Vēža cilmes šūnas - P. Stradiņa Klīniskā universitātes slimnīca

“Vēža cilmes šūnas”terminoloģija, hipotēzes,pierādījumi...Dr. Aija LinēVPP 5.projekta pārskata seminārs

Vēzis – sarežģīts orgāns, kas sastāv no daudziemšūnu tipiem, nevis homogēna šūnu masaHanahan D & Weinberg RA, Cell 144, 2011

Vēža cilmes šūnu funkcionālā definīcija – audzēja šūnupopulācija, kas efektīvi iniciē audzēja veidošanos eksperimentadzīvniekos

Vēža cilmes šūnas(Cancer stem cells, CSCs)Audzēju iniciējošās šūnas(Tumour initiating cells, TIC)Cilmes šūnām līdzīgās šūnasStem cell-like cells (SCLC)Vēža šūnu populācija, kam piemīt cilmes šūnuīpašības (pašatjaunošanās un spēja radīt daļējidiferencētas meitšūnas), spēj iniciēt audzējaveidošanos eksperimenta dzīvniekos un ir rezistentaspret staru un ķīmijterapiju

Vēža cilmes šūnu īpašības Ir specifiski šūnas virsmas marķieri, piemēramCD133, CD44, ABCB5 Ekspresē cilmes šūnām raksturīgus transkripcijasfaktorus un gēnu ekspresijas regulatorus – Oct4,Lin28, Nanog, Sox2 Rezistentas pret staru un ķīmijterapiju CSC biežums dažādos audzējos var būt dažāds –0.1-30% no visas šūnu masas Neliels skaits (~100-500) CSCs spēj veidotaudzēju imunodeficītās pelēs injicējot audzējušūnas, kamēr ir vajadzīgas ~10 6 nešķirotasšūnas, lai iniciētu audzēja veidošanos

Vēža cilmes šūnu izolēšanas metodesCilmes šūnu īpašība, ko izmantoizolēšanaiŠūnas virsmas marķieri (CD133,CD44)Augsta zāļu transporta proteīnuaktivitāteAugsta aldehīd-dehirogenāzesaktivitāteMetodeFACS, magnētiskāslodītesHoechst sidepopulation: FACSAldefluor tests:FACSSpēja veidot sfēras bez-seruma vidē Sfēru kultūraRezistence pret ķīmijterapijuRezistentopopulācijuselekcija

Sfēru kultūraBez-seruma vidē cilmes šūnas veido multicelulāras sfērasun saglabā nediferenciētu stāvokliKatra sfēra ir veidojusies no vienas šūnas (klons)Rezistentas pret zālēmEkspresē cilmes šūnu marķierus (CD44, CD133) unembrionālo cilmes šūnu transkripcijas faktorus (OCT4,NANOG, SOX2)Fizioloģiski dabiskāks in vitro modelis kā 2D kultūrasVeido audzējus in vivo

Vienīgais īstais pierādījums tam, ka izolētajām šūnām irCSC īpašības, ir to spēja veidot histoloģiski identiskuaudzēju imunodeficītās pelēsAlison MR et al, J Pathol, 2011

No kā rodas vēža cilmes šūnas?

Vēža (cilmes) šūnu plasticitāte Hipoksijas atbilde Epiteliāli-mezenhimāla tranzīcija Audzēja mikrovides ietekme Ķīmijterapijas ietekme?

Hipoksijas atbildeVeselos audos: ~7% O 2Audzējos: ~2-5% O 2

HIF1 un HIF2 mērķgēniHIF1HIF2VEGFCA IXCA XIIpHregulationGLUTGlycolysisTGFTwistEMTInvasionNotch1/3signallingSurvivalhTERTOct4CD133SelfrenewalMDR1/ABCG2AngiogenesiscMycProliferationDrugresistanceMetastasis

Epiteliāli-mezenhimāla tranzīcija (EMT)Programma, kuras rezultātā epiteliālās šūnas zaudē todiferenciācijas pazīmes un iegūst mezenhimālo šūnu īpašības,ieskaitot kustīgumu un rezistenci pret apoptozi; nepieciešamaembrija attīstībai un brūču dzīšanai

• Imortlizētās krūts dziedzera epiteliālajās šūnas var inducētEMT, tajās ekspresējot transkripcijas faktorus Twist unSnail;• Šūnas, kas iegūst mezenhimālo šūnu īpašības, vienlaikusiegūst arī sekojošas īpašības: Spēj diferencēties par luminālajām un mioepiteliālajāmšūnām; Veido sfēras; Veido kolonijas pusmīkstajā agarā; Veido audzēju bez-tīmusa (nu-/nu-) pelēs.

No CD44 lo CD24 + ESAdziedzerepitēlijašūnu kloniemspontāni veidojas CD44 hi šūnas; Gan pre-eksistējošām, gan de novoiegūtajām CD44 hi šūnām piemītcilmes šūnu īpašības – spēja veidotmammosfēras un veidot vadiemlīdzīgas struktūras; Šāda pat īpašība piemīt arītransformētām epitēlija šūnām

Wnt signālceļa aktivitāte ir nepieciešamazarnu normālo cilmes šūnu uzturēšanā;CSCs ar augstu Wnt aktivitāti lokalizētasblakus mioepiteliālajām šūnām;Mioepiteliālās šūnas producē hepatocītuaugšanas faktoru (HRF), kas aktivē Wntsignālceļu;HGF atjauno CSC fenotipu daļējidiferencētās vēža šūnās

Vēža cilmes šūnas kā terapeitiskais mērķisEramo A et al, Oncogene, 2010

Molekulārie mērķi vēža cilmes šūnāsCD33+CLL-1PI3K/Akt/mTORHedgehogNotchEpiģenētiskāsizmaiņasHipoksijaMikrovide, EMT???Šūnas virsmas marķieriAML, Gemtuzumab ozogamacin, FDA approvedAML, pre-clinicalSignālceļiTemsirolimus, everolimus, FDA approvedGDC-0449, phase I (Genentech)PF04449913, phase I (Pfizer)Phase II, Cancer Research UKJauni potenciāli mērķiHDACi iduce HIF1 degradationBioreductive prodrugs that are activated inhypoxic tissue or moleculat targets involved inthe survival of hypoxic cells

Take-home messages: Lai gan apšaubīta pašos pamatos, vēža cilmes šūnu hipotēzeir izturējusi laika pārbaudi vismaz 15 gadu garumā; Iespējams, vēža cilmes šūnas nav statiskas un fenotipiskinemainīgas, bet gan var veidoties no daļēji diferencētām šūnāmun iegūt cilmes šūnu īpašības dažādu procesu rezultātā –hiposkijas, EMT, mikrovidē esošu signālu un dažādu stresafaktoru (staru vai ķīmijterapija, imūnreakcija) ietekmē; Nepietiek ar zāļu mērķēšanu uz esošajām cilmes šūnām, jatās var veidoties arī no citām vēža šūnām – ir vajadzīga zāļukombinācija; Signālceļi, kas nodrošina vēža cilmes šūnu pašatjaunošanosun izdzīvošanu, ir perspektīvi zāļu mērķi un tiek intensīvi pētīti; Procesi, kas inducē vēža cilmes šūnu veidošanos varētu būtjauni zāļu mērķi.

Valsts pētījumu programma:„Jaunu profilakses, ārstniecības, diagnostikas līdzekļu unmetožu, biomedicīnas tehnoloģiju izstrāde sabiedrībasveselības uzlabošanai”Vadītājs: Prof. Valdis Pīrāgs5. projekta mērķis:izstrādāt jaunu pieeju individualizētupretvēža ārstniecības līdzekļu radīšanai, kasbalstīta uz vēža cilmes šūnām kā terapeitiskomērķi

Projekta uzdevumi:Organiskās sintēzes institūts Cinka atkarīgo enzīmu inhibitoru dizains un sintēze; Sintezēto savienojumu citotoksiskās aktivitātes(IC 50 ) un toksicitātes (LD 50 ) testēšana šūnu līnijās;

Projekta uzdevumi:Rīgas Austrumu Klīniskā UniversitātesslimnīcaPaula Stradiņa Klīniskā Universitātesslimnīca Biobankas veidošana un klīniskās un patoloģiskāsinformācijas apkopošana; Iegūto gēnu ekspresijas datu korelācija ar pacientuklīniskajiem un patoloģijas datiem

Projekta uzdevumi: Metodikas izstrāde vēža cilmes šūnu un normālucilmes šūnu izolēšanai no audu paraugiem; Iegūto cilmes šūnu populāciju fenotipa raksturošana; Terapeitiski nozīmīgāko cinka enzīmu ekspresijasanalīze un funkcionālie pētījumi vēža un normālocilmes šūnu populācijās; Audzēju šūnu pašatjaunošanās un rezistencesattīstības molekulāro mehānismu padziļināta izpēte invitro modeļos;

Projekta uzdevumi: Līdersavienojumu testēšana dažādās vēža cilmes šūnupopulācijās, vērtējot to ietekmi uz šūnas ciklu,diferenciāciju, koloniju veidošanas spēju uninvazivitāti.

Krūts vēža cilmes šūnas

Krūts vēža klīniskā materiāla biobankasveidošana (RAKUS, Onkoloģijas centrs)Klīniskipatoloģiskāsinfo datubāzeDMEM, AbTNRNALatterFicollEDTATNDzīvas šūnassfēru un adherentajāmkultūrāmRNS, DNS unproteīnukolekcijaAsins šūnasfunkcionāliemimunoloģijaspētījumiemDNSģenētiskajaiizpētei

Audu dezintegrēšana, šūnu suspensijas iegūšana unkultivēšanaAudzējsVeselie audiBez seruma vide DMEM+10% FBS Bez seruma vide DMEM+10% FBS

Adherenta kultūraSfēru kultūraP2stockPrimārā sfēru kultūradezintegrēP3stockSekundārā sfērukultūraP3-P5 izmantoeksperimentiem2. un 3. sfēru kultūruizmantoeksperimentiem

SfērasAdherentaIegūtās krūts vēža un normālo auduprimārās kultūrasParauga Nr 28 29LN29R30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46+ + T + + + + + + + +LN +N+ + +T + + + + + + +LN +

Imunocitoķīmiska primāro kultūruraksturošanaCitokeratīnsE-kadherīnsVimentīnsESACD44CD24Oct3/4NanogCD44vimentinCytokeratinOct3/4

qPCR-array gēnu ekspresijas profilēšanaiCinka enzīmiWnt/β-katenīna signālceļšNotch signālceļšHedgehog signālceļšEpiteliāli mezenhimālātranzīcijaHipoksijas atbildes signālceļšTelomerāzeKrūts vēža cilmes šūnumarķieriKrūts vēža subtipu marķieriPluripotences marķieriCA9, CA12HDAC2, HDAC3, HDAC4, HDAC6, HDAC8,SIRT1, SIRT7MMP1, MMP2, MMP7, MMP9, MMP10,LEF1, MYC, WISP1, JUN , CCND1, (MMP7,CD44, TWIST1, VEGFA, TERT)HES1, (CD44, ERBB2, CCND1)GLI1, MYCN, SHHSNAI1, TWIST1, CDH1, VIM, (MMP2, MMP9,SIRT1)LDHA, SLC2A1, VEGFA, (CA9, CA12, JUN,MMP2)TERTCD44, CD24, FLOT2ESR1, ESR2, KRT5, PGR, ERBB2NANOG, SOX2, LIN28

CA9, SIRT7, MMP1 un MMP10 ekspresija ir ievērojamipaaugstināta, bet HDAC4 un SIRT1 - pazemināta krūtsvēža audos, salīdzinot ar normāliem audiemCA9T-test: p=0.041M-W: p=0.2SIRT7T-test: p=0.0021M-W: p=0.099MMP1T-test: p=0.0055M-W: p=0.0029MMP10T-test: p=0.0035M-W: p=0.15HDAC4T-test: p=0.0058M-W: p=0.005SIRT1T-test: p=0.17M-W: p=0.033

Gēnu ekspresijas izmaiņas audzējos, salīdzinotar normāliem audiemSIRT7Lin28SLC2A1/Glut1VEGFACA12HDAC3HDAC8TWIST1HES1C-JUNMYCSIRT1HDAC4MMP1MMP10CA9MYCNWISP1

CAIX – nodrošina intracelulārā pH regulācijuBiology of HIF-1A Weidemann and R S Johnson

CAIX, MMP1 un MMP10 CA IX stabilizē intracelulāro pH – padara bāziskākuintracelulāro vidi, bet paskābina ekstracelulāro vidi CA IX koordinē pHi regulāciju multicelulārās sfērās pHi regulācija ir svarīgs šūnu izdzīvošanas mehānisms CA IX un angioģenēzes inhibitoru kombinācija varētu būtperspektīva terapijas stratēģija MMP1 un MMP10 – pastiprināti ekspresētas endoteliālajāsšūnās pēc VEGF stimulācijas un ir nepieciešamas angioģenēzei Daļā krūts vēžu CA IX, MMP1 un MMP10 tiek koordinētiekspresēti – to inhibīcijai varētu būt terapeitisks efekts Vides skābums izraisa T šūnu anerģiju – tās nespēj sekretētperforīnu CA IX inhibitoru kombinēšana ar imunoterapiju?!?

Kuņģa vēža cilmes šūnasEpCAM+/CD44+

Vai kuņģa vēža cilmes šūnas ir radušās nokaulu smadzeņu šūnām???

Vai tomēr dziedzerepitēlija cilmes šūnām???(GPR49)

Kuņģa vēža un normālo audu primāro kultūruiegūšanaAudzējsVeselie audiBez seruma vide DMEM+10% FBS DMEM+10% FBS?

Izvirzītie jautājumi Vai iespējams iegūt sfēru kultūru tieši no primārās audzējašūnu suspensijas? Kāds ir sfēru veidojošo šūnu fenotips (t.i. epiteliālo vsmezenhimālo cilmes šūnu marķieri)? Vai no viena audu parauga iegūtās sfēras ir fenotipiskihomogēnas vai heterogēnas? Cinka enzīmu ekspresijas profils audos un iegūtajās cilmesšūnu populācijās un tā korelācija ar cilmes šūnu bioloģijāsvarīgu signālceļu aktivāciju. Ekspresijas datu korelācija ar klīniskajām un patoloģiskajāmpazīmēm.

Plaušu vēža cilmes šūnas

Plaušu audzēju biobankas veidošanaOperējamipacienti(~30%)NSCLCpacientiNeoperējamipacienti (~70%)Staru un/vaiķīmijterapijaBiopsija(diagnostiskābronhoskopija)T N LNT N LNRNALatterRNALatter

Plaušu audu primāro kultūru iegūšana uncisplatīna rezistento šūnu selekcijaT (LN)NSfērasNAdherentakultūra-cisplatin 3µM 7µM-cisplatin 3µM 7µM

Dr. Karīna SiliņaDr. Zane KalniņaElīna ZandbergaEdgars EndzeliņšPāvels ZajakinsLāsma IvanovaAngelina PismenajaProf. Mārcis LejaDr. Jānis EglītisDr.Mihails TimofējevsDr. Guntis AncānsDr. Armands SīviņšDr. Inta Liepniece-KareleAgita VavilovaDr. Gunta PurkalneDr. Uldis KopeikaDr. Viktors KozirovskisMelita Magone