L3
schadelijk genproduct, anders dan in f. van: Klasse 2 L2
j. De sequentie bevat genetische L1 L2 De gastheer is Klasse 4 L4
informatie die codeert voor een een pathogeen Klasse 3 L3
onschadelijk genproduct van: Klasse 2 L2
VIB brochure bioveiligheid in het laboratorium
1. Activiteiten in een gastheer/vectorsysteem die
voldoen aan de criteria voor indeling in risicoklasse
1
2. Activiteiten in een gastheer/vectorsysteem
waarbij enkel de vector niet voldoet aan de
criteria voor indeling in risicoklasse 1
3. Activiteiten waarbij een pathogeen microorganisme
van biologische risicoklassen 2, 3
of 4 als gastheer wordt gebruikt

2: Activiteiten met animale cellen zonder virale vectoren en met baculovirussen
tweede richting
Activiteiten waarbij gekarakteriseerd genetisch materiaal is toegevoegd Activiteiten waarbij ongekarakteriseerd genetisch materiaal is toegevoegd
eerste richting
4. Vervaardiging in
animale cellen
waarbij geen virale
vector wordt
gebruikt
5. De virale vector is,
of is afgeleid van,
een baculovirus dat
biologisch ingeperkt
is of dat door
de vervaardiging
ingeperkt wordt
6. De virale vector is,
of is afgeleid van,
een biologisch nietingeperktbaculovirus
dat door de vervaardiging
evenmin
wordt ingeperkt
a. De donor produceert een toxine van T3 L1 L2 L3
respectievelijk klasse T2 L1 L1 L2
T1 L1 L1 L2
b. De donor is, of is afgeleid van, een Klasse 4 L4 L4 L4
voor eukaryote cellen infectieus virus Klasse 3 L3 L3 L3
van respectievelijk klasse 4, 3 of 2, en Klasse 2 L2 L2 L2
aanwezigheid van het genetisch
materiaal van de donor in de gastheer
kan leiden tot de vorming van
autonoom replicerende virusdeeltjes
c. De donor is, of is afgeleid van, een Klasse 4 L3 L2 L3
defect voor eukaryote cellen infectieus Klasse 3 L2 L2 L2
virus van respectievelijk klasse 4, 3 of Klasse 2 L1 L1 L2
2, en aanwezigheid van het genetisch
materiaal van de donor in de gastheer
kan niet leiden tot de vorming van
autonoom replicerende virusdeeltjes
d. De donor is een niet-viraal Klasse 4 L3 L2 L3
pathogeen van respectievelijk Klasse 3 L2 L2 L2
Klasse 2 L1 L1 L2
e. De donor is een organisme van L1 L1 L2
biologische risicoklasse 1 of een plant
of een dier
f. De sequentie bevat genetische T3 L1 L2 L3
informatie die codeert voor een toxine T2 L1 L1 L2
van respectievelijk klasse T1 L1 L1 L2
g. De sequentie bevat genetische Klasse 4 L4 L4 L4
informatie voor de vorming van een Klasse 3 L3 L3 L3
voor eukaryote cellen infectieus Klasse 2 L2 L2 L2
virus, van respectievelijk klasse 4, 3 of
2 en aanwezigheid van het genetisch
materiaal van de donor in de gastheer
kan leiden tot de vorming van
autonoom replicerende virusdeeltjes
h. De sequentie bevat genetische Klasse 4 L3 L2 L3
informatie voor de vorming van een Klasse 3 L2 L2 L2
defect, voor eukaryote cellen Klasse 2 L1 L1 L2
infectieus virus, van respectievelijk
klasse 4, 3 of 2, en aanwezigheid van
het genetisch materiaal van de donor in
de gastheer kan leiden tot de vorming
van autonoom replicerende virusdeeltjes:
i. De sequentie bevat genetische L1 L1 L2
informatie die codeert voor een
schadelijk genproduct, anders dan in f.
j. De sequentie bevat genetische L1 L1 L2
informatie die codeert voor een
onschadelijk genproduct
VIB brochure bioveiligheid in het laboratorium 55

56
3: Activiteiten met animale cellen in combinatie met virussen of virale vectoren
tweede richting
Activiteiten waarbij ongekarakteriseerd genetisch materiaal is toegevoegd
Activiteiten waarbij gekarakteriseerd genetisch
materiaal is toegevoegd
eerste richting
a. De donor produceert een toxine van T3 L2 Resp. L4, L4, L4 Resp. L3, L3, L3
respectievelijk klasse T2 L2 Resp. L4, L4, L3 Resp. L3, L2, L2
T1 L2 Resp. L4, L4, L3 Resp. L3, L2, L2
b. De donor is, of is afgeleid van, een Klasse 4 L4 Resp. L4, L4, L4 Resp. L4, L4, L4
voor eukaryote cellen infectieus virus van Klasse 3 L3 Resp. L4, L3, L3 Resp. L3, L3, L3
respectievelijk klasse 4, 3 of 2 en Klasse 2 L2 Resp. L4, L3, L2 Resp. L3, L2, L2
aanwezigheid van het genetisch materiaal
van de donor in de gastheer kan leiden
tot de vorming van autonoom
replicerende virusdeeltjes
c. De donor is, of is afgeleid van, een Klasse 4 L3 Resp. L4, L3, L3 Resp. L3, L3, L3
defect voor eukaryote cellen infectieus Klasse 3 L2 Resp. L4, L3, L2 Resp. L3, L2, L2
virus van respectievelijk klasse 4, 3 of 2, Klasse 2 L1 Resp. L4, L3, L2 Resp. L3, L2, L1
en aanwezigheid van het genetisch
materiaal van de donor in de gastheer
kan niet leiden tot de vorming van
autonoom replicerende virusdeeltjes
d. De donor is een niet-viraal pathogeen Klasse 4 L3 Resp. L4, L3, L3 Resp. L3, L3, L3
van respectievelijk Klasse 3 L2 Resp. L4, L3, L2 Resp. L3, L2, L2
Klasse 2 L1 Resp. L4, L3, L2 Resp. L3, L2, L1
e. De donor is een organisme van biolo- L1 Resp. L4, L3, L2 Resp. L3, L2, L1
gische risicoklasse 1, of een plant of een dier
f. De sequentie bevat genetische T3 L2 Resp. L4, L4, L4 Resp. L3, L3, L3
informatie die codeert voor een toxine T2 L2 Resp. L4, L4, L3 Resp. L3, L2, L2
van respectievelijk klasse T1 L2 Resp. L4, L4, L3 Resp. L3, L2, L2
g. De sequentie bevat genetische Klasse 4 L4 Resp. L4, L4, L4 Resp. L4, L4, L4
informatie voor de vorming van een voor Klasse 3 L3 Resp. L4, L3, L3 Resp. L3, L3, L3
eukaryote cellen infectieus virus, van Klasse 2 L2 Resp. L4, L3, L2 Resp. L3, L2, L2
respectievelijk klasse 4, 3 of 2 en
aanwezigheid van het genetisch materiaal
van de donor in de gastheer kan leiden
tot de vorming van autonoom
replicerende virusdeeltjes
h. De sequentie bevat genetische Klasse 4 L3 Resp. L4, L3, L3 Resp. L3, L3, L3
informatie voor de vorming van een Klasse 3 L2 Resp. L4, L3, L2 Resp. L3, L2, L2
defect, voor eukaryote cellen Klasse 2 L1 Resp. L4, L3, L2 Resp. L3, L2, L1
infectieus virus, van respectievelijk klasse
4, 3 of 2, en aanwezigheid van het
genetisch materiaal van de donor in de
gastheer kan leiden tot de vorming van
autonoom replicerende virusdeeltjes
i. De sequentie bevat genetische L2 Resp. L4, L3, L2 Resp. L3, L2, L2
informatie die codeert voor een schadelijk
genproduct, anders dan in f.
j. De sequentie bevat genetische L1 Resp. L4, L3, L2 Resp. L3, L2, L1
informatie die codeert voor een
onschadelijk genproduct
VIB brochure bioveiligheid in het laboratorium
7. De virale vector is een compleet
of defect ecotroop muizenretrovirus
8. De virale vector is een mens- of
dierpathogeen autonoom replicerend
virus van respectievelijk
klasse 4, 3 of 2 of een daarvan
afgeleid defect virus en de
mogelijkheid dat autonoom
replicerende virusdeeltjes
gevormd worden bestaat
9. De virale vector is, of is afgeleid
van, een satellietvirus, of is een
defect virus afgeleid van een
mens- of dierpathogeen van
respectievelijk klasse 4, 3 of 2;
de mogelijkheid dat autonoom
replicerende virusdeeltjes
gevormd worden bestaat niet

4: Vervaardiging in plantencellen
tweede richting
Activiteiten waarbij ongekarakteriseerd genetisch materiaal is toegevoegd
Activiteiten waarbij gekarakteriseerd genetisch
materiaal is toegevoegd
eerste richting
10. De virale vector is, of is afgeleid
van, een plantenvirus en
is biologisch ingeperkt.
11. De virale vector is, of is afgeleid
van, een plantenvirus en is
niet biologisch ingeperkt
a. De donor produceert een toxine van T3 L2 L3
respectievelijk klasse T2 L1 L2
T1 L1 L2
b. De donor is, of is afgeleid van, een Klasse 4 L4 L4
voor eukaryote cellen infectieus virus Klasse 3 L3 L3
van respectievelijk klasse 4, 3 of 2, en Klasse 2 L2 L2
aanwezigheid van het genetisch
materiaal van de donor in de gastheer
kan leiden tot de vorming van
autonoom replicerende virusdeeltjes
c. De donor is, of is afgeleid van, een Klasse 4 L1 L2
defect voor eukaryote cellen infectieus Klasse3 L1 L2
virus van respectievelijk klasse 4, 3 of Klasse 2 L1 L2
2, en aanwezigheid van het genetisch
materiaal van de donor in de gastheer
kan niet leiden tot de vorming van
autonoom replicerende virusdeeltjes
d. De donor is een niet-viraal Klasse 4 L1 L2
pathogeen van respectievelijk Klasse 3 L1 L2
Klasse 2 L1 L2
e. De donor is een organisme van L1 L2
biologische risicoklasse 1, of een plant
of een dier
f. De sequentie bevat genetische T3 L2 L3
informatie die codeert voor een toxine T2 L1 L2
van respectievelijk klasse T1 L1 L2
g. De sequentie bevat genetische Klasse 4 L4 L4
informatie voor de vorming van een Klasse3 L3 L3
voor eukaryote cellen infectieus Klasse 2 L2 L2
virus, van respectievelijk klasse 4, 3 of
2 en aanwezigheid van het genetisch
materiaal van de donor in de gastheer
kan leiden tot de vorming van
autonoom replicerende virusdeeltjes
h. De sequentie bevat genetische Klasse 4 L1 L2
informatie voor de vorming van een Klasse 3 L1 L2
defect, voor eukaryote cellen Klasse 2 L1 L2
infectieus virus, van respectievelijk
klasse 4, 3 of 2, en aanwezigheid van
het genetisch materiaal van de donor in
de gastheer kan leiden tot de vorming
van autonoom replicerende virusdeeltjes:
i. De sequentie bevat genetische L1 L2
informatie die codeert voor een
schadelijk genproduct, anders dan in f.
j. De sequentie bevat genetische informatie L1 L2
die codeert voor een onschadelijk genproduct
VIB brochure bioveiligheid in het laboratorium 57

58
HST B. RICHTLIJNEN VOOR INSCHALING VAN ACTIVITEITEN IN SERRES MET
PLANTEN DIE TRANSGEEN ZIJN OF GENETISCH GEMODIFICEERDE
MICRO-ORGANISMEN DRAGEN
Hieronder zijn de inschalingsrichtlijnen weergegeven uit bijlage 5.51.4.C van Vlarem II
Niveau G1:
• De steriele of gesteriliseerde planten.
• De strikt autogame planten (zelfbevruchters).
• De planten die niet in staat zijn om in het ecosysteem te overleven (zoals banaan).
• De planten die in het ecosysteem geen interfertiele soorten hebben (zoals banaan).
• De planten die door een virus van biologische risicoklasse 2, door een genetisch gemodificeerd
virus van risicoklasse 1 of 2 of door een virale vector van risicoklasse 1 of 2 zijn geïnfecteerd, of
die een viraal genoom van risicoklasse 1 of 2 vertonen.
• De planten die drager zijn van een zichzelf niet verspreidend fytopathogeen van biologische risicoklasse
1 of 2.
Niveau G2:
• De allogame (kruisbevruchters) of autogame (zelfbevruchters), anemofiele (windbestuivers) of
entomofiele (insectenbestuivers) planten.
• De planten waarvan de volledige ontwikkelingscyclus enkel kan plaatsvinden in het ecosysteem en
waarvan de zaden een lange overlevingsduur hebben (naargelang het geval en de verworven ervaring).
• De planten die door een virus van biologische risicoklasse 3, door een virale vector van risicoklasse
3 zijn geïnfecteerd of die een viraal genoom van risicoklasse 3 vertonen.
• De planten die drager zijn van een zichzelf verspreidend fytopathogeen of van een GGO van (biologische)
risicoklasse 2 of van een fytopathogeen of van een GGO van (biologische) risicoklasse 3.
Niveau G3:
• De planten die gelijkaardige eigenschappen hebben als diegene die beschreven zijn in niveau 2 en
die, hetzij een gevaarlijk vreemd gen (dat bijvoorbeeld voor een toxine codeert), hetzij een virus
van biologische risicoklasse 4, hetzij een viraal genoom van biologische risicoklasse 4 hebben
gekregen.
• De planten die onderworpen zijn aan eerste proeven van overdracht van genen, die afkomstig zijn
van een voor de mens of het milieu gevaarlijk pathogeen organisme en waarvan de risico’s niet
gekend zijn.
• De planten die drager zijn van een fytopathogeen of van een GGO van (biologische) risicoklasse 4.
Niveau G4:
• De planten die een virus van biologische risicoklasse 4 hebben gekregen, dat een bijzonder hoog
gevaar vertegenwoordigt voor het milieu (of waarvoor een nultolerantie vereist is) of een gen
bevatten dat verantwoordelijk is voor de synthese van voor de mens of het dier bijzonder gevaarlijke
stoffen.
• De planten die drager zijn van een fytopathogeen of een GGO van (biologische) risicoklasse 4, dat
een bijzonder groot gevaar vertegenwoordigt voor het milieu (of waarvoor een nultolerantie vereist
is).
• De planten die vreemde genen bevatten, afkomstig van een voor de mens, het dier of het milieu
bijzonder gevaarlijk pathogeen organisme en waarvan de risico’s niet gekend zijn.
VIB brochure bioveiligheid in het laboratorium

HST C. RICHTLIJNEN VOOR INSCHALING VAN ACTIVITEITEN IN
DIERVERBLIJVEN MET DIEREN DIE TRANSGEEN ZIJN OF GENETISCH
GEMODIFICEERDE MICRO-ORGANISMEN OF CELLEN DRAGEN
Niveau A1:
• de zichzelf niet verspreidende dieren (varkens, schapen, runderen) die een vreemd DNA-fragment
in hun genoom hebben opgenomen zonder de hulp van een virale vector;
• de zichzelf niet verspreidende dieren die drager zijn van GGO’s van risicoklasse 1.
Niveau A2:
• de zichzelf verspreidende dieren (kleine knaagdieren, konijnen, insecten, vissen) die een vreemd
DNA-fragment in hun genoom hebben opgenomen, zonder de hulp van een virale vector;
• de zichzelf verspreidende dieren die drager zijn van GGO’s van risicoklasse 1 of 2.
Opmerkingen
De inschaling van activiteiten met dieren die genetisch gemodificeerde micro-organismen (GGM’s) of
cellen dragen is gecompliceerder dan de inschaling van genetisch gemodificeerde micro-organismen
op zich. Dit komt omdat bij activiteiten in dierverblijven niet alleen de risicoklasse van het GGM van
belang is, ook de specifieke combinatie proefdier/micro-organisme, de wijze van toediening en de
mogelijke verspreiding van het micro-organisme spelen een zeer belangrijke rol. Bij werkzaamheden
met GGM’s in een laboratorium wordt het micro-organisme altijd gehanteerd in een gesloten houder,
en wanneer deze houder geopend wordt en de kans daarbij bestaat dat micro-organismen zich
verspreiden (bijv. via aërosolen), gebeurt dit veelal in een veiligheidskabinet (klasse 2 en hoger). Het
proefdier kan niet gezien worden als een gesloten houder. Dit betekent dat voor elke combinatie
proefdier/micro-organisme zorgvuldig bepaald moet worden of eventueel bijzondere maatregelen
nodig zijn om verspreiding van het micro-organisme tegen te gaan. Deze bijzondere maatregelen
zijn in de beschrijving van de inperkingsniveaus A1 t/m A4 in bijlage 1 aangeduid onder het kopje:
“afhankelijk van de werkzaamheden kan hier nog aan worden toegevoegd”.
Een voorbeeld: een genetisch gemodificeerd adenovirus van risicoklasse 2 moet in een laboratorium
onder standaard L2-condities worden gehanteerd. Wanneer dit virus in de longen van een
muis wordt toegediend in de vorm van een aërosol, zijn standaard A2 condities niet voldoende
om verspreiding van het virus tegen te gaan. Er zal een veiligheidskabinet aanwezig moeten zijn
voor de toediening van het virus, de muizen moeten gehuisvest worden in speciale filtertopkooien,
en al het afval (faeces, urine, bedding, etc.) moet geïnactiveerd worden. Wanneer het niet
om een muis zou gaan, maar om een varken, zijn weer andere maatregelen nodig omdat een
varken niet in een filtertopkooi gehuisvest kan worden. Het verblijf in zijn geheel moet dan de
benodigde inperking geven. Dit betekent dat er een sas zal moeten zijn, onderdruk, de ruimte
zal moeten geschikt zijn om te kunnen worden gefumigeerd, medewerkers zullen speciale
beschermende kleding moeten dragen die na de werkzaamheden in de sas achterblijft en er zullen
speciale voorzieningen moeten getroffen worden voor de inactivatie van faeces en urine
(gesloten opvangsysteem gekoppeld aan een installatie voor inactivatie).
VIB brochure bioveiligheid in het laboratorium 59

60
BIJLAGE 3 : DE BIOLOGISCHE RISICOKLASSE
VAN ENKELE RELEVANTE
PATHOGENEN
In deze bijlage zijn de biologische risicoklassen weergegeven van enkele relevante pathogenen. Deze
lijst is een verkorte versie van de bijlage 5.51.8 van Vlarem II. Enkel de meest relevant geachte
pathogenen zijn in deze lijst weergegeven. Wordt er gewerkt met een ander pathogeen dat niet op
deze lijst voorkomt, dan kunnen de lijsten van Vlarem geraadpleegd worden. Komt het pathogeen
ook daar niet op voor, dan dient u contact op te nemen met de interne of externe deskundigen (zie
bijlage 4), of met de Sectie Bioveiligheid en Biotechnologie van het WIV (http://biosafety.ihe.be).
M = biologische risicoklasse voor mensen
D = biologische risicoklasse voor dieren
P = biologische risicoklasse voor planten
OP = opportunistisch pathogeen
(*) = vertonen een beperkt infectierisico, omdat ze niet overdraagbaar zijn via de lucht
+ = virus waarvan het biologisch risico afhangt van het gastheer-dier
Mens en dierpathogenen: bacteriën en aanverwanten
M D
3 3 Bacillus anthracis
OP OP Bacillus cereus
2 Bacillus lentimorbus
2 Bacillus popiliae
2 Bacillus sphaericus
2 Bacillus thuringiensis
2 Bordetella avium
2 3 Bordetella bronchiseptica
2 Bordetella parapertussis
2 Bordetella pertussis
2 2 Campylobacter coli
2 2 Campylobacter fetus subsp. fetus
3 Campylobacter fetus subsp. venerealis
2 2 Campylobacter jejuni
2 2 Campylobacter spp.
2 Chlamydia pneumoniae
2 2 Clostridium botulinum
2 2 Clostridium tetani
2 Enterobacter spp.
2 Enterococcus faecalis
2 2 Escherichia coli (uitgezonderd niet
pathogene stammen)
2 Helicobacter hepaticus
2 Helicobacter pylori
2 Klebsiella mobilis
(Enterobacter aerogenes)
2 Klebsiella oxytoca
2 2 Klebsiella pneumoniae
2 2 Klebsiella spp.
2 2 Listeria ivanovii
2 2 Listeria monocytogenes
2 3 Mycobacterium avium subsp.
paratuberculosis
3 3 Mycobacterium bovis
(behalve de stam BCG)
VIB brochure bioveiligheid in het laboratorium
M D
3 Mycobacterium leprae
3 3 Mycobacterium tuberculosis
2 Neisseira gonorrhoeae
2 Neisseira meningitidis
2 2 Neisseira spp.
2 Pseudomonas aeruginosa
2 3 Salmonella Abortusequi
2 3 Salmonella Abortusovis
2 2 Salmonella choleraesuis (enterica)
subsp. arizonae
2 3 Salmonella Dublin
2 2 Salmonella Enteritidis
2 3 Salmonella Gallinarum
2 Salmonella Paratyphi A,B,C
2 3 Salmonella Pullorum
3 (*) Salmonella Typhi
2 2 Salmonella Typhimurium
2 Shigella boydii
3 (*) Shigella dysenteriae (Type I)
2 Shigella flexneri
2 Shigella sonnei
2 2 Staphylococcus aureus
2 Staphylococcus epidermidis
2 2 Streptobacillus moniliformis
2 2 Streptococcus agalactiae
2 Streptococcus dysgalactiae
3 Streptococcus equi
2 Streptococcus pneumoniae
2 Streptococcus pyogenes
2 2 Streptococcus spp.
2 2 Streptococcus suis
2 Streptococcus uberis
2 Vibrio cholerae (El Tor inbegrepen)
3 3 Yersinia pestis

Mens en dierpathogene virussen
M D
2
Adenoviridae
Animal adenoviruses
2 Human adenoviruses
4 African swine fever virus
Arenaviridae
3 Flexal virus
4 + Junin virus
4 + Lassa virus
4 + Machupo virus
3 Equine arteritis
3 Simian haemorrhagic fever virus
Astroviridae
2 2 Astroviruses
Baculoviridae
2 Invertebrate baculoviruses
Birnaviridae
2 Drosophila X virus
3 Infectious pancreatic necrosis virus
Bunyaviridae
3 2 California encephalitis virus
3 Hantaan virus (Korean haemorrhagic
fever)
Filoviridae
4 4 Ebola virus
4 4 Marburg virus
Flaviviridae
3 Dengue virus 1-4
3 + Japanese encephalitis virus
3 + Yellow fever virus
3 Hepatitis C virus
3 Border disease virus
3 Bovine diarrhoea virus
4 Hog cholera virus
Herpesviridae
3 Avian herpesvirus 1 (ILT)
3 Marek’s disease
3 Bovine herpesvirus 1
2 Bovine herpesvirus 2
2 Bovine herpesvirus 3
2 Bovine herpesvirus 4
2 Chimpanzee herpesvirus
(pongine herpesvirus 1)
2 Cytomegalovirus
(Human herpesvirus 5)
2 Cytomegaloviruses of mouse,
guinea pig and rat
2 Epstein-Bar virus
(EBV, Human herpesvirus 4)
3 2 Herpes virus B
Orthomyxoviridae
2 3 Avian influenza virus A-Fowl plague
2 2 Equine influenza virus 1 (H7N7)
and 2 (H3N8)
2 3 Influenza viruses (Types A, B & C)
Papovaviridae
2 Animal papillomaviruses
2 Human papillomaviruses (HPV)
2 Bovine polyomavirus (BPoV)
2 Monkey (SV40, SA-12, STMV, LPV)
Paramyxoviridae
2 Measles virus
2 Mumps virus
M D
2 2 Parainfluenza viruses types 1-4
Parvoviridae
2 Adeno-associated viruses AAV
2 Canine parvovirus (CPV)
2 Human parvovirus (B 19)
Picornaviridae
2 Coxsackieviruses
2 Polioviruses
2 3 Swine vesicular disease virus
2 Bovine rhinoviruses (types 1-3)
2 Human rhinoviruses
Poxviridae
2 Entomopoxviruses
3 Fowlpox virus
2 Other avipoxviruses
3 Camelpox virus
2 2 Cowpox virus
2 3 Horsepox virus
3 3 Monkeypox virus
2 3 Rabbitpox virus-variant of vaccinia
2 2 Vaccinia virus
4 Variola (major & minor)virus
4 + White pox (Variola virus)
2 Swinepox virus
Reoviridae
2 2 (ortho)reoviruses
2 2 Human rotaviruses
2 Mouse rotaviruses (EDIM,
epizootic diarrhoea of infant mice)
2 2 Rat rotavirus
Retroviridae
3 Avian leucosis viruses (ALV)
3 Avian sarcoma viruses (Rous
sarcoma virus, RSV)
2 Bovine foamy virus
3 Bovine immunodeficiency virus (BIV)
2 Equine infectious anemia virus
3 Feline immunodeficiency virus (FIV)
3 Feline sarcoma virus (FeSV)
3 Human immunodeficiency viruses
(HIV) types 1 & 2
3 Human T-cell lymphotropic viruses
(HTLV) types 1 & 2
3 Leukomogenic murine oncovirus
(Murine lymphosarcoma virus: MuLV)
3 Lymphosarcoma viruses of
nonhuman primates
3 Monkey mammary tumor viruses
(MPTV)
3 Murine mammary tumor viruses
(MMTV)
3 Murine sarcoma viruses (MuSV)
3 Porcine sarcoma virus
3 Rat lymphosarcoma virus
(Rat LSA)
2 Reticuloendotheliosis viruses
(REV)
2 Simian foamy virus
3 Simian immunodeficiency viruses
(SIV)
3 Simian sarcoma viruses (SSV)
VIB brochure bioveiligheid in het laboratorium 61

62
M D
3 3
Rhabdoviridae
Rabies virus
2 3 Vesicular stomatitis virus (VSV)
Togaviridae
2 + Semliki Forest virus
2 2 Sindbis virus
2 Rubella virus
Ongeklasseerd
3 Blood-borne hepatitis viruses nog
niet geïdentificeerd
3 Borna diseases virus
Mens en dierpathogene schimmels
M D
2 2 Aspergillus flavus
2 2 Aspergillus fumigatus
OP OP Aspergillus nidulans
2 Aspergillus parasiticus
OP OP Aspergillus terreus
OP OP Aspergillus versicolor
2 2 Candida albicans
Mens en dierpathogene parasieten
M D
3 Eimeria acervulina
3 Eimeria burnetti
3 Eimeria maxima
3 Eimeria necratix
3 Eimeria spp.
3 3 Leishmania brasiliensis
3 3 Leishmania donovani
2 Leishmania ethiopica
3 Leishmania major
2 3 Leishmania mexicana
2 Leishmania peruviana
2 Leishmania spp.
3 3 Leishmania tropica
3 Plasmodium falciparum
2 Plasmodium spp. (bij mensen en apen)
2 Pneumocystis carinii
3 Theileria annulata
VIB brochure bioveiligheid in het laboratorium
M D
Niet conventionele agentia verbonden
met
3 Bovine spongiform
encephalopathy (BSE)
3 Chronic wasting disease of deer
3 Creutzfeldt–Jakob disease
3 Gerstmann-Sträussler-Scheinker
syndrome
3 Kuru
3 Mink encephalopathy
3 Scrapie
M D
2 2 Cryptococcus neoformans
2 Fusarium coccophilum
3 2 Penicillium marneffei
OP OP Pneumocystis carinii
OP 2 Rhizomucor pusillus
2 Rhizopus cohnii
2 Rhizopus microspous
M D
3 Theileria hirei
2 Theileria mutans
2 Theileria ovis
3 Theileria parva
2 Theileria taurotragi
2 3 Toxoplasma gondii
3 Trichomonas foetus
2 Trichomonas vaginalis
3 Trypanosoma brucei brucei
3 Trypanosoma brucei gambiense
3 3 Trypanosoma brucei rhodesiense
3 Trypanosoma congolense
3 Trypanosoma cruzi
3 Trypanosoma equiperdum
3 Trypanosoma evansi
2 Trypanosoma vivax
Fytopathogenen
N.B.: Op de volgende pagina is de pathogeniteit van enkele fytopathogenen aangeduid.
Sommige fytopathogenen zijn bovendien onderworpen aan bepalingen van de federale
besluiten voor de bestrijding van voor planten of plantaardige producten schadelijke organismen
(quarantaineregels).

Fytopathogene virussen
P
2 Alfalfa mosaic virus
2 Apple chlorotic leaf spot virus
2 Apple mosaic virus
2 Apple stem grooving virus
2 Barley yellow mosaic virus
2 Beet western yellows virus
2 Carnation ringspot virus
2 Cucumber mosaic virus
3 Hop american latent virus
2 Hop mosaic virus
3 Lettuce mosaic virus
2 Maize dwarf mosaic virus
2 Melon necrotic spot virus
2 Papaya ringspot virus
2 Pea early-browning virus
2 Potato leafroll virus
2 Potato virus A
Fytopathogene bacteriën en aanverwanten
P
2 Agrobacterium rhizogenes
2 Agrobacterium rubi
2 Agrobacterium tumefaciens
2 Erwinia carotovora subsp. betavasculorum
2 Erwinia chrysanthemi pv. chrysanthemi
3 Erwinia salicis
3 Erwinia tracheiphila
2 Pseudomonas cichorii
Fytopathogene schimmels
P
2 Alternaria dauci
3 Alternaria solani
2 Botrytis allii
2 Botrytis elliptica
3 Botrytis fabae
2 Botrytis hyacynthi
2 Botrytis tulipae
2 Cladosporium phlei
2 Cladosporium variabile
3 Claviceps gigantea
2 Claviceps purpurea
2 Fusarium arthrosporioides
3 Fusarium coeruleum
2 Fusarium culmorum
2 Fusarium graminum
2 Fusarium oxysporum f. sp. betae
3 Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici
2 Fusarium oxysporum f. sp. pisi
3 Fusarium oxysporum f. sp. trifolii
3 Fusarium solani f. sp. cucurbitae
3 Fusarium solani f. sp. phaseoli
3 Fusarium solani f. sp. pisi
2 Glomerella cingulata
(anamorph Colletotrichum gloeosporioides)
2 Glomerella graminicola
(anamorph Colletotrichum graminicola)
Fytopathogene parasieten
P
3 Heterodera glycines
P
2 Potato virus M
2 Potato virus S
2 Potato virus X
2 Potato virus Y
2 Tobacco mosaic virus
2 Tobacco necrosis virus
2 Tobacco rattle virus
3 Tobacco streak virus
2 Tobacco stunt virus
3 Tomato bushy stunt virus
2 Tomato mosaic virus
3 Tomato yellow leaf curf virus
2 Tulip breaking virus
2 Turnip crinkle virus
2 Turnip mosaic virus
3 Wheat dwarf virus
3 Wheat spindle steak mosaic virus
P
2 Pseudomonas fluorescens
3 Pseudomonas syringae pv. phaseolicola
3 Pseudomonas syringae pv. pisi
2 Pseudomonas syringae subsp. syringae
2 Rhodococcus fascians
3 Xanthomonas campestris pv. aberrans
2 Xanthomonas campestris pv. alfalfae
3 Xanthomonas populi
P
2 Glomerella tucamanensis
(anamorph Colletotrichum falcatum)
3 Mucor circinelloides
3 Mucor piriformis
3 Mucor racemosus
3 Mucor strictus
2 Penicillium corymbiferum
2 Penicillium cyclopium
2 Penicillium digitatum
2 Penicillium expansum
2 Penicillium italicum
2 Phytophthora infestans
2 Phytophthora megasperma
2 Rhizoctonia carotae
2 Rhizoctonia fragariae
2 Rhizoctonia tuliparum
2 Rhizopus arrhizus
2 Rhizopus stolonifer
2 Sclerophthora macrospora
2 Sclerospora graminicola
2 Sclerotinia minor
2 Sclerotinia trifoliorum
3 Septoria apiicola
2 Septoria azaleae
3 Septoria chrysanthemella
2 Septoria lactucae
3 Septoria lycopersici var. lycopersici
VIB brochure bioveiligheid in het laboratorium 63

64
BIJLAGE 4: LEESCOMMISSIE
Hierbij betuigen wij onze dank aan onderstaande personen die bij de totstandkoming van dit boekje
nuttige commentaren hebben geleverd.
Ann Van Gysel, communicatiemanager VIB
Bernadette Van Vaerenbergh, WIV, Sectie Bioveiligheid en Biotechnologie
Greet Van Eetvelde, milieucoördinator, Universiteit Gent
Huub Schellekens, Klankbordcommissie VIB, Universiteit Utrecht
Kim De Rijck, bioveiligheidsadviseur, Milieudienst KULeuven
Mieke Van Lijsebettens, VIB departement Plantengenetica, Universiteit Gent
Hilde Revets, VIB departement Immunologie, Parasitologie en Ultrastructuur, VUB
Peter Brouckaert, VIB departement Moleculaire Biologie, Universiteit Gent
Thierry Vandendriessche, VIB departement Transgene Technologie en Gentherapie, KULeuven
Wim Van de Ven, VIB departement Menselijke Erfelijkheid, KULeuven
Hubert Backhovens, VIB departement Moleculaire Genetica, UIA
BIJLAGE 5: INFORMATIEBLAD
Namen en coördinaten van verantwoordelijken
Deze lijst dient als overzicht van de voor uw afdeling geldende contactpersonen inzake (bio)veiligheid.
Contactpersonen verschillen vaak per afdeling. Vul de onderstaande gegevens zelf in en zorg dat u ze
in het labo bij de hand heeft.
Naam Telefoon Overige
Noodnummer
Laboratoriumverantwoordelijke
EHBO-verantwoordelijke
Locatie EHBO verzorgingskast
Lokale coördinator bioveiligheid
Contactpersoon Preventiedienst
Arbeidsgeneesheer
Contactpersoon afval
Regulatory Affairs Manager VIB René Custers 09 244 66 11 rene.custers@vib.be
Als u algemene vragen heeft over inschalingen of te nemen maatregelen, raadpleeg dan eerst uw hiërarchische
overste, en indien dit geen uitsluitsel geeft achtereenvolgens uw groepsleider, interne bioveiligheidsexpert
of externe bioveiligheidsexpert.
VIB brochure bioveiligheid in het laboratorium