laboratoriniai darbai - Biochemijos ir molekulinÄs biologijos katedra
laboratoriniai darbai - Biochemijos ir molekulinÄs biologijos katedra
laboratoriniai darbai - Biochemijos ir molekulinÄs biologijos katedra
You also want an ePaper? Increase the reach of your titles
YUMPU automatically turns print PDFs into web optimized ePapers that Google loves.
VILNIAUS UNIVERSITETASBIOCHEMIJOS IR BIOFIZIKOS KATEDRALida Bagdonienë, Vida Bendikienë,Jurgis Kadziauskas, Danutë Labeikytë,Arvydas Markuckas, V<strong>ir</strong>ginija Sabaliauskienë,Zofija Sasnauskienë, Vaida ÐeputienëBIOCHEMIJOS<strong>laboratoriniai</strong> <strong>darbai</strong>VILNIAUS UNIVERSITETO LEIDYKLA2006
Turinys1. SAUGAUS DARBO BIOCHEMIJOS LABORATORIJOJEPAGRINDINËS TAISYKLËS1.1. Bendrosios taisyklës1.2. Pagrindinës taisyklës1.3. Higienos reikalavimai1.4. Saugos priemonës1.5. Laboratorijoje naudojami sveikatai kenksming<strong>ir</strong>eagentai <strong>ir</strong> darbo ypatumai1.6. P<strong>ir</strong>moji pagalba nelaimingø atsitikimø atveju2. TIRPALAI IR JØ RUOÐIMAS2.1. T<strong>ir</strong>palø koncentracijos reiðkimo bûdai2.2. T<strong>ir</strong>palø ruoðimas, darbas su t<strong>ir</strong>palais2.3. T<strong>ir</strong>palø tûrio matavimo priemonës2.4. Darbas automatiniu dozatoriumi2.4.1 Automatinio dozatoriaus darbo tikslumo ávertinimas3. TIRPALØ PH. BUFERINIAI TIRPALAI3.1. Vandenilio jonø koncentracijos reiðkimas3.2. Vandenilio jonø koncentracijos matavimas3.3. Silpnø rûgðèiø <strong>ir</strong> baziø jonizacija3.4. Buferiniai t<strong>ir</strong>palai3.5. Buferiniø t<strong>ir</strong>palø ruoðimas3.5.1. Buferinio t<strong>ir</strong>palo gaminimas, buferinëst<strong>ir</strong>palo talpos nustatymas4. AUDINIØ IR LÀSTELIØ ARDYMAS IR FRAKCIONAVIMAS4.1. Làsteliø <strong>ir</strong> audiniø suardymas.4.2. Làsteliø <strong>ir</strong> audiniø suardymas, nenaudojant detergentø.4.3. Làsteliø <strong>ir</strong> audiniø ardymas, naudojant detergentus4.4. Homogenizacijos t<strong>ir</strong>palo sudedamosios dalys4.5. Làsteliø <strong>ir</strong>/ar audiniø frakcionavimo bûdai. Centrifugavimas.4.5.1. Diferencinis centrifugavimas4.5.2. Centrifugavimas tankio gradientu
4 _________________________________ BIOCHEMIJOS LABORATORINIAI DARBAI4.6. Nelàstelinio ekstrakto frakcionavimo metodai4.6.1. Baltymø nusodinimas trichloracto rûgðtimi (TCA)4.6.2. Baltymø nusodinimas amonio sulfatu4.6.3. Baltymø nusodinimas etanoliu4.6.4. Baltymø nusodinimas parûgðtintu acetonu <strong>ir</strong> metanoliu4.6.5. Dializë4.7. Peramininimas4.8. Alkoholio dehidrogenazës (ADH) iðskyrimas ið kepimo mieliø4.8.1. Alkoholio dehidrogenazës gryninimas4.8.2. Baltymo kiekio nustatymas frakcijose4.8.3. Fermento aktyvumo nustatymas5. ÐVIESOS SUGERTIS5.1. ðviesos sugerties prigimtis5.2. Kiekybiniai matavimai. Bero <strong>ir</strong> Lamberto dësnis5.3. Kokybinës aminorûgðèiø atpaþinimo reakcijos.5.3.1. Ninhidrino reakcija5.3.2. Reakcija su histidinu <strong>ir</strong> t<strong>ir</strong>ozinu (Paulio reakcija)5.3.3. Biureto reakcija peptidiniams ryðiams nustatyti5.4. Kokybinës angliavandeniø nustatymo reakcijos5.4.1. Selivanovo reakcija ketoheksozëms nustatyti5.4.2. Triomerio reakcija aldozëms nustatyti5.5. Baltymø kiekio nustatymas5.5.1. Baltymø koncentracijos nustatymas, matuojantultravioletinës ðviesos sugertá ties 280 nm.5.5.2. Baltymo kiekio nustatymas Louri metodu5.5.3. Baltymo kiekio nustatymas bisinchoninësrûgðties (BCA) metodu5.5.4. Baltymø kiekio nustatymas biureto metodu6. BALTYMØ IR PEPTIDØ MERKAPTOGRUPIØ NUSTATYMAS7. CHROMATOGRAFIJA7.1 Chromatografijos pasisk<strong>ir</strong>stymo koeficientas7.2 Chromatografijos bûdai7.3 Kolonëlinë chromatografija7.3.1. Kolonëlinës chromatografijos áranga7.3.2. Nuostovioji fazë – uþpildas/ sorbentas/neðiklis7.3.3. Kolonëlës paruoðimas <strong>ir</strong> eliucija
1. Saugaus darbo biochemijos laboratorijoje pagrindinës taisyklës ________________________ 57.4. Plokðèioji (popieriaus <strong>ir</strong> plonasluoksnë) chromatografija7.4.1. Popieriaus chromatografija7.4.2. Plonasluoksnë chromatografija7.5 Chromatografijos metodai7.5.1. Adsorbcinë chromatografija7.5.2. Pasisk<strong>ir</strong>stymo chromatografija7.5.3. Jonø mainø chromatografija7.5.4. Molekuliø iðskyrimo chromatografija (gelchromatografija)7.5.5. Giminingumo (afininë) chromatografija7.6. Aminorûgðèiø <strong>ir</strong> nukleotidø nustatymas7.6.1. Plonasluoksnë chromatografija7.6.2. Ratinë popieriaus chromatografija7.6.3. Kylamoji chromatografija7.7. Mëlynojo dekstrano nudruskinimas gelchromatografijos metodu7.7.1. Kolonëlës pildymas7.7.2. Pavyzdþio paruoðimas <strong>ir</strong> uþpylimas ant kolonëlës7.8. Hemoglobino molekulinës masës nustatymasgelchromatografijos bûdu7.8.1 Sefadekso G-75-kolonëlës V onustatymas7.8.2 Sefadekso G-75-kolonëlës V enustatymas8. BALTYMØ ELEKTROFOREZË8.1. Elektra <strong>ir</strong> elektroforezë8.2. Omo dësnis <strong>ir</strong> elektroforezë8.3. Vienkryptë staèioji nutrûkstamoji baltymø gelelektroforezë denatûravimosàlygomis (atsiþvelgiant á Lemli)8.3.1. Poliakrilamido gelio paruoðimas8.3.2. Baltymø paruoðimas elektroforezei <strong>ir</strong> jø ápilimas á koncentruojamojogelio ðulinëlius8.3.3. Elektroforezës aparato ájungimas á elektros srovës ðaltiná8.3.4. Elektroforezës aparato iðrinkimas po elektroforezës8.3.5. Baltymø daþymas gelyje8.4. Baltymø nustatymas gelio elektroforezës metodu8.4.1. Sk<strong>ir</strong>iamojo gelio paruoðimas8.4.2. Koncentruojamojo gelio paruoðimas8.4.3. Baltymø preparatø paruoðimas elektroforezei <strong>ir</strong> jø ápylimas ákoncentruojamojo gelio ðulinëlius8.4.4. Baltymø daþymas gelyje po elektroforezës
6 _________________________________ BIOCHEMIJOS LABORATORINIAI DARBAI9. NUKLEORÛGÐÈIØ GRYNINIMAS IR ANALIZË9.1. DNR gryninimas9.2. RNR gryninimas9.3. DNR modifikuojantys fermentai9.1.1. Restrikcijos endonukleazës9.1.2. DNR polimerazës9.1.3. Nukleazës9.1.4. DNR ligazës9.1.5. Fosfatazës <strong>ir</strong> kinazës9.4. Nukleorûgðèiø elektroforezë agaroziniame gelyje9.5. Plazmidinës DNR gryninimas <strong>ir</strong> analizë9.5.1. Plazmidinës pTZ19R DNR gryninimas9.5.2. Fermentinë pTZ19R DNR analizë9.5.3. 1% agarozinio gelio paruoðimas.9.5.4. Fermentiniø reakcijø produktø analizë agaroziniame gelyje.9.6. Bakterijø RNR gryninimas <strong>ir</strong> analizë9.6.1. Bakterijø RNR gryninimas9.6.2. Bakterinës RNR fermentinë analizë9.6.3. Formaldehidinio 1,5% agarozës gelio paruoðimas9.6.4. RNR analizë agaroziniame gelyje denatûravimo sàlygomis9.7. Nukleoproteinø ið mieliø iðskyrimas <strong>ir</strong> analizë9.7.1. Nukleoproteinø iðskyrimas.9.7.2. Nukleoproteininio komplekso nukleorûgðèiø analizë9.7.3. Nukleoproteinø komplekso peptidø analizë9.8. Chromosominës DNR iðskyrimas ið eukariotiniø làsteliøA. TRIACILGLICEROLIØ HIDROLIZË10. PRADINIO FERMENTINËS REAKCIJOS GREIÈIO NUSTATYMAS10.1. Fermentai – biologiniai katalizatoriai10.2. Katalizës samprata10.2.1. Fermentø struktûra <strong>ir</strong> veikimo ypatumai10.3. Fermentiniø reakcijø greièio priklausomumasnuo substrato koncentracijos10.4. Alkoholio dehidrogenazës katalizuojamos reakcijospradinio reakcijos greièio nustatymas10.4.1. Pradinio reakcijos greièio priklausomumonuo fermento kiekio nustatymas10.4.2. Pradinio reakcijos greièio priklausomumasnuo etanolio koncentracijos
1. Saugaus darbo biochemijos laboratorijoje pagrindinës taisyklës ________________________ 710.5. Ðarminës fosfatazës ið E. coli pradinio reakcijos greièio nustatymas 13410.5.1. Pradinio reakcijos greièio priklausomumonuo fermento kiekio nustatymas10.5.2. Pradinio reakcijos greièio priklausomumo nuo p-NPPkoncentracijos nustatymas11. PRIEDAI
8 _________________________________ BIOCHEMIJOS LABORATORINIAI DARBAI
1. Saugaus darbo biochemijos laboratorijoje pagrindinës taisyklës ________________________ 91. Saugaus darbo biochemijos laboratorijojepagrindinës taisyklës1.1. Bendrosios taisyklës• Prieð pradedant d<strong>ir</strong>bti biochemijos laboratorijoje, susipaþástama su saugaus darbosu cheminëmis medþiagomis, <strong>laboratoriniai</strong>s prietaisais, darbo su mikroorganizmais<strong>ir</strong> bandomaisiais gyvûnais taisyklëmis.• Darbo saugumas priklauso nuo þmogaus, d<strong>ir</strong>banèio laboratorijoje, asmeninësatsakomybës.Studentai, supaþindinti su saugaus darbo taisyklëmis, pas<strong>ir</strong>aðo Darbo saugosþurnale.• Prieð pradëdami d<strong>ir</strong>bti, studentai turi pasakyti dëstytojui apie tam tikrussveikatos sutrikimus, (pvz. alergijà, astmà). Ligos gali paûmëti, atliekantlaboratorijoje tam tikrus bandymus.2. Pagrindinës taisyklës• Laboratorijoje ned<strong>ir</strong>bkite darbø, tiesiogiai nesusijusiø su atliekama uþduotimi.Prieð pradëdami bandymus, bûtinai iðsiaiðkinkite darbo atlikimo metodikà <strong>ir</strong>pradëkite darbà tik dëstytojui leidus.• Nenaudokite cheminiø reagentø, ant kuriø pakuoèiø nëra etikeèiø. Darbo vietojeturi bûti tik konkreèiai uþduoèiai atlikti reikalingi reagentai <strong>ir</strong> prietaisai.• Centrifuguokite tik sulygsvarintus mëgintuvëlius (rotoriuje vienas prieð kitàdedami lygaus svorio mëgintuvëliai ) <strong>ir</strong> uþdaræ centrifugos dangtá.• Nepalikite be prieþiûros deganèio dujø degiklio <strong>ir</strong> veikianèiø prietaisø.• Atsargiai d<strong>ir</strong>bkite elektroforezës (baltymø <strong>ir</strong> nukleorûgðèiø) aparatais. Ájungti áelektros tinklà galima tik uþdengus dangtá; elektroforezës metu nepilkitebuferinio t<strong>ir</strong>palo <strong>ir</strong> nelieskite.• Negalima siurbti skysèio á pipetæ burna, reikia naudoti gumines kriauðes arbaspecialius pipeèiø antgalius.• Visada naudokite maþiausià kenksmingos medþiagos kieká.• Draudþiama pilti á kriaukles cheminiø reagentø <strong>ir</strong> organiniø t<strong>ir</strong>pikliø atliekas,mikroorganizmams auginti panaudotos mitybinës terpës liekanas. Á ðiukðliø dëþænegalima iðmesti naudotø agarozës <strong>ir</strong> poliakrilamido geliø, Petri lëkðteliø subakterijø kolonijomis. Ðios atliekos pilamos arba sudedamos á tam sk<strong>ir</strong>tuskonteinerius.
10 _________________________________ BIOCHEMIJOS LABORATORINIAI DARBAI3. Higienos reikalavimai• Paltus <strong>ir</strong> striukes palikite drabuþinëje, o rankines, kuprines tvarkingai sudëkitetam sk<strong>ir</strong>toje vietoje. Pageidautina, kad apsivilktumëte laboratoriná chalatà oilgus plaukus suriðtumëte.• Laboratorijoje draudþiama valgyti, gerti, rûkyti. Negalima uostyti arba ragautijokiø cheminiø medþiagø.Prisiminkite, kad beveik visos cheminës medþiagosyra nuodingos!• D<strong>ir</strong>bti su ypaè kenksmingomis <strong>ir</strong> skleidþianèiomis nemalonø kvapà medþiagomis(pvz.,. fenoliu, chloroformu) reikia traukos spintoje <strong>ir</strong> bûtinai uþsimovusp<strong>ir</strong>ðtines.• Darbus, kuriø metu gali bûti paþeistos akys, reikia atlikti su apsauginiais akiniaisar kaukëmis.4. Saugos priemonës• Visada prisiminkite, kad koncentruotos rûgðtys, jas skiedþiant, visada pilamosá vandená, o ne atv<strong>ir</strong>kðèiai!• Bûkite atsargûs d<strong>ir</strong>bdami su organiniais t<strong>ir</strong>pikliais: beveik visi yra degûs. Jønegalima kaitinti atv<strong>ir</strong>a liepsna, nes kilus gaisrui sunku uþgesinti. Be to, t<strong>ir</strong>pikliaiyra lakûs <strong>ir</strong> nuodingi.• Laboratorijose naudojami stikliniai cheminiai indai, todël reikia d<strong>ir</strong>bti atsargiai,nes dûþtantys stiklai gali suþaloti. Nenaudokite áskilusiø arba aplûþinëjusiaiskraðtais indø.• Ypaè atsargiai reikia naudoti stiklinius gyvsidabrio termometrus. Negalimatermometrø naudoti vietoje stiklinës lazdelës reakcijos miðiniui maiðyti. Suduþustermometrui <strong>ir</strong> iðsipylus gyvsidabriui, reikia nedelsiant praneðti laborantui arbadëstytojui. Gyvsidabrá bûtina surinkti.• Kaitinant arba v<strong>ir</strong>inant skysèius mëgintuvëliuose arba kolbose, jø angà reikianukreipti nuo savæs <strong>ir</strong> ðalia d<strong>ir</strong>banèiø kolegø, o indà judinti, kol skystis tolygiaiáðyla. Negalima þiûrëti á kaitinamo indo turiná ið v<strong>ir</strong>ðaus. Saugokite akis!• Neliesti elektros prietaisø ðlapiomis rankomis.5. Laboratorijoje naudojami sveikatai kenksming<strong>ir</strong>eagentai <strong>ir</strong> darbo ypatumai:• Akrilamidas – neurotoksinas, patekæs pro odà, kaupiasi organizme. Sverti reikialabai atsargiai, uþsidëjus kaukæ <strong>ir</strong> mûvint p<strong>ir</strong>ðtines. Poliakrilamido geliai nërapavojingi.• Aktinomicinas D – antibiotikas, kancerogenas, gali sukelti alergijà. Sverti <strong>ir</strong>t<strong>ir</strong>pinti tik uþsimovus p<strong>ir</strong>ðtines, saugoti akis.
1. Saugaus darbo biochemijos laboratorijoje pagrindinës taisyklës ________________________ 11• Ditiotreitolis (DTT ) – neurotoksinas.• Etidþio bromidas – mutagenas, nuodingas. Su t<strong>ir</strong>palais, turinèiais etidþiobromido, d<strong>ir</strong>bti tik mûvint p<strong>ir</strong>ðtines.• Beta-merkaptoetanolis – neurotoksinas. Ðá reagentà pilstyti tik traukos spintoje.Ðaltame kambaryje reagentà reikia pilti labai atidþiai <strong>ir</strong> greitai (skleidþianemalonø kvapà).• Fenolis – labai agresyvus, grauþia, gali sukelti sunkius nudegimus. D<strong>ir</strong>bti tikmûvint p<strong>ir</strong>ðtines <strong>ir</strong> su apsauginiais akiniais. Ákvëpus fenolio garø, gerti stipriàkavà arba arbatà, kvëpuoti 2% sodos t<strong>ir</strong>palà.• NDS (natrio dodecilsulfatas) – alergenas, sverti NDS tik uþsidëjus kaukæ <strong>ir</strong>uþsimovus p<strong>ir</strong>ðtines (labai lengvai dulka, pavojinga ákvëpti).• Trichloracto <strong>ir</strong> trifluoracto rûgðtys – agresyvios organinës rûgðtys, d<strong>ir</strong>btiuþsimovus p<strong>ir</strong>ðtines <strong>ir</strong> su apsauginiais akiniais.6. P<strong>ir</strong>moji pagalba nelaimingø atsitikimø atveju• Pr<strong>ir</strong>eikus naudotis p<strong>ir</strong>mosios medicininës pagalbos vaistinële.• Ásipjovus ar susiþeidus stiklo ðukëmis, atsargiai paðalinti ið þaizdos stiklogabaliukus, o ápjautà vietà patepti sp<strong>ir</strong>itiniu jodo t<strong>ir</strong>palu <strong>ir</strong> apriðti.• Apsideginus, odà ðaldyti vandeniu, vëliau paþeistà vietà plauti 5% kaliopermanganato t<strong>ir</strong>palu <strong>ir</strong> patepti tepalu nuo nudegimo. Cheminiø nudegimø atvejupaþeistà vietà gerai nuplauti ðalto vandens srove, o apsideginus rûgðtimis plauti2% NaHCO 3t<strong>ir</strong>palu. Patekus rûgðtims á akis, taip pat skalauti 2% NaHCO 3t<strong>ir</strong>palu, o vëliau labai atidþiai skalauti vandeniu. Nedelsiant reikia kreiptis ágydytojà!• Nusideginus ðarmais, paþeistà vietà skalauti tekanèia vandens srove, o vëliauplauti 2% acto arba boro rûgðties t<strong>ir</strong>palu. Ðarmai ypaè pavojingi akims. Patekusðarmams á akis, reikia vandens srove 5–10 min. plauti aká, vëliau skalauti 2%boro rûgðties t<strong>ir</strong>palu. Nedelsiant reikia kreiptis á gydytojà !• Patekus ant odos fenoliui, trifluoracto, trichloracto rûgðtims ar kitomsagresyvioms, medþiagoms, paþeistà vietà nuplauti 40% etanoliu, patepti tepalunuo nudegimø <strong>ir</strong> apriðti.
12 _________________________________ BIOCHEMIJOS LABORATORINIAI DARBAI2.T<strong>ir</strong>palai <strong>ir</strong> jø ruoðimas2.1. T<strong>ir</strong>palø koncentracijos reiðkimo bûdaiT<strong>ir</strong>palas yra homogeniðka sistema, sudaryta ið t<strong>ir</strong>piklio (pvz., vandens) <strong>ir</strong> t<strong>ir</strong>pinio.T<strong>ir</strong>palø savybës priklauso nuo t<strong>ir</strong>piklio <strong>ir</strong> t<strong>ir</strong>pinio santykio bei jø savybiø. Labai daþna<strong>ir</strong>eikia nustatyti t<strong>ir</strong>palo koncentracijà, t. y. paruoðti tam tikros sudëties t<strong>ir</strong>palà arbanustatyti iðt<strong>ir</strong>pusios medþiagos kieká t<strong>ir</strong>pale. Remiantis SI sistema, iðt<strong>ir</strong>pusios medþiagoskoncentracija reiðkiama mol × m –3 , dimensija m –3 . Tiesa, laboratorijoje ðiskoncentracijos reiðkimo bûdas naudojamas retai. Daugiau áprasta vartoti nesisteminiuskoncentracijos reiðkimo vienetus.2.1. lentelë. Nesisteminiai koncentracijos reiðkimo bûdaiŽymėjimasC mCC NTww%Pavadinimas <strong>ir</strong> paaiškinimasMolialinė koncentracija – t<strong>ir</strong>pinio molių kiekis 1000 g t<strong>ir</strong>piklioMolinė koncentracija– t<strong>ir</strong>pinio molių kiekis viename litre t<strong>ir</strong>paloMolinė ekvivalentų koncentracija – t<strong>ir</strong>pinio ekvivalentų moliųkiekis viename litre t<strong>ir</strong>paloTitras – t<strong>ir</strong>pinio masė gramais, esanti 1 ml t<strong>ir</strong>paloMasės dalis (w/w) – t<strong>ir</strong>pinio <strong>ir</strong> t<strong>ir</strong>palo masių santykisMasės dalies procentai (%w/w) – procentinė koncentracija – t<strong>ir</strong>piniomasė gramais, esanti 100 g t<strong>ir</strong>paloDaþniausiai t<strong>ir</strong>palo koncentracija reiðkiama C , C N<strong>ir</strong> w bûdais.Molinë koncentracija , C (mol l –1 ) vartojama bene daþniausiai, þymima paprastaisskliaustais <strong>ir</strong> raide C (pvz., C(NaCl)) arba lauþtiniais skliaustais (pvz.[NaCl]). Molis –bedimensis medþiagos kiekio matavimo vienetas. Tai medþiagos kiekis, kuriame yra6,022×10 23 (Avogadro konstanta) tos medþiagos molekuliø. Sutarta kalbant apiemedþiagos kieká, þymëti „mol“ (bedimensis dydis). Raðant „M“, turima galvoje nemedþiagos kiekis, o koncentracija – molis/litre. „M“ dimensija – [l –1 ]. Taigi M = mol/l.Naudotis molinës koncentracijos reiðkimo bûdu paprasta tik þinant t<strong>ir</strong>pinio „molinæmasæ“, t. y. 6.03×10 23 t<strong>ir</strong>pinio molekuliø masæ. Medþiagos molinë masë þymima „M m“<strong>ir</strong> matuojama gramais. Kartais ji pateikiama kaip santykinë molinë masë „M r” . „M r“ –bedimensis dydis, kurio skaitinë reikðmë lygi „M m“.
1. 2. Saugaus T<strong>ir</strong>palai <strong>ir</strong> darbo jø paruoðimas biochemijos _________________________________________________________laboratorijoje pagrindinës taisyklës 13Pavyzdys. Koks kiekis <strong>ir</strong> kokia masë(m) KCl yra 5 ml 5M KCl t<strong>ir</strong>palo?1 litre 5M KCl t<strong>ir</strong>palo yra iðt<strong>ir</strong>pusios 5 mol druskos, t. y. 1 ml – 5 mmoldruskos. Tai yra 5 ml t<strong>ir</strong>palo yra iðt<strong>ir</strong>pusios n = 5 × 5=25 mmol KCl druskos.M r(KCl) =74,54. m (KCl) = n M m=0,025 × 74,54 = 0,11g.Molinë ekvivalentø koncentracija (ekv l –1 ). Iðt<strong>ir</strong>pusios medþiagos ekvivalentø moliøskaièius viename litre t<strong>ir</strong>palo. Ekvivalentø molio masë – elemento arba medþiagosmasë gramais, skaitine reikðme lygi ekvivalentui. Rûgðties ekvivalentas skaitine reikðmelygus molinei rûgðties masei, padalytai ið vandenilio atomø skaièiaus rûgðties molekulëje,bazës – molinei bazës masei, padalytai ið metalo valentingumo, druskos – molineidruskos masei, padalytai ið metalo atomø saièiaus <strong>ir</strong> metalo valentingumo sandaugos.Pavyzdys. Koks kiekis HCl <strong>ir</strong> H 2SO 4yra 1ml ðiø rûgðèiø 1N t<strong>ir</strong>paluose?HCl–vienprotonë rûgðtis, HCl g-ekv=M m(HCl). Taigi 1 litre t<strong>ir</strong>palo yra1 molis HCl, o 1 ml 1N HCl t<strong>ir</strong>pale yra 1 mmol HCl .H 2SO 4– dviprotonë rûgðtis, H 2SO 4g-ekv = M m(H 2SO 4)/2 . Taigi 1 litret<strong>ir</strong>palo yra 0,5 molio H 2SO 4, o 1 ml 1N H 2SO 4t<strong>ir</strong>palo yra 0,5 mmol H 2SO 4.Masës dalies (procentiniai) t<strong>ir</strong>palai. Masës dalis gali bûti iðreikðta vieneto dalimis(þymima w/w) arba procentais (þymima %w/w):Èia w% – masës dalis (ðiuo atveju procentais).T<strong>ir</strong>pinio masës dalá iðreikðti procentais daugiau áprasta nei vieneto dalimis. Procenta<strong>ir</strong>odo, kiek daliø sudaro t<strong>ir</strong>pinys, jeigu visas t<strong>ir</strong>palas sudaro 100 daliø.Pavyzdys. Kiek grynos acto rûgðties yra 400 g t<strong>ir</strong>palo, kuriame actorûgðties masës dalis yra 9%?m (CH 3COOH) = 9% × 400 g/100% = 36 g t. y. grynos acto rûgðties –36 g.Norint paruoðti 5% NaCl t<strong>ir</strong>palà, reikia 5 g druskos iðt<strong>ir</strong>pinti 95 g vandens. Galimapasverti 95 g vandens <strong>ir</strong> t<strong>ir</strong>pinti druskà arba paprasèiausiai 5 g druskos t<strong>ir</strong>pinti 95 mlvandens (distiliuoto vandens tankis 1g/cm 3 , taigi /v / = /w /, èia v – vandens tûris, w –masë). Kartais 5% NaCl t<strong>ir</strong>palas ruoðiamas kitaip – 5 g NaCl iðt<strong>ir</strong>pinama maþamevandens tûryje (pvz., ≈80 ml), o vëliau matavimo kolboje ar menzûroje t<strong>ir</strong>palo tûrispapildomas iki 100 ml. Taip paruoðtas t<strong>ir</strong>palas sk<strong>ir</strong>iasi nuo p<strong>ir</strong>muoju bûdu pagaminto.Susitarta, kad p<strong>ir</strong>muoju bûdu pagaminti t<strong>ir</strong>palai þymimi w/w, o antruoju bûdu – w/v. Taiyra t<strong>ir</strong>palai, kuriø koncentracija iðreikðta masës dalies procentais, atsiþvelgiant áparuoðimo bûdà, turëtø bûti þymimi %w/w arba %w/v. Kartais uþraðas %v/v rodo skysto
14 _________________________________ BIOCHEMIJOS LABORATORINIAI DARBAIt<strong>ir</strong>pinio procentinæ tûrio dalá. Taigi, jei ruoðiate t<strong>ir</strong>palà, kurio koncentracija iðreikðtat<strong>ir</strong>palo masës arba tûrio dalimis, nurodykite w/w, w/v arba v/v – t. y. paaiðkinkite, kaippagaminote t<strong>ir</strong>palà. Jei ant t<strong>ir</strong>palo etiketës nëra ðiø þenklø, daþniausiai daroma prielaida(ne visada teisinga), kad t<strong>ir</strong>palo koncentracija %w/w.Pavyzdys. Kaip pagaminti 10% w/w akrilamido (100g) , 10% w/vsacharozës (100 ml) <strong>ir</strong> 10% v/v glicerolio (100 ml) t<strong>ir</strong>palus.10% w/w akrilamido t<strong>ir</strong>palas ruoðiamas 10 g akrilamido iðt<strong>ir</strong>pinus 90 g(90ml) vandens. 10% w/v sacharozës t<strong>ir</strong>palas ruoðiamas 10 g sacharozëst<strong>ir</strong>pinant vandenyje, vëliau t<strong>ir</strong>palo tûris papildomas iki 100 ml. 10% v/vglicerolio t<strong>ir</strong>palas ruoðiamas 10 ml glicerolio tûrá praskiedþiant iki 100 ml.Kartais naudojami kiti nesisteminiai (w/v) koncentracijos reiðkimo bûdai. ppm(angl. parts per million) – milijoninës dalys, ppb (angl. parts per billion) – milijardinësdalys. ppm ekvivalentiðkas uþraðui µg ml –1 (10 –6 g ml –1 ), t. y. 1,0 ppm t<strong>ir</strong>paloaveragekoncentracija µg ml –1 (1,0 × 10 –6 g ml –1 ). Analogiðkai, ppb – milijardinë dalis, uþraðasekvivalentiðkas ng ml –1 (10 –9 g ml –1 ), t.y 1,0 ppb t<strong>ir</strong>palo koncentracija ng ml –1 (1,0 ×10 –9 g ml –1 ). Ðie vienetai daþniausiai taikomi liepsnos fotometrijai, atominei absorbcineispektroskopijai, dujø chromatografijai –apibûdinant labai praskiestus t<strong>ir</strong>palus.T<strong>ir</strong>palø skiedimas. Skiedþiant t<strong>ir</strong>palus, labai patogu atsiminti priklausomybæ:[C 1]V 1=[C 2]V 2; èia C 1<strong>ir</strong> C 2– pradinio <strong>ir</strong> galutinio (praskiesto) t<strong>ir</strong>paløkoncentracijos, iðreikðtos tais paèiais vienetais, V 1<strong>ir</strong> V 2– ðiø t<strong>ir</strong>palø tûriai.Pavyzdys. Kaip ið 0,5 M NaCl 200 ml t<strong>ir</strong>palo pagaminti 0,1M NaClt<strong>ir</strong>palà?0,5 M × 200 ml = 0,1 M × V 2; V 2= 1000 ml. Tai yra reikia 200 ml 0,5 MNaCl t<strong>ir</strong>palà atskiesti iki 1000 ml, kad jo koncentracija bûtø 0,1 M.Pradiniai t<strong>ir</strong>palai (angl. stock solutions). Daþnai t<strong>ir</strong>palai gaminami ið koncentruotesniøt<strong>ir</strong>palø, juos tinkamai praskiedþiant. Tai patogu, nereikia kiekvienà kartàið naujo ruoðti t<strong>ir</strong>palø.Pavyzdys. Atliekant PAGE-NDS elektroforezæ, t<strong>ir</strong>iami pavyzdþiai turibûti iðt<strong>ir</strong>pinti t<strong>ir</strong>pale, vadinamame baltymø denatûravimo (pavyzdþio) buferiu.Pavyzdþio buferio sudëtis – 62,5 mM TRIS-HCl, pH 6,8; 2% NDS, 10%glicerolio, 5% β-merkaptoetanolio <strong>ir</strong> 0,001% bromfenolio mëlynojo.Praktiðkai ruoðiami 2 ×, 3 ×,...,6 × koncentruotesni pavyzdþio buferiniait<strong>ir</strong>palai, kuriuose visø t<strong>ir</strong>palo sandø (TRIS, NDS, glicerolio, β-merkaptoetanolio)koncentracija yra 2 ×, 3 ×,...,6 × didesnë.
1. 2. Saugaus T<strong>ir</strong>palai <strong>ir</strong> darbo jø paruoðimas biochemijos _________________________________________________________laboratorijoje pagrindinës taisyklës 15Kokiu santykiu pavyzdþio buferis turi bûti sumaiðytas su t<strong>ir</strong>iamu mëginiu,jeigu vartosite 2 ×, 3 × <strong>ir</strong> 6 × koncentruotesnius baltymø pavyzdþio buferiniust<strong>ir</strong>palus?Naudojant 2 × pavyzdþio buferá sumaiðoma 1:1 santykiu, t. y. imamaviena dalis pavyzdþio buferio <strong>ir</strong> viena dalis t<strong>ir</strong>iamo t<strong>ir</strong>palo, naudojant3 × buferá sumaiðoma santykiu 1:2 (imama viena dalis pavyzdþio buferio <strong>ir</strong>dvi dalys t<strong>ir</strong>iamo mëginio), naudojant 6 × pavyzdþio buferá sumaiðoma 1:5santykiu (imama viena dalis pavyzdþio buferio <strong>ir</strong> penkios dalys t<strong>ir</strong>iamot<strong>ir</strong>palo).2.2 T<strong>ir</strong>palø ruoðimas, darbas su t<strong>ir</strong>palaisRuoðdami t<strong>ir</strong>palà, pasidomëkite t<strong>ir</strong>pinamos medþiagos savybëmis. Neatsargiaid<strong>ir</strong>bdami su tam tikromis medþiagomis, galite pakenkti sveikatai. Bendra taisyklë –visø medþiagø t<strong>ir</strong>palai potencialiai kenksmingi – d<strong>ir</strong>bkite atidþiai <strong>ir</strong> susikaupæ.Ruoðdami t<strong>ir</strong>palus laikykitës ðiø pagrindiniø taisykliø:– visø medþiagø t<strong>ir</strong>palus ruoðkite ið turimø reagentø pas<strong>ir</strong>inkæ geriausios kokybës,ðvariausià reagentà;– t<strong>ir</strong>palus gaminkite naudodami aukðèiausios kokybës vandená, patartina dukartdistiliuotà <strong>ir</strong> dejonizuotà;– esant galimybei, visi t<strong>ir</strong>palai sterilizuojami (autoklavuojama, jei t<strong>ir</strong>palo sandaistabilûs kaitinant arba filtruojama pro 0,22 mm filtrà).Gaminant t<strong>ir</strong>palus, tenka sverti norimà reagento ar t<strong>ir</strong>piklio kieká. Laboratorinëssvarstyklës sk<strong>ir</strong>iasi savo svërimo tikslumu <strong>ir</strong> svërimo riba. Svarstyklës, kuriø svërimotikslumas 0,0001 g, svërimo riba – 60 g, naudojamos sverti maþiems medþiagoskiekiams, daþniausiai iki 100 mg. Sveriant didesnius medþiagos kiekius, naudojamossvarstyklës, kuriø svërimo tikslumas yra 0,001 g, svërimo riba 100 g. Retsykiais, ka<strong>ir</strong>eikia pasverti didesnius medþiagø kiekius kaip 100 g arba maþesnius kaip 0,0001 g,kreipkitës á laborantà ar dëstytojà.Sveriant „X” g medþiagos reikia:– padëti ant svarstykliø tuðèià talpà, kurioje bus sveriamas reagentas.– nustatyti „0".– mentele (ðvaria <strong>ir</strong> iðkaitinta) áberti „X” g reagento.Sunkumai sveriant :– reagentas „susigulëjo”:• Uþkimðus reagento butelá <strong>ir</strong> stipriai supurèius, kartais pavyksta paðalintisunkumus.• Mentele (ðvaria <strong>ir</strong> iðkaitinta) susmulkinamas susigulëjæs reagentas.
16 _________________________________ BIOCHEMIJOS LABORATORINIAI DARBAI– reikia sverti lakias (NDS, bakterijø kultivavimo terpës) medþiagas.• Sverti traukos sàlygomis.• Sverti uþsidëjus apsauginæ kaukæ.– svërimo metu reagentas iðbarstytas ant svarstykliø lëkðtelës.• negalima bandyti surinkti reagento atgal á talpà. Toks iðbarstytas reagentasatsargiai nuëmus svarstykliø lëkðtelæ iðmetamas. Svarstykliø lëkðtelë atsargiainuvaloma. Draudþiama bandyti nupûsti iðbarstytà reagentà. Tai uþtikrintasbûdas maþà problemà padaryti didþiule.2.3. T<strong>ir</strong>palø tûrio matavimo priemonësD<strong>ir</strong>bant su þinomos koncentracijos t<strong>ir</strong>palais, svarbu tiksliai pamatuoti t<strong>ir</strong>palø tûrá.T<strong>ir</strong>palø tûriui matuoti priemonës pateiktos 2.2 lentelëje.2.2 lentelë. Laboratorijoje naudojamos t<strong>ir</strong>palø tûrio matavimo priemonësTūrio dozavimopriemonėT<strong>ir</strong>palo tūris, kurįgalima dozuotiTikslumasAr tinka kartotiniamdozavimui, ( + / −)Kolba, stiklinė 25–5000 ml Mažas +Matavimo cilindras 5–2000 ml Vidutinis +Matavimo kolba 25–1000 ml Labai didelis +Pipetė 1–100ml Didelis +Automatinis tūrio 0,5–5000µl Labai didelis +(pipetmanas) 1dozatoriusŠv<strong>ir</strong>kštas 0,5–20 ml Vidutinis +Mikrošv<strong>ir</strong>kštas 0,5–50µl Labai didelis +Svėrimas 2,3 Bet koks Labai didelis 3 –1 – tikslumas labai didelis, jei dozuoti parinktas tinkamas prietaisas, taip pat jei jis tinkamainaudojamas2 – þinant t<strong>ir</strong>palo tanká (medþiagø tankiai nesunkiai randami þinynuose <strong>ir</strong>/ar kataloguose),galima apskaièiuoti t<strong>ir</strong>palo tûrá (m=ρ ×V, kur ρ – t<strong>ir</strong>palo tankis, m – t<strong>ir</strong>palo masë, V –t<strong>ir</strong>palo tûris)3 – naudojant tinkamas svarstyklesLaboratorijoje naudojamos 3 rûðiø pipetës, pavaizduotos 2.1 pav. A. Atkreipkite dëmesáá a) <strong>ir</strong> b) sk<strong>ir</strong>tumus. Pipetës (a) tûrio gradavimas nuo v<strong>ir</strong>ðutinës þymës iki apatinëspadalos, pipetë (b) kalibruota nuo apaèios iki v<strong>ir</strong>ðutinës þymës. Skystis á pipetesásiurbiamas kriauðëmis <strong>ir</strong> siurbliukais. Venkite traukti burna – tai nesaugu. Siurbliukaigaminami keliø spalvø. Geltonu siurbliuku daugiausia galima ásiurbti 0,2 ml, mëlynu –2 ml, þaliu – 10 ml, raudonu – 25 ml skysèio. Persuktas siurbliuko sraigtas yra daþniausiaðiø patogiø árankiø lûþimo prieþastis.
1. 2. Saugaus T<strong>ir</strong>palai <strong>ir</strong> darbo jø paruoðimas biochemijos _________________________________________________________laboratorijoje pagrindinës taisyklës 17(a) (b) (c)A B C2.1 pav. Laboratorijoje skysèiø tûriui paimti <strong>ir</strong> matuoti naudojami árankiai.A – pipetës: a) tûris graduojamas nuo pipetës v<strong>ir</strong>ðaus, baigiasi apatine padala; b) serologinëpipetë – graduoti pradedama nuo pipetës apaèios baigiama v<strong>ir</strong>ðutine padala; c) nustatytotûrio pipetë – tûrá rodo pipetës þymë. B – skysèiui imti naudojamos kriauðës <strong>ir</strong> C – siurbliukai.Ðiuo metu laboratorijose daþniausiai d<strong>ir</strong>bant su vandeniniais t<strong>ir</strong>palais naudojamiautomatiniai dozatoriai (pipetmanai).Atsiminkite: su automatiniais dozatoriais negalima dozuoti koncentruotø rûgðèiø <strong>ir</strong> ðarmøt<strong>ir</strong>palø; naudokite automatinius dozatorius, ant kuriø yra uþdëti pakeièiamieji plastikiniaiantgaliai; visi dozatoriai turi didþiausià leistinà dozuoti tûrá (jis paþymëtas ant kiekvienoprietaiso korpuso). Negalima, reguliuojant dozatoriø, bandyti nustatyti didesnátûrá nei didþiausias leistinas (taip galima sulauþyti prietaisà); maþiausias leistinas dozuoti tûris ne visada bûna paþymëtas ant prietaisokorpuso. Negalima, reguliuojant dozatoriø, bandyti nustatyti maþesná tûrá, neileistinas maþiausias (jei jis nepaþymëtas ant prietaiso korpuso – 10–20 %didþiausio leistino), nes taip galima sulauþyti prietaisà; átraukæ á prietaiso korpuso ertmæ (ne á plastikiná antgalá) bet kurio skysèio,nedelsdami apie tai pasakykite laborantui ar dëstytojui; baigus darbà, automatiniai dozatoriai ástatomi á stovà.
18 _________________________________ BIOCHEMIJOS LABORATORINIAI DARBAI2.3 lentelë. Automatiniai keièiamo tûrio dozatoriaiKeičiamasis tūris, µl Rekomenduojama dozuoti µl Mažiausia padala, µl0–2 0,1–2 0,0020–10 0,5–10 0,020–20 2–20 0,020–100 10–100 0,20–200 50–200 0,20–1000 100–1000 2,00–5000 500–5000 2,00–10.000 1 ml–10 ml 20,02.4. Darbas automatiniu dozatoriumi1. Parinkite tinkamà prietaisà tam tikram tûriui dozuoti. Dozatoriø modeliaiyra dviejø rûðiø: keièiamojo tûrio <strong>ir</strong> nekeièiamojo (fiksuoto) tûrio. Fiksuototûrio dozatoriui galima paimti tik tam tikrà, ant prietaiso korpuso uþraðytà t<strong>ir</strong>palotûrá. Ant visø keièiamojo tûrio prietaisø korpusø uþraðytas didþiausias ásiurbiamoskysèio tûris. Keièiamojo tûrio dozatoriai yra keleto tipø (þr.lentelæ 3): 2, 10 µl,20 µl,100 µl, 200 µl, 1000 µl, 5 ml <strong>ir</strong> 10 ml didþiausiems tûriams ásiurbti. Jeigujums reikia ásiurbti, pvz. 67 µl, jûs galite naudoti 100 µl arba 200 µl keièiamojotûrio dozatorius.13245A B C2.2 pav. Automatiniai dozatoriai.A– 1 – dozatoriaus stûmoklis; 2 – plastikinio antgalio numetimo stûmoklis; 3 – sraigtas, kurásukant nustatomas dozuojamas tûris; 4– “rankovë” numetanti antgalá; 5– keièiamasisplastikinis antgalis. B – dozatoriaus stûmoklio darbas ásiurbiant tam tikrà tûrá; C – dozatoriausstûmoklio darbas iðpilant paimtà t<strong>ir</strong>palà
1. 2. Saugaus T<strong>ir</strong>palai <strong>ir</strong> darbo jø paruoðimas biochemijos _________________________________________________________laboratorijoje pagrindinës taisyklës 192. Sraigtu (2.2 pav., A) nustatykite norimà paimti tûrá.3. Uþmaukite tinkamà plastikiná antgalá. Antgaliai yra plastikinëse dëþutëse, kartaisyra svarbu, kad jie bûtø sterilûs.4. T<strong>ir</strong>palo ásiurbimas. Laikydami dozatoriø staèiai, nuspauskite stûmoklá iki prieðinimosi(2.2 pav., B– p<strong>ir</strong>moji padëtis STOP). Laikydami nykðtá ant stûmokliotokia padëtimi, plastikiná antgalá ámerkite á t<strong>ir</strong>palà. Palengva atleiskite p<strong>ir</strong>ðtà nuostûmoklio – t<strong>ir</strong>palas átraukiamas á plastikiná antgalá. Palaukite keletà sekundþiø –svarbu, kad nebûtø átraukta oro burbuliukø. Iðtraukite antgalá ið t<strong>ir</strong>palo. Daþniausiapradedanèiøjø naudotis automatiniais dozatoriais klaida – per greitas stûmoklioatleidimas, tokiu bûdu átraukiama oro, netiksliai dozuojamas t<strong>ir</strong>palo tûris.5. T<strong>ir</strong>palo iðpylimas. Antgalis priglaudþiamas prie indo, á kurá iðpilamasdozuojamas t<strong>ir</strong>palas, sienelës 10–15° kampu nuo vertikalios padëties (þr. pav.2.2. C). Stûmoklis nuspaudþiamas iki galo– antrosios STOP padëties (2.2 pav.C). Keletà sekundþiø palaukiame, leidþiame visam skysèiui iðtekëti ið plastikinioantgalio. Su nuspaustu iki galo stûmokliu (neatleidæ p<strong>ir</strong>ðto nuo stûmoklio),dozatoriø iðimame ið indo. Atleidþiame stûmoklá6. Antgalio nuëmimas. Daugelis dozatoriø turi specialø stûmoklá antgaliams nuimti(2.2 pav. A). Tuo atveju paprasèiausiai nuspaudþiame ðá stûmoklá <strong>ir</strong> paðalinamenaudotà antgalá. Atsiþvelgiant á naudotas medþiagas (nuodingos medþiagos,áprasti t<strong>ir</strong>palai) naudoti antgaliai surenkami á atsk<strong>ir</strong>us konteinerius. Dozatoriausneturinèio antgaliø stûmoklio naudotà antgalá atsargai nuimame p<strong>ir</strong>ðtais,laikydami uþ v<strong>ir</strong>ðutinës antgalio dalies.7. Dozatoriø ástatome á stovà.2.4.1. Automatinio dozatoriaus darbo tikslumo ávertinimasTikslas: Iðmokti naudotis automatiniu dozatoriumi <strong>ir</strong> svarstyklëmis. Ávertinti dozavimopaklaidas.Automatinio dozatoriaus darbo tikslumas ávertinamas gravimetrijos bûdu. Paimamidistiliuoto vandens mëginiai <strong>ir</strong> pasveriami. Distiliuoto vandens tankis 1 g/cm 3 , todël/v i/ = /w i/ , kur v i– i-tojo mëginio tûris, w i– ðio mëginio masë. Pasvërus kartotinaiimamus mëginius, galima statistiðkai ávertinti dozavimo paklaidas. Tikrosiosmatuojamo dydþio vertës áverèiu laikomas matavimo rezultatø aritmetinis vidurkis.Matavimai yra vienodo tikslumo, todël aritmetinis vidurkis nustatomas taip:n∑ wiµ= i1 = ;nÈia n – matavimø skaièius, w i– i-tojo matavimo metu gauta matuojamo dydþio vertë.
20 _________________________________ BIOCHEMIJOS LABORATORINIAI DARBAIAbsoliuèioji paklaida (E):µ−v0E% = × 100;vÈia v o– dozuojamas tûris, µ – aritmetinis vidurkis.Santykinë matavimo rezultatø paklaida (E%):0| µ−v 0|E% = × 100;v0Standartinë paklaida:n2∑ (v0−w i)s = i1 = .n−1Apskaièiavæ santykinæ paklaidà, galime ávertinti prietaiso tikslumà – dozuojamotûrio atitikimà pas<strong>ir</strong>inktà reikðmæ. Standartinë paklaida rodo kartojimàsi, t. y. þmogaus,kuris atlieka dozavimo operacijà, atidumà.Medþiagos <strong>ir</strong> prietaisai:1. Automatiniai keièiamojo tûrio dozatoriai.2. Svarstyklës.3. Distiliuotas vanduo.Darbo eiga:1. Pas<strong>ir</strong>enkamas tinkamas prietaisas dëstytojo pasiûlytam tûriui dozuoti.2. Dozatoriumi paimti distiliuoto vandens mëginiai (n≥5) pasveriami. Sveriantvandens mëginius [2–10] ml naudoti svarstykles, kuriø tikslumas 0,0001 g, kitaisatvejais – svarstykles, kuriø tikslumas – 0,001 g.3. Apskaièiuojamas dozuojamo tûrio aritmetinis vidurkis, santykinë <strong>ir</strong> standartinëmëginiø dozavimo paklaidos.Kontroliniai klausimai.1. Sk<strong>ir</strong>iant ribosomas ið kvieèiø daigeliø, naudojamas t<strong>ir</strong>palas, kurio sudëtis :90 mM KCl, 2 mM CaCl 2, 1 mM Mg(CH 3COO)2 , 6 mM KHCO 3. Kaip paruoðti100 ml tokio t<strong>ir</strong>palo? Molinës masës (M r) : 74,55 (KCl); 219 (CaCl 2×6H 2O);214,46 (Mg(CH 3COO) 2×4H 2O); 100,1 (KHCO 3).2. Ávertinkite automatiniø dozatoriø tikslumà. Trim dozatoriais (A, B <strong>ir</strong> C) buvokartotinai imamas 1000 ml vandens bandinys. Ðie bandiniai pasverti. Nustatyti
1. 2. Saugaus T<strong>ir</strong>palai <strong>ir</strong> darbo jø paruoðimas biochemijos _________________________________________________________laboratorijoje pagrindinës taisyklës 21rezultatai (g). Kuris prietaisas geriausiai kalibruotas. Kuriuo atveju studentasdozuodamas darë daugiausia klaidø?a. 0,986; 0,971; 0,993; 0,964; 0,983; 0,996; 0,977; 0,969; 0,982; 0,974;b. 1,013; 1,011; 1,010; 1,009; 1,011; 1,010; 1,011; 1,009; 1,011; 1,012;c. 0,985; 1,022; 1,051; 1,067; 0,973; 0,982; 0,894; 1,045; 1,062; 0,928.1. Praktikuokitës paruoðti t<strong>ir</strong>palus ið koncentruotø pradiniø (stock) t<strong>ir</strong>palø.Tarkime, jûs turite ðiuos pradinius t<strong>ir</strong>palus : 0,1 M NaCl, 0,2 M KCl, 0,16 MCaCl 2; 0,005 M gliukozë. Kaip paruoðti t<strong>ir</strong>palus, kuriø sudëtis:a. 1ml 0,001 M KCl t<strong>ir</strong>palo;b. 50 ml 0,0025 M NaCl <strong>ir</strong> 0,0005 M gliukozës t<strong>ir</strong>palo ;c. 100 ml 0,005M NaCl; 0,0025 M KCl; 0,040 M CaCl 2; 0,0025 M gliukozë;d. 10 ml t<strong>ir</strong>palo, kuriame NaCl, KCl <strong>ir</strong> CaCl 2bûtø po 20,0 mmol ml –1 ;e. 25 ml t<strong>ir</strong>palo, kuriame CaCl 2bûtø 0,008 M, KCl – 0,05 M, gliukozës– 20,0nmol ml –1 .Literatûra:1. http: www.chemnetbase.com2. Boyer R. (2000) Modern Experimental Biochemistry, 3 rd edn, Benjamin Cummings,San Francisco.
22 _________________________________ BIOCHEMIJOS LABORATORINIAI DARBAI3.T<strong>ir</strong>palø pH. Buferiniai t<strong>ir</strong>palai3.1. Vandenilio jonø koncentracijos reiðkimaspH yra neigiamas deðimtainis vandenilio jonø koncentracijos logaritmas.+pH=−log10C(H ), arba+pH=−lg[H ].Nuo pH priklauso visos biologinës sistemos aktyvumas, daugelio biomolekuliøt<strong>ir</strong>pumas. Gyvø organizmø vidiniø skysèiø pH beveik nekinta. Tai sudaro palankiassàlygas veikti tam tikriems fermentams. Vandeniniø t<strong>ir</strong>palø pH priklauso nuo :• Vandens molekuliø jonizacijos. Vanduo – silpnas elektrolitas. Dalis vandensmolekuliø t<strong>ir</strong>pale yra jonizuotos : H 2O ↔ H + + OH – .• Rûgðèiø jonizacijos H–A ↔ H + + A – . Èia H–A – rûgðties molekulë, A – – rûgðtiesanijonas. Jonizuojantis rûgðtims, daugëja H + jonø, t. y. t<strong>ir</strong>palo pH maþëja.• Baziø jonizacijos X–OH ↔ X + + OH – . Èia X–OH – bazës molekulë, X + –metalojonas. Jonizuojantis bazëms, vandeninio t<strong>ir</strong>palo pH didëja.Daugeliui medþiagø bûdingos bazinës ar rûgðtinës savybës. Stipriø baziø <strong>ir</strong> rûgðèiøvandeniniai t<strong>ir</strong>palai yra beveik visiðkai jonizuoti, o silpnos rûgðtys ar bazës vandeniniamet<strong>ir</strong>pale yra ið dalies jonizuotos.Lygtis H 2O ↔ H + +OH – suprastintai vaizduoja vandens jonizacijos procesà. Ðisavaiminë jonizacija apraðoma pusiausvyros konstanta K c. Bandymais 24°C nustatytaK clygi 1,8×10 –16 .+ . −C(H ) x C(OH ) −16Kc= = 1,8·10 .C(H O)2Þinodami, kad vandens koncentracija 55,55 M, galime paraðyti:. + . − −16 −14w= c 2 = × = × × =K K C(H O) C(H ) C(OH ) 1,8 10 55,55 10Konstanta K wvadinama vandens sandauga <strong>ir</strong> lygi 10 –14 . Nesant vandenyje kitø junginiø,C(H + ) = C(OH – ) = 10 –7 .1909 metais S.Siorensenas (S.Sörensen) pasiûlë vandenilio <strong>ir</strong> hidroksilo jonøkoncentracijas reikðti neigiamais deðimtainiais logaritmais : pH <strong>ir</strong> pOH (nuo potentioHydrogenii).
1. 3. Saugaus T<strong>ir</strong>palø pH. darbo Buferiniai biochemijos t<strong>ir</strong>palai laboratorijoje _____________________________________________________pagrindinës taisyklës 23Tada pK w= pH +pOH = 14.Stipriø rûgðèiø t<strong>ir</strong>palø pH = 0 – 2, silpnø rûgðèiø – 3 – 6. Neutraliø t<strong>ir</strong>palø pH lygus7. Silpnø baziø t<strong>ir</strong>palø pH = 8 – 11, o ðarmø t<strong>ir</strong>palams bûdinga pH = 12 – 14.3.2. Vandenilio jonø koncentracijos matavimasT<strong>ir</strong>palø pH kiekybiðkai ávertinamas pH-metru (3.1 pav.) arba indikatoriniais daþais.Indikatoriniai daþai (lentelë priedas 5) daþniausiai turi silpnø rûgðèiø savybes.Keièiantis pH, tokios medþiagos keièia spalvà. Ádëjus maþus ðiø medþiagø kiekius át<strong>ir</strong>palà, pasikeitus t<strong>ir</strong>palo spalvai, apytikriai (paklaida daþniausiai 1–2 pH vienetai)galima daryti iðvadà apie tokio t<strong>ir</strong>palo pH. Indikatoriniuose popierëliuose sujungtoskeleto indikatoriniø daþø savybes – tokiu bûdu maþëja nustatomo t<strong>ir</strong>palo pH vertinimopaklaida. Indikatoriniai popierëliai naudojami apytiksliai vertinant t<strong>ir</strong>palo pH. Tiksliait<strong>ir</strong>palo pH galima pamatuoti pH-metru.potenciometrasAg/ AgCl elektrodasSotusisKCL t<strong>ir</strong>palasKamðtisHCl t<strong>ir</strong>palaspalyginamasis kalomelioelektrodasH + jautrus stikloelektrodast<strong>ir</strong>iamasis t<strong>ir</strong>palas3.1 pav. pH - metro schema.pH-metru vandenilio jonø koncentracija matuojama elektrodu, jautriu vandeniliojonø koncentracijai, prijungtu prie potenciometro. pH elektrodas sudarytas ið dviejøatsk<strong>ir</strong>ø sistemø : H + – jautraus stiklo elektrodo <strong>ir</strong> palyginamojo elektrodo (kalomelioelektrodas). Elektrodà ámerkus á t<strong>ir</strong>iamà t<strong>ir</strong>palà, ant stiklo elekrodo ats<strong>ir</strong>anda potencialøsk<strong>ir</strong>tumas, kuris pamatuojamas potenciometru.
24 _________________________________ BIOCHEMIJOS LABORATORINIAI DARBAI3.3. Silpnø rûgðèiø <strong>ir</strong> baziø jonizacijaRûgðtys – junginiai, kurie t<strong>ir</strong>pale jonizuojasi <strong>ir</strong> iðsk<strong>ir</strong>ia protonà. Rûgðties HA jonizacijoslygtis:HA A – + H + .Ði gráþtamoji reakcija apraðoma pusiausvyros konstanta K a, vadinama rûgðtiesjonizacijos konstanta:+ . −C(H ) x C(A )K a =.C(HA)Silpnø rûgðèiø jonizacijos konstantos – labai maþi dydþiai. Pavyzdþiui, acto rûgðtiesjonizacijos konstanta 24°C lygi 1,75×10 –5 . Patogiau naudotis jonizacijos konstantøneigiamaisiais logaritmais – pK a. pK a= – lg K a. Pavyzdþiui, acto rûgðties pK alygus4,75. Þinodami pK a, galime numatyti, kokios formos (molekulinës ar jonizuotos) t<strong>ir</strong>palebus junginys. Kai t<strong>ir</strong>palo pH yra maþesnë uþ pK, t<strong>ir</strong>pale vyrauja nejonizuota junginioforma. Jei pK lygi pH, pusë junginio molekuliø yra jonizuotos. Jei pH > pK a, vyraujajonizuota junginio forma (3.2 pav.).Stiprios rûgðtys, pvz., HCl, jonizuojasi (iðsk<strong>ir</strong>ia protonus), esant maþoms pHreikðmëms, o silpnos rûgðtys jonizuojasi esant didesnëms pH reikðmëms, kartais pH>7. Pavyzdþiui, aminorûgðties t<strong>ir</strong>ozino funkcinës grupës – fenilo (labai silpnos rûgðties),pK a≈10. Bendra taisyklë – juo stipresnë rûgðtis, tuo jos pK amaþesnis.1.0Bazësekvivalentøskaièius0.5CH 3COO – (–1.0)(–0.75)(–0.5)RûgðtiesmolekulëskrûvisCH 3COOHpH=pK a(–0.25)0.02 3 4 5 6 7 80.03.2 pav. Acto rûgðties titravimo kreivë. Molekulës krûvis (deðinioji ordinatë) –acto rûgðties disocijuotø <strong>ir</strong> nedisocijuotø molekuliø krûvio vidurkis
1. 3. Saugaus T<strong>ir</strong>palø pH. darbo Buferiniai biochemijos t<strong>ir</strong>palai laboratorijoje _____________________________________________________pagrindinës taisyklës 25Pavyzdys. Apskaièiuokite 0,01M acto rûgðties t<strong>ir</strong>palo pH <strong>ir</strong> jonizacijoslaipsná, jei acto rûgðties K alygus 1,75×10 –5 .Acto rûgðties jonizacijos lygtis: CH 3COOH ↔CH 3COO – + H + .+ .−3C(H ) x C(CH COO )−5Ka= = 1,75 x10 .C(CH COOH)3Paþymëkime x = C(H + ). Tada acetato koncentracija taip pat bus lygi x, o(x)(x)nejonizuotos rûgðties koncentracija lygi (0,01–x). Taigi −5= 1,75 x10 .0,01−xPo akivaizdþiø lygties pertvarkymø gauname lygtá1,75×10 –7 – 1,75×10 –5 x =x 2 .Ðià kvadratinæ lygtá nesunkiai galime iðspræsti áprastu bûdu, arba,pastebëjus, kad lygties dëmuo 1,75×10 –5 x labai maþas, paprasèiau jonepaisyti. Tada x 2 = 1,75×10 –7 . x = C(H + ) = 4,18×10 –4 M.pH = –lgC(H + ) = 3,38. Jonizacijos laipsnis α – skaièius, rodantis, kuriiðt<strong>ir</strong>pusiø molekuliø dalis yra jonø pavidalo. Acto rûgðties jonizacijoslaipsnis:−C(CH3COO )−44,18 x 10−2−C(CH3COO ) + C(CH3COOH)0,01T. y. tiktai ≈4% acto rûgðties molekuliø yra jonizuotos.α= = = 4,18x10 arba 4,18 %.Bazës – junginiai, kurie t<strong>ir</strong>pale jonizuojasi <strong>ir</strong> iðsk<strong>ir</strong>ia OH – jonà. Amino grupesturintiems junginiams (p<strong>ir</strong>miniams, antriniams, tretiniams aminams) bûdingos silpnøbaziø savybës. Aminø (RNH 2) jonizacija uþraðoma lygtimi:RNH 2+ H 2O RNH 3++ OH – .Ði gráþtama jonizacija apraðoma pusiausvyros konstanta K b, vadinama bazësjonizacijos konstanta:+ . −3b =.2 2C(RNH ) x C(OH )K .C(RNH ) x C(H O)Kaip <strong>ir</strong> rûgðèiø aveju, daþniau vartojami jonizacijos konstantø neigiamieji logaritmaipK b= –lgK b. Ði konstanta (panaðiai, kaip K arûgðèiø atveju) yra kiekybinis bazësstiprumo matas. Bendra taisyklë – juo stipresnë bazë, juo jos pK bdidesnis. Daugiausiabaziø pK breikðmës yra didesnës uþ 7, pvz., etanolamino pK b=9,5. Vadinasi, t<strong>ir</strong>pale,kurio pH=9,5, pusë etanolamino molekuliø yra jonizuotos
26 _________________________________ BIOCHEMIJOS LABORATORINIAI DARBAI3.4. Buferiniai t<strong>ir</strong>palaiBuferiniu t<strong>ir</strong>palu, arba tiesiog buferiu, vadinamas t<strong>ir</strong>palas, kurio pH nesikeièia arbakeièiasi maþai, t<strong>ir</strong>palà skiedþiant arba pridëjus nedidelá kieká tiek stiprios rûgðties arðarmo.Buferiniai t<strong>ir</strong>palai yra keliø rûðiø:1. T<strong>ir</strong>palai, turintys silpnà rûgðtá <strong>ir</strong> ðios rûgðties stiprios bazës druskos (pvz.,CH 3COOH + CH 3COONa). Tai vadinamieji rûgðtiniai buferiai.2. T<strong>ir</strong>palai, turintys silpnà bazæ <strong>ir</strong> druskà, sudarytà ið tos bazës <strong>ir</strong> stiprios rûgðtiesanijono (pvz., NH 4OH + NH 4Cl). Tai vadinamieji baziniai buferiai.Buferinis silpnos rûgðties <strong>ir</strong> jos druskos (pvz., CH 3COOH +CH 3COONa) veikimas:ádëjus á toká t<strong>ir</strong>palà ðiek tiek ðarmo, pvz., NaOH, vyksta procesas :− −HA+ OH → A + H O , (+ -− +CH COOH+ Na + OH → CH COO + Na + H O). )23 3 2Ðarmas suriða silpnos rûgðties HA protonus H + <strong>ir</strong> susidaro silpnas elektrolitas H 2O.Aiðku, didëja silpnos rûgðties anijono A – koncentracija.Ádëjus á toká t<strong>ir</strong>palà ðiek tiek stiprios rûgðties, pvz., HCl, didëja silpnos rûgðtieskoncentracija:+ −H + A →HA,(+ − − + + −3 3H + Cl + CH COO + Na → Na + Cl + CH COOH ).Tai yra stiprios rûgðties protonai H + sus<strong>ir</strong>iða su druskos anijonu A – , susidaro silpnarûgðtis.Buferiniam t<strong>ir</strong>palui, sudarytam ið silpnos rûgðties HA <strong>ir</strong> jos druskos D (pvz.,CH 3COOH + CH 3COONa), paraðykime lygtá, siejanèià tokio t<strong>ir</strong>palo pH <strong>ir</strong> silpnosrûgðties <strong>ir</strong> jos druskos koncentracijas (C(HA), C (A – )). Silpnos rûgðties HA jonizacijospusiausvyros konstanta K a:+ . −C(H ) x C(A )K a =.C(HA)Esant t<strong>ir</strong>pale vienvardþiø druskos anijonø (A – ), rûgðties jonizacija vyks daug lëèiau.Praktiðkai silpnos rûgðties koncentracija po jonizacijos bus lygi pradinei rûgðtieskoncentracijai C(HA). Druskos anijonø (A – ) koncentracija bus lygi druskos koncentracijaiC(D).−C(A )Taigi pH= pKa+ lg arbaC(HA)+ K a x C(HA)C(H ) =.−C(A )
1. 3. Saugaus T<strong>ir</strong>palø pH. darbo Buferiniai biochemijos t<strong>ir</strong>palai laboratorijoje _____________________________________________________pagrindinës taisyklës 27(1).Lygtis (1) vadinama Hendersono <strong>ir</strong>Haselbacho (Handerson–Hasselbach) lygtimi.Ið (1) lygties matome, kad pakeitæ santykápvz.,10 kartø, santykio deðimtainislogaritmas (kartu <strong>ir</strong> pH) pasikeis tik per vienetà. Skiedþiant buferinius t<strong>ir</strong>palus,vandenilio jonø koncentracija (vadinasi, <strong>ir</strong> pH) nesikeèia, nes nekinta santykis .Buferinio t<strong>ir</strong>palo veikimas, jo sugebëjimas suriðti vandenilio ar hidroksilo jonusparodytas 3.3 paveiksle.pK+3pK+2pK+1pKpK–1pK–2pK–3Nebuferinist<strong>ir</strong>palasNebuferinist<strong>ir</strong>palaspH lgpK–2 –2pK–1 –1pK 0pK+1 1pK+2 23.3 pav. Buferinio t<strong>ir</strong>palo veikimasPavyzdys. Kaip pakis buferinio t<strong>ir</strong>palo, sudaryto ið 0,1M acto rûgðties <strong>ir</strong>0,1M natrio acetato, pH, á t<strong>ir</strong>palà áneðus 0,05M NaOH? Acto rûgðties K alygus1,75×10 –5 .Kaip ðis kiekis ðarmo pakeistø vandens pH?Hendersono <strong>ir</strong>Heselbacho lygtis acetatiniam buferiui:C(A )pH= pKa+ lg ,C(HA)−0,1+0,05pH= 4,46+ lg = 4,76+ 0,48=5,24.0,1−0,05Vandens pH =7. Ádëjus á vandená 0,05 M NaOH, t<strong>ir</strong>palo pH = pK w– pOH=14– 1,31= 12,69. Tai yra buferinio t<strong>ir</strong>palo pH, ádëjus 0,05M NaOH pakitoper 0,78 pH, o vandens – per 5,69 pH .
28 _________________________________ BIOCHEMIJOS LABORATORINIAI DARBAIAnalogiðki procesai bus stebimi NH 4OH/NH 4Cl buferinëje sistemoje (bazinisbuferinis t<strong>ir</strong>palas). Ðioms sistemoms Hendersono <strong>ir</strong> Haselbacho lygtis:C(B)C(B)pH= pKw− pKb+ lg = 14− pKb+lg .C(D)C(D)Èia K b– silpnos bazës disociacijos konstanta, K w– vandens disociacijos konstanta;C(B) = [B] – silpnos bazës B koncentracija, C(D) = [BH + ] – silpnos bazës katijonoBH + koncentracija.Buferinis veikimas bûdingas <strong>ir</strong> druskø miðiniams. Druskoms hidrolizuojantis vienaið druskø sukelia labiau rûgðtinæ, kita – labiau bazinæ reakcijà. Pavyzdþiui, NaH 2PO 4+Na 2HPO 4, NaHCO 3+Na 2CO 3. Ðios buferinës sistemos labai svarbios þmogausorganizmo gyvybiðkai svarbiø sistemø pastoviam pH palaikyti.Buferinio t<strong>ir</strong>palo veikimo sritá lemia silpnos rûgðties ar bazës pK reikðmë. Laikoma,kad buferines savybes sistema turi intervale pK ± 1.Buferiniai t<strong>ir</strong>palai sk<strong>ir</strong>iasi savo gebëjimu palaikyti nekintamà pH. Jei vieno t<strong>ir</strong>palopH pakito maþiau, pvz., ádëjus ðiek tiek HCl, negu kito buferinio t<strong>ir</strong>palo, sakome, kadp<strong>ir</strong>majam t<strong>ir</strong>palui bûdinga didesnë buferinë talpa. Buferinæ talpà galime ávertintikiekybiðkai. Tai ðarmo ar rûgðties kiekis (ekvivalentais), kurá ádëjæ á 1 l t<strong>ir</strong>palo, ðiopH pasikeièia vienetu. Buferinë talpa visada yra teigiamas dydis, todël (2) lygtis galiojaðarmo atveju, o (3) – rûgðties atveju :d[B]β=dpH(2);d[B]β=−dpH(3);Buferinë talpa gali bûti apskaièiuota teoriðkai. Buferio, á kurio sudëtá áeina silpnarûgðtis, buferinë talpa, kai pH = pK, gali bûti apskaièiuota taip (4):2,303β max = C(4),4C – bendra silpnos rûgðties HA <strong>ir</strong> jos druskos A – koncentracijaVisiems buferiniams t<strong>ir</strong>palams yra bûdingas taip vadinamasis temperatûros efektas.Daugumos buferiø pH silpnai kinta, pakitus temperatûrai. Taèiau tam tikrø buferiniøt<strong>ir</strong>palø nustatyta kambario temperatûros sàlygomis pH gali sk<strong>ir</strong>tis nuo darbinës t<strong>ir</strong>palopH reikðmës. 0,05 M TRIS/HCl t<strong>ir</strong>palo, kurio pH yra 7,05 temperatûrà sumaþinus nuo37 0 C iki 23 0 C, t<strong>ir</strong>palo pH padidëja iki 7,20. Tokie vandenilio jonø koncentracijospokyèiai gali turëti átakos t<strong>ir</strong>iamam procesui <strong>ir</strong> jø nepaisyti negalima. Ðiuo konkreèiu
1. 3. Saugaus T<strong>ir</strong>palø pH. darbo Buferiniai biochemijos t<strong>ir</strong>palai laboratorijoje _____________________________________________________pagrindinës taisyklës 29atveju pH pasikeitimà per 0,15 pH vieneto, atitinkantis ∆ [H + ] sk<strong>ir</strong>iasi net 41%.Populiariems buferiams nustatyti vadinamieji temperatûros koeficientai. Pvz., TRIS’oatveju temperatûros koeficientas –0,028 / 0 C. Jei gaminate 0,05 M TRIS–HCl pH 7,4buferá kambario (23°C) temperatûros sàlygomis, o naudosite já 4 0 C, praktiðkai reikiaruoðti 6,86 pH t<strong>ir</strong>palà. Esant 40 0 C temperatûrai, ðio t<strong>ir</strong>palo pH bus 7,4. Aiðku, daugumosbuferiniø t<strong>ir</strong>palø temperatûros koeficientas daug maþesnis <strong>ir</strong> didelës átakos ðiø t<strong>ir</strong>paløpH neturi.3.5. Buferiniø t<strong>ir</strong>palø ruoðimasBuferiniai t<strong>ir</strong>palai ruoðiami dvejopai:• sumaiðant silpnà rûgðtá <strong>ir</strong> jos druskà (rûgðtiniams buferiams) arba silpnà bazæ<strong>ir</strong> jos druskà (baziniams buferiams) tam tikru santykiu. Þinant pK aarba pK bgalima paruoðti norimo pH t<strong>ir</strong>palà. Sudedamøjø daliø santyká nesunkiaigalima apskaièiuoti ið Hendersono <strong>ir</strong> Haselbacho lygties.• t<strong>ir</strong>palai ruoðiami ið silpnos rûgðties ar silpnos bazës, palengva pridedamaðarmo ar stiprios rûgðties iki norimo pH (t<strong>ir</strong>palo pH pokyèiai stebimi pHmetru).Pavyzdys. Kaip paruoðti litrà 0,05 M TRIS-HCl pH 8,2 t<strong>ir</strong>palo?M r(TRIS)=121,1. Litre 0,05 M t<strong>ir</strong>palo yra 50 mmol, t. y. 6,055 g TRIS’obazës. Pasvëræ ðá medþiagos kieká, iðt<strong>ir</strong>piname maþesniame nei galutinisdejonizuoto vandens tûryje (pvz., ≅ 600 ml). Maþomis porcijomis ádedame át<strong>ir</strong>palà HCl, pH-metru stebime pH kitimà iki reikiamos pH – 8,2. Gautàt<strong>ir</strong>palà (pH = 8,2) atskiedþiame iki 1l.6 lentelëje (þr. priedas) pateikti daþnai laboratorijoje naudojami buferiai. Parinkdamibuferinæ sistemà atsiþvelgiame:• á darbinæ , t. y. rekomenduojamà naudoti t<strong>ir</strong>palo pH sritá. Tinkamiausia laikomata buferinë sistema, kurios pK arèiausias t<strong>ir</strong>palo pH. Jei pH = pK, t<strong>ir</strong>palo buferinëtalpa didþiausia.• ar kitos t<strong>ir</strong>palo sudedamosios dalys nereaguoja su buferiu. Pavyzdþiui, t<strong>ir</strong>iantZn 2+ <strong>ir</strong> Pb + átakà tam tikram medþiagø apykaitos procesui, nepatartina naudotikarbonatinio buferio.
30 _________________________________ BIOCHEMIJOS LABORATORINIAI DARBAI3.5.1. Buferinio t<strong>ir</strong>palo gaminimas,buferinës t<strong>ir</strong>palo talpos nustatymasNaudojantis Hendersono <strong>ir</strong> Haselbacho lygtimi, apskaièiuoti fosfato buferinës sistemossudedamøjø daliø santyká, ruoðiant tam tikro pH t<strong>ir</strong>palus. Paruoðti tokius t<strong>ir</strong>palus <strong>ir</strong>iðt<strong>ir</strong>ti ðiø t<strong>ir</strong>palø buferines savybes.<strong>Biochemijos</strong> darbø metu daþnai naudojamas fosfatinis buferis. Ðià buferinæ sistemàsudaro H 2PO 4–(silpna rûgðtis) <strong>ir</strong> HPO 42–(silpnos rûgðties anijonas, konjuguotoji bazë).KH 2PO 4(silpnos rûgðties) pK a=6,8. HPO 42–/H 2PO 4–buferinei sistemai Hendersono<strong>ir</strong> Haselbacho lygtis:2−4−2 4[HPO ]pH= pKa+ lg .[H PO ]2−[HPO 4 ]kai 1,−[H2PO 4]= t. y. [HPO ]= [H 2PO − ], pH = pK a = 6,8.4Cheminiai reagentai:1. 0,05 M K 2HPO 4<strong>ir</strong> 0,05M K H 2PO 4t<strong>ir</strong>palai.2. 0,1 N NaOH <strong>ir</strong> 0,1 N HCl.3. KH 2PO 44. 0,1N KOH.−Darbo eiga:1. Naudojant 0,05 M K 2HPO 4<strong>ir</strong> 0,05M KH 2PO 4t<strong>ir</strong>palus, paruoðti po 20 ml t<strong>ir</strong>palø,kuriø pH bûtø 5,8; 6,8; 7,8. Sudedamøjø daliø santyká, reikalingà nurodytamt<strong>ir</strong>palui ruoðti, apskaièiuokite vartodami Hendersono <strong>ir</strong> Haselbacho lygtá.− − 2 +2 4 4HPO ↔ HPO + H. Rûgðties pK alygus 6,8.5. Patikrinkite gautø t<strong>ir</strong>palø pH, naudodami pH-metrà.6. Paimkite po 5 ml ið pagamintø t<strong>ir</strong>palø (pH 5,8, 6,8 <strong>ir</strong> 7,8). Atskieskite ðiuosmëginius vandeniu deðimt kartø.7. pH-metru pamatuokite deðimt kartø praskiestø t<strong>ir</strong>palø pH.8. Nustatykite t<strong>ir</strong>palø, kuriø pH 5,8 <strong>ir</strong> 6,8 buferinæ talpà pagal rûgðtá <strong>ir</strong> ðarmà.Buferinæ talpà apytikriai galime ávertinti tokiu bûdu. Prie 10 ml tam tikro pHt<strong>ir</strong>palo pridedame 1,0 ml 0,1 N NaOH arba 0,1N HCl <strong>ir</strong> pamatuojamas t<strong>ir</strong>palopH. Buferinæ t<strong>ir</strong>palo talpà apskaièiuojame ið formulës:NVβ≈(pH pH )V11−0 0kur pH 1– pH 0= ∆pH pH-metro rodmenø sk<strong>ir</strong>tumas, ádëjus NaOH arba HCl, N –ádedamos rûgðties ar ðarmo ekvivalentø moliai, V 1– ádedamos rûgðties ar ðarmo tûris,V 0– pradinis t<strong>ir</strong>palo tûris.;24
1. 3. Saugaus T<strong>ir</strong>palø pH. darbo Buferiniai biochemijos t<strong>ir</strong>palai laboratorijoje _____________________________________________________pagrindinës taisyklës 319. Nustatykite deðimt kartø atskiestø t<strong>ir</strong>palø, kuriø pH 6,8 <strong>ir</strong> 5,8 buferinæ talpàpagal rûgðtá <strong>ir</strong> ðarmà.10. Palyginkite nustatytà buferinës talpos reikðmæ pH = pK = 6,8 su teoriðkaiapskaièiuota atsiþvelgiant á (4).11. Paruoðkite 100 ml 0,05 M fosfatiná buferá, kurio pH bûtø 6,8, antruoju bûdu,t. y. titruodami KH 2PO 4t<strong>ir</strong>palà 0,1N KOH iki reikiamo pH:• apskaièiuokite, koks kiekis KH 2PO 4turi bûti pasvertas, norint paruoðti 0,05Mt<strong>ir</strong>palà;• iðt<strong>ir</strong>pinkite druskà maþame tûryje vandens (≅60ml);• maþomis porcijomis pridëdami 0,1 N KOH, pasiekite, kad t<strong>ir</strong>palo pH bûtø6,8• t<strong>ir</strong>palo tûrá menzûroje papildykite iki 100 ml.Kontroliniai klausimai :1. Buferiniai t<strong>ir</strong>palai. Hendersono <strong>ir</strong> Haselbacho lygtis buferiniams t<strong>ir</strong>palams, ákuriø sudëtá áeina silpna rûgðtis <strong>ir</strong> t<strong>ir</strong>palams, á kuriø sudëtá áeina silpna bazë.2. Tarp daugybës buferiniø sistemø, kurios dalyvauja palaikant vidulàsteliniøorganizmo skysèiø pastovø pH [6,8; 7,8], labai svarbios yra HCO 3––H 2CO 3(pK a=8,3) <strong>ir</strong> HPO 42–– H 2PO 4–(pK a=6,8) sistemos. Paraðykite lygtis, kaip ðiøbuferiniø sistemø sudedamosios dalys reaguoja su rûgðtimis <strong>ir</strong> bazëmis.3. Kokios aminorûgðtys pasiþymi buferinëmis savybëmis fiziologinëse (t. y. pH[6,8; 7,8]), sàlygose?4. Glicino α-COOH grupës pK a=2,34, NH 2– grupës pK a= 9,60. Nubrëþkiteglicino titravimo kreivæ. Kuriais pH intervalais glicino t<strong>ir</strong>palas turi buferiniøsavybiø? Koks glicino pI?5. Tribazës fosforo rûgðties pKa reikðmës yra 2,2; 7,2; 12,3. Paraðykite kokiosformos H 3PO 4molekulë bus pH 0, pH 4, pH 9 <strong>ir</strong> pH14. Koks t<strong>ir</strong>palo, sudarytoið 0,1 M NaH 2PO 4<strong>ir</strong> Na 2HPO 4pH?Literatûra:1. Rilbe H.(1996) pH and Buffer Theory – a new Approach, Wiley, New York.2. Reed R., Holmes D., Weyers J., Jones A. (2003) Practical skills in Biomolecularsciences, Pearson Educated Limited.
32 _________________________________ BIOCHEMIJOS LABORATORINIAI DARBAI4. Audiniø <strong>ir</strong> làsteliø ardymas<strong>ir</strong> frakcionavimasArdymas – vyksmas, kurio metu struktûriðkai suardoma làsteliø <strong>ir</strong>/ar audiniø struktûrøvientisumas. Suardæ làsteles <strong>ir</strong> audinius, toliau mes juos frakcionuojame, t. y. dalijameá daug atsk<strong>ir</strong>ø sudëtiniø daliø (frakcijø), norëdami iðgryninti pavyzdþius tyrimui. Làsteliøsuspensijos <strong>ir</strong> audiniai gali bûti frakcionuojami daugybe bûdø, atsiþvelgiant á dalis,kurias norime iðgryninti (pvz., mitochondrijas, plazmines membranas, DNR, RNR,t<strong>ir</strong>pius baltymus). Labai svarbu, kad kitas eksperimentatorius, norëdamas pakartotijûsø frakcionavimà, þinotø, kiek pradinës medþiagos jis/ji turëtø paimti. Dokumentuojantlàsteliø/ audiniø frakcionavimo eigà, reikia ávertinti gryninamos medþiagos kiekákiekvienoje frakcijoje. Tai vadinama iðeigos skaièiavimu. Skaièiuojant iðeigà, reikiaþinoti visø frakcijø tûrá <strong>ir</strong> gryninamos medþiagos koncentracijà frakcijoje:iðeiga = [frakcijos tûris ] × [gryninamos medþiagos kiekis frakcijoje].Dauguma audiniø <strong>ir</strong> làsteliø ardymo <strong>ir</strong> frakcionavimo metodø buvo sukurti arbabent pasiûlyti iki 1960 –1970 metø. Ðiuolaikiniai laimëjimai daþniausiai susijæ su ðiømetodø optimizavimu <strong>ir</strong> automatizavimu. Ðiandien yra sukurti nuodugnûs protokolaitam tikriems produktams iðsk<strong>ir</strong>ti <strong>ir</strong> iðgryninti ið áva<strong>ir</strong>iausios biologinës medþiagos:Current Protocols in Protein Science (CPPS, Coliegen et al, 1998), Current Protocolsin Molecular biology (CPMB, Ausubel F. M. et al, 1999). Ðie protokolai siûlo strategijàtam tikro objekto sudëtiniø daliø gryninimui. Pavyzdþiui, strategija sk<strong>ir</strong>sis <strong>ir</strong> priklausysnuo to, ar tikslinis produktas yra làstelëje, ar nelàstelinëje frakcijoje. Pastaruoju atvejutereikia atsk<strong>ir</strong>ti terpæ nuo làsteliø. Gali bûti, kad tikslinë dalis yra tam tikroje làstelësorganelëje. Tada tikslinga produktà sk<strong>ir</strong>ti ne ið viso làstelës lizato, o p<strong>ir</strong>miausia iðsk<strong>ir</strong>tiðià làstelës organeliø frakcijà. Protokolø pasiûlyta strategija turi bûti optimizuota:patikslinta frakcionavimo buferiø sudedamøjø daliø santykis <strong>ir</strong> koncentracijos.4.1. Làsteliø <strong>ir</strong> audiniø suardymasÐaltinis (mikroorganizmai, augalai, gyvûnai, augalø <strong>ir</strong> gyvûnø audiniai), ið kuriosk<strong>ir</strong>iamas produktas (baltymai, fermentai, nukleorûgðtys, lipidai, làstelës organelës),labai daþnai lemia ardymo bûdà.Visø ðiø objektø làstelës turi plazminæ membranà. Gyvûnø làstelëse – tai vienintelëuþtvara, sk<strong>ir</strong>ianti làstelës turiná nuo iðorinës aplinkos. Ði uþtvara gana lengvai suardoma.Bakterijø <strong>ir</strong> augalø plazminë membrana apsupta tv<strong>ir</strong>tos làstelës sienelës. Làsteliø sienelë– pagrindinë kliûtis ardant làsteles <strong>ir</strong> audinius. Bakterijø sienelës pagrindinë sudedamoji
1. 4. Saugaus Audiniø <strong>ir</strong> darbo làsteliø biochemijos ardymas <strong>ir</strong> laboratorijoje frakcionavimas pagrindinës __________________________________________taisyklës 33mikroorganizmai augalai gyvūnailąstelių suardymasląstelių suardymasląstelių suardymasfenolių pašalinimascentrifugavimasneląstelinis ekstraktasužląstelinisekstraktaspradinis frakcionavimas (nusodinimas druskomis, nusodinimas organiniais t<strong>ir</strong>pikliais)antrinis frakcionavimas (jonų mainų, hidrofobinė, giminingumo chromatografijos, kiti metodai)4.1 pav. Bendra ðaltinio frakcionavimo schemaiðorinë membranapeptidoglikanasperiplazminë ertmëplazminë membranaGram –Gram +peptidoglikanasplazminë membrana4.2 pav. Gramneigiamøjø <strong>ir</strong> gramteigiamøjø bakterijø sienelës sandaradalis – peptidoglikanas (4.2 pav.). Ðis peptidoglikano sluoksnis ypaè gramteigiamøjøbakterijø gali bûti suardomas veikiant fermentu lizocimu. Iðorinë gramneigiamøjøbakterijø membrana apsaugo bakterijà nuo lizocimo poveikio. Dël ðios prieþastiesgramneigiamosios bakterijos prieð veikiant su lizocimu inkubuojamos t<strong>ir</strong>pale,turinèiame EDTA (EDTA suriða Ca 2+ <strong>ir</strong> taip destabilizuoja iðorinæ membranà). Ypaètv<strong>ir</strong>tos grybø <strong>ir</strong> mieliø làsteliø sienelës, turinèios daugiau kaip 90% polisacharidø (pvz.,chitino, manano). Augalø làsteliø sienelës sudarytos ið daugelio celiuliozës sluoksniø,
34 _________________________________ BIOCHEMIJOS LABORATORINIAI DARBAIturinèiø lignino <strong>ir</strong> hemiceliuliozës intarpø. Aiðku, ðios iðorinës làsteliø uþtvaros suteikialàstelëms ne tik formà, bet <strong>ir</strong> atsparumà suardymui. Ypaè atsparios suardymui yraaugalø làstelës. Vadinasi, visada turime parinkti tinkamà làsteliø suardymo metodà <strong>ir</strong>homogenizacijos buferá.Suardæ làsteles <strong>ir</strong>/ar audinius gauname homogenatà. Homogenatas – làsteliø araudiniø ekstraktas, sudarytas ið áva<strong>ir</strong>aus dydþio molekuliø (baltymø, lipidø,nukleorûgðèiø <strong>ir</strong> t. t.), làstelës organeliø, nesuardytø làsteliø. Jei homogenizacijosmetodas <strong>ir</strong> homogenizacijos buferis parinkti teisingai – suardomos làsteliø sienelës <strong>ir</strong>plazminës membranos, o làstelës organeliø membranos lieka nepaþeistos. Suardþiuslàstelës organeliø membranas, paskleidþiamos medþiagos (pvz., fenoliai, peptidazës),kurios toliau ardo organeles <strong>ir</strong> biomolekules (4.1 pav.).Ardant audinius <strong>ir</strong> làsteles iðsisk<strong>ir</strong>ia daug ðilumos, todël skyrimo procedûros metubaltymai <strong>ir</strong> kitos biomolekulës gali denatûruoti <strong>ir</strong> sulipti (agreguotis). Siekiant to iðvengtihomogenizavimo procedûros atliekamos kaip galima greièiau <strong>ir</strong> esant 0–4 0 Ctemperatûrai, visi darbui reikalingi árankiai <strong>ir</strong> t<strong>ir</strong>palai prieð darbà turi bûti atðaldyti.4.2 Làsteliø <strong>ir</strong> audiniø suardymas,nenaudojant detergentø.Literatûroje áprasta làsteliø <strong>ir</strong> audiniø ardymo metodus sk<strong>ir</strong>ti á dvi grupes, t. y. metodus,kuriø metu naudojami detergentai <strong>ir</strong> metodus, kuriø metu detergentai nenaudojami.Nenaudojant detergentø làstelës sienelës <strong>ir</strong> membranos suardomos mechaniðkai, taippat fizikiniais <strong>ir</strong> cheminiais bûdais (þr. 4.1 lentelæ). Daþniausiai frakcionavimoprotokoluose abu ðie bûdai (mechaninis suardymas <strong>ir</strong> suardymas, naudojant detergentus)taikomi kartu, átraukiant detergentà á homogenizacijos buferio sudëtá.4.3. Làsteliø <strong>ir</strong> audiniø ardymas, naudojant detergentusNaudojant detergentus, làsteles <strong>ir</strong> audinius galima suardyti lengviau <strong>ir</strong> ðvelnesnëmissàlygomis. Detergentai – áva<strong>ir</strong>ios cheminës sudëties (þr. 4.5 pav.) junginiai, turintyshidrofobines <strong>ir</strong> hidrofilines sritis. Detergentai savo hidrofobine dalimi ásiterpia á baltymohidrofobinæ sritá ar membranos fosfolipidiná dvisluoksná <strong>ir</strong> suardo baltymo armembranos vientisumà. Detergentai t<strong>ir</strong>pina membranø lipidus <strong>ir</strong> baltymus, be to, suardolipidø–lipidø, baltymø–baltymø, baltymø–lipidø sàveikas. Panaðiai kaip lipidai,detergentai patys gali jungtis <strong>ir</strong> sudaryti miceles (4.5 pav.).Detergentai sk<strong>ir</strong>iami á joninius (Pav.4.5– B <strong>ir</strong> E), cviterjoninius (pav.4.5– C) <strong>ir</strong>nejoninius (pav.4.5–A <strong>ir</strong> D). Nejoniniai <strong>ir</strong> cviterjoniniai detergentai maþiau denatûruojabaltymus, negu joniniai detergentai.
1. 4. Saugaus Audiniø <strong>ir</strong> darbo làsteliø biochemijos ardymas <strong>ir</strong> laboratorijoje frakcionavimas pagrindinës __________________________________________taisyklës 354.1 lentelë. Audiniø <strong>ir</strong> làsteliø suardymo bûdaiSuardymobūdasPriemonėsSuardymo apibūdinimasMechaninis Lėkštelė <strong>ir</strong> grūstuvėlis Ląstelės ar audiniai (labai dažnaiaugalai) sutrinami, dažnai prieš taiatšaldžius skystu azotuUltragarsiniobūduAtšaldymas/sušildymasCheminisFermentinisVoringo (Waring)homogenizatoriusDaunco (Dounce)homogenizatoriusPotter–ElvehjemhomogenizatoriusFrench presasUltragarso dezintegratoriusŠaldiklis, kartais skystasledas/etanolisOrganiniai t<strong>ir</strong>pikliai. Dažniausiainaudojamas fenolis arba chloroformo<strong>ir</strong> metanolio mišiniaiChaotropiniai junginiai (kaliotiocianatas, kalio bromidas, ličiodijodsalicilatas <strong>ir</strong> kt).Chitinazės, pektinazės, lipazės,peptidazės, celiuliazės, lizocimasarba fermentų mišiniaiSukdamiesi peiliai susmulkina <strong>ir</strong>sutrina ląsteles <strong>ir</strong> audinius(4.4 – C pav.)Ląstelės ar audiniai, naudojant slėgį,sutrinami (4.4 – B pav.)Ląstelės ar audiniai, naudojant slėgį,sutrinami (4.4 – D pav.)Ląstelės ar audiniai, naudojant slėgį,perspaudžiant pro siaurą angą arplyšįAukšto dažnio garsas suardo ląsteliųsienelesSusidaro ledo kristalai <strong>ir</strong> kartotiniatšaldymo/sušildymo ciklai suardoląstelesT<strong>ir</strong>pinami membranų lipidai <strong>ir</strong>suardomos membranosDestabilizuojami membranų lipidai,membranos lengviau suardomosSuardžius fermentais ląstelės sienelęgaunami protoplastai, kurie lengvaihomogenizuojami4.4 Homogenizacijos t<strong>ir</strong>palo sudedamosios dalysÁ homogenizacijos t<strong>ir</strong>palo bûtinieji sandai – buferinis t<strong>ir</strong>palas <strong>ir</strong> druskos, lemianèioshomogenizacijos t<strong>ir</strong>palo osmosines savybes. Làstelës citozolio pH ≈7,5, taigihomogenizacijos t<strong>ir</strong>palo pH <strong>ir</strong>gi turëtø bûti silpnai ðarminis – pH 7–8 . Audiniams <strong>ir</strong>làstelëms homogenizuoti naudojami fosfato, TRIS, HEPES ar kiti organiniai buferiai,kuriø pH tarp 7 <strong>ir</strong> 8 (pK = 7– 8). Làsteliø ar audinio rûðis, audinio <strong>ir</strong> homogenizavimot<strong>ir</strong>palo santykis lemia buferio koncentracijà. Daþniausiai homogenizacijos t<strong>ir</strong>palobuferio koncentracija 20–50 mM.Làsteliø membranø <strong>ir</strong> sieneliø suardymui labai svarbios homogenizacijos t<strong>ir</strong>paloosmosinës savybës. Làsteliø <strong>ir</strong>imas palengvinamas, vartojant hipotoniná homogenizavimot<strong>ir</strong>palà. Tokiu bûdu làsteles iðbriksta, fizikinis ardomasis poveikis sustiprinamas.Daþniausiai homogenizacijos t<strong>ir</strong>paluose druskø koncentracija 50–150 mM. Jonineit<strong>ir</strong>palø jëgai palaikyti naudojamos NaCl, KCl, (NH 4) 2SO 4druskos. Sk<strong>ir</strong>iant þinduoliø
36 _________________________________ BIOCHEMIJOS LABORATORINIAI DARBAI4.3 pav. Audiniø <strong>ir</strong> làsteliø suardymasA B C D4.4 pav. Prietaisai audiniams <strong>ir</strong> làstelëms ardyti.A–ultragarsinis dezintegratorius; B– Daunco homogenizatorius; C– Voringo (Waring)homogenizatorius, D – Porterio homogenizatoriusmitochondrijas daþniausiai vartojami homogenizacijos t<strong>ir</strong>palai, turintys 0,15 M KClarba 0,25 – 0,3 M sacharozës, sk<strong>ir</strong>iant augalø mitochondrijas, naudojami t<strong>ir</strong>palai, turintys0,2–0,5 M sacharozës arba manitolio. Tokiø t<strong>ir</strong>palø osmotiðkumas panaðus á citozolio,taigi sk<strong>ir</strong>iamø mitochondrijø membrana nepaþeidþiama.Á homogenizacijos t<strong>ir</strong>palo sudëtá daþnai áeina <strong>ir</strong> kiti junginiai.• Metalus chelatuojantys junginiai. Daþniausiai homogenizacijos t<strong>ir</strong>paluose yraEDTA (suriða dvivalenèius metalø jonus, ypaè Ca 2+ <strong>ir</strong> Mg 2+ ) ar EGTA (atrankiaisuriða Ca 2+ ). Ðiø metalø jonai– proteolitiniø fermentø aktyvikliai. DaþniausiaiEGTA <strong>ir</strong> EDTA koncentracija homogenizavimo t<strong>ir</strong>pale 1 mM. Taigi EDTA arEGTA homogenizacijos t<strong>ir</strong>pale suriða metalø jonus, maþina oksidacines paþaidas<strong>ir</strong> baltymø agregacijà.• Gliukozë, sacharozë ar manitolis (250–500 mM). Stabilizuoja mitochondrijø<strong>ir</strong> lizosomø membranas, stabdo proteaziø iðsiskyrimà.
1. 4. Saugaus Audiniø <strong>ir</strong> darbo làsteliø biochemijos ardymas <strong>ir</strong> laboratorijoje frakcionavimas pagrindinës __________________________________________taisyklës 374.5 pav. Detergentai.Nonidet-NP-40 (A), natrio dodecilsulfatas (NDS) (B); sulfobetainas (SB12) (C);n-oktilgliukozidas (D); deoksicholatas (E)• Glicerolis (5–10%). Glicerolis stabilizuoja baltymus.• Detergentai (pvz., deoksicholatas, Triton X-100). Detergentai didina maþai t<strong>ir</strong>piøbaltymø t<strong>ir</strong>pumà, ardo membranines struktûras. Daþniausiai detergentøkoncentracija 0,1–1%.• Ligandai, metalø jonai (Mg 2+ , ATP, GTP). Daþniausiai naudojamos 1–10 mMligandø koncentracijos stabilizuoja gryninamus baltymus.• Peptidaziø slopikliai (inhibitoriai) (pvz., aprotininas, benzamidinas, PMSF,EDTA, EGTA). Proteaziø slopikliø sudëtis priklauso nuo ðaltinio, ið kurio sk<strong>ir</strong>iamasproduktas. Pavyzdþiui, frakcionuojant E.coli, proteazës neaktyvios, jei homogenizacijost<strong>ir</strong>pale yra 1 mM EDTA <strong>ir</strong> 1 mM PMSF, d<strong>ir</strong>bant su mielëmis frakcionavimot<strong>ir</strong>paluose daþniausiai be 1 mM EDTA <strong>ir</strong> 1mM PMSF yra <strong>ir</strong> 1 µg/mlleupeptino bei 1 µg/ml pepstatino A. Proteaziø inhibitoriai labai retai naudojamivienu metu.• Antioksidantai (redukuojantys junginiai). Tai ditiotreitolas (DTT),β- merkaptoetanolis (β-ME), askorbo rûgðtis <strong>ir</strong> kt. Daþniausiai homogenizacijost<strong>ir</strong>pale ðiø junginiø koncentracija 1–10 mM (0,05%). Antioksidantai maþinabaltymø sufhidriliniø grupiø oksidacijà, kartu didina jø stabilumà.• Jauèio serumo albuminas (BSA). Ðio baltymo daþniausiai dedama áhomogenizacijos t<strong>ir</strong>palus, sk<strong>ir</strong>iant mitochondrijas. BSA suriða riebalø rûgðtis
38 _________________________________ BIOCHEMIJOS LABORATORINIAI DARBAI(BSA funkcija kraujo plazmoje), kurios susidaro fosfolipazëms veikiantfosfolipidus, taip pat fenolius, kurie susidaro su<strong>ir</strong>us vakuolëms. Esant homogenizacijost<strong>ir</strong>pale BSA, maþëja frakcionuojamø mitochondrijø baltymø paþaidos(proteolitiniai fermentai naudoja ðá alternatyvø substratà, kurio koncentracijadaug didesnë nei kitø baltymø).• Polivinilp<strong>ir</strong>olidonas. Daþniausiai ðio polimero dedama á homogenizacijost<strong>ir</strong>palus, ardant augalø làsteles arba audinius. Polivinilp<strong>ir</strong>olidonas suriða fenolius.Nëra vieno metodo, tinkamo visoms làstelëms <strong>ir</strong>/ar audiniams homogenizuoti,nëra buferio, kurio sudëtis tinkama visoms làstelëms <strong>ir</strong>/ar audiniams homogenizuoti.Frakcionuojant làsteles <strong>ir</strong> audinius daþnai reikia optimizuoti homogenizacijos t<strong>ir</strong>palosudëtiniø daliø santykius. Kaip pradinis buferis, pvz., gali bûti panaudotas buferis A(50 mM TRIS-HCl pH 7,5, 100 mM NaCl, 1 mM DTT, 5% glicerolis).4.5. Làsteliø <strong>ir</strong>/ar audiniø frakcionavimo bûdai.Centrifugavimas.Gravitacijos jëgø veikiamos didelës dalelës nusëda. Nusëdimo greitis priklauso nuodaleliø parametrø (masës, dydþio, tankio), taip pat t<strong>ir</strong>palo, kuriame suspenduotosdalelës, klampumo. Centrifugos – prietaisai, kurie, sukdami dalelæ apie centrinæ aðá,sukuria didesnæ iðcentrinæ jëgà nei gravitacinë þemës jëga, tuo labai pagreitinamasdaleliø nusëdimas.Centrifugavimo metu atsk<strong>ir</strong>iamos daleles, kuriø sk<strong>ir</strong>iasi masë, dydis <strong>ir</strong> tankis, nesjø nusëdimo greitis proporcingas iðcentrinei jëgai (4.6 pav.). Frakcionavimà (nuosëdos/nuopylos) lemia:• daleliø dydis, forma <strong>ir</strong> tankis. Juo didesni dalelës masë, tankis, tûris, juo ji nusëdagreièiau;• t<strong>ir</strong>palo klampumas. Juo didesnis t<strong>ir</strong>palo, kuriame suspenduota dalelë, tankis,juo lëèiau ði nusëda;• centrifugavimo jëga. Juo didesnë centrifugavimo jëga (w 2 r), juo greièiau dalelënusëda.ωr = 0F fF bF c4.6 pav. Jëgos, veikianèios dalelæcentrifugavimo metu:• F c= m w 2 r (iðcentrinë jëga).• F f= –f v (trinties jëga).• F b= – m ow 2 r (prieðinimosi jëga). Èia m– sedimentuojanèios dalelës masë, w –kampinis greitis, r – dalelës nuotolis ikisukimosi aðies; m o– dalelës iðstumtot<strong>ir</strong>palo masë, f– trinties koeficientas, v –dalelës sedimentacijos greitis
1. 4. Saugaus Audiniø <strong>ir</strong> darbo làsteliø biochemijos ardymas <strong>ir</strong> laboratorijoje frakcionavimas pagrindinës __________________________________________taisyklës 394.7 pav. Làsteliø homogenato centrifugavimas.Po centrifugavimo daþniausiai yra dvi frakcijas – nuopylos (supernatantas) <strong>ir</strong> nuosëdos4.2 lentelë. Centrifugø rûðys <strong>ir</strong> jø techniniai duomenysCentrifugų rūšysTechniniai duomenys NedideliogreičioDidelio greičio UltracentrifugaGreitis RPM (10 3 ) 2–6 18–30 35– 120Didžiausias RCF (10 3 ) 8 100 700Šaldymas Tam tikros Taip TaipVakuumo sistema neturi Turi TuriTaikymas frakcionuoti:Ląsteles Taip Taip TaipBranduolius Taip Taip TaipLąstelės organeles Tam tikras Taip TaipMembranos frakcijas Ne Tam tikras TaipRibosomas/polisomas Ne Tam tikras TaipMakromolekules Ne Tam tikras TaipDalelës nusëdimo (sedimentavimo) greitis iðcentrinës jëgos vienetui vadinamasvsedimentacijos koeficientu (s). s = . Jai dalelës masë iðreikðta g (gramais), o2w riðcentrinë jëga g/s (gramai/sekundës), makromolekuliø sedimentacijos koeficientokitimo intervalas 10 –13 –10 –9 sekundþiø. Skaièius 10 –13 sekundþiø vadinamas Svedbergokonstanta (S) arba tiesiog svedbergu. Pavyzdþiui, hemoglobino sedimentacijoskoeficientas yra 4×10 –13 sekundþiø arba 4S, prokariotø rRNR sedimentacijoskoeficientas 16S arba 16×10 –13 sekundþiø. Sedimentacijos koeficientas S didëja,didëjant dalelës masei, taèiau priklauso <strong>ir</strong> nuo dalelës dydþio bei formos.Laboratoriniø darbø metu centrifugos– nepakeièiami árankiai frakcionuojant làsteliø<strong>ir</strong> audiniø ekstraktus. Centrifugø techniniai duomenys labai sk<strong>ir</strong>tingi. Jø techniniaiduomenys pateikti 4.2 lentelëje.Apraðant frakcionavimà centrifuguojant, reikia nurodyti, kokiu pagreièiu (pagreitisþymimas RCF arba g) buvo veikiama dalelë centrifugavimo metu. RCF rodo, kiekkartø didesnë nei gravitacinë þemës jëga (g = 9,8 m s –2 ) buvo veikiama dalelëcentrifugavimo metu (RCF = × . g). Ði jëga priklauso nuo :
40 _________________________________ BIOCHEMIJOS LABORATORINIAI DARBAI4.8 pav. Centrifugos, turinèios nustatyto kampo rotoriø, schema• rotoriaus apsisukimø skaièiaus per minutæ (þym. RPM arba n)• apsisukimo spindulio R (pateikiami centrifugos techniniame pase).Kartais frakcionavimas apraðomas, nurodant centrifugos apsisukimø per minutæskaièiø. Centrifugø labai sk<strong>ir</strong>iasi techniniai duomenys, rotoriaus spindulys, todël ðisdydis nerodo, kokia jëga dalelë buvo veikiama centrifugavimo metu. Norint gauti atsikartojanèiusfrakcionavimo duomenis, reikia þinoti, kokiu pagreièiu (RCF = × . g)buvo veikiama dalelë centrifugavimo metu. RCF <strong>ir</strong> RPM lengva perskaièiuoti, þinantcentrifugos rotoriaus spindulá. Ðiuolaikinës centrifugos automatiðkai atlieka ðáperskaièiavimà. Taèiau turint senesnio modelio prietaisà, ðiuos skaièiavimus nesunkuatlikti patiems:RCF = 1,118 × 10 -5 × . R × n 2 , arba RCF = 1,118 × 10 -5 × R × (RPM) 2 ,RCFRCFtaigi RPM = 945,7 .51,118 10 − =× × R RÈia R – centrifugos rotoriaus spindulys (cm), n – centrifugos apsisukimø skaièius perminutæ (RPM).Suspenduotos centrifuginiuose mëgintuveliuose dalelës dedamos á centrifugosrotoriø. Atsiþvelgiant á centrifugos rotoriuje esanèiø mëgintuvëliø padëtá, rotoriaisk<strong>ir</strong>iami á vertikalius, nustatyto kampo <strong>ir</strong> nenustatyto kampo (swing-out) rotorius.Daþniausiai naudojamos centrifugos, turinèios nustatyto kampo <strong>ir</strong> nenustatyto kampo(swing-out) rotorius (4.8, 4.9 pav.).Atkreipkite dëmesá (4.6 pav.), kad, centrifuguojant nustatyto kampo rotoriumi,nuosëdos susidaro ant centrifuginio mëgintuvëlio sienelës, tuo tarpu po centrifugavimonenustatyto kampo rotoriumi, nuosëdos surenkamos centrifuginio mëgintuvëlio dugne.
1. 4. Saugaus Audiniø <strong>ir</strong> darbo làsteliø biochemijos ardymas <strong>ir</strong> laboratorijoje frakcionavimas pagrindinës __________________________________________taisyklës 414.9 pav. Nenustatyto kampo (swing-arm) rotorius4.5.1. Diferencinis centrifugavimasDalelës frakcionuojamos, atsiþvelgiant á dydá <strong>ir</strong> tanká. Keièiant centrifugos apsisukimøskaièiø, rotoriaus spindulá, terpës tanká, galima iðsk<strong>ir</strong>ti atsk<strong>ir</strong>as làstelës organeles.4.10 pav. Diferencinio centrifugavimo bûdu galima frakcionuoti làstelës organeles
42 _________________________________ BIOCHEMIJOS LABORATORINIAI DARBAI4.5.2. Centrifugavimas tankio gradientuSuspendavimo terpës klampumas lemia dalelës sedimentavimo greitá (4.6 pav.).Gradientas formuojamas ið CsCl, sacharozës, Ficol, Percol <strong>ir</strong> kitø medþiagø. Gradientàformuojanèios medþiagos tankis turi bûti maþesnis uþ sedimentuojanèiø daleliø tanká.Gradientas gali bûti tolygus arba laiptinis. Tolygus gradientas savaime susidaro,centrifuguojant klampø t<strong>ir</strong>palà arba specialiai supylant komponentus. Maþiausias t<strong>ir</strong>palotankis mëgintuvëlio v<strong>ir</strong>ðuje, didþiausias –mëginyscentrifugavmaslëtai sedimentuojantigreitai sedimentuojanti4.11. Centrifugavimas tankiogradientumëgintuvëlio dugne. Laiptinis gradientassudaromas atsargiai vienas ant kitouþlaðinant sk<strong>ir</strong>tingo tankio t<strong>ir</strong>palus.Kartais taikoma vieno laiptelio tankiouþtvara vienos rûðies dalelëms atsk<strong>ir</strong>ti.Centrifuguojant tankio gradientu gaunameatsk<strong>ir</strong>as zonas (4.11 pav.).Zoninis centrifûgavimas. Centrifuguojama daþniausiai maþu (5–20 %) sacharozësar CsCl tankio gradientu. Mëginys atsargiai uþlaðinamas ant suformuoto gradiento.Vienodo dydþio <strong>ir</strong> formos dalelës po centrifugavimo sudaro zonà, jos sustoja, kai yrapusiausv<strong>ir</strong>os su terpe. Po centrifugavimo susidaro daug juostø, turinèiø sk<strong>ir</strong>tingos masës<strong>ir</strong> dydþio daleles. Po centrifugavimo mëgintuvëlio dugnas praduriamas <strong>ir</strong> atsargiaisurenkamos frakcijos.Vienodo tankio (izopikninis) centrifugavimas. Centrifuguojama dideliamesacharozës arba CsCl tankio gradiente (20–70 %). Frakcionuojama atsiþvelgiant á dalelëstanká (daleliø masë <strong>ir</strong> forma atskyrimui neturi átakos). Mëginys atsargiai uþlaðinamasant suformuoto gradiento. To paties tankio (buoyant density) dalelës po centrifugavimosudaro zonà, dalelës „sustoja“, kai yra pusiausv<strong>ir</strong>os su gradientu. Po centrifugavimosusidaro daug juostø, turinèiø sk<strong>ir</strong>tingo tankio daleliø. Po centrifugavimo mëgintuvëliodugnas praduriamas <strong>ir</strong> atsargiai surenkamos frakcijos.Centrifuginiai mëgintuvëliaiCentrifuguojant frakcionuojama medþiaga bûna suspenduota centrifuginiuosemëgintuveliuose. Labai svarbios centrifuginiø mëgintuvëliø savybës – mëgintuvëliøtalpa <strong>ir</strong> medþiaga, ið kurios pagaminti mëgintuvëliai. Mëgintuvëliø talpa lemia didþiausiàt<strong>ir</strong>palo tûrá, kurá galima mëgintuvëliuose centrifuguoti. Medþiaga, ið kurios pagamintimëgintuvëliai, riboja centrifugavimo greitá <strong>ir</strong> taip pat centrifuguojamos medþiagoscheminæ sudëtá. Yra keletas taisykliø, kurias þinant garantuojamas saugus darbas.
1. 4. Saugaus Audiniø <strong>ir</strong> darbo làsteliø biochemijos ardymas <strong>ir</strong> laboratorijoje frakcionavimas pagrindinës __________________________________________taisyklës 43Paprasto stiklo (Pyrex) mëgintuvëlai nerekomenduojami centrifuguojant didesniaisnei 2,000 × g pagreièiais. Corex stikliniai mëgintuvëliai tinkami naudoti iki 15,000–18,000 × g. Praktiðkesni, nors <strong>ir</strong> maþiau inertiðki, yra plastikiniai (polipropileno,polist<strong>ir</strong>eno) <strong>ir</strong> nitroceliulioziniai mëgintuvëliai. Polipropileniniuose mëgintuvëliuosegalima saugiai centrifuguoti iki 20,000 × g. Dauguma ultracentrifuginiø mëgintuvëliøpagaminti ið nitroceliuliozës. Jie nelabai brangûs <strong>ir</strong> gamintojai ðiuos mëgintuvëliussiûlo naudoti kaip vienkartinius. Lentelëje XX pateikti duomenys apie plastikiniømëgintuvëliø tinkamumà centrifuguoti tam tikros cheminës sudëties t<strong>ir</strong>palus.Saugaus darbo centrifugomis pagrindinës taisyklës:• visi centrifugavimai didelio greièio centrifuga turi bûti paþymëti centrifugosnaudojimo þurnale. Prieð pradëdami darbà perþiûrëkite þurnalo áraðus <strong>ir</strong>ásitikinkite, kad centrifugavimas duota centrifuga yra saugus – nepaþeistasrotorius, nëra pastabø apie gedimus;• pradëdami centrifuguoti neþinoma centrifuga, pasitarkite su laborantu ardëstytoju;• centrifugà ájunkite tik uþdaræ centrifugos dangtá;• centrifuguoti galima tik taisyklingai subalansavus centrifuginius mëgintuvëlius.Daþniausiai tokio pat svorio centrifuginiai mëgintuvëliai dedami rotoriuje vienasprieð kità . Bûkite labai atidûs : 0,01g neatitiktis centrifuguojant 100000 × gpagreièiu ekvivalentiðka 1 kg neatitikèiai;• centrifuguodami sulaukite, kol centrifuga pasieks nustatytà greitá;• po centrifugavimo iðimkite rotoriø. Iðvalykite.4.6. Nelàstelinio ekstrakto frakcionavimo metodaiIlgà laikà vienintelis bûdas iðfrakcionuoti nelàstelinius ekstraktus buvo nusodintiatsk<strong>ir</strong>us ekstrakto komponentus. Ðiandien nusodinimas daþniausiai taikomas norintsukoncentruoti labai praskiestus vandeninius baltymø t<strong>ir</strong>palus.MëginysNuosëdos+CentrifugavimasNuosëdos+NusodinimoveiksnysT<strong>ir</strong>pusekstraktasNuopylos
44 _________________________________ BIOCHEMIJOS LABORATORINIAI DARBAI4.12 pav. Baltymø nusodinimasorganiniais t<strong>ir</strong>pikliais4.13 pav. Baltymø nusodinimas (NH 4) 2SO 4Veiksniai, kuriø poveikyje atsk<strong>ir</strong>os ekstrakto sudëtinës dalys tampa maþiau t<strong>ir</strong>pios<strong>ir</strong> nusodinamos yra labai áva<strong>ir</strong>ûs: atðaldymas, ekstrakto pH <strong>ir</strong> joninës jëgos keitimas,organiniai t<strong>ir</strong>pikliai, imunoprecipitacija <strong>ir</strong> kt. Daþniausiai baltymai nusodinamiorganiniais t<strong>ir</strong>pikliais (etanoliu, metanoliu, acetonu), druskomis (daþniausiai amoniosulfatu) <strong>ir</strong> trichloracto rûgðtimi.Mechanizmai, kurie lemia baltymø sulipimà (agregacijà) vandeniniuose organiniøt<strong>ir</strong>pikliø t<strong>ir</strong>paluose labai áva<strong>ir</strong>ûs. Didþiausià átakà turi t<strong>ir</strong>palo dielektrinës konstantossumaþëjimas.Á nelàsteliná t<strong>ir</strong>palà ápylus organinio t<strong>ir</strong>piklio, sumaþëja t<strong>ir</strong>palo dielektrinë konstanta(H 2O dielektrinë konstanta – 78.5; metanolio –32.6; etanolio –24.3). Juo maþesnët<strong>ir</strong>palo dielektrinë konstanta, juo lengviau sk<strong>ir</strong>tingai ákrautos molekulës sàveikaujaviena su kita. Tokiu bûdu molekulës sulimpa <strong>ir</strong> nusëda.Su druskomis (pvz., (NH 4) 2SO 4) baltymø nusodinimas vyksta pagal dumechanizmus. P<strong>ir</strong>miausia, druskos anijonai baltymo molekulæ daro maþiau t<strong>ir</strong>pià dëlsàveikos su teigiamai ákrautomis aminorûgðèiø liekanomis. Ði sàveika daugveiksmingesnë, kai pH
1. 4. Saugaus Audiniø <strong>ir</strong> darbo làsteliø biochemijos ardymas <strong>ir</strong> laboratorijoje frakcionavimas pagrindinës __________________________________________taisyklës 45Darbo eiga:1. Á baltymo t<strong>ir</strong>palo ápilti 1/10 tûrio 100% ÒCA.2. Inkubuoti leduose 30 min. arba 15 min., esant –20 o C temperatûrai.3. 5 min. centrifuguoti didþiausiu greièiu ependorfiniuose megintuvëliuose stalocentrifuga4. .Pipete paðalinti nuopylas (supernatant¹).5. Gautas nuosëdas galima:6. Iðt<strong>ir</strong>pinti 50 – 100 µl 0,1 N NaOH.7. Keletà kartø praplauti nuosëdas 1ml etanolis–eteris miðiniu (1:1 v/v) , norintvisiðkai paðalinti rûgðtá, truputá padþiovinti <strong>ir</strong> iðt<strong>ir</strong>pinti norimame buferyje.Trichloracto rûgðtis (TCA, CCl 3COOH M r=163.39) laikoma tamsiame indetraukos sàlygomis. Ruoðiant 100 ml 100% (w/w) t<strong>ir</strong>palo reikia 68,78 gramusrûgðties iðt<strong>ir</strong>pinti 31,22 ml distiliuoto vandens.Remiantis Bollag, D.M., Edelstein, S.J. (1991). Protein Methods. Wiley-Liss, Inc.,New York, p.72 -3.4.6.2. Baltymø nusodinimas amonio sulfatuMetodas taikomas daugiau kaip 130 metø. Anksèiau jis buvo vienas ið plaèiausiainaudojamø baltymø frakcionavimo bûdø. Ðiuo metu metodas vertinamas kaip labaipigus baltymø nusodinimo bûdas. Nusodinant baltymus gaunamas <strong>ir</strong> gryninimo poveikis,t. y. nusodinant baltymus ið làsteliø ar audiniø ekstraktø amonio sulfatu galima tikëtisgauti 2–10 kartø daugiau ásotintus tiksliniu baltymu ekstraktus.Amonio sulfato koncentracija t<strong>ir</strong>pale reiðkiama sotumo laipsniais arba sotumoprocentais. Pavyzdþiui, 0,4 <strong>ir</strong> 0,6 atitinkamai 40% <strong>ir</strong> 60% yra santykiniai dydþiai,laikant kad 1,0 <strong>ir</strong> 100% atitinka visiðkà sotumà.(NH 4) 2SO 4, M m=132,1 g/M, soèiojo t<strong>ir</strong>palo koncentracija 4,1M (707 g l –1 ).(NH 4) 2SO 4t<strong>ir</strong>pumas beveik nesikeièia, keièiant temperatûrà nuo 0 iki 30 0 C.Nors literatûroje galima rasti duomenø apie amonio sulfato koncentracijas, kuriomsesant baltymai iðkrenta nuosëdomis, daþniausiai kiekvienu konkreèiu atveju „bandymø<strong>ir</strong> klaidø“ metodu yra parenkamos sàlygos.4.3 lentelëje parodyti amonio sulfato kiekiai, reikalingi pasiekti 0–100% sotumus.Amonio sulfato kieká, reikalingà pasiekti atitinkamà sotumo laipsná, galimaapskaièiuoti ið formulës0,515× V × (Pr −Pr )x=,1 − (0,272×Pr )1 1 22kur x –amonio sulfato kiekis (g), reikalingas norint pasiekti Pr 2sotumo laipsná, V 1–pradinio t<strong>ir</strong>palo tûris, Pr 1– pradinio t<strong>ir</strong>palo sotumo amonio sulfatu laipsnis, Pr 2–norimo t<strong>ir</strong>palo sotumo laipsnis.
46 _________________________________ BIOCHEMIJOS LABORATORINIAI DARBAI4.3 lentelë. (NH 4) 2SO 4kiekis (g l -1 ) reikalingas norint pasiekti norimà sotumà(procentais)Galutinė koncentracija (%) 20 30 40 50 60 70 80 90 100→Pridėto amonio sulfato kiekis (g l -1 )Pradinė koncentracija ↓0 107 166 229 295 366 442 523 611 70710 54 111 171 236 305 379 458 545 63620 – 56 115 177 244 316 392 476 56530 – 57 119 184 253 328 408 49540 – 59 122 190 262 340 42450 – 61 127 197 272 35360 – 63 131 204 28370 – 66 136 21280 – 68 14190 – 71Naudojant sotøjá amonio sulfato t<strong>ir</strong>palà reikalingas druskos t<strong>ir</strong>palo kiekisapskaièiuojamas ið formulës:V 1× (Pr2−Pr 1)V2=,1−Pr2kur V 2– reikalingas soèiojo amonio sulfato t<strong>ir</strong>palo tûris (ml), V 1– pradinis t<strong>ir</strong>palotûris (ml), Pr 1– pradinis sotumo laipsnis, Pr 2– galutinis sotumo laipsnis. Èia Pr 1<strong>ir</strong> Pr 2sotumo laipsnis iðreiðkiamas trupmeniniu sotumo laipsniu – S f= 0,4 = 40%Darbo eiga:1. Þinyne ar eksperimentiðkai nustatyti kurio sotumo laipsnio (NH 4) 2SO 4nusodina tiksliná baltymà.2. Á baltymo t<strong>ir</strong>palà maþais kiekiais, maiðant dëti reikiamà kieká (NH 4) 2SO 4.3. Nusodinimas pradedamas nuo didþiausios (NH 4) 2SO 4koncentracijos, kuriaiesant tikslinis baltymas dar neiðsûdomas.4. Inkubuoti 30 min. nestipriai maiðant, esant reikiamai temperatûrai.5. Nuosëdas atsk<strong>ir</strong>ti centrifuguojant.6. Jei nusodinimas laiptinis – á nuopilas dëti kità porcijà (NH 4) 2SO 4<strong>ir</strong> pakartoti3–4 sk.procedûras.7. Nupilti nuopilas.8. Greitai centrifuguojant mëgintuvëlio dugne surinkti nuopilø likuèius <strong>ir</strong> paðalintipipete.9. Tiksliná baltymà iðt<strong>ir</strong>pinti reikiamame buferyje.Pastabos• Daþniausiai, kai amonio sulfato koncentracija maþesnë kaip 1 M (25% soèiojo)nusëda tik labai didelës dalelës, sulipæ arba labai dideli baltymai. Nusodinant
1. 4. Saugaus Audiniø <strong>ir</strong> darbo làsteliø biochemijos ardymas <strong>ir</strong> laboratorijoje frakcionavimas pagrindinës __________________________________________taisyklës 47laiptiðkai daþniausiai naudojama ði amonio sulfato koncentracijø serija : 0 M; 1 M(25% soèiojo); 1,6M (40% soèiojo); 2,4M (60% soèiojo); 3,2M (80% soèiojo).• Á baltymo t<strong>ir</strong>palà galima pridëti kristalinio amonio sulfato arba pilti soèiojodruskos t<strong>ir</strong>palo. P<strong>ir</strong>masis bûdas patogesnis, kai reikia pridëti didelius kiekiusamonio sulfato <strong>ir</strong> nenorima labai padidinti pavyzdþio tûrio. Visais atvejais druskapridedama nepertraukiant maiðymo, kad nesusidarytø sritys, turinèios didelævietinæ druskos koncentracijà.• Juo didesnë t<strong>ir</strong>palo temperatûra, juo didesnë tikimybë baltymams denatûruoti.Daþniausiai iðsûdymas atliekamas 0 0 C , taèiau (NH 4) 2SO 4stabilizuoja baltymus<strong>ir</strong> stabdo bakterijø augimà, todël kai kada baltymø iðsûdymas atliekamas 25 0 C.• Atsk<strong>ir</strong>iant susidariusias nuosëdas nuo likusio t<strong>ir</strong>palo daþniausiai uþtenka 10min 6000 × g, 4 0 C centrifugavimo. Iðsûdant baltymus ið daugiau praskiestøt<strong>ir</strong>palø <strong>ir</strong> naudojant didesnius druskos kiekius, kartais tenka centrifuguoti didesniugreièiu <strong>ir</strong> ilgesná laikà.Kodël amonio sulfatas, o ne NaCl?• Iðsûdymo poveikis priklauso ne tik nuo druskos koncentracijos, bet <strong>ir</strong> nuo t<strong>ir</strong>palojoninës jëgos. Dël ðios prieþasties, esant vienodai molinei koncentracijai,polivalentinai anijonai veiksmingesni nei monovalentiniai, o polivalentiniaikatijonai trukdo iðsûdymui. Taigi optimalus druskos derinys – polivalentinisanijonas su monovalentiniais katijonais.• Maþa amonio sulfato kaina.• Iðsûdymo poveikis maþëja eilëje : Citratas> Sulfatas> Fosfatas> Chloridas>Nitratas> Tiocianatas. Ðia tvarka maþëja druskø stabilizacinis poveikis <strong>ir</strong> didëjachaotropinës druskø savybës. Tuo bûdu iðsûdyti tinkamiausios druskos – citratai<strong>ir</strong> sulfatai.• Sulfatai yra t<strong>ir</strong>pesni (pvz., kambario temperatûros sàlygomis amonio citrato <strong>ir</strong>amonio sulfato sotieji t<strong>ir</strong>palai 2,5 Ì <strong>ir</strong> 4,1 Ì atitinkamai).• NaCl t<strong>ir</strong>pumas maþas.• Stabilizuojantis poveikis, kurá druska (esant koncentracijai, didesnei kaip 0,5M)daro daugumai baltymø.Sunkumai nusodinant baltymus amonio sulfatu.1. Amonio jonai trukdo tiksliai ávertinant nuosëdose baltymo kieká Bredfordo,Louri metodais.2. Iðsûdomi ne tik baltymai, bet <strong>ir</strong> kitos medþiagos, pvz., detergentai. Tween 20 <strong>ir</strong>Triton X100 pradeda nusësti, kai amonio sulfato koncentracija ðiek tiek didesnëkaip 1 M. Susidariusiø agregatø tankis maþesnis nei druskos t<strong>ir</strong>palo, todëlcentrifuguojant ðie agregatai “pakyla”, kartu nusineðdami <strong>ir</strong> dalá baltymø.
48 _________________________________ BIOCHEMIJOS LABORATORINIAI DARBAI3. Baltymø, kuriø veikimui reikalingas Ca 2+ , negalima nusodinti amonio sulfatu,nes kalcio sulfatas net<strong>ir</strong>pus.4.6.3. Baltymø nusodinimas etanoliuMetodas daþnai taikomas sukoncentruoti labai praskiestus vandeninius baltymøt<strong>ir</strong>aplus.1. Dëti 9 tûrius atðaldyto 100 % etanolio á 1 tûrá praskiesto baltymo t<strong>ir</strong>palo.2. Sumaiðyti t<strong>ir</strong>palus.3. Palikti maþiausiai 60 min. –20°C (daþniausiai tokie t<strong>ir</strong>palai paliekami per naktá).4. Centrifuguoti 15 min. 4°C didþiausiu pagreièiu (≥15000 g)5. Paðalinti nuopilas, nusausinti nuosëdas (apvertus mëgintuvëlá ant filtravimopopieriaus).6. Nuosëdas perplauti 70 % atðaldytu etanoliu (-20°C). Sumaiðyti, 5 min.centrifuguoti didþiausiu pagreièiu (15 000 g).7. Nuosëdas padþiovinti kambario temperatûroje arba speed-vac centrifugoje.8. Iðt<strong>ir</strong>pinti nuosëdas norimos sudëties buferyje.4.6.4. Baltymø nusodinimas parûgðtintu acetonu <strong>ir</strong> metanoliu:1. Paruoðti parûgðtintà acetonà: sumaiðyti 120 ml acetono <strong>ir</strong> 10 µl HCl (HClkoncentracija 1 mM).2. Paruoðti nusodinimo reagentà: sumaiðyti lygius tûrius (1:1, v/v) parûgðtintoacetono <strong>ir</strong> metanolio. Laikyti –20°C.3. Sumaiðyti 1 tûrá praskiesto baltyminio t<strong>ir</strong>palo su 4 tûriais nusodinimo reagento.4. Palikti -20°C bent valandà. Galima laikyti per naktá.5. Centrifuguoti 4°C 15 min. didþiausiu pagreièiu (≥15000 g).6. Atsargiai nupilti nuopilas. Nusausinti mëgintuvëlá ant filtravimo popieriaus.7. Nuosëdas padþiovinti speed-vac centrifugoje arba kambario temperatûrossàlygomis.8. Iðt<strong>ir</strong>pinti nuosëdas norimos sudëties buferyje.4.6.5. DializëPo nusodinimo amonio sulfatu <strong>ir</strong> iðt<strong>ir</strong>pinus pas<strong>ir</strong>inktame buferyje ið t<strong>ir</strong>palø turi bûtipaðalinta druska. Vienas ið bûdø tai padaryti – dializuoti t<strong>ir</strong>palà prieð buferá, kuriodruskø koncentracija maþa. Dializuojant t<strong>ir</strong>palus galima :• sumaþinti druskos koncentracijà t<strong>ir</strong>pale;• gauti kitos sudëties baltymø t<strong>ir</strong>palà;• ið dializuojamø t<strong>ir</strong>palø paðalinti detergentus, polisacharidus.
1. 4. Saugaus Audiniø <strong>ir</strong> darbo làsteliø biochemijos ardymas <strong>ir</strong> laboratorijoje frakcionavimas pagrindinës __________________________________________taisyklës 494.14 pav. Dializës schemaKoncentruotas baltymø t<strong>ir</strong>palas dializës maiðelyje (dializës maiðelio membranosporos neleidþia baltymams pasklisti t<strong>ir</strong>pale) dedamas á didelá tûrá buferio, kurio druskøkoncentracija maþa <strong>ir</strong> maiðant laikomas ilgà laikà (16 – 24 val) (4.12 pav.). Per ðá laikàt<strong>ir</strong>palas dializës maiðelyje susilygsvarina su buferiu – druskos koncentracija t<strong>ir</strong>palesumaþëja. Kai ðis pusiausv<strong>ir</strong>inimo procesas pakartojamas keletà kartø – pakeièiantpusiasv<strong>ir</strong>inimo buferá – pasiekiamas dializës tikslas – sumaþinama druskos konentracijabaltymo t<strong>ir</strong>pale.Kartais dializës metu dalis baltymø iðkrenta nuosëdomis. Dël ðios prieþastiesdializuotas t<strong>ir</strong>palas daþniausiai centrifuguojamas, paðalinamos nuosëdos, kad josnetrukdytø vëlesnëmis frakcionavimo stadijomis.Pastabos• Dializës maiðelio parinkimas. Dializës maiðeliai – tai cilindriðkos porëtosmembranos. Ðiø porø dydis lemia molekuliø, kurios pereina membranà dydá.Daþniausiai gaminamos membranos, kuriø poros praleidþia molekules,maþesnëms uþ 5 kDa, 10 kDa, 30 kDa, 100 kDa. Taigi, dializei parinkusmembranà pralaidþià molekulëms maþesnëms uþ 30 kDa, visos nedidelësmolekulës, tame tarpe <strong>ir</strong> maþi baltymai, pasklis dializës buferyje – maiðelyje liksbaltymai <strong>ir</strong> molekulës, kuriø dydis didesnis kaip 30 kDa.• Tinkamo dydþio dializës maiðelio parinkimas. Maiðelis parenkamas tokio dydþio,kad maþdaug treèdalis maiðelio tûrio liktø nepripildyta dializuojamo t<strong>ir</strong>palo.Dializuojant didelës druskos koncentracijos t<strong>ir</strong>palus <strong>ir</strong> naudojant nedidelësjoninës jëgos pusiausv<strong>ir</strong>inimo t<strong>ir</strong>palus, esant netinkamam maiðelio dydþiui,osmosinës jëgos gali suplëðyti maiðelá.
50 _________________________________ BIOCHEMIJOS LABORATORINIAI DARBAI•. Maiðelio vienas galas uþspaudþiamas spaustuku (arba uþriðamas siûlu), atsargiaipripildomas dializuojamo t<strong>ir</strong>palo (vengiama áleisti oro burbuliukø), spaustukuuþdaromas kitas maiðelio galas (arba uþriðamas siûlu) <strong>ir</strong> dializës maiðelisdedamas á pusiausv<strong>ir</strong>inimo buferá.•. Pusiausv<strong>ir</strong>inamojo buferio tûris turi bûti bent 100 kartø didesnis uþ dializuojamot<strong>ir</strong>palo tûrá. Dializë daþniausiai atliekama 4 0 C, taigi buferis prieð darbà <strong>ir</strong>gi turibûti atðaldytas. Lëtai maiðant dializë atliekama 12 – 16 val. keletà kartø pakeièiantbuferá.• Po dializës maiðelis atsargiai iðimamas, atidarius vienà maiðelio galà atsargiaiturinys perkeliamas á centrifuginá mëgintuvëlá.• Parduodami dvejopi dializës maiðeliai: sausi ar ádëti á t<strong>ir</strong>palà, dþniausiai 25 %etanolio. Sausos membranos prieð darbà turi bûti paruoðtos.Dializës maiðeliø paruoðimas• Iðv<strong>ir</strong>inti maiðelius dideliame tûryje 2% (w/v) natrio karbonato <strong>ir</strong> 1 mM EDTApH 8,0 t<strong>ir</strong>palo.• Gerai praplauti distiliuotu vandeniu.• V<strong>ir</strong>inti 10 min 1mM EDTA (pH 8,0).• Atðaldyti t<strong>ir</strong>palà. Perkelti maiðelius á 25% EtOH <strong>ir</strong> laikyti 4°C iki pr<strong>ir</strong>eiks.• Prieð naudojimà gerai praplauti distiliuotu vandeniu.4.7. PeramininimasPeramininimo reakcija plaèiai paplitusi audiniuose. Beveik visos aminorûgðtysátraukiamos á ðias reakcijas. Ypaè greitai peramininimo reakcijos vyksta dalyvaujantdikarboksiaminorûgðtims (glutamo <strong>ir</strong> asparto) arba jas atitinkanèioms α-ketonorûgðtims(α-ketoglutaro <strong>ir</strong> oksalatacto). Azoto apykaitos procesuosams didþiausià átakàturi peramininimo reakcija - aminorûgðèiø sintezës <strong>ir</strong> skilimo reakcija. Oksidazës,katalizuojanèios oksidaciná aminorûgðèiø deamininimà iki amoniako <strong>ir</strong> α-keto rûgðèiø,fiziologinëmis sàlygomis labai neaktyvios. Ðiø fermentø pH optimumas yra ðarminis.Todël aminorûgðtys, patekusios á organizmà su maistu <strong>ir</strong> nesunaudotos baltymø <strong>ir</strong> kitømedþiagø sintezei, deamininamos netiesioginiu bûdu. Ið pradþiø jos dalyvaujaperamininimo reakcijoje su α-ketoglutaro rûgðtimi. Susidariusi glutamo rûgðtis, veikiantlabai aktyviam fermentui glutamato dehidrogenzei, netenka amoniako <strong>ir</strong> v<strong>ir</strong>sta α-ketoglutaro rûgðtimi. Ðis procesas yra gráþtamas, todël amoniakas þinduoliø audiniuosegali v<strong>ir</strong>sti aminorûgðtimis. Veikiant glutamato dehidrogenzei, vyksta atv<strong>ir</strong>kðtinë reakcija– α-ketoglutaro rûgðties amininimas. Susidariusi glutamo rûgðtis peramininimo metuperduoda azotà kitoms aminorûgðtims. Bûtent peramininimo metu <strong>ir</strong> susidaro tamtikros aminorûgðtys, esant organizme pakankamam atitinkamø α-ketonorûgðèiø kiekiui,bei paruoðiamas aminorûgðèiø anglies griauèiai skaidyti.
1. 4. Saugaus Audiniø <strong>ir</strong> darbo làsteliø biochemijos ardymas <strong>ir</strong> laboratorijoje frakcionavimas pagrindinës __________________________________________taisyklës 51Substratais peramininimo reakcijos metu gali bûti ne tik dikarboksiaminorûgðtysarba dikarboksiketonorûgðtys. Galimos peramininimo reakcijos <strong>ir</strong> tarp monokarboksiaminorûgðèiø,<strong>ir</strong> monokarboksiketonorûgðèiø. Peramininimo reakcija yra gráþtamojifermentinë reakcija, kurios metu aminorûgðties aminogrupë perneðama ant α–ketonorûgðties.Fermentai, katalizuojantys ðià reakcijà, vadinami aminotransferazëmis, arba transaminazëmis.Tai sudëtingi baltymai, turintys kovalentiniu ryðiu, prie aminorûgðties lizinoε-aminogrupës prijungtà kofermentà p<strong>ir</strong>idoksalfosfatà. P<strong>ir</strong>idoksalfosfatas fermentinësreakcijos metu reaguoja su aminorûgðtimi <strong>ir</strong> v<strong>ir</strong>sta p<strong>ir</strong>idoksaminofosfatu, kuris atiduodaaminogrupæ α–ketonorûgðèiai, o pats vël v<strong>ir</strong>sta p<strong>ir</strong>idoksalfosfatu. Ðio proceso schema:P<strong>ir</strong>idoksalfosfatasAminorûgðtisα–ketonorûgðtisP<strong>ir</strong>idoksamino fosfatas
52 _________________________________ BIOCHEMIJOS LABORATORINIAI DARBAIP<strong>ir</strong>idoksaminofosfatasα–ketonorûgðtisP<strong>ir</strong>idoksalfosfatasAminorûgðtisP<strong>ir</strong>idoksalfosfatas – ne tik aminotransferaziø, bet <strong>ir</strong> daugelio kitø fermentø (dekarboksilaziø),katalizuojanèiø tam tikrus aminorûgðèiø katabolizmo procesus,kofermentus. Reakcijø kryptá <strong>ir</strong> fermentø veikimo savitumà visada lemia baltyminëfermento dalis.Su peramininimo procesu galima susipaþinti, nagrinëjant glutamo <strong>ir</strong> p<strong>ir</strong>uvo rûgðèiøperamininimà, dalyvaujant raumenø aminotransferazei.glutamo rûgðtis p<strong>ir</strong>uvo rûgðtis α–ketoglutarorûgðtisalaninas
1. 4. Saugaus Audiniø <strong>ir</strong> darbo làsteliø biochemijos ardymas <strong>ir</strong> laboratorijoje frakcionavimas pagrindinës __________________________________________taisyklës 53P<strong>ir</strong>uvatas α–ketoglutaratasGlutamatas AlaninasApie reakcijos intensyvumà galima spræsti ið alanino daugëjimo ar glutamo rûgðtieskiekio maþëjimo. Ðie pokyèiai kokybiðkai matomi atliekant popieriaus chromatografijà.Kad nevyktø glikolizë, á reakcijos miðiná dedama monobromacto rûgðties.Medþiagos <strong>ir</strong> reagentai:1. Triuðio raumenys (triuðio raumenys 1,5 – 2,0 g) susmulkinami þ<strong>ir</strong>klëmis <strong>ir</strong>/arbaskalpeliu, po to sutrinami porceliano lëkðtelëje, pridedant nedidelá kieká smëlio).2. 1,0 % glutamo rûgðties t<strong>ir</strong>palas.3. 1,0 % alanino t<strong>ir</strong>palas.4. 1,0 % p<strong>ir</strong>uvo rûgðties t<strong>ir</strong>palas.5. 0,025 % monobromacto rûgðties t<strong>ir</strong>palas.6. 0,1 % KHCO 3t<strong>ir</strong>palas.7. 10,0 % trichloracto rûgðties t<strong>ir</strong>palas.Darbo eiga:1. Á du mëgintuvëlius ápilama po 0,5 ml glutamo rûgðties <strong>ir</strong> po 0,5 ml p<strong>ir</strong>uvo rûgðties.Á kiekvienà ið ðiø mëgintuvëlá pridedama po 1 ml 0,1% KHCO 3(pH optimumuisudaryti) <strong>ir</strong> po 0,25 ml 0,025% monobromacto rûgðties (glikolizei sustabdyti).2. Á p<strong>ir</strong>màjá mëgintuvëlá (kontrolinis mëgintuvëlis), ápilama 2 ml 10% trichloractorûgðties.3. Á abu mëgintuvëlius pridedama po 500 mg triuðio raumenø tyrelës.4.. Abu mëgintuvëliai inkubuojami 0,5 val. termostate (37°C).5. Po 0,5 val inkubacijos á antràjá mëgintuvëlá dedama 2 ml trichloracto rûgðties(fermentams inaktyvinti).6. Abiejø mëgintuvëliø turiniai filtruojami <strong>ir</strong> filtratai t<strong>ir</strong>iami popieriauschromatografijos metodu.Chromatografijos eiga1. Ant chromatografinio popieriaus starto linijos viename taðke uþlaðinama keletaslaðø ið p<strong>ir</strong>mojo mëgintuvëlio (kontrolë), kitame - ið antrojo mëgintuvëlio. Startolinijoje uþlaðinami <strong>ir</strong> kontroliniø aminorûgðèiø alanino <strong>ir</strong> glutamo rûgðtiest<strong>ir</strong>palai.
54 _________________________________ BIOCHEMIJOS LABORATORINIAI DARBAI2. Kylamosios popieriaus chromatografijos sistema: izopropilo alkoholis:amoniakas: vanduo (7:1:2) 15 – 18 val (per naktá).3. Chromatograma iðdþiovinama, apipurðkiama 0,1% ninhidrino t<strong>ir</strong>palu acetone<strong>ir</strong> dþiovinama 50°C temperatûroje. Aminorûgðèiø vietos chromatogramojenusidaþo violetine spalva.4. Apskaièiuojamas kiekvienos aminorûgðties pasisk<strong>ir</strong>stymo koeficientas <strong>ir</strong>sprendþiama apie peramininimo reakcijos eigà.Kontroliniai klausimai :1. Pakeièiamosios <strong>ir</strong> nepakeièiamosios aminorûgðtys.2. Amoniako paðalinimo keliai.3. P<strong>ir</strong>idoksalfosfato veikimo mechanizmas.4.8. Alkoholio dehidrogenazës (ADH)iðskyrimas ið kepimo mieliøTikslas: iðgryninti alkoholio dehidrogenazæ ið kepimo mieliø <strong>ir</strong> nustatyti tam tikrasfermento charakteristikasAlkoholio dehidrogenazë (ADH) katalizuoja ðià reakcijà:ADHC 2H 5OH + NAD + CH 3CHO + NADH + H +Alkoholio dehidrogenazë (EC 1.1.1.1) yra oksidoreduktazë (katalizuoja oksidacijos–redukcijosreakcijas). Mieliø ADH molekulinë masë yra 141 kDa. Fermentomolekulë sudaryta ið 4 subvienetø, ji turi 4 tv<strong>ir</strong>tai suriðtus Zn atomus. Kiekvienasfermento subvienetas turi po dvi SH- grupes. Þinoma, kad aktyviame fermento centreyra histidino liekana. Mieliø làstelëse reakcijos pusiausvyra yra nukreipta acetaldehidoredukcijos iki etanolio kryptimi.pH optimumas: etanolio oksidacija optimaliai vyksta pH 8,6–9,0.Fermento aktyvikliai: merkaptoetanolis, ditiotreitolis, sunkiuosius metalus suriðantysjunginiai.
1. 4. Saugaus Audiniø <strong>ir</strong> darbo làsteliø biochemijos ardymas <strong>ir</strong> laboratorijoje frakcionavimas pagrindinës __________________________________________taisyklës 55Substratinis savitumas: p<strong>ir</strong>miniai alkoholiai daug geresni substratai nei antriniaiar ðakotosios grandinës aktyviame fermento centre yra His liekana. Mieliø làstelësereakcijos pusiausvyra yra nukreipta acetaldehido redukcijos iki etanolio kryptimi.Inhibitoriai (slopikliai): sunkieji metalai <strong>ir</strong> –SH junginiai.Stabilizatoriai: praskiesti fermento preparatai stabilizuojami pridedant serumoalbumino, þelatinos <strong>ir</strong>/ar cisteino arba glutationo. Koncentruoti fermento t<strong>ir</strong>palai netvandenyje stabilûs keletà dienø 5 0 C . Jei pH maþesnis kaip 6,0, taip pat jei pH didesnisuþ 8,5, fermentas labai nestabilus. Liofilizuoti fermento preparatai laikomi 2–8 °C,iðlieka stabilûs 6–12 mënesiø.Reakcijos greitis nustatomas matuojant NADH koncentracijos didëjimà. Tai patoguatlikti matuojant spektrofotometrijos bûdu ðviesos sugertá (absorbcijà) esant ðviesosbangos ilgiui ë = 340 nm.Medþiagos <strong>ir</strong> reagentai:1. Dþiovintos kepimo mielës, 100g.2. 0,066 M K 2HPO 4– 300 ml.3. 1 mM kalio fosfatinis buferis (pH 7,5) –1000 ml.4.8.1. Alkoholio dehidrogenazës gryninimas1. Dþiovintos kepimo mielës uþpilamos 300 ml 0,066 M K 2HPO 4t<strong>ir</strong>palu <strong>ir</strong> maiðantinkubuojamos 2 val. 37 0 C. Vyksta làsteliø autolizë.2. Suspensija paliekama stovëti 3 val. kambario temperatûros sàlygomis. Taipbaltymai iðt<strong>ir</strong>psta.3. 30 min. centrifuguojama 600 × g 4 0 C.4. Nuosëdos iðmetamos, o nuopilos (supernatantas) vandens vonioje pakaitinamos15 min. 55 0 C.5. Suspensija staigiai atðaldoma leduose iki 0 – 4 0 C.6. Suspensija centrifuguojama 20 min. 6000 × g 4 0 C.7. Nuosëdos iðmetamos, o nuopilos ðaltame kambaryje ar ðaldytuve (4 0 C) gali bûtipaliekamos per naktá. Padedame 100 µl ðio t<strong>ir</strong>palo fermento aktyvumo <strong>ir</strong> baltymøkiekiui nustatyti (I frakcija).8. Á gautà nuopilà maþomis porcijomis, maiðant, pilamas atðaldytas (-10–15 0 C)acetonas. Nuopilø <strong>ir</strong> acetono tûriø santykis 1:0,5. Svarbu, kad suspensijostemperatûra bûtø ne didesnë, kaip - 2 0 C.9. Miðinys centrifuguojamas 15 min. 6000 × g 0 0 C.10. Nuosëdos iðmetamos, o á nuopilas dar pilama atðaldyto atsetono. Nuopilø <strong>ir</strong>acetono tûriø santykis 1:0,6.
56 _________________________________ BIOCHEMIJOS LABORATORINIAI DARBAI11. Miðinys centrifuguojamas 15 min. 6000 × g 0 0 C.12.Nuopilos paðalinamas, o nuosëdos suspenduojamos 25 ml 1 mM kaliofosfatiniame buferyje, pH 7,5. Padedame 100 µl ðio t<strong>ir</strong>palo fermento aktyvumui<strong>ir</strong> baltymø kiekiui nustatyti (II frakcija).13. Suspensija dializuojama 3 val. 4 0 C prieð 0,5 litro 1 mM kalio fosfatinio buferio(pH 7,5), kas valandà keièiamas buferis.14. Dializuota suspensija centrifuguojama 15 min. 15000 × g 4 0 C.15. Nuosëdos paðalinamos, o á nuopilas (III frakcija), lëtai maiðant 4 0 C, dedamaamonio sulfato. (Prieð tai atidedame 100 µl III frakcijos t<strong>ir</strong>palo fermentoaktyvumui <strong>ir</strong> baltymø kiekiui nustatyti). Á 10 ml nuopilø dedama 3,6 g amoniosulfato.16. Po 20 min. inkubacijos centrifuguojama 20 min. 15000 × g 4 0 C.17. Nuosëdos t<strong>ir</strong>pinamos 5 ml dejonizuoto vandens (IV frakcija: padedame 100 µlðio t<strong>ir</strong>palo fermento aktyvumui <strong>ir</strong> baltymø kiekiui nustatyti), pridedama 1gamonio sulfato.18. Po 20 min. inkubacijos centrifuguojama 20 min. 15000 × g 4 0 C.19. Á nuopylas (V frakcija : atidedame 100 µl ðio t<strong>ir</strong>palo fermento aktyvumo <strong>ir</strong>baltymo kiekio nustatymui), lëtai maiðant dedama amonio sulfato iki 0,6 soties.20. Po 20 min. inkubacijos centrifuguojama 20 min. 15000 × g 4 0 C.21. Nuosëdos t<strong>ir</strong>pinamos 1 ml dejonizuoto vandens (VI frakcija).Pamatuojamas kiekvienos frakcijos tûris, pamatuojama baltymo koncentracija,nustatomas fermentinis aktyvumas.4.8.2. Baltymo kiekio nustatymas frakcijoseVisose frakcijose pamatuojame baltymo koncentracijà. Baltymø koncentracijosnustatymas Bredfordo metodu apraðytas 5.5.2. skyriuje.4.8.3. Fermento aktyvumo nustatymasPamatavus ðviesos sugertá tam tikru laiko momentu, galima apskaièiuoti NADHkoncentracijà reakcijos miðinyje tuo laiko momentu. Atsiþvelgiant á Bero–Lambertodësná, sugertá su medþiagos koncentracija sieja ði priklausomybë:A = å M× c × l,kur A – sugertis, esant ë = 340 nm, ε M– molinës ekstinkcijos koeficientas (M -1 cm -1 ),c – koncentracija (M), l – ðviesos nueitas kelias t<strong>ir</strong>pale (cm).
1. 4. Saugaus Audiniø <strong>ir</strong> darbo làsteliø biochemijos ardymas <strong>ir</strong> laboratorijoje frakcionavimas pagrindinës __________________________________________taisyklës 57NADH atveju ε M= 6220 M -1 cm -1 . Taigi NADH koncentracija apskaièiuojamapagal formulæ:c = A / å M× lAlkoholio dehidrogenazës aktyvumo vienetas – fermento kiekis, kuris redukuoja1µmol NAD + per 1 min. áprastinëmis sàlygomis.Savitasis fermento aktyvumas iðreiðkiamas aktyvumo vienetais vienam mgbaltymo (U/mg).Reagentai:1. 100 mM TRIS-HCl buferis, pH 8,8 .2. 25 mM kalio fosfato buferis pH 7,5.3. 1 mg/ml NAD + (t<strong>ir</strong>pinama 25 mM kalio fosfato buferyje, pH 7,5.4. 3 M etanolis.Darbo eiga:1. Á spektrofotometro kiuvetæ ápilama: 2,8 ml TRIS-HCl buferio pH 8,8 ; 0,1 ml(100 µl) 3 M etanolio <strong>ir</strong> 0,1 ml (100 µl) NAD + <strong>ir</strong> gerai iðmaiðoma.2. Kiuvetë dedama á spektrofotometro ðulinëlá <strong>ir</strong> prietaisas kalibruojamas taip,kad rodytø optiná tanká, lygø 0 , esant bangos ilgiui λ = 340 nm .3. Ápilama 10 – 50µl fermento t<strong>ir</strong>palo (I–VI frakcijos ) <strong>ir</strong> iðmatuojamas optiniotankio pokytis kas 30 sek 2min. laikotarpiui.4. Ávertinamas pradinis fermentinës reakcijos greitis <strong>ir</strong> apskaièiuojamas savitasisaktyvumas.5. Savitasis aktyvumas iðreiðkiamas susidariusio per 1 min. NADH kiekio mikromoliais,skaièiuojant mg baltymo:∆A340/minvnt/mg⋅ baltymo =..6,22 × mg⋅baltymo/mlFermento gryninimo rezultatai pateikiami lentelëje (4.4 lentelë)4.4 lentelë. Alkoholio dehidrogenazës gryninimo eigaEilėsNr.GryninimoStadija1 I frakcija2 II frakcija3 III frakcija4 IV frakcija5 V frakcija6 VI frakcijaBendrastūris /ml/Bendrasbaltymokiekis /g/Savitasisaktyvumasvnt/mgBendrasaktyvumasIšgryninimasFermentoišeiga
58 _________________________________ BIOCHEMIJOS LABORATORINIAI DARBAIKontroliniai klausimai :1. Alkoholio dehidrogenazës savitumas.2. Alkoholio dehidrogenazës struktûra.3. Fermentø aktyvumo vienetai.4. Fermentø gryninimo metodai.
1. 5. Ðviesos Saugaus sugertis darbo _________________________________________________________________biochemijos laboratorijoje pagrindinës taisyklës 595.Ðviesos sugertis5.1. Ðviesos sugerties prigimtisÐviesos sugerties prigimtá patogu aiðkinti remiantis kvantinëmis ðviesos savybëmis.Sklindant ðviesai medþiaga áprastinëmis sàlygomis ðviesos intensyvumas maþëja, nesðviesos kvantai (fotonai) sukelia medþiagà sudaranèiø daleliø ðuolius ið maþesnës ádidesnës energijos lygmenis. Po dalelës sàveikos su fotonu ji perðoka á aukðtesná energijoslygmená <strong>ir</strong> bûna suþadinta, o fotonas iðnyksta. Suþadintos bûsenos dalelë gyvuoja neilgai.Ji atiduoda suþadinimui iðeikvotos energijos dalá <strong>ir</strong> perðoka á þemesná lygmená. Jeigutokio ðuolio metu yra iðspinduliuojamas fotonas, tai dalelei suþadinti sunaudota energijavël v<strong>ir</strong>sta fotono energija. Taèiau daþniausiai suþadinimo energija, dalelei perðokant iðaukðtesniojo lygmens á þemesnájá, v<strong>ir</strong>sta kitomis energijos rûðimis, pavyzdþiui, ðilumine,dël to maþëja medþiaga sklindanèios ðviesos intensyvumas.Ðviesos, sklindanèios per medþiagà intensyvumo maþëjimas, vadinamas ðviesossugertimi. Jei sugeriama regimosios arba ultravioletinës spektro dalies ðviesa, taisuþadinami elektronai perðoka á aukðtesná lygmená, o vëliau gráþta á þemesná lygmená.Medþiagos nevienodai sugeria sk<strong>ir</strong>tingø bangos ilgiø ðviesà. Medþiagos sugertiespriklausomumas nuo bangos ilgio vadinamas medþiagos sugerties spektru.Vanduo nesugeria nei regimosios, nei ultravioletinës spektro dalies ðviesos. Daugeliomedþiagø t<strong>ir</strong>palai (pvz. hemoglobino, citochromo c) yra spalvoti, nes jø molekulëssugeria regimàjà ðviesà. Pavyzdþiui, redukuotas citochromas c yra geltonas, jo sugertiesmax yra 550 nm <strong>ir</strong> 420 nm – tai lemia hemo prostetinë grupë, kuri yra chromoforas(spalvos neðiklis). Kitos medþiagos – nukleorûgðtys, baltymai, NAD(H) sugeriaultravioletinæ ðviesà. NADH ultravioletinës ðviesos sugerties maksimumas yra ties 260 nm<strong>ir</strong> 340 nm, o NAD + – tik ties 260 nm. Fermentø, pvz., nuo NAD priklausomø dehidrogenaziøaktyvumas gali bûti vertinamas atsiþvelgiant á ðviesos sugerties kitimà ties 340 nm.NAD +SugertisNAD H220 240 260 280 300 320 340 360 380 bangos ilgis (nm)5.1 pav. NAD + <strong>ir</strong> NADH optinio tankio priklausomumas nuo bangos ilgio λ
60 _________________________________ BIOCHEMIJOS LABORATORINIAI DARBAIBangos ilgis ties kuriuo yra didþiausias optinis tankis vadinamas λ max. Medþiagagali turëti keletà sugerties maksimumø. Tuomet þymime λ 1,λ 2,λ 3<strong>ir</strong> t. t.Junginiø sugerties spektrai gali bûti vartojami jiems nustatyti.5.2. Kiekybiniai matavimai. Bero <strong>ir</strong> Lamberto dësnis.Ásivaizduokime NADH t<strong>ir</strong>palà spektrofotometro kiuvetëje (plotis 1 cm). Pro já yraleidþiama 340 nm monochromatinë ultravioletinë ðviesa.Tegu krintanèios ðviesos intensyvumas = I o, o praëjusios ðviesos intensyvumas = IÐviesos intensyvumà medþiagoje apibûdina ðviesos pralaidumas T. Jis lygus promedþiagà praëjusios <strong>ir</strong> á medþiagà kritusios ðviesos intensyvumø santykiui:IT= . II0T′=100%Daþnai ðviesos pralaidumas iðreiðkiamas procentais: I0Ðviesos pralaidumas priklauso nuo kiuvetëje esanèio t<strong>ir</strong>palo koncentracijos, t<strong>ir</strong>palosluoksnio storio <strong>ir</strong> ðviesos bangø ilgio.Ðviesos pralaidumui atv<strong>ir</strong>kðtinio dydþio deðimtainis logaritmas vadinamas optiniutankiu A:A=lg1/T=lg I o/I.5.1 lentelë. Ðviesos pralaidumo <strong>ir</strong> optinio tankio santykisKrintančios šviesosintensyvumas(I o )Praėjusios šviesosintensyvumas(I)Pralaidumas (T)procentaisI/I oOptinis tankis (A)lg I o /I100 100 100% 0100 50 50% 0,3100 10 10% 1.0100 1 1% 2.0
1. 5. Ðviesos Saugaus sugertis darbo _________________________________________________________________biochemijos laboratorijoje pagrindinës taisyklës 61• T<strong>ir</strong>palo optinis tankis yra tiesiog proporcingas medþiagos, kuri sugeria ðviesà,koncentracijai (pavyzdþiui, optinis tankis yra tiesiog proporcinga NADHkoncentracijai).• Optinis tankis taip pat yra tiesiog proporcingas ðviesos nueitam keliui permëginá, t. y. spektrofotometro kiuvetës ploèiui.• Ekstinkcijos koeficientas ε rodo t<strong>ir</strong>palo optinio tankio santyká su medþiagoskoncentracija <strong>ir</strong> t<strong>ir</strong>palo sluoksnio storiu (t. y. ðviesos nueitu pro t<strong>ir</strong>palà keliu).• Molinis ekstinkcijos koeficientas ε M. Jeigu medþiagos koncentracija yra vienasmolis/litre (molinë), tuomet ekstinkcijos koeficientas vadinamas molinisekstinkcijos koeficientas <strong>ir</strong> þymimas ε M.T<strong>ir</strong>iamos medþiagos kieká t<strong>ir</strong>pale galima nustatyti matuojant optintiná tanká tiesλ max<strong>ir</strong> taikant Bero <strong>ir</strong> Lamberto dësná.A=ε M×c×l;èia A =optinis tankis,c – koncentracija (mol/litre),l – kelio ilgis (kiuvetës plotis) (cm)ε M– molinis ekstinkcijos koeficientas.ε Mvienetai yra M –1 cm –1 (t. y. litrai × mol –1 × cm –1 ). NADH ε Mreikðmë yra6220 M –1·cm–1 .Bero <strong>ir</strong> Lamberto dësná galima pateikti grafiðkai kaip tiesinê priklausomybê A nuo c.Esant A>1, optinio tankio priklausomumas nuo koncentracijospasikeièia, pasidaro nebe tiesinis. Kintantbangos ilgiui ë, molinës ekstinkcijos koeficientas kinta,todël Bero <strong>ir</strong> Lamberto dësnis galioja tik monochromatineiðviesai. Daugumos gamtiniø medþiagø ε Mgalimarasti þinynuose arba juos galima nustatyti matuojanttikslios koncentracijos grynosios medþiagos t<strong>ir</strong>palooptinátanká. Þinant medþiagos ε M, lengvai galima nustatyti joskoncentracijà t<strong>ir</strong>pale, matuojant t<strong>ir</strong>palo optiná tanká.Pavyzdþiui, aminorûgðties triptofano t<strong>ir</strong>palo optinistankis ties 280 nm 1 cm kiuvetëje yra 0,167. Triptofanoε Mties 280 nm yra 5580 l·mol –1·cm –1 :Pertvarkius lygtá gaunama:A=ε M×c×lC = A/ε M×lAc5.2. pav. Optinio tankiopriklausomumas nuo medþiagoskoncentracijos
62 _________________________________ BIOCHEMIJOS LABORATORINIAI DARBAITaigi:C = 0,167/5580=3.0×10 –5 mol·l –1Medþiagø spektrines savybes keièiantys veiksniai. Tos paèios medþiagos λ max<strong>ir</strong>ε Mgali sk<strong>ir</strong>tis – tai priklauso nuo sàlygø – t<strong>ir</strong>palo pH, t<strong>ir</strong>piklio poliaringumo <strong>ir</strong> kt.T<strong>ir</strong>palø optiná tanká galima pamatuoti spektrofotometru arba fotokolorimetru.Spektrofotometras yra naudojamas t<strong>ir</strong>palo optinio tankio matavimui ties tiksliu bangosilgiu. Fotokolorimetras yra paprastesnis instrumentas. Naudojant ðviesos filtrus galimapamatuoti t<strong>ir</strong>palo optiná tanká platesnëje spektro dalyje (t. y. þalios, raudonos, mëlynosregimosios ðviesos spektro srityse).Praktiðki patarimai matuojant optiná tanká:1. Spektrofotometro kiuvetës bûna pagamintos ið stiklo (paprasto arba kvarcinio)arba plastiko. Matuojant t<strong>ir</strong>palo optiná tanká regimosios ðviesos srityje, galimanaudoti visø rûðiø kiuvetes. Taèiau matuojant optiná tanká ultravioletinëje ðviesoje,kai bangos ilgis trumpesnis kaip 300 nm, galima naudoti tik kiuvetes pagamintasið kvarcinio stiklo. Kiuvetës turi bûti gerai iðplautos. Daugelis medþiagø(baltymai, nukleorûgðtys) adsorbuojasi ant vidinio kiuveèiø pav<strong>ir</strong>ðiaus <strong>ir</strong> sunkiaiiðsiplauna. Kiuveèiø pav<strong>ir</strong>ðius turi bûti ðvarus <strong>ir</strong> sausas. Galima liesti tik matiná(neskaidrø) kiuveèiø pav<strong>ir</strong>ðiø. Bûtina þinoti kiuvetës plotá (daþniausiai 1cm).Kvarcinës kiuvetës yra trapios <strong>ir</strong> brangios, todël bûkite atidûs.2. Matuojant optiná tanká p<strong>ir</strong>miausia uþraðoma nulinë sugertis, t. y. pamatuojamakontrolinës kiuvetës, kurioje yra tik t<strong>ir</strong>piklis, optinis tankis. Tai yra bûtina, nesdalá ðviesos sugeria kiuvetës medþiaga <strong>ir</strong> t<strong>ir</strong>piklis. Atmetus kontrolinës kiuvetësoptinio tankio reikðmes (nusibrëþus nulinæ linijà), galima pamatuoti t<strong>ir</strong>iamot<strong>ir</strong>palo tiksliø optiná tanká.3. Jeigu matuojant spektrofotometru t<strong>ir</strong>palo optinis tankis A>1, t<strong>ir</strong>palà reikiapraskiesti. Taèiau matuojant t<strong>ir</strong>paløoptiná tanká, kai spalva susidarë sureagavussandams (pvz., nustatant baltymø, angliavandeniø <strong>ir</strong> kitø medþiagø kiekius),negalima skiesti tokio spalvoto t<strong>ir</strong>palo, nes tuomet praskiedþiama tiek t<strong>ir</strong>iamamedþiaga, tiek reagentai.Tokiu atveju reikia praskiesti pradiná medþiagos t<strong>ir</strong>palà<strong>ir</strong> atlikti reakcijà.Literatûra1. Wilson K., Walker J. (2003) Principles and techniques of practical biochemistry,479–485.2. Reed R., Holmes D., Weyers J., Jones A. (2003) Practical skills in biomolecularsciences
1. 5. Ðviesos Saugaus sugertis darbo _________________________________________________________________biochemijos laboratorijoje pagrindinës taisyklës 635.3. Kokybinës aminorûgðèiø atpaþinimo reakcijos.5.3.1. Ninhidrino reakcijaVisos aminorûgðtys, turinèios laisvà aminogrupæ, reaguoja su ninhidrinu <strong>ir</strong> sudaromëlynos spalvos kompleksus. Prolinas <strong>ir</strong> hidroksiprolinas su ninhidrinu sudaro geltonosspalvos kompleksus. Veikiant ninhidrinui, aminorûgðtys oksiduojasi <strong>ir</strong> suskyla ikiamoniako, aldehido <strong>ir</strong> angliarûgðtës. Redukuotas ninhidrinas jungiasi su kita ninhidrinomolekule <strong>ir</strong> amoniaku, susidaro sudëtingos struktûros spalvotas junginys. Analogiðkaisu ninhidrinu reaguoja laisvas aminogrupes turintys peptidai <strong>ir</strong> baltymai.Reagentai1. 0,1% aminorûgðties t<strong>ir</strong>palas.2. 1,0% baltymo t<strong>ir</strong>palas.3. 0,1% ninhidrino t<strong>ir</strong>palas.
64 _________________________________ BIOCHEMIJOS LABORATORINIAI DARBAIDarbo eiga1. Á vienà kûginá mëgintuvëlá pilama 0,2 ml 0,1% aminorûgðties, á kità mëgintuvëlá– 0,2 ml 1% baltymo t<strong>ir</strong>palo. Á treèiàjá (kontroliná) mëgintuvëlá vietojeaminorûgðties álaðinama 0,2 ml vandens.2. Á visus mëgintuvëlius pilama po 0,1 ml 0,1% ninhidrino t<strong>ir</strong>palo <strong>ir</strong> uþv<strong>ir</strong>inama.Po 1 – 2 minuèiø t<strong>ir</strong>palai, kuriuose buvo aminorûgðtys, nusidaþo melsvai. Laikantspalva ryðkëja.5.3.2. Reakcija su histidinu <strong>ir</strong> t<strong>ir</strong>ozinu (Paulio reakcija)Á ðarminá histidino, t<strong>ir</strong>ozino arba baltymo t<strong>ir</strong>palà pridëjus diazoreagento, t<strong>ir</strong>palas ágaunaoranþinæ spalvà. Reakcijoje dalyvauja aminorûgðtys – t<strong>ir</strong>ozinas <strong>ir</strong> histidinas, kurios,reaguodamos su diazobenzensulfonrûgðtimi, sudaro oranþinës spalvos azodaþiklá.Azodaþiklio spalvos ryðkumas priklauso nuo histidino <strong>ir</strong> t<strong>ir</strong>ozino kiekio. Ið visø ábaltymø sudëtá áeinanèiø aminorûgðèiø Pauli reakcija vyksta tik su histidinu <strong>ir</strong> t<strong>ir</strong>ozinu.Reagentai1. 1,0% sulfanilo rûgðties t<strong>ir</strong>palas 2% druskos rûgðtyje.2. 5,0% natrio nitrito t<strong>ir</strong>palas.3. 10,0% natrio karbonato t<strong>ir</strong>palas.4. 0,1% alanino t<strong>ir</strong>palas.5. 1,0% kiauðinio baltymo t<strong>ir</strong>palas.
1. 5. Ðviesos Saugaus sugertis darbo _________________________________________________________________biochemijos laboratorijoje pagrindinës taisyklës 65Darbo eiga1. Á tris mëgintuvëlius ápilama po 0,1 ml 1,0% sulfanilo rûgðties t<strong>ir</strong>palo <strong>ir</strong> 0,1 ml5,0% natrio nitrito t<strong>ir</strong>palo. Reakcijos miðinys suplakamas.2. Á p<strong>ir</strong>màjá mëgintuvëlá ápilama 0,2 ml 0,1% histidino, antràjá mëgintuvëlá –0,2 ml 1% kiauðinio baltymo, treèiàjá mëgintuvëlá – 0,2 ml 0,1% alanino t<strong>ir</strong>palø.3. Á visus mëgintuvëlius ápilama po 0,2 ml 10,0% natrio karbonato t<strong>ir</strong>palo.Reakcijos miðinys p<strong>ir</strong>muose dviejuose mëgintuvëliuose nusidaþo rausvai oranþinespalva.5.3.3. Biureto reakcija peptidiniams ryðiams nustatytiLabai ðarminëje aplinkoje Cu 2+ jonai, reaguodami su biuretu (H 2N–CO–NH–CO–NH 2), oksamidu (H 2N–CO–CO–NH 2), peptidais ar baltymais, sudaro mëlynaivioletinius ar raudonai violetinius kompleksus. Biureto reakcijà lemia peptidiniø ryðiøbuvimas. Kad susidarytø spalvotas kompleksas reikalingi maþiausiai du peptidinia<strong>ir</strong>yðiai. Manomo Cu 2+ <strong>ir</strong> peptido komplekso struktûra parodyta 5.4 pav.5.4 pav. Manomas Cu 2+ <strong>ir</strong> peptidinio ryðio kompleksasBiureto komplekso spalva priklauso nuo vario druskos kiekio t<strong>ir</strong>pale <strong>ir</strong> nuo medþiagosstruktûros. Baltymø <strong>ir</strong>imo produktai peptonai sudaro rausvos spalvos kompleksus.Magnio sulfatas <strong>ir</strong> amonio sulfatas t<strong>ir</strong>pale trukdo biureto reakcijai. Esant amoniodruskoms, reikia imti didelá ðarmo pertekliø.Reagentai1. 1,0% kvieèiø baltymas.2. 1,0% kiauðinio baltymas.3. 0,1% aminorûgðèiø t<strong>ir</strong>palas.4. 10,0% natrio hidroksidas.5. 0,1% vario sulfatas.
66 _________________________________ BIOCHEMIJOS LABORATORINIAI DARBAIDarbo eiga1. Á vienà mëgintuvëlá ápilama 0,2ml 1,0% kvieèiø baltymo, á antràjá mëgintuvëlá –0,2 ml 1% kiauðinio baltymo, á treèiàjá mëgintuvëlá – 0,2ml 0,1% aminorûgðtiest<strong>ir</strong>palo.2. Á visus mëgintuvëlius ápilama po 0,2 ml 10,0% natrio hidroksido bei 1 – 2 laðus0,1% vario sulfato t<strong>ir</strong>palo <strong>ir</strong> sumaiðoma.Reakcijos miðinys p<strong>ir</strong>muosiuose dviejuose mëgintuvëliuose nusidaþo violetinespalva.Kontroliniai klausimai1. Kurios aminorûgðtys dalyvauja Pauli reakcijoje? Uþraðykite jø struktûrà.2. Kodël alaninas su vario jonais ðarminëje aplinkoje nesudaro spalvoto junginio?3. Kurio metalo jonai dalyvauja susidarant kompleksiniam junginiui biuretoreakcijoje?4. Kurios baltymø <strong>ir</strong> aminorûgðèiø funkcinës grupës reaguoja su ninhidrinu?5. Ar reaguoja su ninhidrinu jûsø odos baltymai?5.4. Kokybinës angliavandeniø nustatymo reakcijos5.4.1. Selivanovo reakcija ketoheksozëms nustatytiSelivanovo reakcija atliekama ketozëms paþinti. Fruktozæ veikiant druskos rûgðtimi,susidaro oksimetilfurfurolas, kuris su rezorcinoliu sudaro raudonos spalvos kondensacijosproduktà. Ðia reakcija galima atsk<strong>ir</strong>ti gliukozæ nuo fruktozës. Selivanovoreakcija vyksta su disacharidais (pvz., sacharoze), á kuriø sudëtá áeina fruktozë. Rûgðtinëshidrolizës metu iðsisk<strong>ir</strong>ia fruktozë, kuri <strong>ir</strong> nusidaþo. Gliukozës t<strong>ir</strong>palas nusidaþo silpnarausva spalva tik po ilgo v<strong>ir</strong>inimo su rezorcinoliu.Reagentai1. Tolenso reagentas (1,0% rezorcinolio t<strong>ir</strong>palas koncentruotoje druskos rûgðtyje).2. 1,0% sacharozës t<strong>ir</strong>palas.3. 1,0% gliukozës t<strong>ir</strong>palas.4. 1,0% fruktozës t<strong>ir</strong>palas.Darbo eiga1. Á tris kûginius mëgintuvëlius ápilama po 300 µl sacharozës, fruktozës <strong>ir</strong> gliukozëst<strong>ir</strong>palø atitinkamai.2. Á visus mëgintuvëlius ápilama po 100µl Tolenso reagento.3. Lëtai ðildant, t<strong>ir</strong>palas, kuriame iðt<strong>ir</strong>pinta fruktozë <strong>ir</strong> sacharozë, nusidaþo raudonaspalva. Reakcijos miðinys, kuriame yra gliukozë, spalvoto junginio su Tolensoreagentu nesudaro.
1. 5. Ðviesos Saugaus sugertis darbo _________________________________________________________________biochemijos laboratorijoje pagrindinës taisyklës 675.4.2. Triomerio reakcija aldozëms nustatytiAldozës ðarminëje terpëje redukuoja dvivalenèio vario hidroksidà iki vienvalenèio.Susidaræs vienvalenèio vario hidroksidas <strong>ir</strong> jo skilimo produktas vario oksidas yraspalvoti junginiai. Reakcijos metu vyksta gliukozës oksidacija <strong>ir</strong> dvivalenèio variohidroksido redukcija.Reagentai1. 1,0% sacharozës t<strong>ir</strong>palas.2. 1,0% gliukozës t<strong>ir</strong>palas.3. 10,0% natrio hidroksidas.4. 2,0% vario sulfatas.Darbo eiga1. Á mëgintuvëlá ápilama 0,5 ml gliukozës t<strong>ir</strong>palo <strong>ir</strong> 0,15 ml 10,0% natrio hidroksidot<strong>ir</strong>palo.2. Vëliau atsargiai laðinamas 2,0% vario sulfato t<strong>ir</strong>palas (20–40µl) tol, kol susidaræsmelsvas drumstumas, purtant mëgintuvëlá, neiðnyksta.3. T<strong>ir</strong>palas paðildomas. Esant gliukozei, ið pradþiø susidariusios geltonosvienvalenèio vario hidroksido nuosëdos v<strong>ir</strong>sta raudonomis vienvalenèio variooksido nuosëdomis.4. Analogiðkai, kaip <strong>ir</strong> 1 – 3 punktuose, atliekama reakcija su sacharozës t<strong>ir</strong>palu.
68 _________________________________ BIOCHEMIJOS LABORATORINIAI DARBAI5.5. Baltymø kiekio nustatymasBaltymø kiekiui t<strong>ir</strong>pale nustatyti plaèiausiai taikomi kolorimetrijos metodai. Baltymot<strong>ir</strong>palà veikiant atitinkamu reagentu susidaro spalvotas junginys, kurio ðviesos sugertisnustatoma spektrofotometrijos bûdu. Baltymo kiekis proporcingas spalvos ryðkumui<strong>ir</strong> nustatomas ið kalibravimo kreivës. Kalibravimo kreivës daþniausiai paruoðiamos sujauèio serumo albuminu. Taèiau spalvos ryðkumas priklauso nuo baltymo aminorûgðèiøsudëties, prostetiniø grupiø buvimo. Baltymø koncentracijai t<strong>ir</strong>iamajame mëginyjenustatyti taikomi keli metodai: ðviesos sugerties matavimas ultravioletinëje spektrodalyje, Bredfordo, Louri, bisinchoninës rûgðties, biureto metodai.5.5.1. Baltymø koncentracijos nustatymas, matuojantultravioletinës ðviesos sugertá ties 280 nm.Aromatiniø aminorûgðèiø triptofano <strong>ir</strong> t<strong>ir</strong>ozino liekanos baltymuose sugeria ðviesàties 280 nm. Metodas gana jautrus. Galima pamatuoti 10µg/ml – 1mg/ml baltymøkoncentracijas. Patogu, kad pamatavus sugertá, baltymø t<strong>ir</strong>palus galima toliau naudoti.Metodas plaèiai taikomas baltymø, praëjusiø pro chromatografines kolonëles, koncentracijomsnustatyti. Tam tikrø baltymø sugerties koeficientai sk<strong>ir</strong>iasi, taèiau,apytikriai, baltymø t<strong>ir</strong>palo, kurio sugertis A 280=1, koncentracija yra lygi 1mg/ml, jeigukiuvetës plotis lygus 1 cm.Baltymø t<strong>ir</strong>paluose bûna <strong>ir</strong> kitø medþiagø (pvz. nukleorûgðèiø), kurios sugeria ðviesàties 280 nm <strong>ir</strong> trukdo tiksliai nustatyti baltymø kieká t<strong>ir</strong>pale. Matuojant baltyminiø t<strong>ir</strong>paløsugertá ties 260 nm <strong>ir</strong> 280 nm, galima patikslinti baltymø koncentracijà. Nustatyta, kad:Baltymas (mg/ml) = 1,45 × A 280– 0,74 × A 260Peptidiniai baltymø ryðiai sugeria ðviesà ties 190 nm. Praktiðkai baltymø sugertis(pvz., frakcionavimo metu) matuojama ties 210 nm. Jei baltymo koncentracija lygi 1µg/ml, t<strong>ir</strong>palo sugertis A 210= 20. Ðis metodas taikomas retai, nes matuojant sugertá ties210 nm labai didelæ átakà turi ðalutiniø medþiagø sugertis.Norint tiksliai nustatyti baltymo koncentracijà daþniausiai taikomi Bredfordo <strong>ir</strong>Louri pasiûlyti metodai.5.5.2. Baltymo kiekio nustatymas Bredfordo metodu.Baltymai jungiasi su Kumasi briliantinio mëlio daþikliu <strong>ir</strong> matuojamas susidariusiokomplekso spalvos intensyvumas. Gryno daþiklio katijoninë forma sugeria ðviesà ties470 nm <strong>ir</strong> 650 nm, o susijungusi su baltymo arginino <strong>ir</strong> aromatinëmis aminorûgðtimisanijoninë daþiklio forma sugeria ðviesà ties 595 nm. Ðis metodas yra paprastas, greitesnis
1. 5. Ðviesos Saugaus sugertis darbo _________________________________________________________________biochemijos laboratorijoje pagrindinës taisyklës 69negu Louri. Spalvotas junginys susidaro greitai <strong>ir</strong> yra stabilus. Galima nustatyti 1 – 10µg/ml baltymø koncentracijas. Taèiau susidariusio komplekso spalvos ryðkumaspriklauso nuo baltymo sudëties. Glicerolis, detergentai, â-merkaptoetanolis, actorûgðtis, amonio sulfatas, TRIS <strong>ir</strong> tam tikri ðarminiai buferiai taip pat turi átakosspalvotam kompleksiniui junginiui susidaryti. Daþiklis gana tv<strong>ir</strong>tai prilimpa priekvarciniø kiuveèiø pav<strong>ir</strong>ðiaus <strong>ir</strong> sunkiai nusiplauna.Reagentai1. 0,5 mg/ml jauèio serumo albumino t<strong>ir</strong>palas – 2 ml. Laikyti – 20 0 C temperatûrossàlygomis.2. 0,15M NaCl t<strong>ir</strong>palas, 50 ml.3. Kumasi briliantinio mëlio G250 daþiklio t<strong>ir</strong>palas: 50 mg Kumasi briliantiniomëlio G250 iðt<strong>ir</strong>pinama 25 ml 95% etanolio <strong>ir</strong> ápilama 50 ml 85% fosfororûgðties. Ápilama vandens iki 0,5 litro. Filtruojama. Laikoma 4 0 C temperatûrossàlygomis.Darbo eigaVisiems kalibravimo kreivës taðkams nustatyti procedûra atliekama po 2 kartus.1. Á 8 mëgintuvëlius ápilama atitinkamai po 10, 20, 30, <strong>ir</strong> 40 µl jauèio serumoalbumino t<strong>ir</strong>palo <strong>ir</strong> á visus ápilama iki 100 µl 0,15 M NaCl t<strong>ir</strong>palo. Á kontrolinius(9,10) mëgintuvëlius ápilama tik po 100 µl 0,15 M NaCl t<strong>ir</strong>palo.2. Á visus mëgintuvëlius ápilama po 1,0 ml Kumasi briliantinio mëlio G 250 t<strong>ir</strong>palo<strong>ir</strong> sumaiðoma.3. Laikoma 2 min. kambario temperatûros sàlygomis.4. Spektrofotometru pamatuojama sugertis ties λ = 595 nm (A 595) <strong>ir</strong> braiþomakalibravimo kreivë. Ant ordinaèiø aðies paþymima sugertis (A 595), o ant abscisiø– baltymo kiekis (µg).5. Á 50 µl neþinomos koncentracijos baltymo t<strong>ir</strong>palà ápilama iki 100 µl 0,15 MNaCl t<strong>ir</strong>palo, 1,0 ml Kumasi briliantinio mëlio G 250 t<strong>ir</strong>palo <strong>ir</strong> sumaiðoma.Laikoma 2 min. kambario temperatûros sàlygomis. Spektrofotometru pamatuojamaA 595, baltymo kiekis nustatomas ið kalibravimo kreivës. Jeigu matuojamojobaltymo sugertis yra didelë <strong>ir</strong> nustatyti duomenys nepatenka á kalibravimokreivës ribas, tada neþinomos koncentracijos baltymas praskiedþiamas<strong>ir</strong> matavimas kartojamas. Susidarius spalvotam junginiui t<strong>ir</strong>paloskiesti negalima.
70 _________________________________ BIOCHEMIJOS LABORATORINIAI DARBAI5.5.3. Baltymo kiekio nustatymas Louri metoduTai jautrus, anksèiau plaèiai taikytas metodas, kuriuo galima nustatyti 1 – 20 µg/mlbaltymø koncentracijas. Reaguojant Folino <strong>ir</strong> Èiokateu reagentui (miðinys natriotartrato, molibdato <strong>ir</strong> fosfato kartu su vario sulfato t<strong>ir</strong>palu) su peptidiniais baltymøryðiais <strong>ir</strong> t<strong>ir</strong>ozino aminorûgðèiø liekanomis, susidaro spalvoti kompleksiniai junginiai,kuriø sugertis matuojama ties 750 nm. Jautrumas sk<strong>ir</strong>tingiems baltymams beveiknesisk<strong>ir</strong>ia. Taèiau yra daug medþiagø, kurios turi átakos spalvotam kompleksiniamjunginiui susidaryti. Tokios medþiagos yra detergentai, denatûruojantys veiksniai, tamtikri buferiai(TRIS, Pipes, Hepes) <strong>ir</strong> sieros turintys junginiai. Baltymo nusodinimasdeoksicholatu/trichloracto rûgðtimi, padeda iðvengti dalies medþiagø neigiamos átakos.Susidaræs spalvotas kompleksinis junginys yra stabilus (A 750maþëja 1– 2% laikant 1valandà kambario temperatûros sàlygomis).Reagentai1. 0,5 mg/ml jauèio serumo albumino t<strong>ir</strong>palas – 2ml. Laikyti – 20 0 C temperatûrossàlygomis.2. 0,8 M NaOH.3. 10,0% natrio dodecilsulfato t<strong>ir</strong>palas.4. Vario tartrato/karbonato (CTC) t<strong>ir</strong>palas.a) CTC pradinis t<strong>ir</strong>palas: á 50 ml 0,2% CuSO 4×H 2O, 0,2% kalio tartrato t<strong>ir</strong>palàlëtai ápilama, stipriai maiðant, 50 ml 20% natrio karbonato t<strong>ir</strong>palo. CTCpradinis t<strong>ir</strong>palas yra tinkamas naudoti 8 savaites, laikant kambariotemperatûros sàlygomis.b) CTC darbinis t<strong>ir</strong>palas: vienodais tûriais sumaiðomas CTC pradinis t<strong>ir</strong>palas,0,8 M NaOH, 10% natrio dodecilsulfato t<strong>ir</strong>palas <strong>ir</strong> vanduo. Ðis reagentas yrastabilus kambario temperatûros sàlygomis 1 – 2 savaites.5. Folino <strong>ir</strong> Èiokateu reagentas. Reagento paruoðimas: apvaliadugnëje kolboje700ml vandens iðt<strong>ir</strong>pinama 100 g Na 2WO 4×2H 2O <strong>ir</strong> 25 g Na 2MoO 4×2H 2O.Pilama 50ml 85% fosfato rûgðties <strong>ir</strong> 100 ml koncentruotos druskos rûgðties.Prijungiamas Lybigo kondensatorius <strong>ir</strong> miðinys 10 valandø v<strong>ir</strong>inamas. Dedama150 g lièio sulfato, 50 ml vandens <strong>ir</strong> keli bromo laðai. Nuëmus Libicho ðaldytuvà,15 min. v<strong>ir</strong>inama traukos spintoje. Tokiu bûdu paðalinamas bromo perteklius.T<strong>ir</strong>palas atauðinamas <strong>ir</strong> pripilama vandens iki 1 litro. Filtruojama pro stiklofiltrà. Visø ðio reagento ruoðimo stadijø metu t<strong>ir</strong>palo spalva turi bûti geltona. Jeimiðinys turi þalsvà atspalvá, vadinasi, ðis reagentas buvo ruoðiamas ið neðvariømedþiagø. Daþniausiai tai ávyksta dël tam tikrø katijonø priemaiðø druskosrûgðtyje. Paruoðtas Folino <strong>ir</strong> Èiokateu reagentas titruojamas 1 M ðarmo t<strong>ir</strong>palu<strong>ir</strong> nustatoma jo koncentracija. Folino <strong>ir</strong> Èiokateu reagentas laikomas tamsausstiklo butelyje.
1. 5. Ðviesos Saugaus sugertis darbo _________________________________________________________________biochemijos laboratorijoje pagrindinës taisyklës 71Darbo eigaVisiems kalibravimo kreivës taðkams nustatyti procedûra atliekama po 2 kartus.1. Á 8 mëgintuvëlius ápilama atitinkamai 10, 20, 30, <strong>ir</strong> 40 µl jauèio serumo albuminot<strong>ir</strong>palo <strong>ir</strong> á kiekvienà vandens iki 200 µl. Á kontrolinius (9, 10 mëgintuvëlius)pilama tik 200 µl vandens.2. Á visus mëgintuvëlius ápilama po 200 µl CTC darbinio t<strong>ir</strong>palo <strong>ir</strong> sumaiðoma.3. Mëgintuvëliai laikomi 10 min. kambario temperatûros sàlygomis.4. Pilama 100 µl 0,4 N Folino <strong>ir</strong> Èiokateu reagento <strong>ir</strong> nedelsiant sumaiðoma.Mëgintuvëliai laikomi 30 min. kambario temperatûros sàlygomis.5. Fotoelektrokolorimetru pamatuojama sugertis ties 750 nm (A 750) <strong>ir</strong> braiþomakalibravimo kreivë. Ant ordinaèiø aðies paþymima sugertis (A 750), o ant abscisiø– baltymo kiekis (µg).6. Á du mëgintuvëlius, turinèius po 50 µl neþinomos koncentracijos baltymo t<strong>ir</strong>palo,pilama vandens iki 200 µl, 200 µl CTC darbinio t<strong>ir</strong>palo <strong>ir</strong> sumaiðoma. Laikoma10 min. kambario temperatûros sàlygomis. Ápilama 100 µl 0,4 N Folino <strong>ir</strong>Èiokateu reagento, nedelsiant sumaiðoma. Laikoma 30 min. kambario temperatûrossàlygomis. Fotoelektrokalorimetru pamatuojama A 750. Baltymo kiekisnustatomas ið kalibravimo kreivës. Jeigu matuojamojo baltymo sugertis yradidelë <strong>ir</strong> nustatyti duomenys nepatenka á kalibravimo kreivës ribas, tadaneþinomos koncentracijos baltymas praskiedþiamas <strong>ir</strong> matavimas kartojamas.Susidarius spalvotam t<strong>ir</strong>palui negalima skiesti t<strong>ir</strong>palo.5.5.4. Baltymo kiekio nustatymasbisinchoninës rûgðties (BCA) metoduÐis metodas panaðus á Louri metodà, taèiau jautresnis. Juo galima nustatyti 0,5 µg/mlbaltymø koncentracijas. Bisinchoninës rûgðties natrio druska gerai t<strong>ir</strong>psta vandenyje,yra stabili, ðarminëje aplinkoje sudaro su Cu 1+ jonais kompleksiná, ryðkiai raudonosspalvos junginá. Ádëjus baltymo t<strong>ir</strong>palo susidaro naujas kompleksinis junginys su Cu 2+jonais, kurio spalvos ryðkumas yra susijæs su baltymo koncentracija t<strong>ir</strong>pale. T<strong>ir</strong>paloðviesos sugertis matuojama ties 562 nm. BCA metodas maþiau jautresnis áva<strong>ir</strong>iomspriemaiðoms negu Louri metodas.Reagentai1. 0,5 mg/ml jauèio serumo albumino t<strong>ir</strong>palas – 2 ml. Laikomas – 20 0 Ctemperatûros sàlygomis.2. Reagentas A – 200 ml (stabilus kambario temperatûros sàlygomis ilgà laikà).T<strong>ir</strong>palo sudëtis:1% BCANa 2, 2% Na 2CO 3, 0,16% Na 2tartratas, 0,4% NaOH,0,95% NaHCO 3. Iðt<strong>ir</strong>pinus reagentus apytikriai 150 ml vandens, koncentruotuNaOH t<strong>ir</strong>palu pasiekiamas pH 11,25 (BCA optimumas), vëliau dejonizuotu
72 _________________________________ BIOCHEMIJOS LABORATORINIAI DARBAIH 2O t<strong>ir</strong>palas praskiedþiamas iki 200 ml.3. Reagentas B – 5 ml (stabilus kambario temperatûros sàlygomis ilgà laikà).4% CuSO 4×5H 2O.4. Standartinis darbinis reagentas (S-DR)S-DR = 100 tûriø A + 2 tûriai B.Ruoðiamas kas savaitæ. Spalva þalsva.Darbo eigaVisiems kalibravimo kreivës taðkams nustatyti procedûra atliekama po 2 kartus.1. Á 8 mëgintuvëlius pilama atitinkamai 10, 20, 30, <strong>ir</strong> 40 µl jauèio serumo albuminot<strong>ir</strong>palo <strong>ir</strong> á kiekvienà vandens iki 50 µl. Á kontrolinius mëgintuvëlius (9,10)pripilama tik 50 µl dejonizuoto vandens.2. Á visus mëgintuvëlius ápilama 950µl S-DR t<strong>ir</strong>palo <strong>ir</strong> sumaiðoma.3. Laikoma 30 min., 37°C temperatûros sàlygomis.4. Atvësinama iki kambario temperatûros, palaikant mëgintuvëlius 5 min. kambariotemperatûros sàlygomis.5. T<strong>ir</strong>palø sugertis matuojama spektrofotometru ties λ=562 nm, ið gautø duomenøbraiþoma kalibravimo kreivë. Ant ordinaèiø aðies atidedama sugertis (A 562), oant abscisiø – baltymo kiekis (µg).6. Á mëgintuvëlá ápilama 50µl t<strong>ir</strong>iamo baltymo t<strong>ir</strong>palo <strong>ir</strong> 950µl S-DR t<strong>ir</strong>palo. Sumaiðiusturi ats<strong>ir</strong>asti rausva spalva. Laikoma 30min, 37 0 C temperatûroje. Atvësinamaiki kambario temperatûros, palaikant mëgintuvëlius 10 min. kambariotemperatûroje. T<strong>ir</strong>palø sugertis matuojama spektrofotometru ties λ=562nm.T<strong>ir</strong>iamo baltymo kiekis nustatomas ið kalibravimo kreivës. Jeigu matuojamojobaltymo sugertis yra didelë <strong>ir</strong> gautas rezultatas nepatenka á kalibracinës kreivësribas, tada neþinomos koncentracijos baltymas praskiedþiamas <strong>ir</strong> matavimaspakartojamas. Negalima skiesti t<strong>ir</strong>palo, kai jau susidarë spalvotas junginys.5.5.5. Baltymø kiekio nustatymas biureto metoduReaguojant vario jonams su peptidiniu ryðiu, susidaro violetinës spalvos kompleksinisjunginys. Ði spalvinë reakcija taikoma baltymø kiekiui nustatyti. Reakcija su biuretoreagentu yra maþiau jautri, negu su Folino reagentu arba BCA. Taèiau, jà atliekant,galima nustatyti didesnius baltymo kiekius. Amonio jonai, TRIS, sacharozë, glicerolistrukdo reakcijai, nes keièia kompleksinio junginio spalvà. Lipidai <strong>ir</strong> detergentai galisudrumsti t<strong>ir</strong>palus.Reagentai1. 0,5mg/ml jauèio serumo albumino t<strong>ir</strong>palas – 2 ml. Laikyti –20 0 C temperatûrossàlygomis.
1. 5. Ðviesos Saugaus sugertis darbo _________________________________________________________________biochemijos laboratorijoje pagrindinës taisyklës 732. Biureto reagentas – 250 ml. 2,25 g NaK tartrato, 0,75 g CuSO 4×5H 2O, 1,25 gKJ paeiliui iðt<strong>ir</strong>pinami 100 ml 0,2 M NaOH. Ápilama vandens iki 250 ml. Jeigususidaro juodos nuosëdos, nufiltruojama.Reagentas laikomas polietileniniame inde.Darbo eigaVisiems kalibravimo kreivës taðkams nustatyti procedûra atliekama po 2 kartus.1. Á 8 mëgintuvëlius ápilama 20, 50, 100 <strong>ir</strong> 200 µl jauèio serumo albumino t<strong>ir</strong>palo<strong>ir</strong> á kiekvienà ápilama vandens iki 200 µìl. Á kontrolinius (9, 10 mëgintuvëlius)ápilama tik 200 µl vandens.2. Á visus mëgintuvëlius ápilama po 800 ìl biureto reagento <strong>ir</strong> sumaiðoma.3. T<strong>ir</strong>palai laikomi kambario temperatûros sàlygomis 15 min.4. T<strong>ir</strong>palø sugertis matuojama spektrofotometru ties λ? 650 nm, ið gautø duomenøbraiþoma kalibravimo kreivë. Ant ordinaèiø aðies paþymima sugertis (A 540), oant abscisiø – baltymo kiekis (µg).5. Á mëgintuvëlá ápilama 50 ìl t<strong>ir</strong>iamo baltymo t<strong>ir</strong>palo, 150 µl vandens <strong>ir</strong> 800 µl Biuretoreagento. Mëginys laikomas kambario temperatûros sàlygomis 15 min. <strong>ir</strong> sugertismatuojama spektrofotometru ties λ = 540 nm arba kalorimetru ties 540–650 nm.T<strong>ir</strong>iamo baltymo kiekis nustatomas ið kalibravimo kreivës. Jeigu matuojamobaltymo t<strong>ir</strong>palo sugertis yra didelë <strong>ir</strong> nustatyti duomenys nepatenka á kalibravimokreivës ribas, tada neþinomos koncentracijos baltymo t<strong>ir</strong>palas yra praskiedþiamas<strong>ir</strong> matavimas kartojamas. Susidarius spalvotam junginiui, negalimaskiesti t<strong>ir</strong>palo.Literatûra1. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. (1951). Protein measurementwith the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem., V.193, p.265–275.2. Cadman E., Bostwick J.R., Eichberg J. (1979). Determination of protein by a modifiedLowry procedure in the presence of some commonly used detergents. Anal.Biochem., V.96, p.21–23.3. Peterson G.L. (1979). Review of the Folin phenol protein quantitation method ofLowry, Rosebrough, Farr and Randall. Anal. Biochem., V.100, p.201–220.4. Bradford M.M.(1976). A rapid and sensitive method for the quantitation ofmicrogram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Anal.Biochem., V. p.248–2545. Smith P.K et al. (1985). Measurement of protein using bicinchoninic acid. AnalyticalBiochemistry V.150, p.76–85.6. Wilson K., Walker J. (2003) Principles and techniques of practical biochemistry,479–485.
74 _________________________________ BIOCHEMIJOS LABORATORINIAI DARBAIKontroliniai klausimai:1. Kurios medþiagos trukdo baltymo kieká nustatyti Bredfordo metodu?2. Kaip spektrines medþiagø savybes lemia terpës rûgðtingumas?3. T<strong>ir</strong>palo koncentracijos priklausomumas nuo ðviesos sugerties. Bero <strong>ir</strong> Lambertodësnis.4. Kurios aminorûgðtys sugeria ðviesà ties 280 nm ?5. Kurios medþiagos daþnai trukdo matuoti baltymø sugertá ultravioletinëje srityje?6. Kokio bangos ilgio ðviesà sugeria peptidiniai ryðiai ?
1. 6. Baltymø Saugaus <strong>ir</strong> darbo peptidø biochemijos merkaptogrupiø laboratorijoje nustatymas pagrindinës __________________________________________taisyklës 756.Baltymø <strong>ir</strong> peptidø merkaptogrupiø nustatymasBiologinis baltymø aktyvumas <strong>ir</strong> makromolekulinë jø struktûra pasikeièia, oksiduojantarba blokuojant baltymø merkaptogrupes (–SH). Ðios grupës gali áeiti á aktyvø fermentocentrà <strong>ir</strong> dalyvauti katalizëje. Jos sudaro disulfidinius ryðius <strong>ir</strong> palaiko baltymo tretinæstruktûrà. Daugelio fermentø aktyvumas yra slopinamas oksiduojant SH grupes arblokuojant jas tam tikrais veiksniais. Merkaptogrupës átraukiamos á tam tikras cheminesreakcijas (acilinimo, oksidacijos, alkilinimo, toliatø susidarymo). Be to SH grupëssudaro vandenilinius ryðius.Merkaptogrupëms nustatyti taikomi ðie metodai: 1) amperometrinis titravimas,naudojant sidabro nitratà; 2) spektrofotometrinis titravimas su p-chlormerkurabenzoatu(pCMB) arba 5,5’–ditio–bis(2–nitrobenzenkarboks<strong>ir</strong>ûgðtimi) – Elmano reagentu.6.1. Merkaptogrupiø nustatymas baltymuose arbapeptiduose titruojant su p-chlormerkurabenzoatup-chlormerkurabenzoatas su laisvomis baltymø ar peptidø SH grupëmis sudarotoliato kompleksà, kurio ðviesos sugerties maksimumas yra ties 250 nm. Matuojantðviesos sugertá ties 250 nm galima nustatyti SH grupiø kieká tenkantá 1 moliui baltymo.6.1.1. p-chlormerkurabenzoato t<strong>ir</strong>palo paruoðimas <strong>ir</strong>jo koncentracijos nustatymas spektrofotometrijos bûduNorint nustatyti baltymø SH grupiø skaièiø, reikia þinoti tikslià p-chlormerkurabenzoatot<strong>ir</strong>palo koncentracijà. p-chlormerkurabenzoato ðviesos sugerties maksimumas yra ties232 nm. pCMB molinës ekstinkcijos koeficientas ε M=1,69×10 4 M –1 cm –1 . Pamatavusp-chlormerkurabenzoato t<strong>ir</strong>palo ðviesos sugertá ties 232 nm, atsiþvelgiant á Bero <strong>ir</strong>Lamberto dësná, galima apskaièiuoti p-chlormerkurabenzoato t<strong>ir</strong>palo koncentracijà.Reagentai:1. 5×10 –4 M p-chlormerkurabenzoato t<strong>ir</strong>palas, 10 ml.2. 0,5 M KCl t<strong>ir</strong>palas (pH 7,6), 25 ml.3. 2,0 M KOH t<strong>ir</strong>palas, 5ml.4. 0,5 M HCl t<strong>ir</strong>palas, 5ml.
76 _________________________________ BIOCHEMIJOS LABORATORINIAI DARBAIDarbo eiga:1. Pasvertas p-chlormerkurabenzoatas suberiamas á 10 ml kolbutæ, pilama 5 mldistiliuoto vandens, paðarminto 2 M KOH iki pH 11(matuojama su indikatoriniupopierëliu).2. Á p-chlormerkurabenzoato t<strong>ir</strong>palà maiðant pamaþu laðinamas 0,5 M HCl t<strong>ir</strong>palas,kol pasiekiama pH reikðmë lygi 7,6 (matuojama pH metru). Álaðinus per daugrûgðties iðkrenta pCMB nuosëdos <strong>ir</strong> t<strong>ir</strong>palas susidrumsèia. Paruoðus skaidrø pH7,6 t<strong>ir</strong>palà, pilamas distiliuotas vanduo iki 10 ml.3. Á dvi spektrofotometro kiuvetes pilama po 2,8 ml KCl t<strong>ir</strong>palo.4. Á vienà kiuvetæ (antroji yra kontrolinë) pilama 0,05 ml p-chlormerkurabenzoatot<strong>ir</strong>palo <strong>ir</strong> kruopðèiai sumaiðoma.5. Pamatuojama t<strong>ir</strong>palo ðviesos sugertis ties 232 nm.6. Á kiuvetæ dar tris kartus ápilama po 0,05 ml p-chlormerkurabenzoato t<strong>ir</strong>palo,kruopðèiai sumaiðoma <strong>ir</strong> kiekvienà kartà pamatuojama t<strong>ir</strong>palo ðviesos sugertisties 232 nm.7. pCMB t<strong>ir</strong>palo koncentracijà apskaièiuojama po kiekvieno p-chlormerkurabenzoatot<strong>ir</strong>palo pridëjimo:C pCMB=A 232× (2,8 + V),1,69 × 10 4 × Vèia A 232– ðviesos sugertis, V – pridëto pCMB t<strong>ir</strong>palo tûris.6.1.2. Glutationo merkaptogrupiø nustatymasReagentai:1. 1×10 –3 M redukuoto glutationo t<strong>ir</strong>palas, 2 ml.2. 5×10 –4 M p-chlormerkurabenzoato t<strong>ir</strong>palas, 1 ml.3. 0,5 M KCl t<strong>ir</strong>palas (pH 7,6), 25 ml.Darbo eiga:1. Á spektrofotometro kiuvetæ pilama 0,1 ml 1×10 –3 M redukuoto glutationo t<strong>ir</strong>palo<strong>ir</strong> 2,7 ml 0,5M KCl t<strong>ir</strong>palo.2. Á kontrolinæ kiuvetæ ápilama 2,8 ml 0,5 M KCl t<strong>ir</strong>palo.3. Á abi kiuvetes ápilama po 0,04 ml p-chlormerkurabenzoato t<strong>ir</strong>palo <strong>ir</strong> kruopðèiaisumaiðoma.4. Po 2 min. matuojama ðviesos sugertis ties 250 nm.5. Tris kartus á abi kiuvetes pilama po 0,04 ml p-chlormerkurabenzoato t<strong>ir</strong>palo,kruopðèiai sumaiðoma.
1. 6. Baltymø Saugaus <strong>ir</strong> darbo peptidø biochemijos merkaptogrupiø laboratorijoje nustatymas pagrindinës __________________________________________taisyklës 776. Po 2 min. matuojama ðviesos sugertis ties250 nm.7. p-chlormerkurabenzoato t<strong>ir</strong>palo priedøtûris sumaþinamas iki 0,02 ml, o po dviejøkartø iki 0,01 ml.8. Po 2 min. matuojama ðviesos sugertis ties250 nm.Matavimai baigiami, kai po naujos p-chlormerkurabenzoatot<strong>ir</strong>palo porcijos pridëjimo6.1 pav. Merkaptogrupiøtitravimo kreivët<strong>ir</strong>palo ðviesos sugertis nebesikeièia.9. Nubrëþiamas ðviesos sugerties A 250priklausomumo nuopridëto p-chlormerkurabenzoato t<strong>ir</strong>palo tûrio grafikas. Nustatomas p-chlormerkurabenzoato t<strong>ir</strong>palo tûris, atitinkantis kreivës lûþio taðkà.Ekvivalentiniame taðke yra susijungusios visos SH grupës. Atsiþvelgiant á sunaudotop-chlormerkurabenzoato kieká galima apskaièiuoti SH grupiø kieká, esantá 1 mol redukuotoglutationo:,n – merkaptogrupiø kiekis, esantis 1 mol glutationo.C 1– t<strong>ir</strong>iamos medþiagos (glutationo) pradinë koncentracija.V 1– t<strong>ir</strong>iamo t<strong>ir</strong>palo tûris.C 2– pradinë pCMB koncentracija.V 2– pridëto pCMB t<strong>ir</strong>palo tûris ekvivalentiniame taðke.6.1.3. Merkaptogrupiø nustatymas baltymuoseReagentai:1. 1 mg albumino, iðt<strong>ir</strong>pinto 1 ml 0,5 M KCl, 10ml.2. 5×10 –4 p-chlormerkuribenzoato t<strong>ir</strong>palas, 1ml.3. 0,5 M KCl t<strong>ir</strong>palas (pH 7,6), 25 ml.Darbo eiga:1. Á vienà spektrofotometro kiuvetæ ápilama 2,8 ml baltymo t<strong>ir</strong>palo, o á kità, kontrolinæ– 2,8 ml 0,5M KCl t<strong>ir</strong>palo.2. Po to á abi kiuvetes ápilama po 0,04 ml 5×10 –4 p-chlormerkurabenzoato t<strong>ir</strong>palo,gerai iðmaiðoma.3. Po 2 min. pamatuojama ðviesos sugertis ties 250 nm.4. Analogiðkai glutationui nustatomas SH grupiø kiekis albumine. NubrëþiamaSH grupiø titravimo kreivë, nustatomas ekvivalentinis taðkas, apskaièiuojamasmerkaptogrupiø kiekis, tenkantis vienam moliui baltymo.
78 _________________________________ BIOCHEMIJOS LABORATORINIAI DARBAI6.1.4. Ðlapalo poveikis SH grupiø kiekiui baltymo molekulëje.Darbo eiga1. Á tris mëgintuvëlius ápilama po 1,5 ml baltymo t<strong>ir</strong>palo <strong>ir</strong> 1,5 ml 2M, 4M, 6Mðlapalo t<strong>ir</strong>palø atitinkamai.2. Inkubuojama 5 min. kambario temperatûros sàlygomis.3. Po inkubacijos nustatomas merkaptogrupiø kiekis visuose trijuose mëgintuvëliuose.4. Nubraiþomas grafikas, atspindintis SH grupiø kiekio priklausomumà nuo ðlapalokoncentracijos.
1. 7. Chromatografija Saugaus darbo biochemijos ________________________________________________________________laboratorijoje pagrindinës taisyklës 797.ChromatografijaChromatografija – junginiø iðskyrimo ið miðiniø, jø gryninimo <strong>ir</strong> analizës metodas.Chromatografijos pradininkas yra rusø botanikas Michailas Cvetas. Tai p<strong>ir</strong>masismokslininkas, kuris 1903 m. sëkmingai iðskyrë kelis augalø pigmentus, miðinápraleisdamas pro kalcio karbonato kolonëlæ. Jis árodë, kad chlorofilas nëra vienintelisaugalø pigmentas. Ðiuo metu chromatografijos technika yra labai tobula. Naudojamosautomatizuotos sistemos, padedanèios iðgryninti ne tik tam tikros struktûros cheminiusjunginius, atsk<strong>ir</strong>ti enantiomerus (stereoizomerus izomerus), bet analizuoti biologiðkaiaktyvias, labilias medþiagas – fermentus, nukleorûgðtisChromatografija gali bûti analizinë, taikoma junginiams nustatyti, struktûraianalizuoti, arba preparatyvinë – iðsk<strong>ir</strong>iant <strong>ir</strong> gryninant didelius medþiagø kiekius7.1. Chromatografijos pasisk<strong>ir</strong>stymo koeficientasBendru atveju visos chromatografinës sistemos susideda ið dviejø sandø– nuostoviosios(stacionariosios) fazës, kuri gali bûti kieta, skysta arba gelis, <strong>ir</strong> ið judriosios fazës , kuribûna skysta (skysèiø chromatografija) arba dujinë (dujø chromatografija). Judriojifazë teka (juda) pro nuostovià fazæ. Chromatografijos specialistai vartoja tokius terminus:nuostovioji fazë daþnai vadinama sorbentu arba neðikliu, o judrioji fazë –eliuentu(t<strong>ir</strong>piklis arba buferis). Eliuentas, turintis iðt<strong>ir</strong>pusià iðsk<strong>ir</strong>iamà medþiagà, vadinamaseliuatu. Nuostovioji <strong>ir</strong> judrioji fazës yra parenkamos tokios, kad iðsk<strong>ir</strong>iamos ið miðiniomedþiagos tarp faziø pasisk<strong>ir</strong>stytø sk<strong>ir</strong>tingai, t. y. turëtø sk<strong>ir</strong>tingà pasisk<strong>ir</strong>stymokoeficientà R f. Pasisk<strong>ir</strong>stymo koeficientas apibrëþia, kaip medþiagos kiekis (koncentracija)pasisk<strong>ir</strong>sto tarp dviejø nesimaiðanèiø faziø A <strong>ir</strong> B. Iðsk<strong>ir</strong>iamos medþiagospasisk<strong>ir</strong>stymo koeficientas yra nekintamas dydis, esant toms paèioms fazëms A <strong>ir</strong> B,pastoviai temperatûrai <strong>ir</strong> kitoms chromatografavimo sàlygoms. Pasisk<strong>ir</strong>stymokoeficientas iðreiðkiamas lygtimi:judriosios fazës A medþiagos koncentracijanuostoviosios fazës B medþaigos koncentracija = R fChromatografija veiksminga, jei visas iðsk<strong>ir</strong>iamos ið miðinio medþiagos kiekis yravienoje ið faziø (A arba B). Tai pasiekiama parenkant chromatografijos bûdà pagalnuostoviosios <strong>ir</strong> judriosios faziø sàveikos mechanizmà:• adsorbcinë chromatografija – hidrofobinës sàveikos chromatografija –adsorbcijos pusiausvyra tarp nuostoviosios kietos <strong>ir</strong> judriosios skystos fazës;
80 _________________________________ BIOCHEMIJOS LABORATORINIAI DARBAI• pasisk<strong>ir</strong>stymo chromatografija – chromatografijos bûdas, kai nuostovioji <strong>ir</strong>judrioji fazës yra nesimaiðantys arba ið dalies susimaiðantys skysèiai, o chromatografuojamamedþiaga pasisk<strong>ir</strong>sto tarp faziø pagal giminingumà (t<strong>ir</strong>pumà);• jonø mainø chromatografija, chromatofokusavimas – jonø pusiausvyra tarpjoninio neðiklio <strong>ir</strong> judriosios fazës buferio ar elektrolito;• giminingumo (afininë), imunoafininë, metalo–chelato–afininë chromatografija– pusiausvyra tarp nuostoviosios fazës imobilizuoto (átverto ligando <strong>ir</strong> skystosjudriosios fazës;• molekuliø iðskyrimo chromatografija, gelchromatografija – kai molekulësatsk<strong>ir</strong>iamos pagal dydá ar formà sieto principu, leidþiant tekëti pro porëtusneðiklius.7.2. Chromatografijos bûdaiMedþiagoms atsk<strong>ir</strong>ti taikomi du pagrindiniai chromatografijos bûdai:• kolonëlinë chromatografija – nuostovioji fazë (sorbentas/neðiklis) yra dedamaá stiklo, plastiko ar metalinæ kolonëlæ, o judrioji fazë teka pro kolonëlæ dëlskysèio lygio sk<strong>ir</strong>tumo arba stumiama siurbliuku. Tai daþniausiai naudojamaschromatografijos bûdas.• plokðèioji (plonasluoksnë, popieriaus) chromatografija – nuostovioji fazë – taiplonu neðiklio sluoksniu padengta stiklo, plastiko ar metalo folijos plokðtelëarba chromatografinio popieriaus celiuliozës pluoðtas. Judrioji fazë (t<strong>ir</strong>pikliøsistema) kapiliarinio veikimo principu teka pro plonà neðiklio sluoksná archromatografiná popieriø. Naudojant ðá chromatografijos bûdà, vienu metu galimaanalizuoti daug mëginiø. Plonasluoksnës chromatografijos procesas yra greitas.Jam reikia maþo t<strong>ir</strong>iamos medþiagos kiekio, todël daþnai naudojamaskokybiniams bandymams arba cheminës sintezës metu stebint reakcijos kinetikà.7.3. Kolonëlinë chromatografija7.3.1. Kolonëlinës chromatografijos árangaNormalaus slëgio kolonëlinei chromatografijai naudojamos stiklinës ar plastikinëscilindro formos áva<strong>ir</strong>aus skersmens <strong>ir</strong> aukðèio kolonëlës. Kolonëlës dugne turi bûtiporëta membrana, sulaikanti kolonëlëje sorbentà, <strong>ir</strong> praledþianti judriàjà fazæ (eliucijosbuferá <strong>ir</strong> chromatografuojamas medþiagas). Komercinëms kolonëlëms sandarintinaudojamos porëto stiklo plokðtelës, pritv<strong>ir</strong>tintos prie specialiø nailoniniø antgaliø,leidþianèiø reguliuoti kolonëlës tûrá. Laboratoriniams darbams daþnai naudojamoskolonëlës, uþkimðtos stiklo plauðø kamðèiais. Kolonëlë plastikiniais vamzdeliais
1. 7. Chromatografija Saugaus darbo biochemijos ________________________________________________________________laboratorijoje pagrindinës taisyklës 81Indas su eliuentuIndas su eliuentuStklinë kolonëlëNeðiklisReguliuojamas stûmoklisNailoniniai diskaiReguliuojamas stûmoklisStiklo vataEliuatas, tekanis ádetektoriø <strong>ir</strong> frakcijøkolektoriø7.1 pav. Chromatografinës kolonëlës:a – laboratorinë kolonëlë, b – komercinë kolonëlësujungiama su detektoriumi <strong>ir</strong>/ar frakcijø kolektoriumi (7.1 pav.) Á ðiuolaikinius aukðtoslëgio chromatografus dedamos plieninës kolonëlës, atlaikanèios aukðtà slëgá <strong>ir</strong> labaigreitai iðsk<strong>ir</strong>ianèios medþiagas7.3.2. Nuostovioji fazë – uþpildas/ sorbentas/neðiklisUþpildu vadinama nuostoviàjà fazæ sudaranti pagrindinë medþiaga. Ji, chemiðkaimodifikavus ar prijungus tam tikras funkcines grupes, vadinama sorbentu arba neðikliu.Uþpildo parinkimas svarbus sëkmingai chromatografijai. uþpildas turi bûti mechaniðkai<strong>ir</strong> chemiðkai atsparus, neuþkimðti kolonëlës, lengvai praleisti judriàjà fazæ (eliuentà).Be to, uþpildas turi turëti funkcines grupes, kurias modifikujant galima bûtø gautisk<strong>ir</strong>tingø savybiø neðiklius.Pagrindiniai uþpildai:• Agarozë – polisacharidas, sudarytas ið pasikartojanèiø agarobiozës fragmentø.Agarobiozë yra disacharidas, sudarytas ið D–galaktozës <strong>ir</strong> 3,6–anhidrogalaktozësliekanø. Taip gaunamas sk<strong>ir</strong>tingo poringumo, stabilus pH pokyèiams agarozësgelis.
82 _________________________________ BIOCHEMIJOS LABORATORINIAI DARBAIKomerciniai agarozës preparatai – Sepharose <strong>ir</strong> Bio–Gel A.Agarobiozë• Celiuliozë – polisacharidas, sudarytas ið â–(1>4)–glikozidiniais ryðiais susijungusiøgliukozës liekanø. Naudojant epichlorhidrinà, gaunama celiuliozë, kurioslinijinës molekulës sujungiamos skersiniais ryðiais. Celiuliozë gaminamagrûdeliais arba plauðinë, yra hidrofiliðka <strong>ir</strong> stabili rûgðtinëje bei ðarminëje terpëse.• Dekstranas – polisacharidas, sudarytas ið á–(1>6)–glikozidiniais ryðiais susijungusiøgliukozës liekanø. Skersiniams ryðiams sudaryti naudojamas epichlorhidrinas.Dekstranas, kaip uþpidas, maþiau stabilus nei celiuliozë. Komercinis preparatas–SephadexPoliakrilamidas – akrilamido polimeras, “susiûtas” N,N,N’,N’–metilenbisakrilamidu.Tai labai patvarus polimeras. Komercinis preparatas – Bio Gel PCH 2CHCONH 2Akrilamidas+RadikalinëkatalizëCH 2(NHCOHC CH 2) 2N,N,N’,N’–metilenbisakrilamidas• Polist<strong>ir</strong>enas – st<strong>ir</strong>eno polimeras, „susiûtas“ divinilbenzenu. Polist<strong>ir</strong>enas,naudojamas kaip uþpildas jonø mainø chromatografijoje, yra stabilus rûgðèiø <strong>ir</strong>ðarmø poveikiui.• Silikagelis – polimeras, sudarytas ið silicio rûgðties (techn. SiO 2× nH 2O, geliopavidalo medþiaga). Ðis polimeras labai hidrofiliðkas, todël silanolio –OH grupiøperteklius yra blokuojamas, veikiant trichlormetilsilanu.
1. 7. Chromatografija Saugaus darbo biochemijos ________________________________________________________________laboratorijoje pagrindinës taisyklës 837.3.3. Kolonëlës paruoðimas <strong>ir</strong> eliucijaChromatografijos sëkmë labai priklauso nuo taisyklingo kolonëlës paruoðimo. Sorbentas(neðiklis) yra suspenduojamas <strong>ir</strong> brinkinamas buferyje. Suspensija, ðvelniai maiðant,lëtai pilama á kolonëlæ. Reikia nuolatos stebëti, kad buferio sluoksnis visada bûtø v<strong>ir</strong>ðneðiklio <strong>ir</strong> nepatektø oro burbuliukai. Pripildyta reikalingo sorbento kiekiu, kolonëlësandariai uþdaroma, kad neiðdþiûtø. Chromatografijai paruoðtas medþiagø miðinysatsargiai plonu sluoksniu uþpilamas ant neðiklio pav<strong>ir</strong>ðiaus tokiu bûdu, kad jis susigertøá v<strong>ir</strong>ðutiná sorbento sluoksná. Vëliau atliekama chromatografija. Pro kolonëlæ leidþiamajudrioji fazë (buferis ar t<strong>ir</strong>piklis). Ðitas procesas vadinamas eliucija Pro kolonëlæjudëdamos sk<strong>ir</strong>tingos medþiagos atsisk<strong>ir</strong>ia <strong>ir</strong> ið kolonëlës iðteka su sk<strong>ir</strong>tingu buferio(eliuato) tûriu. Judriosios fazës tûris, kuris reikalingas tam tikrai medþiagai iðplauti(eliuoti) ið kolonëlës, yra vadinamas eliucijos tûriu. Tekantis ið kolonëlës buferis –eliuatas paprastai prateka detekcijos kiuvetæ, kur yra nuolat matuojama sugertis, esantatitinkamam bangos ilgiui. Registracijos sistema sav<strong>ir</strong>aðiu uþraðo pratekanèio t<strong>ir</strong>palosugertá <strong>ir</strong> braiþo eliucijos profilá, kuriame eliuojamos individualios medþiagos uþraðomostam tikrais „ pikais“. Baltymø chromatografijos atveju matuojama sugertis, kai λ = 280nm, nukleorûgðèiø, kai λ = 250 – 260 nm. Pratekëjæs detekcijos kiuvetæ, eliuatas maþaistûriais, frakcijomis, surenkamas automatiniu frakcijø kolektoriumi. Eliucijos bûdaspriklauso nuo chromatografijos metodo: jonø mainø chromatografijos metu daþniausiainaudojama gradientinë eliucija: kai keièiama buferio joninë jëga arba keièiamas buferiopH; gelchromatografijos metu eliuojama vienu pas<strong>ir</strong>inktu buferiu, nekeièiant buferiopH ar koncentracijos7.4 Plokðèioji (popieriaus <strong>ir</strong> plonasluoksnë) chromatografija7.4.1. Popieriaus chromatografijaVietoje kolonëlës, kurioje neðiklis yra celiuliozë, gali bûti naudojamas specialiaiparuoðtas chromatografinis popierius.Popieriaus chromatografijos metodu galima atsk<strong>ir</strong>ti vienus nuo kitø <strong>ir</strong> identifikuotidaugelá cheminiø junginiø, pvz., nukleozidus, nukleotidus bei aminorûgðtis.Popieriaus chromatografijai reikalingas chromatografinis popierius, chromatografiniscilindras <strong>ir</strong> t<strong>ir</strong>pikliø sistema. Á chromatografijos cilindrà ápilama paruoðta t<strong>ir</strong>pikliøsistema, vëliau merkiamas á ritiná susuktas <strong>ir</strong> susegtas chromatografinio popieriauslakðtas, su uþlaðintos t<strong>ir</strong>iamos medþiagos. Daþniausiai uþlaðinamos þinomos struktûrosmedþiagos kaip þymenys (kontroliniai taðkai) – ðalia t<strong>ir</strong>iamos medþiagos.Chromatografijos procesas vyksta 15–20 val.: chromatografiniu popieriumi kyla t<strong>ir</strong>piklis(popierius pamaþu drëgsta), <strong>ir</strong> kartu neða uþlaðintas ant popieriaus medþiagas. T<strong>ir</strong>iamø
84 _________________________________ BIOCHEMIJOS LABORATORINIAI DARBAImedþiagø iðsidëstymas chromatogramoje priklauso nuo cheminës jø prigimties <strong>ir</strong>t<strong>ir</strong>pumo judriojoje bei nuostoviojoje chromatografinës sistemos fazëse. Ðiuo atvejunuostoviosios fazës vaidmená atlieka popieriaus lakðtà sudarantis celiuliozës pluoðtas<strong>ir</strong> jame suriðtas vanduo. Chromatografiná popieriø gamina áva<strong>ir</strong>ios komercinës kompanijos,popieriaus savybës sk<strong>ir</strong>iasi. Atsiþvelgiant á celiuliozinio pluoðto tanká, chromatografinispopierius sk<strong>ir</strong>stomas á „greità“, „vidutinio greièio“ <strong>ir</strong> „lëtàjá“, nes sk<strong>ir</strong>tingugreièiu juo teka chromatografinë sistema. Popieriaus celiuliozë yra higroskopiðka, á jossudëtá áeina suriðtas vanduo, nors <strong>ir</strong> skrupulingai iðdþiovinta. Medþiagø pasisk<strong>ir</strong>stymaschromatografuojant popieriaus chromatografijos bûdu vyksta tarp nuostoviosios fazës(celiuliozës suriðto vandens) <strong>ir</strong> judrios fazës – organinio t<strong>ir</strong>piklio. Chromatografijainaudojamose t<strong>ir</strong>pikliø sistemose taip pat yra vandens. Judriosios fazës funkcijà atliekaáva<strong>ir</strong>ûs organiniai t<strong>ir</strong>pikliai (izopropilo alkoholis, n–propanolis, n–butanolis, tretinis–butanolis, etanolis), áeinantys á chromatografines sistemas. Juo didesnis medþiagøt<strong>ir</strong>pumas judriojoje fazëje (hidrofobinës medþiagos) <strong>ir</strong> juo maþesnis nuostoviojoje(hidrofilinës medþiagos), tuo greièiau tos medþiagos juda kartu su organiniu t<strong>ir</strong>pikliu.Ant chromatogramos (popieriaus lakðto) iðsiskyrusios medþiagos nustatomospanaudojant áva<strong>ir</strong>iais bûdais. Chromatografuojamos spalvotos medþiagos nustatomosið pasisk<strong>ir</strong>sèiusiø spalvotø dëmiø, nespalvotas medþiagas galima ryðkinti savitaisiaisreagentais. Aminorûgðtys ar peptidai ryðkinami apipurðkiant ninhidrinu. Vietos, kurioseyra ðios medþiagos, nusidaþo violetine spalva. Nukleozidai, nukleotidai ar kitosmedþiagos, sugerianèios UV ðviesà, nustatomos chromatoskopu.. Ðiø medþiagøsusitelkimo vietose matomos tamsios dëmës.Atsiþvelgiant á judriosios fazës judëjimo kryptá popieriaus chromatografija sk<strong>ir</strong>stomaá tris pagrindines rûðis – ratinæ, kylanèià <strong>ir</strong> nusileidþianèià.7.4.2. Plonasluoksnë chromatografijaPlonasluoksnei chromatografijai vietoje chromatografinio popieriaus naudojamos aliuminio,plastiko ar stiklo plokðtelës, padengtos neorganinëmis medþiagomis – silikageliu(silicio oksidu), aliuminio oksidu, magnio silikatu, ar organinës prigimties medþiagomis– celiulioze, polietileno ar kito polimero milteliais. Serbento, dengianèio plokðteles,sluoksnis bûna 0,2–0,5 mm storio. Ðiuo metu komercinës kompanijos gamina áva<strong>ir</strong>ausdydþio <strong>ir</strong> sk<strong>ir</strong>tingais neðikliais padengtas plokðteles, kurias pagal poreikius galimapanaudoti áva<strong>ir</strong>ioms medþiagoms atsk<strong>ir</strong>ti ar identifikuoti. UV–ðviesà sugerianèiømedþiagø (pvz., nukleotidø) chromatografijai sk<strong>ir</strong>tos plokðtelës yra padengtos neðikliu,sumaiðytu su savitu UV ðviesoje ðvytinèiu daþu. Chromatogramos vietos, kuriose yranukleotidinës prigimties medþiagos, apðvietus UV ðviesa, yra tamsios, o chromatografinësplokðtelës fonas ðvyti. Aminorûgðtys ant chromatografiniø plokðteliø
1. 7. Chromatografija Saugaus darbo biochemijos ________________________________________________________________laboratorijoje pagrindinës taisyklës 85ryðkinamos ninhidrinu. Chromatografijos principas naudojant plokðteles yra panaðus ápopieriaus chromatografijà, tik neðiklis ið dalies atlieka <strong>ir</strong> sorbento funkcijas.Plonasluoksnë chromatografija yra daug greitesnë <strong>ir</strong> reikia labai maþai t<strong>ir</strong>iamosmedþiagos. Ði chromatografija vyksta tik 1–2 val., nes t<strong>ir</strong>pikliø sistema plokðtelëmiskyla labai greitai.7.5. Chromatografijos metodai7.5.1. Adsorbcinë chromatografijaÐi chromatografija grindþiama adsorbcijos principu: kai net<strong>ir</strong>pios medþiagos – neðikliai/absorbentai – ant savo pav<strong>ir</strong>ðiaus sugeba sulaikyti iðt<strong>ir</strong>pusias molekules. Tai adsorbcijosprosesas, paremtas silpnais tarpmolekuliniais ryðiais – van der Valso sàveika,vandeniliniais ryðiais, bet ne joniniais ar kovalentiniais ryðiais. Adsorbcinë chromatografijadaþniau naudojama maþos molekulinës masës medþiagoms atsk<strong>ir</strong>ti.. Ðios chromatografijosprincipas taikomas ne tik kolonëlinei, bet <strong>ir</strong> plonasluoksnei chromatografijai.Adsorbcinei chromatografijai daþniausiai naudojami neðikliai pateikti7.1 lentelëje.7.1 lentelë. Adsorbcinës chromatografijos neðikliaiNešiklis/sorbentasAliuminio oksidasSilikagelisAktyvintosios anglysKalcio fosfatinis gelisHidroksiapatitasAtsk<strong>ir</strong>iamos medžiagosMažos molekulinės masės organinėsmedžiagos, peptidaiAminorūgštys, nukleotidai, steroidaiAngliavandeniai, aminorūgštys, peptidaiBaltymai, polinukleotidaiNukleorūgštys, oligonukleotidai7.5.2 Pasisk<strong>ir</strong>stymo chromatografijaÐis chromatografijos bûdas dar vadinamas skysèiø chromatografija, nes nuostovioji <strong>ir</strong>judrioji fazës yra skysèiai. Medþiagø pasisk<strong>ir</strong>stymas tarp nuostoviosios <strong>ir</strong> judriosiosfaziø grindþiamas giminingumo (t<strong>ir</strong>pumo) sk<strong>ir</strong>tumu. Didþiausia chromatografuojamosmedþiagos koncentracija bus tame skystyje, kuriame ji geriausiai t<strong>ir</strong>psta. Nuostoviosiosfazës skystis gali bûti porëto neðiklio grûdeliuose, panaðiai kaip gelchromatografijosatveju (sk. 3.4.), gali bûti suriðtas su neðiklio pluoðto, kuriuo pripildyta kolonëlë, arbagali plonu sluoksniu padengti nuostoviosios fazës neðiklio grûdelius. Hidrofiliniaineðikliai – celiuliozë, poliakrilamidas, deksranas brinkdami suriða daug vandens, kurisatlieka nuostoviosios fazes funkcijà.. Judrioji fazë ðiuo atveju yra organiniø t<strong>ir</strong>pikliømiðinys.
86 _________________________________ BIOCHEMIJOS LABORATORINIAI DARBAINuostovioji fazë popieriaus chromatografijoje taip pat yra vanduo, suriðtas suchromatografinio popieriaus celiuliozës pluoðtu, o judrioji fazë – organiniø t<strong>ir</strong>pikliømiðinys. Chromatografuojamø medþiagø pasisk<strong>ir</strong>stymas priklauso nuo jø hidrofobiðkumo.Atliekant popieriaus chromatografijà, geriau organiniuose t<strong>ir</strong>pikliuoset<strong>ir</strong>pstanèios medþiagos visada juda toliau su t<strong>ir</strong>pikliø miðiniu, o hidrofilinës medþiagosatsilieka, nes yra giminingesnës vandeninei fazei.Kai kada pasisk<strong>ir</strong>stymo chromatografijos fazës parenkamos atv<strong>ir</strong>kðèiai, t. y., prieneðiklio plonu sluoksniu adsorbuojamas ar cheminiais ryðiais prijungiamas organinist<strong>ir</strong>piklis, o judrioji fazë yra vandenis t<strong>ir</strong>palas. Ðis bûdas vadinamas atv<strong>ir</strong>kðtinës fazëschromatografija (reversed phase chromatography).7.5.3. Jonø mainø chromatografijaÐi chromatografija grindþiamai sàveika tarp sk<strong>ir</strong>tingus krûvius turinèiø molekuliø.Daugelis biologiðkai aktyviø junginiø – baltymai, nukleorûgðtys – turi funkcines grupes,kurios vandeniniuose t<strong>ir</strong>paluose gali jonizuotis, t. y. ágyti teigiamà arba neigiamà krûvá.Krûvis priklauso nuo funkciniø grupiø pK a<strong>ir</strong> nuo buferio pH. Jonø mainøchromatografijai naudojami jonø mainø neðikliai turintys galinèiais jonizuotis funkcinesgrupes. Ðie neðikliai bûna katijoniniai arba anijoniniai. Katijonø mainø neðikliøneigiamàjá krûvá turinèios funkcinës grupës sàveikauja su chromatografuojamømedþiagø katijoninëmis grupëmis. Ðie neðikliai dar vadinami rûgðtiniais jonø mainøneðikliais, nes neigiamas jø krûvis priklauso nuo rûgðtiniø funkciniø grupiø jonizacijos.Anijonø mainø neðikliai turi teigiamàjá krûvá, jie vadinami baziniais neðikliais, nesteigiamàjá krûvá generuoja protonà prisijungusios bazinës funkcinës grupës.Jonø mainai vyksta keliais etapais, jonø pasikeitimas yra pusiausv<strong>ir</strong>asis procesas:Katijonø mainai:RSO 3–..Na + + + NH 3R / RSO 3..... + NH 3R / + Na +Neðiklis Chromatuografuojama Neðiklio <strong>ir</strong> chromat. medþ.medþiagasàveikaAnijonø mainai:(R) 4N + .....Cl – + – OOCR / ( R) 4N + … – OOCR / + Cl –Neðiklis Chromatuografuojama Neðiklio <strong>ir</strong> chromat. medþ.medþiagasàveikaPagrindiniai jonø mainø chromatografijoje naudojami neðikliai pateikiami 7.2lentelëje.
1. 7. Chromatografija Saugaus darbo biochemijos ________________________________________________________________laboratorijoje pagrindinës taisyklës 877.2 lentelë. Pagrindiniai jonø mainø neðikliaiNešiklio rūšis Užpildas Funkcinė grupė Funkcinės grupėspavadinimasKatijonų mainų(silpnai rūgštinisKatijonų mainų(stipriai rūgštinisAnijonų mainų(silpnai bazinis)Anijonų mianų(stipriai bazinis)AgarozėCeliuliozėDekstranasPoliakrilatasCeliuliozėDekstranasPolist<strong>ir</strong>enasAgarozėCeliuliozėDekstranasPolist<strong>ir</strong>enasCeliuliozėDekstranasPolist<strong>ir</strong>enas–COO ––CH 2 COO -––SO 3––CH 2 SO 3––CH 2 CH 2 CH 2 SO 3–CH 2 CH 2 N + H 3– CH 2 CH 2 N + H(CH 2 CH 3 ) 2–CH 2 N + (CH 3 ) 3– CH 2 CH 2 N + ( CH 2 CH 3 ) 3Karboksi-Katrboksimetil-Sulfo-Sulfometil-Sulfopropil-Aminoetil-Dietilaminoetil-Trimetilaminometil-Trietilaminoetil-Visus joninius neðiklius charakterizuoja bendroji joninë talpa, kurià apibrëþiagalimø pakeisti jonø miliekvivalentø skaièius vienam gramui sausojo neðiklio arbahidratuoto neðiklio vienam tûrio vienetui.Parenkant chromatografijai neðiklá, atsiþvelgiama á t<strong>ir</strong>iamo pavyzdþio sandøstabilumà, santykinæ molekulinæ masæ <strong>ir</strong> savituosius atskyrimo poreikius. Biologiðkaiaktyvios medþiagos, ypaè baltyma <strong>ir</strong> fermentai, yra stabilûs tik siaurame pH intervale.Todël baltymø chromatografijai parenkami jonø mainø neðikliai atrankûs tame pHintervale. Eliucijai parenkami tokie buferiai, kad pH bûtø artimas chromatografuojamomiðinio izoelektriniam taðkui. Eliucijai naudojami to paties pH, bet sk<strong>ir</strong>tingos jonøkoncentracijos buferiai (gradientinë eliucija), arba keièiamas buferio pH.7.5.4. Molekuliø iðskyrimo chromatografija (gelchromatografija)Molekuliø atskyrimas pagal jø dydá <strong>ir</strong> formà grindþiamas molekulinio sieto principu:molekulës atsk<strong>ir</strong>iamos tam tikro skersmens (dydþio) poras turinèiais neðikliais.Chromatografijos bûdas, kai naudojamos gelinës polimerinës medþiagos, vadinamasgelchromatografija arba gelfiltracija. Ðis chromatografijos principas yra labai paprastas.Kolonëlë pripildoma porëto stiklo ar gelio maþøjø grûdeliø (mikrogranulëmis),suspenduotø judriosios fazës buferyje. Ant kolonëlës uþpilamas sk<strong>ir</strong>tingo dydþiomolekuliø miðinys. Didelës molekulës ið kolonëlës eliuojamos p<strong>ir</strong>miausia, nes josnepatenka á neðiklio poras <strong>ir</strong> ið kolonëlës iðstumiamos. Maþesnës molekulës pasisk<strong>ir</strong>stoatitinkamo dydþio gelio porose <strong>ir</strong> ið kolonëlës eliuojamos, iðsisijoja pagal dydá vienapaskui kità, 7.2 pav.
88 _________________________________ BIOCHEMIJOS LABORATORINIAI DARBAIJudriojifazëJudriojifazëGranulësDidelës t<strong>ir</strong>pinio molekulësMaþos t<strong>ir</strong>pinio molekulësEliuatasEliuatas7.2 pav.. Sk<strong>ir</strong>tingo dydþio molekuliø atskyrimas gelchromatografijos bûduGelchromatografijai naudojami neðikliai pateikti 7.3 lentelëje.7.3 lentelë. Pagrindiniai gelchromatografijos neðikliaiPolimerasDekstranasDekstranasAgarozėAgarozėPoliakrilamidasPrekybinispavadinimasSefadeksas(Sephadex)Sefakrilas(Sephacryl)Sefarozė(Sepharose)Biogelis(Bio-Gel)Biogelis(Bio-Gel)G-10G-25G-50G-75G-100G-200S-200S-300S-4006B4B2BA5mA15mA50mA150mP2P6P30P100P300Atsk<strong>ir</strong>iamų medžiagų molekulinė masė 1)M m ×10 -3
1. 7. Chromatografija Saugaus darbo biochemijos ________________________________________________________________laboratorijoje pagrindinës taisyklës 89Gelchromatografijos taikymas:• Gryninimas. Biologinëms makromolekulëms grynininti, atsk<strong>ir</strong>ti nuo maþesniøar didesniø molekuliø. Naudojant áva<strong>ir</strong>ias porëto stiklo grûdelius ar sk<strong>ir</strong>tingusgelinius neðiklius galima iðsk<strong>ir</strong>ti <strong>ir</strong> iðgryninti v<strong>ir</strong>usus, baltymus, fermentus,nukleorûgðtis, polisacharidus, antikûnus.• Molekulinei masei nustatyti. Globuliniø baltymø eliucijos buferio tûris priklausonuo baltymo molekulinës masës. Praleidus pro kolonëlæ þinomos molekulinësmasës baltymus <strong>ir</strong> iðmatavus jø eliuato tûrá, galima sudaryti kalibrvimo kreivæ –nustatyti santykinê neþinomo baltymo molekulinê masê.• T<strong>ir</strong>palø koncentravimas Didelës molekulinës masës molekuliø praskiesti t<strong>ir</strong>palai(pvz.. aktyvaus iðgryninto fermento preparatas) gali bûti sukoncentruotas pridëjussauso, b<strong>ir</strong>aus sefadekso G–25. Vandená <strong>ir</strong> maþos molekulinës masës molekulessugers sefadekso grûdeliai, o didelës molekulës liks t<strong>ir</strong>pale Vëliau gelá paðalinticentrifuguojant.• Nudruskinimas Panaudojant sefadekso G–10 ar G–25 kolonëles galima atsk<strong>ir</strong>tididelës molekulinës masës molekules nuo á druskø, <strong>ir</strong> maþos molekulinës masës<strong>ir</strong>imo (degradacijos) produktø. Nudruskinimo metodas yra daug greitesnis <strong>ir</strong>veiksmingesnis negu dializë. Taikant ðá metodà, galima paðalinti fenoliopriemaiðas ið nukleorûgðèiø preparatø, amonio sulfatà po baltymø iðsodinimoarba druskø pertekliø po jonø mainø chromatografijos.7.5.5. Giminingumo (afininë) chromatografijaÐis chromatografijos metodas buvo sukurtas fermentams ið gamtiniø ðaltiniø iðsk<strong>ir</strong>ti<strong>ir</strong> gryninti. Naudojant giminingumo chromatografijà, galima gauti ypaè. grynus fermentopreparatus. Vëliau ðis metodas pritaikytas nukleorûgðtims, imunoglobulinams,biologiniø membranø receptoriams, atsk<strong>ir</strong>oms làstelëms iðsk<strong>ir</strong>ti <strong>ir</strong> gryninti. Naudojantðá chromatografijos bûdà, reikia, kad iðsk<strong>ir</strong>iamas ið baltymø miðinio fermentas savitaisusijungtø su neðiklio ligandu * . Eliuojant buferiu, ið kolonëlës p<strong>ir</strong>miausia iðteka visineprisijungæ baltymai ar peptidai, t. y. nesavitos ligandui medþiagos. Prisijungæs prieligando fermentas ið kolonëlës iðplaunamas keièiant eliucijos sàlygas. Naudojantnespecifinæ (nesavitàjà) eliucijà, didinama buferio joninë jëga arba keièiamas pH.Specifinës (giminingumo) eliucijos atveju, á eliucijos buferá dedama substrato arbafermento slopiklio (gráþtamojo), kurio giminingumas fermentui yra didesnis neguligando. Tokiomis eliucijos sàlygomis nutraukiamas ligando <strong>ir</strong> fermento ryðys, <strong>ir</strong> grynasfermentas iðplaunamas nuo kolonëlës. (7.3. pav.)*Ligandas – tai prie pildo prijungtas (imobilizuotas) junginys, savitai sàveikaujantis suiðsk<strong>ir</strong>iama makromolekule ar kita medþiaga (7.3 pav.)
90 _________________________________ BIOCHEMIJOS LABORATORINIAI DARBAIImobilizuotasligandasNeðiklisFermentasAfininë eliucijaarbaPrie ligado prisijungæsfermentasNespecifinë eliucijaNeðiklisDializëOptimaliø sàlygøatstatymasIðgrynintasfermentas7.3 pav. Fermento gryninimo schema naudojant giminingumo chromatografijàGiminingumo chromatografijai yra labai svarbu pas<strong>ir</strong>inkti tinkamà ligandà. Reikiaþinoti iðsk<strong>ir</strong>iamos medþiagos savybes, t. y. su kokios cheminës struktûros junginiais jisudaro savituosius ryðius. Jei iðsk<strong>ir</strong>iama medþiaga sàveikauja tik su vieninteliu ligandu,tai vadinama giminingumo (biospecifine) sàveika, pvz., fermentas su kofermentu.Daþniausiai naudojami ligandai giminingumo chromatografijai pateikiami 7.4 lentelëje.7 4 lentelë. Giminingumo chromatografijos ligandaiLigandas5’-AMP2’5’-ADPKalmodulinasAvidinasRiebalų rūgštysHeparinasBaltymai A arba GKonkanavalinas ASojų lektinasFenilboronatasPoliALizinasCibachrono mėlynasis F3G-AGiminingumasNuo NAD + priklausomos dehidrogenazės, kai kurioskinazėsNuo NADP + priklausomos dehidrogenazėsKalmoduliną prisijungiantys baltymaiBaltymai, turintys biotinoBaltymai, prisijungiantys riebalų rūgštisLipoproteinai, lipazės, DNR polimerazės, augimofaktoriai, serino proteazių (peptidazių) slopikliaiImunoglobulinaiGlikoproteinai, turintys a-D-gliukop<strong>ir</strong>anozilo liekanasGlikoproteinai, turintys N-acetil-α-( arba β)-galaktop<strong>ir</strong>anozilo liekanasGlikoproteinaiRNR saviti baltymai arba RNR, turinčios poli U sekasrRNRBaltymai, prisijungiantys nukleotidus, koaguliacijosveiksniai
1. 7. Chromatografija Saugaus darbo biochemijos ________________________________________________________________laboratorijoje pagrindinës taisyklës 917.6. Aminorûgðèiø <strong>ir</strong> nukleotidø nustatymas7.6.1. Plonasluoksnë chromatografijaReagentai <strong>ir</strong> medþiagos1. Plonasluoksnë chromatografinë plokðtelë.2. Aminorûgðèiø t<strong>ir</strong>palai ( 1% , po 1 ml.).3. Nukleozidø <strong>ir</strong> nukleotidø t<strong>ir</strong>palai ( 1% , po 1 ml.).4. mikroðv<strong>ir</strong>kðtas arba stikliniai kapiliarai.5. 0,1% ninhidrino t<strong>ir</strong>palas acetone.6. Chromatografinë t<strong>ir</strong>pikliø sistema – izopropilo alkoholis: konc. amoniakas:H 2O, v/v (7:1:2).7. Chromatografinis cilindriukas.8. Chromatoskopas (prietaisas, turintis UV lempà).Darbo eiga1. Paimama chromatografinë plokðtelë <strong>ir</strong> 0,5–1,0 cm atstumu nuo kraðtonubrëþiama starto linija (7.4. pav.).2. Ant jos 1 – 2 cm nuotoliu vienas nuo kito stikliniu kapiliaru arba mikroðv<strong>ir</strong>kðtu( po 2–3 µl) uþlaðinami t<strong>ir</strong>iamø medþiagø mëginiai. Tai gali bûti aminorûgðtys,nukleotidai, nukleozidai <strong>ir</strong> neþinoma medþiaga. Palaukiama kol dëmës iðdþiûsta.3. Chromatografinë plokðtelë dedama á chromatografiná indà turintá t<strong>ir</strong>pikliøsistemà. T<strong>ir</strong>piklio ápilama á chromatografinio indo dugnà tik tiek, kad ásimerktøplokðtelës kraðtas, bet t<strong>ir</strong>piklis nesiektø starto linijos.4. Chromatografija atliekama 1–1,5 val., paskui plokðtelë iðimama, paþymima„fronto“ linija, t. y. vieta, iki kurios sudrëkusi plokðtelë. Plokðtelë iðdþiovinamatraukos spintoje.5. Plokðtelëse aminorûgðèiø susitelkimo vietos nustatomos, apipurðkiant 0,1-0,2%acetoniniu ninhidrino t<strong>ir</strong>palu. Nukleozidai <strong>ir</strong> nukleotidai nustatomi apðvieèiantchromatogratografinæ plokðtelæ UV ðviesa. Ðie junginiai sugeria UV ðviesà, todëlchromatogramoje nukleozidø ar nukleotidø susitelkimo vietose matomostamsios dëmës.6. Iðmatuojami a <strong>ir</strong> b nuotoliai (cm) <strong>ir</strong> apskaièiuojami pasisk<strong>ir</strong>stymo koeficientaiR f. Pasisk<strong>ir</strong>stymo koeficientas, tai :a. R f= a/bAtstumas a– nuo starto linijos iki dëmës centroAtstumas b–nuo starto linijos iki fronto linijos
92 _________________________________ BIOCHEMIJOS LABORATORINIAI DARBAIfrontasstartas7.4 pav. Plonasluoksnës chromatografinës plokðtelës paruoðimas7. Palyginus þinomø <strong>ir</strong> t<strong>ir</strong>iamø medþiagø pasisk<strong>ir</strong>stymo koeficientus, sprendþiama,kokios neþinomos medþiagos buvo paimtos.7.6.2. Ratinë popieriaus chromatografijaReagentai <strong>ir</strong> prietaisai1. Chromatografinis popierius.2. Aminorûgðèiø t<strong>ir</strong>palai (1% , po 1 ml.).3. Nukleozidø <strong>ir</strong> nukleotidø t<strong>ir</strong>palai (1% , po 1 ml.).4. 0,1% ninhidrino t<strong>ir</strong>palas acetone.5. Petri lëkðtelë.6. Mikroðv<strong>ir</strong>kðtas arba stikliniai kapiliarai.7. Chromatografinë sistema – izopropilo alkoholis: konc. amoniakas : H 2O, v/v(7:1:2).Darbo eiga1. Ant chromatografinio popieriaus uþdedama Petri lëkðtelë, aplink jà pieðtukuapibrëþiamas skritulys <strong>ir</strong> iðkerpamas. Ðio skritulio centre pieðtuku nubrëþiamas1 cm spindulio apskritimas <strong>ir</strong> nuo skritulio kraðto iki jo centro ákerpama 1 cmploèio juosta (7.5 pav.). Ji naudojama kaip dagtis, ámerkti á chromatografinæsistemà.2. Centrinis apskritimas yra starto linija, ant kurios vienodu nuotoliu viena nuokitos kapiliaru arba mikroðv<strong>ir</strong>kðtu uþlaðinamos aminorûgðtys (kontrolinai taðkai)<strong>ir</strong> ðalia t<strong>ir</strong>iama medþiaga. Kiekvienos medþiagos laðinama po 2-3 µl á taðkà.Bûtina uþlaðinti ypaè maþais laðeliais <strong>ir</strong> palaukti, kol tos medþiagos laðelis iðdþius.
1. 7. Chromatografija Saugaus darbo biochemijos ________________________________________________________________laboratorijoje pagrindinës taisyklës 933. Uþlaðinus visus mëginius, chromatografiniopopieriaus skritulys uþdedamasant Petri lëkðtelës, á kurià ápiltachromatografinës t<strong>ir</strong>pikliø sistemos.Skritulys turi laikytis ant Petri lëkðtelëskraðtø, o dagtis ám<strong>ir</strong>kti á chromatografinæsistemà.4. Taip paruoðta chromatograma uþdengiamadangteliu <strong>ir</strong> paliekama 1,5-2 val.,kol t<strong>ir</strong>piklio frontas pasiekia popieriauskraðtà.5. Tada chromatograma iðimama, paþymimafronto linija (sudrëkusios chromatogramoskraðto linija), iðdþiovinama traukos spintoje <strong>ir</strong> apipurðkiama 0,1-0,2%ninhidrino t<strong>ir</strong>palu (jei uþlaðintos aminorûgðtys). Ninhidrinà reikia purkðtiatsargiai, geriausiai uþsimovus gumines p<strong>ir</strong>ðtines, nes ninhidrinas iðryðkins netik ant chromatogramos esanèias aminorûgðtis, bet <strong>ir</strong> p<strong>ir</strong>ðtus nudaþys violetinespalva.6. Apipurkðta chromatograma palaikoma 10 min. dþiovinimo spintoje, aminorûgðèiøsusitelkimo vietose iðryðkëja violetinës dëmës.7. Pamatuojami a <strong>ir</strong> b nuotoliai (cm) <strong>ir</strong> apskaièiuojami pasisk<strong>ir</strong>stymo koeficientaiR f. Pasisk<strong>ir</strong>stymo koeficientas, tai:R f= a/b7.5 pav. Ratinës chromatogramosparuoðimasNuotolis a– nuo starto linijos iki dëmës centroNuotolis b–nuo starto linijos iki fronto linijosÐis koeficientas taip pat apskaièiuojamas <strong>ir</strong> neþinomos aminorûgðties. Palyginusvisus koeficientus, sprendþiama, kokios buvo neþinomos aminorûgðtys.7.6.3. Kylamoji chromatografijaReagentai <strong>ir</strong> prietaisai1. Chromatografinis popierius.2. Tam tikrø aminorûgðèiø t<strong>ir</strong>palai ( 1% , po 1 ml).3. Nukleozidø <strong>ir</strong> nukleotidø t<strong>ir</strong>palai ( 1% , po 1 ml).4. Mikroðv<strong>ir</strong>kðtas arba stikliniai kapiliarai.5. 0,1% ninhidrino t<strong>ir</strong>palas acetone.6. Chromatografinë sistema – izopropilo alkoholis: konc. amoniakas : H 2O, v/v(7:1:2).
94 _________________________________ BIOCHEMIJOS LABORATORINIAI DARBAI7. Chromatografinis cilindras.8. Chromatoskopas (prietaisas turintis UV lempà).Darbo eiga17. Kylamoji popieriaus chromatograma paruoðiama panaðiai kaip chromatografinëplokðtelë, tik naudojamas chromatografinis popierius.a. Ant chromatografinio popieriaus lapo (30×30cm) 3 cm nuotoliu nuo kraðtonubrëþiama starto linija.b. Ant jos 2 – 5cm atstumu viena po kitos stikliniu kapiliaru arba mikroðv<strong>ir</strong>kðtu(5 – 10µl) uþlaðinama t<strong>ir</strong>iamø medþiagø t<strong>ir</strong>palø. Tai gali bûti aminorûgðtys,nukleotidai, nukleozidai <strong>ir</strong> neþinoma medþiaga.c. Palaukiama kol dëmës iðdþiûsta, vëliau chromatografinis popieriussusukamas <strong>ir</strong> susegamas á cilindrà, dedamas á chromatografiná indà, turintát<strong>ir</strong>pikliø sistemà. T<strong>ir</strong>piklio ápilama á indo dugnà tik tiek, kad ásimerktøchromatografinio popieriaus kraðtas, bet t<strong>ir</strong>piklis nesiektø starto linijos.d. Chromatografija atliekama 12-18 val., paskui chromatograma iðimama, paþymimafronto linija, iðdþiovinama kambario temperatûroje traukos spintoje.e. Popieriaus chromatogramose aminorûgðèiø susitelkimo vietos nustatomos,apipurðkiant chromatogramà 0,1% acetoniniu ninhidrino t<strong>ir</strong>palu. Nukleozidai<strong>ir</strong> nukleotidai chromatogramoje nustatomi apðvieèiant chromatogramàUV ðviesa, nes ðie junginiai sugeria UV ðviesà, todël chromatogramojenukleozidø ar nukleotidø susitelkimo vietose yra tamsios dëmës.f. Apskaièiuojami R f–pasisk<strong>ir</strong>stymo koeficientai.i. R f= a/bNuotolis a – nuo starto linijos iki dëmës centroNuotolis b – nuo starto linijos iki fronto linijosPalyginus þinomø <strong>ir</strong> t<strong>ir</strong>iamø medþiagø pasisk<strong>ir</strong>stymo koeficientus, sprendþiama,kokios neþinomos medþiagos buvo uþlaðintos ant popieriaus chromatogramos.Sk<strong>ir</strong>tingø aminorûgðèiø, nukleotidø ar nukleozidø pasisk<strong>ir</strong>stymo koeficientas R f,nëra vienodas Jis priklauso nuo t<strong>ir</strong>iamø medþiagø struktûros <strong>ir</strong> chromatografijos sàlygø:t<strong>ir</strong>pikliø sistemos, temperatûros, popieriaus rûðies.Nusileidþiamoji chromatografija yra analogiðka kylamajai, tik popieriaus lakðtaschromatografiniame inde dedamas „þemyn galva“, t. y. pritv<strong>ir</strong>tinamas taip, kad t<strong>ir</strong>piklispopieriumi teka þemyn, o ne kyla á v<strong>ir</strong>ðø. Ði chromatografija vyksta ðiek tiek greièiau,nei kylamoji, bet medþiagø pasisk<strong>ir</strong>stymo principas yra toks pat.
1. 7. Chromatografija Saugaus darbo biochemijos ________________________________________________________________laboratorijoje pagrindinës taisyklës 957.7. Mëlynojo dekstrano nudruskinimasgelchromatografijos metoduGelchromatografija grindþiamai molekuliø iðsijojimo pricipu, kuriam naudojamospolimerinës – gelinës medþiagos, turinèios sk<strong>ir</strong>tingo dydþio poras (7.5.4.sk).Darbo tikslas: gelchromatografijos bûdu nudruskinti mëlynojo dekstrano preparatà.Reagentai <strong>ir</strong> prietaisai:1. Iðbrinkintas sefadeksas G–10, G–25 ar kitas gelfiltracijai tinkamas neðiklis.2. K 2Cr 2O 7(druska).3. Mëlynasis dekstranas (polisacharidas, kurio molekulinë masë 2×10 6 Da.).4. Kolonëlë.5. Mëgintuvëliai.6. Fotoelektrokolorimetras arba spektrofotometras.Darbo eiga7.7.1. Kolonëlës pildymas1. Apatinis kolonëlës galas (jei nëra stiklo tarpinës) uþkemðamas stiklo vatosgumulëliu taip, kad pro já galëtø tekëti vanduo, bet nepraleistø maþøjø sorbentogrûdeliø.2. Kolonëlë tiksliai staèiai átv<strong>ir</strong>tinama stove, <strong>ir</strong> atsargiai pilant iðbrinkinto neðikliosuspensijà pripildoma (7.6 pav.).Vanduo arbabuferis0,5 cm 1–2 cmSefadekasVatos arba stiklopluoðto kamðtisKolonëlësspaustuka7.6 pav. Gelchromatografijos (gelfiltracijos) kolonëlë
96 _________________________________ BIOCHEMIJOS LABORATORINIAI DARBAI3. Pilant neðiklio suspensijà, kolonëlës spaustuvas turi bûti atidarytas, kad pratekëtøvanduo., taèiau reikia stebëti, kad v<strong>ir</strong>ð neðiklio kolonëlëje visada bûtø apie 0,5cm vandens sluoksnis (kolonëlëje neðiklis negali bûti sausas).4. Pripildþius kolonëlæ, spaustukas uþspaudþiamas.7.7.2. Pavyzdþio paruoðimas <strong>ir</strong> uþpylimas ant kolonëlës1. Paruoðiamas tokios sudëties t<strong>ir</strong>palas: 1 ml 5% K 2Cr 2O 7, kuriame iðt<strong>ir</strong>pinamasmëlynasis dekstranas. Dekstrano koncentracija miðinyje turi bûti 0,5% (gaunamasspalvotas miðinys).2. Prieð laðinant medþiagø miðiná ant kolonëlës, reikia kolonëlës spaustuvà lëtaiatsukti, kad vanduo nuo neðiklio pav<strong>ir</strong>ðius nutekëtø <strong>ir</strong> liktø tik minimalussluoksnis.3. Tada, ant neðiklio pav<strong>ir</strong>ðiaus pagal kolonëlës sienelæ automatine pipete uþpilama1 ml paruoðto spalvoto medþiagø miðinio (nesuplakti <strong>ir</strong> nepaþeisti neðikliosluoksnio). Ðis miðinys turi susigerti á neðiklá. Neleiskite iðdþiûti kolonëlei!4. Chromatografuojamam miðiniui susigërus, ant kolonëlës atsargai pilamas vanduo.Ðioje chromatografijoje vanduo (judrioji fazë), tekëdamas pro neðiklá (nuostoviojifazë) eliuoja uþpiltas medþiagas.5. Pratekantá t<strong>ir</strong>palà, maþais tûriais – frakcijomis (po 2 – 3 ml) galima surinkti áatsk<strong>ir</strong>us graduotus mëgintuvëlius <strong>ir</strong> pamatuoti frakcijø sugertá fotoelektrokolorimetru(FEK) arba spektrofotometru.6. Frakcijas, kuriose yra K 2Cr 2O 7(geltonos/oranþinës spalvos ) matuojamos Nr.4filtru, o mëlynos spalvos (dekstrano ) frakcijos Nr.7.filtru Spektrofotometrumatuojama, atitinkamai, kai ë – 440 nm <strong>ir</strong> ë – 590 nm.7. Remiantis matavimø duomenis, nubraiþomas sugerties priklausomumo nuopratekëjusio vandens tûrio grafikas.7.8. Hemoglobino molekulinës masës nustatymasgelchromatografijos bûduBiocheminiø tyrimø metu molekulinæ baltymø masæ galima nustatyti gelchromatografijos(7.5.4. sk), NDS–PAGE elektroforezës ( xxx sk.) <strong>ir</strong> ultracentrifugavimo tankiogradientu metodais.Gelchromatografijos metodu baltymø molekulës frakcionuojamos atsiþvelgiant ádydá, todel galima nustatyti apytikrià molekulinæ masæ. Oligomeriniai baltymaigelchromatografijoje neiðsisk<strong>ir</strong>ia á atsk<strong>ir</strong>us subvienetus, todël nustatoma bendraoligomerinio baltymo molekulinë masë. NDS elektroforezës (elektroforezë denatûravimosàlygomis) bûdu frakcionuojant baltymus, oligomeriniai baltymai denatûruoja<strong>ir</strong> gelyje matomi atsk<strong>ir</strong>i polipeptidai (baltymo subvienetai).
1. 7. Chromatografija Saugaus darbo biochemijos ________________________________________________________________laboratorijoje pagrindinës taisyklës 97Ðio darbo metu, naudojant sefadekso G–75 kolonëlæ nustatoma molekulinëhemoglobino masë. Molekulinë masë apskaièiuojama ið (1) formulës:lgM = 5,624 – 0,752 V e/V o, (1)M – molekulinë masë; V e– eliuato tûris, kuriame ið kolonëlës iðteka hemoglobinas; V o– tarpgrûdelinis arba laisvasis kolonëlës tûris.Konstantos 5,624 <strong>ir</strong> 0,752 nustatytos bandymais. Norint nustatyti V o,á kolonëlæápilamas maþas kiekis didelës molekulinës masës medþiagos t<strong>ir</strong>palo. Vëliau kolonëleleidþiamas eliuentas. Eliuato tûris, kuriame ið kolonëlës iðteka didelës molekulinësmasës medþiaga, <strong>ir</strong> yra tarpgrûdelinis tûris V o. Ðiam tikslui daþniausiai yra naudojamasmëlynasis dekstranas, kurio molekulinë masë 2×10 6 Da.Reagentai <strong>ir</strong> prietaisai1. 0,1 M NaCl turinti 0,02% NaN 3– 500 ml.2. 1% hemoglobino t<strong>ir</strong>palas 0,1 M NaCl, turintis 0,02% NaN 3– 1 ml. Prieðnaudojimà ðá t<strong>ir</strong>palà centrifuguoti 5 min staline centrifuga.3. 1% mëlynojo dekstrano t<strong>ir</strong>palas 0,1 M NaCl, turinèio 0,02% NaN 3– 1 ml. Prieðnaudojimà ðá t<strong>ir</strong>palà centrifuguoti 5 min. staline centrifuga.4. 13,5 cm 3 tûrio kolonëlë, pripildyta sefadekso G–75 <strong>ir</strong> praplauta 0,1M NaClt<strong>ir</strong>palu turinèiu 0,02% NaN 3.Darbo eiga:7.8.1. Sefadekso G–75–kolonëlës V onustatymas:1. Atspaudþiamas kolonëlës spaustukas <strong>ir</strong> nuleidþiamas ið kolonëlës t<strong>ir</strong>palas, esantisv<strong>ir</strong>ð neðiklio taip, kad pav<strong>ir</strong>ðius nebûtø sausas.. Vëliau spaustukas uþspaudþiamas.2. Ant gelio pav<strong>ir</strong>ðiaus atsargiai pagal kolonëlës sienelæ ápilama 0,2 – 0,5 mlcentrifuguoto mëlynojo dekstrano t<strong>ir</strong>palo <strong>ir</strong> atspaudþimas kolonëlës spaustukas;leidþiama mëlynajam dekstrano t<strong>ir</strong>palui susigerti á kolonëlëje esantá neðiklá.3. Kai tik mëlynasis dekstranas ásiskverbia á neðiklá, atsargiai pipete pagal kolonëlëssienelæ pilamas eliucijos t<strong>ir</strong>palas (0,1 M NaCl su 0,02% NaN 3) tokiu bûdu iðkolonëlës eliuojamas dekstranas. Iðtekantis ið kolonëlës nespalvotas eliuatassurenkamas á 10 ml tûrio matavimo cilindrà arba graduotà mëgintuvëlá. Kaieliucijos metu ið kolonëlës pradeda tekëti mëlynas t<strong>ir</strong>palas, jis surenkamas áatsk<strong>ir</strong>us mëgintuvëlius labai maþomis frakcijomis po 5 laðus.4. Eliuatas ið ðiø mëgintuvëliø (pradedant nuo p<strong>ir</strong>mosios frakcijos <strong>ir</strong> baigiantmëgintuvëliu , turinèiu paèià ryðkiausià spalvà (spalvos ryðkumà galimanustatyti matuojant spektrofotometru, λ 670 nm) * , supilamasá matavimo cilindrà,*Matavimui mëginiai paruoðiami tokiu bûdu: ið mëgintuvëliø, kuriø eliuato spalvosryðkumas bus matuojamas, paimama po 100 µl eliuato, supilama á atsk<strong>ir</strong>us mëgintuvëlius<strong>ir</strong> pridedama po 1ml vandens. Matuoti esant λ 670 nm arba λ 440 nm.
98 _________________________________ BIOCHEMIJOS LABORATORINIAI DARBAIkur yra surinktas nespalvotas eliuatas. Tos eliuato frakcijos, kuriø spalvosryðkumas pradeda silpnëti, neáskaitomos.Eliuato tûris ml, kuris surinktas nuo eliucijos pradþios iki ryðkiausiosfrakcijos, <strong>ir</strong> yra tarpgrûdelinis arba laisvasis kolonëlës tûris – V o.7.8.2. Sefadekso G–75–kolonëlës V enustatymas:1. Kartojamas V onustatymo atveju apraðytas bandymas, tik vietoje mëlynojodekstrano á kolonëlæ ápilama 0,5 ml centrifuguoto 1% hemoglobino t<strong>ir</strong>palo.Eliuato tûris, surinktas nuo bandymo pradþios iki frakcijos, turinèiosryðkiausià roþinæ spalvà, yra V e. (Spalvos ryðkumà galima nustatyti matuojantspektrofotometru, λ 440 nm) x2. Apskaièiuojama hemoglobino molekulinë masë ið (1) formulës.3. Baigus darbà, kolonëlë plaunama 0,1 M NaCl, turinèiu 0,02% NaN 3t<strong>ir</strong>palo <strong>ir</strong>saugoma uþspaudus spaustukà. V<strong>ir</strong>ð neðiklio pav<strong>ir</strong>ðiaus turi bûti apie 1 cm aukðèioskysèio stulpelis.Literatûra1. Principles and Techniques of Practical Biochemistry, (2003), Cambridge Univ. press,p.619–6892. Îñòåðì àí Ë.À. Õðîì àòîãðàôèÿ áåëêîâ è íóêëåèíîâûõ êèñëîò, (1985), Íàóêà , Ìî ñêâà,p.145–154.*Matavimui mëginiai paruoðiami tokiu bûdu: ið mëgintuvëliø, kuriø eliuato spalvosryðkumas bus matuojamas, paimama po 100 µl eliuato, supilama á atsk<strong>ir</strong>us mëgintuvëlius<strong>ir</strong> pridedama po 1ml vandens. Matuoti esant λ 670 nm arba λ 440 nm.
1. 8. Baltymø Saugaus elektroforezë darbo biochemijos ____________________________________________________________laboratorijoje pagrindinës taisyklës 998.Baltymø elektroforezëElektroforezës metu ákrautos molekulës juda elektriniame lauke. Ðis metodas labaiplaèiai taikomas biomolekulëms atsk<strong>ir</strong>ti <strong>ir</strong> apibûdinti. Ákrautø molekuliø judrumaselektriniame lauke priklauso nuo jø dydþio <strong>ir</strong> formos, krûvio <strong>ir</strong> cheminës prigimties.Biologiniø makromolekuliø (baltymø, nukleorûgðèiø) elektroforezë daþniausiai yraatliekama buferiais prisotintuose geliuose (poliakrilamido, agarozës). Molekuliøjudrumas tokiuose geliuose priklauso nuo elektrinio lauko stiprumo <strong>ir</strong> gelio porø dydþio.Elektroforezës metu galima frakcionuoti molekuliø miðinius, nustatyti t<strong>ir</strong>iamosmedþiagos grynumà, suþinoti molekulines baltymø mases. Elektroforezæ galima atliktigulsèiose arba staèiose geliø plokðtelëse. Ji bûna vienkryptë <strong>ir</strong> dvikryptë. Dvikryptëselektroforezës metu ið pradþiø baltymai yra atsk<strong>ir</strong>iami izoelektrinio fokusavimobûdu.Toliau toje paèioje gelio plokðtelëje, statmenai p<strong>ir</strong>mai krypèiai, atliekamaelektroforezë. Atliekant dvikryptæ elektroforezæ, galima suþinoti ne tik baltymømolekuliø dydá, bet <strong>ir</strong> jø krûvá. Dvikryptë elektroforezë yra galingas metodassudëtingiems baltymø miðiniams frakcionuoti <strong>ir</strong> plaèiai taikomas proteomikoje. Atlikusvienkryptæ ar dvikryptæ baltymø elektroforezæ <strong>ir</strong> elektroeliucijos ar elektroperneðimobûdais perkëlus juos ant polibrenu (heksadimetrinbromidas) aptrauktø stiklo pluoðtolapeliø arba polivinilidendifluorido (PVDF) membraniniø filtrø, galima nustatytinorimø baltymø aminorûgðèiø sekas. Ðie metodai yra suderinami su aminorûgðèiøsekø nustatymu dujinës fazës baltymø sekoskaièiais (sekvenatoriais).Baltymø elektroforezë gali bûti nenutrûkstamoji <strong>ir</strong> nutrûkstamoji. Nenutrûkstamosioselektroforezës metu elektriniame lauke nagrinëjamos molekulës juda gelyje,prisotintame tam tikros koncentracijos <strong>ir</strong> pH buferio. Baltymams atsk<strong>ir</strong>ti daþniausiaitaikomas nutrûkstamas gelelektroforezës metodas, 1970 m. apraðytas Lemli.ElektrodasV<strong>ir</strong>ðutinëtalpyklaÐulinëliaibaltymams ápiltiElektrodasApatinëtalpyklaAtramastiklamsTarpinës8.1 pav. Statusis baltymø elektroforezës aparatas
100 _________________________________ BIOCHEMIJOS LABORATORINIAI DARBAINutrûkstamos elektroforezës metu baltymø molekulës ið pradþiø juda koncentruojamuojugeliu, turinèiu dideles poras <strong>ir</strong> vëliau pereina á gelá, turintá daug maþesnesporas. Nutrûkstamos elektroforezës metu baltymø miðinys yra sukoncentruojamas ásiaurà juostelæ, todël á ðulinëlius galima pilti <strong>ir</strong> daugiau praskiestus baltymø t<strong>ir</strong>palusnegu nenutrûkstamos elektroforezës atveju. Koncentruojamasis <strong>ir</strong> sk<strong>ir</strong>iamasis geliaiyra prisotinami sk<strong>ir</strong>tingos koncentracijos <strong>ir</strong> pH buferiais. Ðiuose geliuose gaunamas <strong>ir</strong>sk<strong>ir</strong>tingas átampos gradientas. Koncentruojamajame gelyje esanèiame buferyje yra chlorojonø (pagrindiniai), kuriø elektroforezinis judris yra daug didesnis uþ baltymø molekuliøjudrá. Elektroforezës buferyje yra glicino jonø (atsiliekantieji), kuriø elektroforezinisjudris yra maþesnis uþ baltymø molekuliø judrá. Elektroforezës metu greitai judantysjonai palieka maþo laidumo sritá, esanèià tarp jø paèiø <strong>ir</strong> judanèiø baltymø molekuliø,<strong>ir</strong> ðioje srityje padidëjusi átampa verèia baltymø molekules greièiau judëti. Tokiu bûdusrityje tarp pagrindiniø <strong>ir</strong> atsiliekanèiøjø jonø, judanèiø baltymø molekulës yrasukoncentruojamos á siaurà juostelæ, kuria áeina á sk<strong>ir</strong>iamàjá gelá. Palyginti sukoncentruojamuoju geliu, sk<strong>ir</strong>iamojo gelio poros yra maþos, ten esanèio buferiokoncentracija <strong>ir</strong> pH reikðmë yra didesnë. Ðiame gelyje glicino (atsiliekantieji) jonaijuda tuoj pat uþ baltymø molekuliø <strong>ir</strong> baltymø judrumas gelyje priklauso tik nuo jømolekuliø dydþio (denatûravimo sàlygomis) arba molekuliø formos, dydþio <strong>ir</strong> krûvio(nedenatûravimo sàlygomis). Nedenatûruojantys geliai yra naudojami „ágimtiems“baltymams iðsk<strong>ir</strong>ti <strong>ir</strong> t<strong>ir</strong>ti. Prieð elektroforezæ denatûravimo sàlygomis baltymai veikiamimaþos molekulinës masës merkapto junginiais (2-merkaptoetanoliu ar ditiotreitoliu)<strong>ir</strong> natrio dodecilsulfatu (NDS), kaitinant verdanèio vandens vonioje. Merkapto junginia<strong>ir</strong>edukuoja disulfidinius tiltelius, esanèius baltymo molekulëje. Dël hidrofobinëssàveikos natrio dodecilsulfatas prisijungia prie denatûravusiø polipeptidø. Daugumaibaltymø 1,4 mg natrio dodecilsulfato prisijungia prie 1 mg baltymo. Disociavusiøsulfogrupiø perteklius suteikia polipeptidams didelá neigiamàjá krûvá. Daugumaibaltymø neigiamo krûvio dydþio <strong>ir</strong> baltymo masës santykis yra pastovus. Dël atostûmiojëgø tarp neigiamai ákrautø disociavusiø dodecilsulfato liekanø polipeptido grandinëágauna elipsoido formà. Ðio elipsoido dydis priklauso nuo polipeptido grandinës ilgio.Elektroforezës metu dodecilsulfato <strong>ir</strong> polipeptidø kompleksø judëjimo greièiaipoliakrilamido gelyje priklauso tik nuo jø dydþiø.Baltymø molekulës atsisk<strong>ir</strong>ia poliakrilamido gelyje, turinèiame 5–15 % akrilamido<strong>ir</strong> 0,2–0,5 % N,N’- metilenbisakrilamido. Ðiomis sàlygomis yra stebimatiesinë priklausomybë tarp santykinio baltymø molekuliø elektroforezinio judrio <strong>ir</strong>jø molekuliniø masiø logaritmo (8.2 pav.).
1. 8. Baltymø Saugaus elektroforezë darbo biochemijos ___________________________________________________________laboratorijoje pagrindinës taisyklës 101Molekulinë masë (×10 –3 )Santykinis judris (R f)8.2 pav. Tipiðkas kalibracinis grafikas, nubrëþtas atlikus þinomos molekulinës masësáprastiniø baltymø nutrûkstamà elektroforezæ denatûravimo sàlygomis.(A)-7 % poliakrilamido gelis, (B)-11 % poliakrilamido gelis.8.1. Elektra <strong>ir</strong> elektroforezëReikia þinoti, kad elektros srovës stiprumas <strong>ir</strong> átampa, kuri yra sukuriama elektroforezësmetu, yra pavojinga þmogaus gyvybei. Taigi d<strong>ir</strong>bant privalu laikytis saugaus darbotaisykliø:1. Elektroforezës aparato apsauginá dangtelá galima uþdëti arba nuimti tik tuomet,kai maitinimo ðaltinis yra iðjungtas. Niekada abiejomis rankomis neuþdëkite <strong>ir</strong>nenuimkite elektroforezës aparato apsauginio dangtelio, nes gali susidarytipotencialiai m<strong>ir</strong>tina elektros grandinë (per abi rankas krûtinës làsta <strong>ir</strong> ð<strong>ir</strong>dissusijungia su neizoliuotais laidais). Prieð darbà patikrinkite visus laidus <strong>ir</strong> jungtis.Atspurusius <strong>ir</strong> paþeistus laidus pakeiskite naujais.2. Ásitikinkite, kad prieð elektroforezæ maitinimo ðaltinio miliampermetras <strong>ir</strong>voltmetras nustatyti ties nulinëmis padalomis. Pradedant elektroforezæ,nustatoma reikiama átampa, srovës stiprumas ar elektrinio lauko galia. Baiguselektroforezæ, maitinimo ðaltinio miliampermetras <strong>ir</strong> voltmetras vël nustatomities nulinëmis padalomis <strong>ir</strong> tik tuomet jis iðjungiamas <strong>ir</strong> nuimamas apsauginiselektroforezës aparato dangtelis. Dëmesio! Niekada po elektroforezës neatjunkiteaparato nuo maitinimo ðaltinio prieð tai jo neiðjungæ, nes tuomet iðjungtamemaitinimo ðaltinyje ilgà laikà pasilieka gana dideli kiekiai elektros krûviø. Prisilietusprie tokio iðjungto maitinimo ðaltinio iðëjimo lizdø galima gauti elektros smûgá.
102 _________________________________ BIOCHEMIJOS LABORATORINIAI DARBAI8.2. Omo dësnis <strong>ir</strong> elektroforezëNorint suprasti, kaip veikia gelelektroforezës aparatas, reikia prisiminti Omo dësná:átampa (V) = srovës stiprumas (I) × varþa (R), arba V = IR. Elektros grandinëjepoliakrilamido gelá galima vertinti kaip tam tikrà varþà, o maitinimo ðaltiná – kaipelektros srovës tiektuvà. Dauguma maitinimo ðaltiniø elektroforezës metu gali palaikytigrandinëje arba pastovø elektros srovës stiprumà, arba átampà. Kai kurie ðaltiniai galipalaikyti pastovø elektrinio lauko galingumà: galingumas = átampa × srovësstiprumas, arba VI = I 2 R.Vienkryptëje staèioje gelelektroforezës sistemoje daþniausiai katodas dedamas v<strong>ir</strong>ðutinëjeelektrodinio buferio talpykloje, o anodas – apatinëje. Tai vadinamoji anijoninësistema, kurioje neigiamai ákrautos baltymø ar nukleorûgðèiø molekulës juda anodolink, esanèio apatinëje elektrodinio buferio talpykloje. Baltymø NDS-poliakrilamidinëgelelektroforezë (NDS-PAGE) yra anijoninë sistema, nes natrio dodecilsulfatas turineigiamàjá krûvá <strong>ir</strong> sudaro junginius su baltymais.Kartais baltymø elektroforezë yra atliekama katijoninëje sistemoje. Ðioje sistemojebaltymø molekulës ákrautos teigiamai. Tai pasiekiama naudojant rûgðtinius buferius(pvz. acto rûgðties/karbamido buferiai histonams atsk<strong>ir</strong>ti) arba katijoninius ploviklius(pvz, cetiltrimetilamonio bromidas, CTAB). Katijoninës elektroforezës sistemoselektrodø padëtis yra prieðinga negu anijoninës sistemos.Baltymø NDS-PAGE daþniausiai atliekama esant nekintamam elektros srovësstiprumui. Standartinëje Lemli sistemoje NDS-PAGE metu gelio varþa didëja. Jeiguyra palaikomas nekintamas elektros srovës stiprumas, tuomet turi didëti átampa.Daþnai maitinimo ðaltiniai turi daugiau negu vienà porà iðëjimo lizdø. Ðios lizdøporos lygiagreèiai sujungtos tarpusavyje. Jeigu daugiau negu vienas gelelektroforezësaparatas yra tiesiogiai prijungtas prie ðiø lizdø, tai geliai yra sujungti lygiagreèiai(8.3 pav.). Tuomet átampa kiekviename gelyje yra vienoda. Kitais þodþiais tariant, jeigumaitinimo ðaltinyje yra nustatyta 100 V átampa, tai <strong>ir</strong> kiekviename gelyje tarp elektrodøyra 100 V. Taèiau bendras elektros srovës stiprumas yra lygus sumai sroviø stiprumø,esanèiø kiekviename gelyje.Kelis gelelektroforezës aparatus galima prijungti <strong>ir</strong> prie vienos maitinimo ðaltinioiðëjimo lizdø poros. Tuomet elektroforezës aparatai yra sujungiami tarpusavyje. Tamtikrus gelius galima sujungti lygiagreèiai arba nuosekliai (8.3 pav.). Jeigu keli geliai yraprijungti prie tos paèios iðëjimo lizdo poros nuosekliai, tai elektros srovës stiprumaskiekviename gelyje yra lygus bendram srovës stiprumui. Pavyzdþiui, jeigu maitinimoðaltinio miliampermetras rodo 10 mA, tai kiekviename gelyje <strong>ir</strong>gi teka 10 mA srovë.Taèiau ðiuo atveju bendra átampa yra lygi sumai átampø, esanèiø kiekviename gelyje.Pavyzdþiui, jeigu esant pastoviam elektros srovës stiprumui 10 mA viename gelyje yra100 V átampa, tai du vienodi geliai, sujungti nuosekliai, sukels 200 V (100 V kiekvienas).
1. 8. Baltymø Saugaus elektroforezë darbo biochemijos ___________________________________________________________laboratorijoje pagrindinës taisyklës 1038.3 pav. Gelelektroforezës aparatø prijungimo prie maitinimo ðaltinio bûdaiJeigu turime þemosios átampos maitinimo ðaltiná, tai átampos dydis apibrëþia galimybæsujungti nuosekliai daugiau gelelektroforezës aparatø.Poliakrilamido gelio storis taip pat turi reikðmës santykiui tarp elektros srovësstiprumo <strong>ir</strong> átampos. 1,5 mm storio gelá galima vertinti kaip du 0,75 mm storio gelius,sujungtus lygiagreèiai. Ðiuo atveju srovës stiprumas sumuojasi, todël norint pasiekti tàpaèià pradinæ átampà <strong>ir</strong> elektroforezës laikà, 0,75 mm storio geliui reikës perpusmaþesnio elektros srovës stiprumo negu 1,5 mm storio geliui. Jeigu gelio storispadvigubëja, tai <strong>ir</strong> srovës stiprumas turi bûti padvigubintas. Elektroforezei storuosegeliuose yra reikalingos didelës srovës. Dël ðios prieþasties elektroforezës metu geliaikaista. Iðsiskyrusi ðiluma blogina baltymø elektroforezës sk<strong>ir</strong>iamàjà galià. Tokiegelelektroforezës aparatai privalo turëti auðinimo sistemas.8.3. Vienkryptë staèioji nutrûkstamoji baltymø gelelektroforezëdenatûravimo sàlygomis (atsiþvelgiant á Lemli)Gelelektroforezës metu baltymø molekuliø judëjimo greitis poliakrilamido gelyje priklausonuo elektrinio lauko stiprumo <strong>ir</strong> gelio porø dydþio (didinant akrilamidokoncentracijà poros maþëja).Daþniausiai nutrûkstamoji baltymø NDS-poliakrilamidinë gelelektroforezë yraatliekama taikant standartinæ Lemli pasiûlytà metodikà. Yra <strong>ir</strong> kitø alternatyviøelektroforezës metodø, daþniausiai taikomø savitiems tikslams pasiekti (pvz., peptidamsar maþiems baltymams atsk<strong>ir</strong>ti). Vienkryptëje gelelektroforezëje denatûravimosàlygomis (esant 0,1 % natrio dodecilsulfato) baltymø molekulës elektriniame laukepoliakrilamido gelyje juda anodo link <strong>ir</strong> atsisk<strong>ir</strong>ia – tai priklauso nuo molekulinës jømasës (8.2 pav.). Nutrûkstamosios baltymø elektroforezës metu elektroforezës aparate
104 _________________________________ BIOCHEMIJOS LABORATORINIAI DARBAIyra paruoðiamas sk<strong>ir</strong>iamasis poliakrilamido gelis, ant kurio v<strong>ir</strong>ðaus polimerinamaskoncentruojamasis poliakrilamido gelis, turintis ðulinëlius pavyzdþiams ápilti. Prieðápilant baltymus á ðulinëlius, jie denatûruojami, pridëjus á mëginius natrio dodecilsulfato<strong>ir</strong> 2-merkaptoetanolio arba ditiotreitolio <strong>ir</strong> laikant verdanèiame vandenyje.Staèioji baltymø elektroforezë yra atliekama tam tikro dydþio poliakrilamido gelioplokðtelëse. Daþniausiai jos bûna apie 14×14 cm dydþio. Yra naudojamos <strong>ir</strong> maþesnësplokðtelës (6×8 cm). Tokie geliai vadinami minigeliais. Baltymø atskyrimo gebaminigeliuose yra maþesnë negu didesniuose geliuose, taèiau elektroforezei reikia maþiaureagentø <strong>ir</strong> baltymus galima atsk<strong>ir</strong>ti per trumpesná laikà.8.3.1. Poliakrilamido gelio paruoðimasPoliakrilamido gelis susidaro polimerizuojant akrilamidà. Linijinës poliakrilamidograndinës yra skersai sujungiamos N,N / -metilenbisakrilamidu. Polimerizacijos reakcijasukeliama amonio peroksosulfatu, o TEMED (tetrametiletilendiaminas) yra ðiosreakcijos katalizatorius (8.3 pav.).Renkantis sk<strong>ir</strong>iamojo gelio akrilamido koncentracijà atsiþvelgiama á atsk<strong>ir</strong>iamøbaltymø molekuliniø masiø dydá. Rekomenduojamas 5 % gelis atsk<strong>ir</strong>ti denatûruotusbaltymus 60–200 kDa, 10 % gelis: 16–70 kDa <strong>ir</strong> 15 % gelis: 12–45 kDa (8.1 lentelë).8.3 pav. Akrilamido <strong>ir</strong> N,N’-metilenbisakrilamido kopolimerizacijos reakcija
1. 8. Baltymø Saugaus elektroforezë darbo biochemijos ___________________________________________________________laboratorijoje pagrindinës taisyklës 1058.1 lentelë. Sk<strong>ir</strong>iamojo poliakrilamido gelio paruoðimas aPradiniai t<strong>ir</strong>palai30 % akrilamidas/0,8 %metilenbisakrilamidas4× TRIS⋅HCl/NDS buferispH 8,8Galutinė akrilamido koncentracija sk<strong>ir</strong>iamajame gelyje (%) b5 6 7 7,5 8 9 10 12 13 152,5 3,00 3,50 3,75 4,00 4,50 5,00 6,00 6,50 7,53,75 3,75 3,75 3,75 3,75 3,75 3,75 3,75 3,75 3,75H 2O 8,75 8,25 7,75 7,50 7,25 6,75 6,25 5,25 4,75 3,7510 % (svoris/tūris) amonioperoksosulfatas0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05 0,05TEMED 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01ab15 ml sk<strong>ir</strong>iamajam geliui paruoðti (pakanka 0,75 mm × 14 cm × 14 cm gelio plokðtelei).Lentelëje nurodyti skaièiai reiðkia atitinkamø t<strong>ir</strong>palø tûrius, iðreikðtus ml. Akrilamidokoncentracija sk<strong>ir</strong>iamajame gelyje pas<strong>ir</strong>enkama atsiþvelgiant á atsk<strong>ir</strong>iamø baltymømolekuliniø masiø dydá.Sk<strong>ir</strong>iamasis poliakrilamido gelis polimerinamas tarp stiklø elektroforezës aparatogardelëje. Polimerizacijos reakcija kambario temperatûros sàlygomis atliekama per30–60 min. Ant susidariusio sk<strong>ir</strong>iamojo gelio v<strong>ir</strong>ðaus polimerinamas stambiaporis(3–4 %) koncentruojamasis poliakrilamido gelis. Jame padaromi ðulinëliai, baltymøpavyzdþiams ápilti. Paruoðus sk<strong>ir</strong>iamàjá <strong>ir</strong> koncentruojamàjá gelius, stiklai su geliaisástatomi á elektroforezës aparatà. Á v<strong>ir</strong>ðutinæ <strong>ir</strong> apatinæ aparato talpyklas pripilamaelektroforezës buferio. Buferis turi pripildyti koncentruojamajame gelyje esanèiusðulinëlius (v<strong>ir</strong>ðutinëje talpykloje) <strong>ir</strong> skalauti sk<strong>ir</strong>iamojo gelio apaèià (apatinëjetalpykloje). Reikia ásitikinti, ar buferis neiðteka ið v<strong>ir</strong>ðutinës talpyklos.8.3.2. Baltymø paruoðimas elektroforezei<strong>ir</strong> jø ápilimas á koncentruojamojo gelio ðulinëliusBaltymai denatûruojami, pripilant natrio dodecilsulfato t<strong>ir</strong>palo <strong>ir</strong> 2-merkaptoetanolioar ditiotreitolio. Miðinys kaitinamas verdanèio vandens vonioje. Jeigu po elektroforezësbaltymai bus nustatomi daþant Coomassie mëliu, tai á 0,8 cm ploèio ðulinëlárekomenduojama ápilti 25–50 µg baltymo < 20 µl tûryje (kai miðinyje yra daug sk<strong>ir</strong>tingøbaltymø) <strong>ir</strong> 1–10 µg (kai miðinyje yra vienas arba keli sk<strong>ir</strong>tingi baltymai). Jeigu poelektroforezës bus daþoma sidabru, tuomet á ðulinëlá reikia ápilti 10–100 kartø maþiaubaltymo (0,01–5 µg < 20 µl tûryje, atsiþvelgiant á baltymø miðinio sudëtá).Rekomenduojama, prieð pripilant denatûruojamøjø agentø, baltymø t<strong>ir</strong>palus laikyti0ºC temperatûros sàlygomis <strong>ir</strong> denatûruojamøjø agentø t<strong>ir</strong>palus (kambariotemperatûros) pripilti á leduose esantá 1,5 ml plastikiná mëgintuvëlá, turintá baltymømiðinio. Kad negaruotø, mëgintuvëlá reikia dengti dangteliu, miðiná sumaiðyti sûkurine
106 _________________________________ BIOCHEMIJOS LABORATORINIAI DARBAIpurtykle <strong>ir</strong> nedelsiant ádëti 3–5 min. á verdanèio vandens vonià. Negalima kambariotemperatûros sàlygomis ilgai laikyti baltymø kartu su denatûruojamaisiais agentais,nes prieð kaitinimà 100 0 C temperatûra, tokioje terpëje ypaè aktyvios endogeninëspeptidazës, kurios gali suardyti miðinyje esanèius t<strong>ir</strong>iamus baltymus. Be denatûruojamøjøagentø, t<strong>ir</strong>iamø baltymø preparatuose dar yra glicerolio ~ 10 % (tûrio) <strong>ir</strong>bromfenolio mëlynojo.Ðv<strong>ir</strong>kðtu, turinèiu tiesiai nupjautà adatà, á ðulinëlius ápilami paruoðti baltymøpavyzdþiai. Baltymø pavyzdþiø t<strong>ir</strong>palai yra klampûs, todël jie plonu sluoksniuuþsluoksniuojami ant ðulinëliø dugno. Á nepanaudotus ðulinëlius ápilama vien tikbaltymus denatûruojanèio (pavyzdþio) buferio. Tai apsaugo nuo baltymø plitimo áaplinkinius tuðèius (be baltymø) ðulinëlius.Á kontrolinius ðulinëlius taip pat ápilama denatûruotø standartiniø (þinomosmolekulinës masës) baltymø miðinio (þr. Priedà). Jau paruoðtus standartiniø baltymømiðinius gamina komercinës f<strong>ir</strong>mos.8.3.3. Elektroforezës aparato ájungimas á elektros srovës ðaltináSupylus á ðulinëlius baltymø pavyzdþius, elektroforezës aparatas prijungiamas priepastoviosios elektros srovës ðaltinio 0,75 mm storio geliams nustatoma 10 mA stiprumosrovë. Kai bromfenolio mëlynojo daþas áeina á sk<strong>ir</strong>iamàjá gelá, srovës stiprumaspadidinamas iki 15 mA. Dëmesio! Standartiniame 16 cm ilgio <strong>ir</strong> 0,75 mm storio gelyje,esant 4 mA elektros srovës stiprumui, elektroforezë vyksta ~ 15 val. Jei srovës stiprumas15 mA ~ 4–5 val. Vienu aparatu atliekant dviejø geliø elektroforezæ, arba vieno 1,5 mmstorio gelio, – srovës stiprumas padvigubinamas. Atliekant 1,5 mm gelio storioelektroforezæ <strong>ir</strong> nustaèius 30 mA srovës stiprumà, 10 o –20 o C temperatûra turi bûtipalaikoma termostatu, c<strong>ir</strong>kuliuojant pastoviosios temperatûros vandeniui. Esant dideleitemperatûrai, gelyje judanèios baltymø sritys iðsipleèia <strong>ir</strong> iðsikraipo. Negalima atliktielektroforezës, esant < 5 o C temperatûrai, nes buferiniuose t<strong>ir</strong>paluose esantis natriododecilsulfatas iðkrinta á nuosëdas.Kai judantis gelyje bromfenolio mëlynasis pasiekia sk<strong>ir</strong>iamojo gelio apaèià,iðjungiama elektros srovë <strong>ir</strong> elektroforezës aparatas iðjungiamas ið srovës ðaltinio.8.3.4. Elektroforezës aparato iðrinkimas po elektroforezësIð v<strong>ir</strong>ðutinës talpyklos iðpilamas elektroforezës buferis <strong>ir</strong> ið aparato iðimami stiklai,turintys gelius. Jie padedami ant filtravimo popieriaus lapo arba popierinio rankðluosèio.Atsargiai pastumiama á prieká viena tarpinë, esanti tarp stiklø, <strong>ir</strong>, naudojant jà kaipsvertà, prask<strong>ir</strong>iami stiklai. Nuimamas v<strong>ir</strong>ðutinis stiklas <strong>ir</strong> nupjaunamas maþas gabalëlisgelio kampo tam, kad gelio daþymo metu galëtume þinoti takeliø padëtá bei kas <strong>ir</strong> ákuriuos ðulinëlius buvo ápilta.
1. 8. Baltymø Saugaus elektroforezë darbo biochemijos ___________________________________________________________laboratorijoje pagrindinës taisyklës 1078.3.5. Baltymø daþymas gelyjePo elektroforezës baltymus gelyje galima nustatyti daþant juos Coomassie mëliu arbasidabru. Daþymas Coomassie mëliu yra paprastesnis <strong>ir</strong> greitesnis. Daþymo sidabrumetodas yra jautresnis <strong>ir</strong> daþniausiai taikomas maþiems baltymø kiekiams nustatyti.Coomassie mëlis nesavitai jungiasi su baltymø molekulëmis. Ðiuo daþu galima nudaþyti0,3 – 1,0 µg baltymo, esanèio vienoje juostelëje. Baltymai gelyje yra tv<strong>ir</strong>tinami izopropiloalkoholio <strong>ir</strong> acto rûgðties t<strong>ir</strong>palu <strong>ir</strong> nudaþomi Coomassi mëliu. Iðplovus daþà ið gelio,mëlynos nudaþytos baltymø juostelës yra aiðkiai matomos. Toks gelis gali bûti laikomasacto rûgðties t<strong>ir</strong>pale arba vandenyje, fotografuojamas arba iðdþiovinamas.Daþant baltymus sidabru, prie tam tikrø baltymo molekulëje esanèiø cheminiøgrupiø (sulfhidriliniø, karboksi–) prisijungia sidabras. Ðiuo metodu galima nudaþytinuo 2–5 ng baltymo, esanèio vienoje juostelëje. Baltymai poliakrilamido gelyje yratv<strong>ir</strong>tinami metanolio <strong>ir</strong> formaldehido t<strong>ir</strong>palu. Po gelio ekspozicijos sidabro nitratot<strong>ir</strong>pale, jis yra pamerkiamas á ryðkalus. Ryðkinimo metu pasiekus reikiamà nudaþytøbaltymø juosteliø ryðkumà, gelis tv<strong>ir</strong>tinamas. Já galima fotografuoti, iðdþiovinti.8.4. Baltymø nustatymas gelio elektroforezës metoduPrietaisai <strong>ir</strong> medþiagos1. Elektroforezës aparatas, turintis spaustukus, stiklus, gelio paruoðimo stovelá <strong>ir</strong>elektroforezës buferio talpyklas.2. 0,75 mm storio tarpinës.3. 0,75 mm storio politetrafluoretileno „ðukos“, turinèios 1, 3, 5, 10, 15 arba 20dantø.4. Pastoviosios elektros srovës ðaltinis.5. 25 arba 100 µl ðv<strong>ir</strong>kðtas, turintis tiesiai nupjautà adatà.6. 0,45 µm porø skersmens filtrai (naudojami pradiniams t<strong>ir</strong>palams ruoðti).T<strong>ir</strong>palai <strong>ir</strong> jø ruoðimas1. 30 % akrilamido/0,8 % N,N’-metilenbisakrilamido t<strong>ir</strong>palas. Iðt<strong>ir</strong>pinama 30 gakrilamido <strong>ir</strong> 0,8 g N,N’-metilenbisakrilamido <strong>ir</strong> pripilama H 2O iki 100 ml.T<strong>ir</strong>palas perfiltruojamas pro 0,45 µm porø dydþio filtrà <strong>ir</strong> laikomas tamsoje,esant 4°C temperatûrai. Ðis t<strong>ir</strong>palas sunaudojamas per 30 dienø, nes akrilamidaspamaþu hidrolizuojasi iki akrilo rûgðties <strong>ir</strong> amoniako. Dëmesio! Akrilamidomonomeras yra neurotoksiðkas. Sverti atsargiai. D<strong>ir</strong>bant su akrilamido t<strong>ir</strong>palais,mûvëti gumines p<strong>ir</strong>ðtines <strong>ir</strong> nesiurbti burna pipetëmis ðiø t<strong>ir</strong>palø.2. 4× TRIS⋅HCl/NDS buferis pH 6,8 (0,5 M TRIS⋅HCl, 0,4 % NDS). 6,05 g TRISiðt<strong>ir</strong>pinama 40 ml H 2O. Á gautà t<strong>ir</strong>palà ápilama 1 N HCl, kol t<strong>ir</strong>palo pH bus 6,8
108 _________________________________ BIOCHEMIJOS LABORATORINIAI DARBAI<strong>ir</strong> pripilama H 2O iki 100 ml. T<strong>ir</strong>palas perfiltruojamas pro 0,45 µm porø dydþiofiltrà <strong>ir</strong> pridedama 0,4 g NDS. Laikoma, esant 4°C temperatûrai, iki 1 mën.3. 4× TRIS⋅HCl/NDS buferis pH 8,8 (1,5 M TRIS⋅HCl, 0,4 % NDS). 91 g TRISiðt<strong>ir</strong>pinama 300 ml H 2O. Á gautà t<strong>ir</strong>palà pilama 1 N HCl, kol t<strong>ir</strong>palo pH bus 8,8<strong>ir</strong> pripilama H 2O iki 500 ml. T<strong>ir</strong>palas perfiltruojamas pro 0,45 µm porø dydþiofiltrà <strong>ir</strong> pridedama 2 g NDS. Laikoma, esant 4°C temperatûrai, iki 1 mën.4. 1× TRIS⋅HCl/NDS buferis pH 8,8 (praskiedþiamas 4× TRIS⋅HCl/NDS buferispH 8,8).5. 2× baltymø denatûravimo (pavyzdþio) buferis (25 ml 4 × TRIS⋅HCl/NDSbuferio pH 6,8, 20 ml glicerolio, 4 g NDS, 2 ml 2-merkaptoetanolio arba 3,1 gditiotreitolio, 1 mg bromfenolio mëlynojo <strong>ir</strong> pripilama H 2O iki 100 ml. Geraiiðmaiðoma <strong>ir</strong>, iðpilsèius po 1 ml, laikoma, esant –70°C temperatûrai).6. 10 % amonio peroksosulfato [(NH 4) 2S 2O 8] t<strong>ir</strong>palas (svoris/tûris). T<strong>ir</strong>palasruoðiamas prieð pat naudojimà.7. Tetrametiledilendiaminas (TEMED).8. Elektroforezës buferis (3,02 g TRIS, 14,4 g glicino, 1 g NDS <strong>ir</strong> pripilama H 2Oiki 1000 ml. Laikoma, esant 0°–4°C temperatûrai, iki 1 mën.).9. Standartinis miðinys baltymø, turinèiø þinomas molekulines mases (þr.Priedà).10. T<strong>ir</strong>iamø baltymø pavyzdþiai.11. Izobutilo alkoholis, prisotintas vandens.12. Baltymams daþyti Coomassie mëliu:Baltymø tv<strong>ir</strong>tinimo t<strong>ir</strong>palas: [25 % (tûrio) izopropilo alkoholio, 10 % (tûrio)acto rûgðties <strong>ir</strong> 65 % vandens]. Laikoma kambario temperatûros sàlygomis.Daþo Coomassie mëlio t<strong>ir</strong>palas: [10 % (tûrio) acto rûgðties, 0,006 % (svoris/tûris) Coomassie mëlio G-250, 90 % vandens]. Laikoma kambario temperatûrossàlygomis.10 % (tûrio) acto rûgðtis.13. Baltymams daþyti sidabru:Baltymø tv<strong>ir</strong>tinimo t<strong>ir</strong>palas: [40 % (tûrio) metanolio, 0,5 ml 37 % formaldehidovienam litrui t<strong>ir</strong>palo, 60 % vandens]. Laikoma, esant kambario temperatûrai, iki1 mënesio.Natrio tiosulfato (Na 2S 2O 3) t<strong>ir</strong>palas: 0,2 g/l.Ryðkinimo t<strong>ir</strong>palas: [3 % (svoris/tûris) natrio karbonato, 0,0004 % (svoris/tûris) natrio tiosulfato, 0,5 ml 37 % formaldehido vienam litrui t<strong>ir</strong>palo (pripilamaprieð pat naudojimà)]. Laikoma be formaldehido kambario temperatûrossàlygomis.0,1 % sidabro nitrato t<strong>ir</strong>palas. Laikoma tamsiame butelyje kambario temperatûrossàlygomis iki 1 mën.2,3 M citrinø rûgðties t<strong>ir</strong>palas.
1. 8. Baltymø Saugaus elektroforezë darbo biochemijos ___________________________________________________________laboratorijoje pagrindinës taisyklës 1098.4.1. Sk<strong>ir</strong>iamojo gelio paruoðimas1. Naudojant du ðvarius stiklus <strong>ir</strong> dvi tarpinessurenkama elektroforezës aparato gardelë, sk<strong>ir</strong>tapripildyti sk<strong>ir</strong>iamojo <strong>ir</strong> koncentruojamojo poliakrilamidiniøgeliø (8.5 pav.). Dëmesio! Stiklus galitenuplauti Alconox arba RBS-35 (Pierce) t<strong>ir</strong>palais.2. Stiklai suspaudþiami spaustukais tarpusavyje.Gardelë ástatoma á pildymui sk<strong>ir</strong>tà stovelá.3. Á stiklinaitæ supilami t<strong>ir</strong>palai, reikalingi sk<strong>ir</strong>iamajamgeliui paruoðti (1 lentelë). Gerai iðmaiðoma.4. Paruoðtu t<strong>ir</strong>palu pripildoma elektroforezës aparatogardelë. T<strong>ir</strong>palas pilamas ðalia tarpinës, esanèiostarp stiklø. Nuo stiklø v<strong>ir</strong>ðaus koncentruojamajamÐulinëliaibaltymams ápiltiTarpinës8.5 pav. Elektroforezësaparato gardelëgeliui paliekamas ~ 3 cm tarpas. Dëmesio! Paruoðtà t<strong>ir</strong>palà tarp stiklø reikiasupilti nedelsiant, nes kitaip polimerizacijos reakcija ávyks paèioje kolbutëje.5. Ant pav<strong>ir</strong>ðiaus t<strong>ir</strong>palo, esanèio tarp stiklø, pipete atsargiai uþsluoksniuojamaizobutilo alkoholio, prisotinto H 2O. Pilama palengva, ið pradþiø ðalia vienos,vëliau ðalia kitos tarpiniø, esanèiø tarp stiklø. Dëmesio! Nesuardykite polimerinamogelio pav<strong>ir</strong>ðiaus. Deguonis lëtina polimerizacijos reakcijà, o izobutiloalkoholio sluoksnis neleidþia patekti deguoniui á polimerizacijos miðiná. Be to,gaunamas lygus <strong>ir</strong> plokðèias poliakrilamido gelio pav<strong>ir</strong>ðius.6. Laukiama, kol ávyks polimerizacijos reakcija (30–60 min. kambario temperatûrossàlygomis).8.4.2. Koncentruojamojo gelio paruoðimas1. Nupilamas izobutilo alkoholis, prisotintas H 2O, <strong>ir</strong> gelio pav<strong>ir</strong>ðius kelis kartuspraplaunamas 1 × TRIS⋅Cl/NDS buferiu pH 8,8. Dëmesio! Izobutilo alkoholiolikuèiai sumaþina sk<strong>ir</strong>iamàjà elektroforezës gebà, todël jis turi bûti visiðkaipaðalintas. Izobutilo alkoholio sluoksnis ant gelio pav<strong>ir</strong>ðiaus gali bûti ne ilgiaukaip 2 valandas.2. Á stiklinaitæ pripilama 0,65 ml 30 % akrilamido/0,8 % N,N’-metilenbisakrilamidot<strong>ir</strong>palo, 1,25 ml 4 × TRIS⋅HCl/NDS buferio pH 6,8 <strong>ir</strong> 3,05 ml H 2O.Pripilama 25 µl 10 % amonio peroksosulfato t<strong>ir</strong>palo <strong>ir</strong> 5 µl TEMED. Geraiiðmaiðoma.3. Gautas t<strong>ir</strong>palas supilamas tarp stiklø ant sk<strong>ir</strong>iamojo gelio. Dëmesio! Paruoðtàt<strong>ir</strong>palà tarp stiklø reikia supilti nedelsiant, nes kitaip polimerizacijos reakcija ávyks
110 _________________________________ BIOCHEMIJOS LABORATORINIAI DARBAIpaèioje kolbutëje. Tarp stiklø ápiltame koncentruojamajame gelyje neturi bûti oroburbulø. Á uþpiltà koncentruojamojo gelio sluoksná ástatomos „ðukos“ <strong>ir</strong>, jeigureikia, papildomas koncentruojamojo gelio sluoksnis. Laukiama, kol ávykspolimerizacijos reakcija (30 – 45 min. kambario temperatûros sàlygomis).8.4.3. Baltymø preparatø paruoðimas elektroforezei<strong>ir</strong> jø ápylimas á koncentruojamojo gelio ðulinëlius1. 1,5 ml plastikiniame mëgintuvëlyje dalis t<strong>ir</strong>iamo baltymø t<strong>ir</strong>palo praskiedþiamasantykiu 1:1 su 2 × baltymus denatûruojanèiu (pavyzdþio) buferiu <strong>ir</strong> 3 – 5 min.miðinys kaitinamas verdanèio vandens vonioje. Rekomenduojami baltymøkiekiai nurodyti teorinëje ðio apraðymo dalyje.2. 1,5 ml plastikiniame mëgintuvëlyje paruoðiamas reikiamø etaloniniø baltymømiðinys (þr. Priedà): jie iðt<strong>ir</strong>pinami 1 × baltymus denatûruojanèiame (pavyzdþio)buferyje <strong>ir</strong> 3 – 5 min. kaitinama verdanèio vandens vonioje. Rekomenduojamibaltymø kiekiai nurodyti teorinëje ðio apraðymo dalyje.3. Atsargiai iðimamos „ðukos“.4. Ið pripildymui sk<strong>ir</strong>to stovelio iðimama gardelë <strong>ir</strong> ástatoma á elektroforezës aparatà.Á elektroforezës aparato talpyklas pripilama elektroforezës buferio.5. Ðv<strong>ir</strong>kðtu, turinèiu tiesiai nupjautà adatà, á ðulinëlius ápilami paruoðti baltymøpavyzdþiai, atsargiai, plonu sluoksniu jie sluoksniuojami ant ðulinëliø dugno. Ákontroliná ðulinëlá ápilamas etaloniniø baltymø miðinys. Á nepanaudotus ðulinëliusápilamas toks pat tûris 1 × baltymus denatûruojanèio (pavyzdþio) buferio.6. Elektroforezës aparatas prijungiamas prie pastoviosios elektros srovës ðaltinio<strong>ir</strong> atliekama elektroforezë (sàlygos nurodytos teorinëje ðio darbo apraðymodalyje).8.4.4. Baltymø daþymas gelyje po elektroforezësDaþymas Coomassie mëliu1. Po elektroforezës poliakrilamido gelis ádedamas á plastikinæ ar stiklinæ vonelæ<strong>ir</strong> uþpilamas 3 – 5 gelio tûriais baltymø tv<strong>ir</strong>tinimo t<strong>ir</strong>palu. Vonelë lëtai siûbuojamakambario temperatûros sàlygomis – 0,75 mm storio gelá – 10 – 15 min., 1,5 mmstorio gelá – 30 – 60 min.2. Iðpilamas baltymø tv<strong>ir</strong>tinimo t<strong>ir</strong>palas <strong>ir</strong> uþpilama Coomassie mëlio daþo t<strong>ir</strong>palu.Vonelë lëtai siûbuojama kambario temperatûros sàlygomis, kol baltymø juostelësnusidaþys norimo ryðkumo mëlyna spalva (1 – 12 val.).3. Daþø t<strong>ir</strong>palas iðpilamas <strong>ir</strong> uþpilama 10 % acto rûgðtimi. Vonelë lëtai siûbuojama
1. 8. Baltymø Saugaus elektroforezë darbo biochemijos ___________________________________________________________laboratorijoje pagrindinës taisyklës 111kambario temperatûros sàlygomis, kol ið gelio iðsiplaus daþas, nesus<strong>ir</strong>iðæs subaltymu (≥ 2 val.). Nuolatos pakeièiamas 10 % acto rûgðties t<strong>ir</strong>palas. Gelislaikomas 7 % acto rûgðties t<strong>ir</strong>pale arba vandenyje.Daþymas sidabru1. Po elektroforezës poliakrilamido gelis ádedamas á plastikinæ vonelæ <strong>ir</strong> pripilama50 ml baltymø tv<strong>ir</strong>tinimo t<strong>ir</strong>palo. Vonelë 10 min. lëtai siûbuojama kambariotemperatûros sàlygomis. Dëmesio! 10 min. laikas yra 0,75 mm × 5,5 cm × 8 cmdydþio <strong>ir</strong> 12,5 % koncentracijos poliakrilamido geliui. Gelis ádedamas á 8×14 cmdydþio vonelæ.2. Ið vonelës iðpilamas baltymø tv<strong>ir</strong>tinimo t<strong>ir</strong>palas <strong>ir</strong> gelis du kartus praplaunamasvandeniu. Visais atvejais 5 min. vonelë lëtai siûbuojama.3. Iðpilamas vanduo <strong>ir</strong> gelis pamerkiamas 1 min. á 50 ml natrio tiosulfato t<strong>ir</strong>palà.Vonelë lëtai siûbuojama.4. Iðpilamas natrio tiosulfato t<strong>ir</strong>palas <strong>ir</strong> gelis du kartus po 20 sekundþiøpraplaunamas vandeniu.5. Iðpilamas vanduo <strong>ir</strong> gelis 10 min. pamerkiamas á 50 ml 0,1 % sidabro nitratot<strong>ir</strong>palà. Vonelë lëtai siûbuojama.6. Iðpilamas sidabro nitrato t<strong>ir</strong>palas <strong>ir</strong> gelis praplaunamas vandeniu bei maþutûriu ryðkinimo t<strong>ir</strong>palu.7. Gelis pamerkiamas á 50 ml ryðkinimo t<strong>ir</strong>palà <strong>ir</strong> vonelë lëtai siûbuojama, kol busreikiamas baltymø juosteliø spalvos ryðkumas (~ 1 min.).8. Norint sustabdyti ryðkinimà, á vonelæ ápilama 2,5 ml 2,3 M citrinø rûgðties t<strong>ir</strong>palo<strong>ir</strong> vonelë 10 min. lëtai siûbuojama.9. Iðpilamas t<strong>ir</strong>palas ið vonelës <strong>ir</strong> gelis uþpilamas vandeniu. Gelis plaunamas 10min. lëtai siûbuojant vonelæ. Nudaþytas gelis laikomas vandenyje.PastabosBaltymø elektroforezei reikia naudoti ypaè ðvarius cheminius reagentus. Jeigupoliakrilamido gelio paruoðimo metu polimerizacijos reakcija vyksta lëtai, tai tuomet reikiaparuoðti ðvieþià amonio peroksosulfato t<strong>ir</strong>palà, arba vienu treèdaliu padidinti jokoncentracijà, naudoti kokybiðkà TEMED.Koncentruojamasis gelis yra ruoðiamas <strong>ir</strong> uþpilamas prieð pat elektroforezæ. Prieðinguatveju, dël difuzijos buferiai, esantys koncentruojamajame <strong>ir</strong> sk<strong>ir</strong>iamajame geliuose,susimaiðys <strong>ir</strong> tai pablogins baltymø atskyrimà.Elektroforezës metu tekant elektros srovei, gelis kaista. Nevienodas gelio ðilimas turiátakos baltymø judëjimo greièiui. Ðoniniuose poliakrilamido gelio takeliuose baltymaijuda lëèiau negu viduriniuose takeliuose (po elektroforezës nudaþius baltymus gelistarsi ðypsosi). Tai galima paðalinti elektroforezës metu auðinant gelá arba maþinantelektros srovës stiprumà.
112 _________________________________ BIOCHEMIJOS LABORATORINIAI DARBAINeáprastas tam tikrø baltymø molekuliø judrumas poliakrilamido gelyje. Daþniausiaitoks neáprastas elektroforezinis judrumas bûdingas sudëtingiems baltymams(glikoproteinams, nukleoproteinams, fosfoproteinams <strong>ir</strong> pan.) bei turintiems daugbaziniø <strong>ir</strong> kitø ákrautø aminorûgðèiø liekanø.Po elektroforezës nekokybiðkos juostelës. Jei signalinio bromfenolio mëlynojo juostelëelektroforezës metu yra difuzinë, tuomet reikia paruoðti naujus buferinius t<strong>ir</strong>palus <strong>ir</strong>monomero akrilamido t<strong>ir</strong>palà. Jeigu po elektroforezës nudaþytos baltymø juostelës yradifuzinës, tuomet rekomenduojama 25 – 50 % padidinti elektros srovës stiprumà beinaudoti didesnës koncentracijos sk<strong>ir</strong>iamàjá gelá. Stebëti, ar nevyksta proteolizë, dël kuriosgali iðnykti didelës molekulinës masës baltymø juostelës <strong>ir</strong> susidaryti <strong>ir</strong>imo produktø„ðliûþës“ gelio takeliuose. Jeigu po elektroforezës baltymø juosteliø kraðtai yra nelygûs <strong>ir</strong>dantyti, tuomet reikia sumaþinti á ðulinëlá pilamo baltymo kieká arba 25 % sumaþintielektros srovës stiprumà. Kita prieþastis tokiø staèiai dantytø baltymø juosteliø gali bûtiá ðulinëlius ápiltos neiðt<strong>ir</strong>pusiø baltymø nuosëdos, kurias galima paðalinti centrifuguojant.Be to, kartais ðiuos sunkumus galimà paðalinti sumaþinus akrilamido koncentracijà gelyje.Dël nekokybiðko koncentruojamojo gelio (blogai ávykusi polimerizacijos reakcija),baltymø juostelës turës nelygius dantytus kraðtus. Tai gali bûti iðtaisoma nuorinantkoncentruojamojo gelio polimerinimui paruoðtà t<strong>ir</strong>palà arba vienu treèdaliu padidinantamonio peroksosulfato <strong>ir</strong> TEMED koncentracijas. Kita tokiø dantytø kraðtø juosteliøprieþastis gali bûti baltymø pavyzdþiuose esanèios druskos, todël prieð elektroforezæpatartina jas paðalinti dializuojant arba gelchromatografijos bûdu. Jeigu pav<strong>ir</strong>ðius tarpsk<strong>ir</strong>iamojo <strong>ir</strong> koncentruojamojo geliø yra nelygus, tuomet po elektroforezës susidarokreivos baltymø juostelës. Norint to iðvengti, reikia, ruoðiant sk<strong>ir</strong>iamàjá gelá, labai atsargiaiuþpilti ant jo pav<strong>ir</strong>ðiaus izobutilo alkoholio prisotintu H 2O. Kartais po elektroforezësmatosi dvigubos baltymø juostelës. Prieþastis gali bûti dalinë baltymø oksidacija arba<strong>ir</strong>imas. Oksidacijà galima sumaþinti, padidinant 2-merkaptoetanolio koncentracijà arbaparuoðiant baltymø pavyzdþius prieð pat elektroforezæ. Jeigu po elektroforezës susidaromaþiau juosteliø negu tikimasi arba turëtø bûti <strong>ir</strong> yra stebima plati baltymo juostasignalinio daþo bromfenolio mëlynojo judëjimo zonoje, tuomet patariama padidintiakrilamido koncentracijà sk<strong>ir</strong>iamajame gelyje.Didelæ reikðmæ baltymø elektroforezës kokybei turi t<strong>ir</strong>iamø baltymø preparatø paruoðimas.Pagrindinis sunkumas yra baltymø proteolizë endogeninëmis peptidazëmis, iðsk<strong>ir</strong>iantjuos ið làsteliø bei ruoðiant elektroforezei. Dauguma endogeniniø peptidaziø yra labaiaktyvios buferiuose, turinèiuose natrio dodecilsulfato. Todël patariama ruoðiant baltymøpavyzdþius elektroforezei, baltymø denatûravimo (pavyzdþio) buferio pripilti <strong>ir</strong> 3 min.70°–100°C temperatûros sàlygomis pakaitinti. Juos reikia pakaitinti prieð pat pavyzdþiuspilant á poliakrilamido gelio ðulinëlius. Kai kuriais atvejais, esant 100°C temperatûrai,gali susidaryti net<strong>ir</strong>pios baltymø sankaupos, kurios elektroforezës metu visiðkai nejudaarba labai blogai juda gelyje. Todël po elektroforezës nudaþius baltymus Coomassie
1. 8. Baltymø Saugaus elektroforezë darbo biochemijos ___________________________________________________________laboratorijoje pagrindinës taisyklës 113mëliu, poliakrilamido gelio pradþioje matomos tokiø baltymø „ðliûþës“. Norint iðvengtiproteolizës <strong>ir</strong> baltymø sankaupø, esant didelei temperatûrai, reikia baltymø iðskyrimometu naudoti savituosius peptidaziø slopiklius <strong>ir</strong>/arba maþinti kaitinimo temperatûràiki 70°–80°C.Jeigu baltymai ið ðulinëliø greitai skverbiasi á koncentruojamàjá gelá, tuomet reikiakiek galima sutrumpinti laikà tarp baltymø ápylimo á ðulinëlius <strong>ir</strong> elektros srovësájungimo, be to, padidinti koncentruojamajame gelyje akrilamido koncentracijà nuo 4% iki 4,5 % ar 5 %. Norint iðvengti baltymø difuzijos koncentruojamajame gelyje,patartina 25 % padidinti elektros srovës stiprumà.Jeigu elektroforezë vyksta labai ilgai, prieþastis gali bûti didelë naudojamø buferiøkoncentracija arba maþas tekanèios elektros srovës stiprumas.Darbo trukmëSk<strong>ir</strong>iamojo <strong>ir</strong> koncentruojamojo poliakrilamido geliø paruoðimas trunka apie 2–3val. 14 × 14 cm dydþio, 0,75 mm storio gelyje elektroforezë vyksta 4–5 valandas, esant15 mA (70–150 V) elektros srovës stiprumui, <strong>ir</strong> 3–4 valandas, jei elektros srovësstiprumas 20 mA (80–200 V). 1,5 mm storio gelyje elektroforezë vyksta 4–5 valandas,esant 30 mA elektros srovës stiprumui. 0,75 mm storio minigeliuose elektroforezëvyksta apie 1 valandà, esant 20 mA (100–120 V) elektros srovës stiprumui. Daþniausiaielektroforezë atliekama 15°–20°C temperatûros sàlygomis. Oru auðinamuoseelektroforezës aparatuose rekomenduojama naudoti maþesná elektros srovës stiprumà.Literatûra1. Laemmli U. K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of thehead of bacteriophage T4. Nature, vol. 227, pp. 680–685.2. Ausubel F. M., Brent R., Kingston R. E., Moore D. D., Seidman J. G., Smith J. A.,Struhl K. (eds.). Current Protocols in Molecular Biology. Vol. 2. 2000, J. Wiley &Sons, Inc.3. Hames B. D., Rickwood D.(eds.). Gel electrophoresis of proteins: a practicalapproach, 2 nd ed. 1990, Oxford University Press, (New York).4. Îñòåðìàí Ë. À. Ìåòîäû èññëåäîâàíèÿ áåëêîâ è íóêëåèíîâûõ êèñëîò. Ýëåêòðîôîðåçè óëüòðàöåíòðèôóãèðîâàíèå (ïðàêòè÷åñêîå ïîñîáèå). 1981, Íàóêà, (Ìîñêâà),286 ñòð.
114 _________________________________ BIOCHEMIJOS LABORATORINIAI DARBAI9.Nukleorûgðèiø gryninimas <strong>ir</strong> analizë9.1. DNR gryninimasSiekiant atlikti DNR analizæ arba naudoti jà tolesnëms procedûroms, DNR turi bûtiiðgryninta, be RNR <strong>ir</strong> baltymø priemaiðø. Siekiant iðgryninti nefragmentuotà <strong>ir</strong>maþiausiai mechaniðkai paveiktà DNR taikomi patys ðvelniausi làsteliø ardymometodai. Idealiu atveju làsteliø sienelës turëtø bûti suardomos fermentiniu metodu(pvz., bakterijø apvalkalas – lizocimu), o làsteliø membrana suardoma detergentais.Taikant fizinius làsteliø ardymo metodus, reikia turëti omenyje, kad turëtø bûti vengiamanaudoti jëgas, dël kuriø DNR molekulës gali trûkti. Làsteliø suardymas <strong>ir</strong> visi kitigryninimo etapai atliekami 4 0 C temperatûros sàlygºmis. Daþniausiai gryninimo metunaudojama EDTA (etilendiamintetraacto rûgðtis), suriðanti Mg 2+ jonus, kurie yrareikalingi fermentams deoks<strong>ir</strong>ibonukleazëms (DNazëms), aktyvinti. Gryninamasteriliais t<strong>ir</strong>palais, neturinèiais DNazinio aktyvumo.Suardþius làsteles, RNR priemaiðos gali bûti paðalinamos naudojant ribonukleazes(RNazes). Kartu iðsiskyræ baltymai paðalinami fenolinës ekstrakcijos metu – á mëgináápilama fenolio <strong>ir</strong> chloroformo miðinio, kuris denatûruoja baltymus. Ðvelniai supurèiusemulsija centrifuguojama. Dël to emulsija pasisk<strong>ir</strong>sto á dvi fazes: apatinæ organinæ <strong>ir</strong>v<strong>ir</strong>ðutinæ vandeninæ, kurioje yra sk<strong>ir</strong>iamoji DNR. Tarp ðiø dviejø faziø centrifugavimometu nusistovi balta denatûruotø baltymø plëvelë. V<strong>ir</strong>ðutinë vandeninë fazë yrasurenkama, jos fenoliná ekstrahavimà daþniausiai reikia kartoti 2–3 kartus, kol organinës<strong>ir</strong> vandeninës fazës sàlyèio pav<strong>ir</strong>ðiuje nebepastebima denatûruotø baltymø plëvëlës.Galiausiai, paðalinus baltymus, DNR iðsodinama ið t<strong>ir</strong>palo etanoliu. Nuosëdosnucentrifuguojamos <strong>ir</strong> iðdþiovinus iðt<strong>ir</strong>pinamos buferyje, turinèiame EDTA(etilendiamintetraacto rûgðtis (EDTA) inaktyvina DNazes). DNR t<strong>ir</strong>palas gali bûtilaikomas esant +4 o C temperatûrai mënesá arba ilgiau uþðaldþius (–20 o C).Iðgryninant DNR ið tam tikrø organeliø (pvz., mitochondrijø), rekomenduojamap<strong>ir</strong>miausia iðgryninti organeles, o tik vëliau – DNR, nes iðgryninti organeliø DNR iðvisos làsteliø suminës DNR miðinio daþniausiai bûna daug sudëtingiau. Ypatingai grynaDNR gaunama po centrifugavimo t<strong>ir</strong>pale, turinèiame cezio chlorido gradientà.Iðgryninus DNR visada reikia patikrinti DNR vientisumà elektroforezës agaroziniamegelyje metu, <strong>ir</strong> nustatyti jos koncentracijà – pamatuoti DNR sugertá UV srityje,esant λ=260 nm. Tai yra daugiausia paplitæs DNR koncentracijos nustatymo metodas.Yra þinoma, kad áprastomis sàlygomis DNR t<strong>ir</strong>palo, kuriame dvigrandës DNR koncentracijayra 50 µg/ml, sugertis yra 1,0. Taigi, pamatavus neþinomos koncentracijosDNR t<strong>ir</strong>palo sugertá, galima nesunkiai paskaièiuoti, kokia yra DNR koncentracija t<strong>ir</strong>pale.
1. 9. Saugaus Nukleorûgðèiø darbo gryninimas biochemijos <strong>ir</strong> analizë laboratorijoje ________________________________________________pagrindinës taisyklës 115Ðis metodas turi <strong>ir</strong> daug trûkumø: pavieniai nukleotidai <strong>ir</strong> RNR priemaiðos taip patsugeria UV <strong>ir</strong> tokiu bûdu sustiprina signalà. Taikant ðá metodà galima nustatyti t<strong>ir</strong>paløkoncentracijà, kuriuose DNR yra ne maþiau kaip 2 µg/ml.Uþraðant DNR sugerties spektrà UV srityje 200 – 300 nm galima ne tik nustatytiDNR koncentracijà, bet <strong>ir</strong> iðt<strong>ir</strong>ti, ar preparate yra baltymø priemaiðø. Tam tiksluipamatuojama DNR t<strong>ir</strong>palo sugertis ties 280 nm, kurià lemia baltymai. Jeigu sugertiesties 260 nm santykis su sugertimi ties 280 nm yra daugiau kaip 1,8, laikoma, kad DNRt<strong>ir</strong>pale nëra baltymø priemaiðø (A 260/A 280>1,8).9.2. RNR gryninimasRNR gryninimo metodai yra labai panaðûs á aukðèiau aptartus DNR gryninimo metodus.RNR molekulës yra daug trumpesnës negu DNR, todël jos nëra taip lengvai paþeidþiamos.Todël gryninimo metu gali bûti taikomi <strong>ir</strong> ðiurkðtesni làsteliø suardymometodai. RNR yra labai paþeidþiama RNaziø (ribonukleaziø), kuriø didelës koncentracijosyra làstelëse, o taip pat egzogeniniø – net ant þmogaus p<strong>ir</strong>ðtø. Todël RNRgryninimo metu bûtina mûvëti gumines p<strong>ir</strong>ðtines, o pradinëmis stadijomis naudotistiprius detergentus – siekiant nedelsiant inaktyvinti RNazes. Vienas ið daþniausiaiRNR gryninti naudojamø reagentø yra guanidino tiocianatas – veiksmingas RNaziøslopiklis <strong>ir</strong> baltymø denatûrantas. RNR daþnai yra stipriai susijungusi su baltymais,todël ypaè svarbu kruopðèiai paðalinti baltymus fenolinës ekstrakcijos metu (kaip apraðytaanksèiau, 9.1 sk.). DNR priemaiðos paðalinamos veikiant RNR mëginá DNazëmis.RNR ið t<strong>ir</strong>palo iðsodinama kaip <strong>ir</strong> DNR – etanoliu.Kai kada bûtina iðgryninti eukariotiniø làsteliø mRNR, kuri sudaro tik 2–5%suminës visos làstelës RNR. Tokiu atveju reikia taikyti giminingumo chromatografijosmetodà – oligo(dT)-celiuliozës kolonëles. Esant didelei druskø koncentracijai, mRNR,turinti poliA sekas, jungiasi prie komplementariø oligo(dT) molekuliø kolonëlëje, okita làsteliø RNR (rRNR, tRNR) nesijungia <strong>ir</strong> paðalinama ið kolonos plaunant didelëskoncentracijos druskø t<strong>ir</strong>palu. Galiausiai prijungtas mRNR molekules galima „atkabinti“<strong>ir</strong> iðsigryninti plaunant maþos koncentracijos druskø t<strong>ir</strong>palu.Kaip <strong>ir</strong> DNR, iðgryninus RNR visada reikia patikrinti jos vientisumà elektroforezësagaroziniame gelyje metu. Eukariotø làstelëse daugiausia yra dviejø rûðiø rRNR molekuliø:t. y. 28S <strong>ir</strong> 18S rRNR, o prokariotø atitinkamai 23S <strong>ir</strong> 16S rRNR. Po elektroforezësagaroziniame gelyje identifikavus ðias rRNR juostas galima tikëtis, kad <strong>ir</strong> kitosRNR molekulës (pvz., mRNR, tRNR) nebus paþeistos RNaziø. Taèiau RNRelektroforezæ patartina atlikti denatûruojanèiomis sàlygomis (formaldehidiniame agaroziniamegelyje) – tokiomis sàlygomis inaktyvinamas antriniø struktûrø susidarymasRNR molekulëse.RNR koncentracija nustatoma matuojant RNR t<strong>ir</strong>palo sugertá UV srityje, esantλ=260 nm. Yra þinoma, kad áprastomis sàlygomis t<strong>ir</strong>palo, kuriame viengrandës RNR
116 _________________________________ BIOCHEMIJOS LABORATORINIAI DARBAIkoncentracija yra 40 µg/ml, sugertis yra 1,0. Taigi, pamatavus neþinomos koncentracijosRNR t<strong>ir</strong>palo sugertá, galima nesunkiai suskaièiuoti, kokia yra RNR koncentracija t<strong>ir</strong>pale.Uþraðant RNR sugerties spektrà UV srityje ties 200 – 300 nm galima nustatyti, armëginyje yra baltymø priemaiðø. Tam tikslui pamatuojama RNR t<strong>ir</strong>palo sugertis ties280 nm, kurià lemia baltymai. Jeigu sugerties ties 260 nm santykis su sugertimi ties 280nm yra daugiau kaip 1,8, laikoma, kad RNR t<strong>ir</strong>pale nëra baltymø priemaiðø (A 260/A 280>1,8).9.3. DNR modifikuojantys fermentai9.3.1.Restrikcijos endonukleazësDNR grandinës hidrolizë <strong>ir</strong> dviejø sk<strong>ir</strong>tingø DNR fragmentø sujungimas buvo p<strong>ir</strong>miejimolekulinës <strong>biologijos</strong> metodai, atlikti laboratorijoje. Dabar jie yra visø rekombinantinësDNR darbø pagrindiniai etapai. Ðiuo metu plaèiai naudojamos áva<strong>ir</strong>ios restrikcijosendonukleazës – molekulinës þ<strong>ir</strong>klës, karpanèios DNR molekules, DNR ligazës –sujungianèios DNR fragmentus <strong>ir</strong> kiti fermentai, modifikuojantys DNR.DNR restrikcijos endonukleazës yra bakterijø fermentai. Jie prisijungia prie dvigrandësDNR molekuliø <strong>ir</strong> „keliauja” iðilgai DNR grandinës, kol randa savità DNRsekà. Ðioje srityje susidaro papildomi cheminiai ryðiai tarp baltymo <strong>ir</strong> DNR. Sàveikasustiprëja, pasikeièia fermento konformacija <strong>ir</strong> DNR grandinë hidrolizuojamadeoks<strong>ir</strong>iboziniame–fosfatiniame karkase. Tai yra hidrolizuojamas kovalentinis ryðystarp deoks<strong>ir</strong>obozës <strong>ir</strong> fosfatinës grupës. Kiekvienas fermentas atpaþásta <strong>ir</strong> hidrolizuojask<strong>ir</strong>tingas DNR sekas (9.1 pav.). Tam tikri fermentai atpaþásta tik 4 bp ilgio DNR sekas,kiti – ilgesnes. Taèiau bendras restrikcijos endonukleaziø atpaþástamø sekø bruoþas –sekos yra polindrominës. Tai yra skaitant jas 5 / ?3 / <strong>ir</strong> 3 / ?5 / kryptimi sekos yra vienodos.AluIbuki galaiHaeIIIbuki galaiBamHIlipnûs galaiHindIIIlipnûs galaiEcoRIlipnûs galai9.1 pav. Tam tikrø DNR restrikcijos endonukleaziøatpaþástamos sekos <strong>ir</strong> k<strong>ir</strong>pimo vietos.Daþniausiai fermentai pavadinami atsiþvelgiantá ðaltinio, ið kurio buvo iðgryninti, pavadinimà.Pavyzdþiui, EcoRI buvo iðgryninta iðEscherichia coli RY13, o HindIII ið Haemophilusinfluenzae.
1. 9. Saugaus Nukleorûgðèiø darbo gryninimas biochemijos <strong>ir</strong> analizë laboratorijoje ________________________________________________pagrindinës taisyklës 117P<strong>ir</strong>moji restrikcijos endonukleazë HindII buvo iðgryninta <strong>ir</strong> apibûdinta 1968 m.Nuo to laiko buvo iðgryninta daugiau kaip 900 restrikcijos fermentø. Tam tikrosrestrikcijos endonukleazës kerpa simetriðkai, <strong>ir</strong> palieka „bukus” galus (pvz., AluI), okitos, pvz., EcoRI – hidrolizuoja DNR grandinæ <strong>ir</strong> palieka iðsikiðusius 5’ arba 3’ galus(9.1 pav.). Tokie DNR restrikcijos produktai vadinami „lipniais”.9.1.2. DNR polimerazësVisos DNR polimerazës katalizuoja reakcijà, kurios metu prie DNR molekulës 3 / galohidroksiliekanos vienas po kito kovalentiðkai prijungiami deoks<strong>ir</strong>ibonukleotidai. DNRmolekulë sintezës metu ilgëja 5 / →3 / kryptimi. Reakcijai yra reikalingi keturideoks<strong>ir</strong>ibonukleotidø trifosfatai (dATP, dGTP, dCTP, dTTP), Mg 2 + jonai bei DNRmatrica, pagal kurià yra kopijuojama nauja sintetinama DNR molekulë.E. coli DNR polimerazë I – nuo DNR priklausoma DNR polimerazë, turinti 5 / →3 /polimeraziná <strong>ir</strong> 3 / →5 / bei 5 / →3 / egzonukleaziná aktyvumà. Iðgryninta ið bakterijøpraktiðkai E. coli DNR polimerazë I buvo naudojama radioaktyviam DNR þymëjimui<strong>ir</strong> kDNR (kopijinës DNR) sintezei. Aktyvumo centrai, atsakingi uþ fermento polimeraziná<strong>ir</strong> egzonukleaziná aktyvumà, yra sk<strong>ir</strong>tinguose holofermento domenuose. Todëlapdorojus baltymà peptidazëmis buvo galima gauti fermentà, neturintá vieno ar kitoaktyvumo. Tad pamaþu DNR polimerazæ I pakeitë Klenovo fragmentas (angl. Klenow),kuris buvo gaunamas peptidaze subtilizinu apdorojus E. coli DNR polimerazæ I. Tokiubûdu buvo paðalinamas DNR procedûroms nenaudingas 5 / →3 / egzonukleazinis aktyvumas.Praktiðkai Klenovo fragmentas yra naudojamas þymint radioktyviàja þymeDNR molekules, paðalinant „lipnius“ 3 / DNR galus, sintetinant dvigrandæ DNR nuoviengrandës DNR. Áterpus mutacijas 3 / →5 / egzonukleaziniame Klenovo fragmentoaktyvumo centre buvo gautas fermentas, turintis tik polimeraziná aktyvumà. Jisvadinamas exo - Klenovo fragmentu.Bakteriofago T4 DNR polimerazë yra panaði á E. coli DNR polimerazæ I. Ji turi5 / →3 / polimeraziná <strong>ir</strong> 3 / →5 / egzonukleaziná aktyvumà. Taèiau fermentas neturi 5 / →3 /egzonukleazinio aktyvumo. T4 DNR polimerazë naudojama per tokius darbus, kaip <strong>ir</strong>Klenovo fragmentas, bet yra <strong>ir</strong> iðsk<strong>ir</strong>tiniø praktiniø bruoþø. T4 DNR polimerazës3 / →5 / egzonukleazinis aktyvumas yra ~ 200 kartø didesnis nei Klenovo fragmento.Todël ðis fermentas daugiau tinka darbams, kuriø metu tenka paðalinti iðsikiðusius3 / „lipnius“ DNR galus.Bakteriofago T7 DNR polimerazë taip pat turi 5 / ?3 / polimeraziná <strong>ir</strong> 3 / → 5 /egzonukleaziná aktyvumà, bet neturi 5 / →3 / egzonukleazinio aktyvumo. Ðis fermentasyra labai procesyvus, lyginant su Klenovo fragmentu ar T4 DNR polimeraze. Tai yrafermentas susintetina daug ilgesnæ DNR, kol disocijuoja nuo matricos. Todël T7 DNRpolimerazë buvo plaèiai naudojama DNR sekai nustatyti Sengerio metodu. Fermento
118 _________________________________ BIOCHEMIJOS LABORATORINIAI DARBAI3 / → // egzonukleazinis aktyvumas buvo slopintas chemiðkai ar áterpiant mutacijas. Tokiosfermento formos Sekvenazës pavadinimu ðiandien plaèiai naudojamos nustatant DNRsekà.Pastaràjá deðimtmetá ypaè daþnai naudojamos DNR polimerazës, iðgrynintos iðtermofiliniø mikroorganizmø. Taq polimerazë ið Thermus aquaticus buvo iðgryninta <strong>ir</strong>naudota anksèiausiai. Su jos naudojimu prasidëjo DNR dauginimo polimerazinësgrandininës reakcijos metodu era (angl. polymerase chain reaction, PCR). Termofilinëspolimerazës, kaip <strong>ir</strong> kitos polimerazës, turi 5 / →3 / polimeraziná aktyvumà, t. y. katalizuojanukleotidtrifosfatø prijungimà prie DNR pradmens 3 / –OH grupës. Jø veiklos optimalitemperatûra yra 75–80 o C. Vëliau buvo iðgrynintos <strong>ir</strong> naudoti pritaikytos <strong>ir</strong> kitostermofiliniø bakterijø polimerazës: Pfu , Vent (arba Tli) (9.1 lentelë).Viena ið svarbiausiø termofiliniø DNR polimeraziø charakteristikø yra klaidø,ávykstanèiø DNR sintezës metu, daþnis. Nesunku nuspëti, kad polimerazëms,neturinèioms 3 / ?5 / egzonukleazinio aktyvumo, bûdingasi didesnis klaidø daþnis, neipolimerazëms, turinèioms 3 / →5 / egzonukleaziná aktyvumà. Taq polimerazës klaidødaþnis yra didþiausias – 1 × 10 –4 – 2 × 10 –5 klaidos/bp. ði Taq polimerazës savybëriboja jos naudojimà polimerazinei grandininei reakcijai, kai yra bûtina iðvengti klaidø,dël kuriø DNR sekoje gali ats<strong>ir</strong>asti mutacijos. Pfu polimerazës yra tiksliausia – 1,5 ×10 –6 klaidos/bp.Iðsk<strong>ir</strong>tiniø savybiø turi revertazës, kurios funkcionuoja kaip nuo RNR priklausomosDNR polimerazës. Jø yra retrov<strong>ir</strong>usuose (v<strong>ir</strong>usuose, kuriø genome informacija yrakoduojama RNR molekulëse). Infekcijos á ðeimininko làsteles metu ðie fermentaisintetina kDNR molekules nuo v<strong>ir</strong>uso RNR genomo. Tokiu bûdu v<strong>ir</strong>uso genomas,perkoduotas ið RNR á DNR, gali ásiterpti á ðeimininko genomà. Laboratorijoje ðisfermentas gali bûti sëkmingai naudojamas DNR sintezei tiek nuo viengrandës RNR,tiek nuo viengrandës DNR matricos. Revertazëms bûdingas <strong>ir</strong> RNazësH aktyvumas, t.y. hidrolizuojamos RNR molekulës RNR-DNR hibridinëse molekulëse, kurios susidarokDNR sintezës nuo RNR matricos metu. Visi retrov<strong>ir</strong>usai turi revertaziø, taèiaupraktiðkai daþniausiai naudojamos yra dvi: Moloney peliukø leukemijos v<strong>ir</strong>uso (angl.9.1 lentelë. Termofilinës DNR polimerazësPolimerazėTaqPfuVent3 / →5 / egzonukleazinisaktyvumasnėrayrayraŠaltinis <strong>ir</strong> savybėsThermus aquaticus.Gyvavimo pusperiodis, esant 95 o C – 1,6 val.Pyrococcus furiosusMažiausias klaidų dažnisThermococcus litoralisGyvavimo pusperiodis esant95 o C – 7 val.
1. 9. Saugaus Nukleorûgðèiø darbo gryninimas biochemijos <strong>ir</strong> analizë laboratorijoje ________________________________________________pagrindinës taisyklës 119Moloney murine leukemia v<strong>ir</strong>us) <strong>ir</strong> paukðèiø mieloblastozës v<strong>ir</strong>uso (angl. Avianmyeloblastosis v<strong>ir</strong>us) revertazës. P<strong>ir</strong>mosios RNazinis aktyvumas yra daug silpnesnis neipaukðèiø mieloblastozës v<strong>ir</strong>uso revertazës, todël ji tinkamesnë ilgøjø kDNR molekuliøsintezei.9.1.3. NukleazësNukleazës daþnai yra laikomos pikèiausiais tyrëjo, kuris stengiasi iðsaugoti nepaþeistusRNR <strong>ir</strong> DNR preparatus, prieðais. Taèiau kartais deoks<strong>ir</strong>ibonukleazës (DNazës) <strong>ir</strong>ribonukleazës (RNazës) yra <strong>ir</strong> nepamainomi pagalbininkai molekulinës <strong>biologijos</strong>laboratorijose. Ðiuo metu yra iðgryninta <strong>ir</strong> apibûdinta tam tikrø nukleaziø, kurios sk<strong>ir</strong>iasisavitumu substratui, reikalingais kofaktoriais, <strong>ir</strong> yra endonukleazës (hidrolizuojanukleorûgðtis molekulës viduje) ar egzonukleazës (hidrolizuoja nukleorûgðtis nuomolekulës galø). Plaèiausiai naudojamos DNazëI <strong>ir</strong> RNazëA, abi iðgrynintos ið jauèiokasos làsteliø.DNazëI hidrolizuoja viengrandæ <strong>ir</strong> dvigrandæ DNR. Tai yra endonukleazë, skeliantiDNR p<strong>ir</strong>imidinø (C ar T) susitelkimo vietose. Hidrolizës produktai yra 5' galuosefosforilinti monodeoksinukleotidai <strong>ir</strong> oligodeoksinukleotidai. Praktiðkai DNazëInaudojama paðalinti DNR priemaiðas ið RNR preparatø, per DNR – baltymø sàveikostyrimus DNazësI p<strong>ir</strong>ðtø atspaudø metodu (angl. DNase footprinting) ar padaryti DNRtrûkius prieð paþymint jà radioaktyviàja þyme (angl. radiolabeling by nick translation).RNazëA yra endoribonukleazë, hidrolizuojanti viengrandæ RNR p<strong>ir</strong>imidinø 3 /galuose. Ji hidrolizuoja fosfodiesteriná ryðá tarp vieno nukleotido 5 / –ribozës <strong>ir</strong> gretaesanèio p<strong>ir</strong>imidininio nukleotido 3 / –ribozës fosfatinës grupës Hidrolizës produktaiyra 3 / galuose fosforilinti mononukleotidai <strong>ir</strong> oligonukleotidai. Daþniausiai RNazëAyra naudojama paðalinti RNR priemaiðas ið DNR preparatø.9.1.4. DNR ligazësDNR ligazës katalizuoja fosfodiesterinio ryðio tarp vienos DNR molekulës 5 / fosfato <strong>ir</strong>kitos (arba tos paèios) molekulës 3 / hidroksiliekanos susidarymà. Ðis fermentasnaudojamas kovalentiðkai sujungti dvi atsk<strong>ir</strong>as DNR molekules, daþniausiai áterpiantDNR fragmentà á plazmidiná klonavimo vektoriø. Tai yra pagrindinis metodas kuriantrekombinantines DNR. Plaèiausiai naudojama bakteriofago T4 DNR ligazë, kuria<strong>ir</strong>eikalingas kofaktorius – ATP. E. coli DNR ligazë naudojama reèiau, o jos kofaktoriusyra NAD.
120 _________________________________ BIOCHEMIJOS LABORATORINIAI DARBAI9.1.5. Fosfatazës <strong>ir</strong> kinazësPlaèiausiai naudojamos ðarminës fosfatazës, kuriø optimalus veikimo pH yra ðarminis.Ðie fermentai paðalina fosfatines grupes nuo DNR <strong>ir</strong> RNR 5 / galø. Praktiðkai naudojamos:bakterijø ðarminë fosfatazë (angl. bacterial alkaline phosphatase, BAP), verðiukoþarnyno ðarminë fosfatazë (angl. calf intestinal alkaline phosphatase, CIP) <strong>ir</strong> kreveèiøðarminë fosfatazë (angl. shrimp alkaline phosphatase). Ðarminë bakterijø fosfatazë yraaktyviausias fermentas, taèiau reakcijos pabaigoje sunkiausia jà inaktyvinti. Ðarminëverðiuko þarnyno fosfatazë yra maþiau aktyvi nei bakterijø fosfatazë. Taèiau ji daþniaunaudojama, nes pasibaigus reakcijai jà lengviau inaktyvinti apdorojus reakcijos miðinápeptidazëmis ar pakaitinus aukðtesne (75 o C) temperatûra. Fosfatazës praktiðkainaudojamos klonavimo metu. Prieð áterpiant DNR fragmentà á plazmidiná klonavimovektoriø, vektoriaus 5 / galø fosfatinës grupës yra paðalinamos defosforilinimo reakcijosmetu. Tokiu bûdu yra sumaþinama paties vektoriaus DNR galø susijungimo galimybëligazës katalizuojamos reakcijos metu, o padaugëja sujungtø vektoriaus <strong>ir</strong> áterpiamoDNR fragmento produktø. Ðarminës fosfatazës plaèiai naudojamos DNR 5 / galøfosfatinei grupei paðalinti prieð prijungiant 5 / galuose radioaktyviàja þyme paþymëtàfosfatinæ grupæ.Fosfatinës grupës prijungimà prie DNR <strong>ir</strong> RNR 5 / galo hidroksiliekanos katalizuojakinazës. Praktiðkai daþniausiai naudojama polinukleotidkinazë, iðgryninta iðbakteriofago T4. Fosfatinë grupë yra perneðama nuo ATP molekulës. Tuo atveju, jeiguDNR ar RNR turi 5 / galuose fosfatines grupes, o reakcijos miðinyje yra ADP perteklius,polinukleotidkinazë p<strong>ir</strong>miausia gali perneðti fosfatus nuo nukleorûgðèiø <strong>ir</strong> prijugti prieADP (P+ADP?ATP), o tada fosforilinti defosforilintus nukleorûgðèiø 5 / galus. Tai yramainø reakcija (angl. exchange reaction). Taèiau ðios reakcijos metu fosforilinimoefektyvumas yra daug maþesnis. Praktiðkai daþnai tenka fosforilinti DNR 5 / galusnaudojant polinukleotidkinazê. Pavyzdþiui, sintetinant 5 / galuose radioaktyviàja fosfatineþyme paþymëtà DNR arba fosforilinti polimerazinës grandininës reakcijos metupadaugintus DNR fragmentus prieð áterpiant juos á plazmidinius ekspresijos vektoriusklonavimo procedûrø metu.9.4. Nukleorûgðèiø elektroforezë agaroziniame gelyjeNukleorûgðèiø elektroforezës agaroziniame gelyje metu DNR ar RNR molekulës yraatsk<strong>ir</strong>iamos pagal dydá. Ðis metodas gali bûti tiek kiekybinis, tiek kokybinis. Taikantmodifikuotà elektroforezës metodà, vadinamà pulsuojanèio lauko gelio elektroforeze(angl. pulsed field gel electrophoresis, PFGE), pagal dydá iðsk<strong>ir</strong>iami dideli DNR fragmentai(pvz., chromosomos). Lengviausias <strong>ir</strong> daugiausia paplitæs metodas yra nukleoelektroforezëhorizontaliame agaroziniame gelyje.
1. 9. Saugaus Nukleorûgðèiø darbo gryninimas biochemijos <strong>ir</strong> analizë laboratorijoje ________________________________________________pagrindinës taisyklës 1219.2 pav. Agarozës struktûros vienetas – agarobiozë (1→4)-3,6-anhidro-a-L-galaktop<strong>ir</strong>anozil-(1→3)-b-D-galaktop<strong>ir</strong>ananas9.3 pav. Agarozinio gelio ruoðimas <strong>ir</strong> elektroforezë. Iðlydytas agarozës t<strong>ir</strong>palas supilamas áspecialià formà, turinèià „ðukutes“ (A). Sustingus „ðukutës“ iðtraukiamos (B). Jossuformuoja mëginiø ápilimo ðulinëlius. DNR mëginiai frakcionuojami elektros lauke (C)Agarozë yra linijinis angliavandeniø polimeras (9.2 pav.), sudarytas ið D-galaktozës<strong>ir</strong> 3,6-anhidro-L-galaktozës, sujungtø β−(1→4) glikozidiniu ryðiu <strong>ir</strong> gaunamas ið jûrødumbliø. Ruoðiant gelá, buferinis agarozës t<strong>ir</strong>palas yra iðlydomas <strong>ir</strong> supilamas á specialiàformà (9.3 pav. A), leidþiama jam atvësti <strong>ir</strong> sustingti (panaðiai, kaip gaminama desertinëþelë). Specialios „ðukutës“, iðtraukiamos geliui sustingus (9.3 pav. B), suformuojaðulinëlius DNR mëginiams supilti. DNR mëginiai uþneðami kartu su daþais bromfenoliomëlynuoju <strong>ir</strong> ksilencianoliu. Atsiþvelgiant á juos stebima elektroforezës eiga, nes ðiemëlynos <strong>ir</strong> violetinës spalvos daþai juda elektros lauke.Ádëjus agaroziná gelá, turintá ápiltus mëginius, elektros lauke (9.3 pav. C), nukleorûgðtys,kurios yra neigiamai ákrautos, juda anodo link. Molekuliø judëjimo greitispriklauso nuo keliø pagrindiniø parametrø:a) nukleorûgðèiø molekuliø dydþio. Dvigrandës linijinës DNR molekulës judagelyje greièiu, kuris yra atv<strong>ir</strong>kðèiai proporcingas jø molelulinës masës logaritmui.Tai yra kuo molekulë maþesnë, tuo greièiau ji juda gelyje;b) agarozës koncentracijos. To paties ilgio DNR fragmentas sk<strong>ir</strong>tingos koncentracijosgeliuose juda sk<strong>ir</strong>tingu greièiu. Todël didesnës koncentracijos agarozniaigeliai yra naudojami trumpesniems, o maþesnës koncentracijos – ilgesniemsDNR fragmentams frakcionuoti;c) nukleorûgðèiø konformacijos. Pavyzdþiui, to paties ilgio þiedinë, linijinë <strong>ir</strong>þiedinë, turinti viengrandá trûká molekulë, juda sk<strong>ir</strong>tingu greièiu. Daþniausiaiþiedinë DNR juda greièiau, nei tokio paties ilgio linijinë DNR;
122 _________________________________ BIOCHEMIJOS LABORATORINIAI DARBAIH 2NN +NH 2Br –CH 2CH 39.4 pav. Etidþio bromidas(2,7-diamino-10-etil-9-fenilfenantridobromidas)d) srovës stiprumo. Esant maþai átampai, linijinës DNR judëjimas yra tiesiog proporcingasátampai. Taèiau padidinus elektros lauko átampà didelio molekuliniosvorio DNR fragmentø judrumas pasikeièia sk<strong>ir</strong>tingai, todël rekomenduojamaelektroforezës átampa yra 5 V/cm.Agaroziniuose geliuose elektroforezës metu frakcionuotosnukleorûgðtys daþomos etidþio bromidu(9.4 pav.). Ðis daþas jungiasi prie DNR <strong>ir</strong> RNR <strong>ir</strong> ásiterpiatarp heterocikliniø baziø plokðtumø (ðis procesas vadinamasinterkaliacija), o apðviestas UV fluorescuoja ryðkiaioranþiðkai rausva spalva. Taikant ðá metodà, galimadetektuoti ~ 1ng DNR.Daþniausiai nukleorûgðèiø elektroforezës agaroziniamegelyje metodas yra taikomas DNR ar RNRvientisumui patikrinti, nagrinëti fermentiniø reakcijø(pvz., restrikcijos endonukleaziø, polimerazinës grandininësreakcijos) produktus. Agaroziniuose geliuosegalima frakcionuoti didesnius kaip 100 bp DNR fragmentus (9.5 pav.). Trumpesnëmsmolekulëms atsk<strong>ir</strong>ti tinkamesnis elektroforezës poliakrilamidiniame gelyje metodas.103190080070060050040030020010080M 1 2 3 4 59.5 pav. DNR elektroforezës 2% agaroziniamegelyje vaizdas. M takelyje – DNRilgio þymenys (1031, 900, 800, 700, 600,500, 400, 300, 200, 100, 80 bp). 1 takelyje– 212 bp, 2 – 329 bp, 3 – 446 bp, 4 – 622bp, 5 – 802 bp ilgio DNR fragmentai.
1. 9. Saugaus Nukleorûgðèiø darbo gryninimas biochemijos <strong>ir</strong> analizë laboratorijoje ________________________________________________pagrindinës taisyklës 1239.5. Plazmidinës DNR gryninimas <strong>ir</strong> analizë9.5.1. Plazmidinës pTZ19R DNR gryninimasMedþiagos <strong>ir</strong> reagentai:1. LB terpë (t. y. bakterijø auginimo terpë. Autorius – Luria-Bertani) turintiampicilino (100 µg/ml).2. STET buferis (8% sacharozë, 5% tritonas X-100, 50 mM EDTA, 50 mM TRIS-HCl, pH 8,0).3. 5 mg/ml lizocimo vandeninis t<strong>ir</strong>palas.4. TE buferis (10 mM TRIS-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0).5. Izopropilo alkoholis.6. 70% etanolisDarbo eiga:1. Bakterijø, turinèiø plazmidæ pTZ19R, kolonija suspenduojama 2 ml LB terpës,turinèios ampicilino (100 µg/ml), <strong>ir</strong> auginama esant 37 o C temperatûrai 14–16 val.2. 1,5 ml làsteliø kultûros supilama á mikrocentrifuginá mëgintuvëlá <strong>ir</strong> centrifuguojamos10 min. 7000 g. Làstelës suspenduojamos 350 µl STET buferio,kuriame yra 30 µg/ml lizocimo.3. Inkubuojama 5 min. kambario temperatûros sàlygomis.4. Mëginys perkeliamas á verdanèio vandens vonià <strong>ir</strong> inkubuojamas 40 sek.5. Centrifuguojama 10 min. 10000 × g.6. Po centrifugavimo mëgintuvëlio dugne matyti làsteliø nuolauþø nuosëdos. V<strong>ir</strong>ðjø – 2 – 3 mm klampus polisacharidø sluoksnis. Tarp ðio sluoksnio <strong>ir</strong> v<strong>ir</strong>ðutiniovandeninio t<strong>ir</strong>palo, kuriame yra sk<strong>ir</strong>iamoji plazmidë, matoma sk<strong>ir</strong>iamoji faziøriba. Atsargiai nusiurbkite vandeniná v<strong>ir</strong>ðutiná sluoksná á ðvarø mikrocentrifuginámëgintuvëlá, neliesdami klampaus sluoksnio mëgintuvëlio dugne.7. Á supernatantà pripilama 350 µl TE buferio <strong>ir</strong> 800 µl izopropilo alkoholio.Sumaiðoma purtykle <strong>ir</strong> inkubuojama kambario temperatûros sàlygomis 30 min.8. Centrifuguojama 10 min. 10000 × g.9. Supernatantas iðpilamas, ant nuosëdø uþpilama 100 µl 70% etanolio <strong>ir</strong> ðvelniaisupurtoma.10. Centrifuguojama 10 min. 10000 × g. Mëgintuvëlio dugne matyti nedidelis kiekisbaltø plazmidinës DNR nuosëdø.11. Supernatantas iðpilamas, nuosëdos iðdþiovinamos palikus atv<strong>ir</strong>à mëgintuvëlákambario temperatûros sàlygomis keleta valandø <strong>ir</strong> iðt<strong>ir</strong>pinamos 50 µl TE buferio(pH 8,0).
124 _________________________________ BIOCHEMIJOS LABORATORINIAI DARBAI9.5.2. Fermentinë pTZ19R DNR analizë9.6 pav. Plazmidës pTZ19R schema (A) <strong>ir</strong> multikloninëssrities (angl. multicloning site, MCS) DNR seka (B). Schemoje<strong>ir</strong> MCS paþymëtos restrikcijos endonukleaziø k<strong>ir</strong>pimo vietos
1. 9. Saugaus Nukleorûgðèiø darbo gryninimas biochemijos <strong>ir</strong> analizë laboratorijoje ________________________________________________pagrindinës taisyklës 125Medþiagos <strong>ir</strong> reagentai:1. Restrikcijos endonukleazë EcoRI (10 u/µl).2. Deoks<strong>ir</strong>ibonukleazëI (DNazëI 2 u/µl).3. RibonukleazëA (RNazëA 10 mg/ml).4. 10× reakcijos buferis (R+ buferis, AB „Fermentas“ (100 mM TRIS-HCl (pH8,5), 100 mM MgCl 2, 1M KCl, 1 mg/ml BSA).5. Sterilus H 2ODarbo eiga:Iðgryninta pTZ19R DNR bus veikiama:a) restrikcijos endonukleaze EcoRI.b) deoks<strong>ir</strong>ibonukleazeI (DNazëI).c) ribonukleazeA (RNazëA).d) kontrolë – fermentais neveikta DNR.1. Paruoðiami fermentiniø reakcijø miðiniai 4 mikrocentrifuginiuose mëgintuvëliuose.P<strong>ir</strong>miausia ápilama DNR t<strong>ir</strong>palo, vëliau sterilaus H 2O, paskui 10×reakcijos buferio, o galiausiai pripilama fermentø.ReagentaiAsu EcoRIBsu DNazeIDNR veikiamaCsu RNazeADkontrolėPlazmidinės DNR t<strong>ir</strong>palas 10 µl 10 µl 10 µl 10 µlSterilus H 2 O 7 µl 7 µl 7 µl 8 µl10× reakcijos buferis 2 µl 2 µl 2 µl 2 µlFermentas 1 µl EcoRI 1 µl DNazėI 1 µl RNazėA -V t - bendras reakcijostūris20 µl 20 µl 20 µl 20 µlDëmesio – fermentø t<strong>ir</strong>palø nepalikite ant stalo kambario temperatûros sàlygomis,o panaudojæ mëgintuvëlius ástatykite atgal á ledus !2. Reakcijos miðiniai inkubuojami 1 val., esant 37 o C temperatûrai.9.5.3. 1% agarozinio gelio paruoðimasMedþiagos <strong>ir</strong> reagentai:1. Agarozë.2. 10× TAE buferis (400 mM TRIS-acetato, 20 mM EDTA pH 8,0).3. Etidþio bromido t<strong>ir</strong>palas (5 mg/ml).
126 _________________________________ BIOCHEMIJOS LABORATORINIAI DARBAIDarbo eiga:1. Paruoðiama 100 ml 1% agarozës t<strong>ir</strong>palo: 1g agarozës, 10 ml 10× TAE buferio,H 2O iki 100 ml.2. T<strong>ir</strong>palas inkubuojamas mikrobangø krosnelëje arba verdanèio vandens voniojekeletà minuèiø, kol pasidaro skaidrus (agarozë iðsilydo).3. Leidþiama t<strong>ir</strong>palui atvësti iki ~ 60 o C temperatûros. Pripilama etidþio bromidoiki galutinës koncentracijos 0,5 µg/ml, t. y. 10 µl <strong>ir</strong> gerai iðmaiðoma.4. T<strong>ir</strong>palas supilamas á gelio formavimo sistemà (þr. 9.3 pav.).5. Po ~30 min. agarozë sukietëja. Iðimamos ðukutës <strong>ir</strong> gelis perkeliamas áelektroforezës aparatà <strong>ir</strong> uþpilamas 1× TAE buferiu.Dëmesio – etidþio bromidas yra mutagenas. Todël mëgintuvëlá, pripiltà t<strong>ir</strong>palo, <strong>ir</strong>agaroziná gelá lieskite tik mûvëdami gumines p<strong>ir</strong>ðtines!9.5.4. Fermentiniø reakcijø produktø analizë agaroziniame gelyje.Medþiagos <strong>ir</strong> reagentai:1. 6×DNR mëginiø buferis (10 mM TRIS-HCl (pH 7,6), 0,03% bromfenoliomëlynojo, 0,03% ksilencianolio, 60%glicerolio, 60 mM EDTA).2. Reagentai elektroforezei – 1% agarozinisgelis, 1× TAE elektroforezës buferis.3. DNR ilgio þymenys (GeneRuler 1kb DNALadder, AB „Fermentas“).Darbo eiga:1. Po inkubacijos reakcijos miðiniai paruoðiamielektroforezei: á reakcijos miðinius pilamapo 5 µl 6×DNR mëginiø buferio.2. Po 10 µl paruoðtø miðiniø <strong>ir</strong> 10 µl DNR ilgioþymens pilama á agarozinio gelio ðulinëlius.3. Atliekama DNR elektroforezë naudojant1šulinėliaDNR ilgiožymenys2šulinėlis3šulinėlis4šulinėlis5šulinėlisA B C D1,0% agarose0,5µg/lane8 cm length gel.,1×TAE, 7V/Cm,45 min5 V/cm ~30 – 40 min. Jos eiga stebima atsiþvelgiantá daþø, frakcionuojamø kartu suDNR mëginiais, judëjimà. Elektroforezë9.7 pav. DNR ilgio þymenø (Gene-Ruler 1kb DNA Ladder, AB „Fermentas“)elektroforezës 1% agarozësgelyje vaizdas
1. 9. Saugaus Nukleorûgðèiø darbo gryninimas biochemijos <strong>ir</strong> analizë laboratorijoje ________________________________________________pagrindinës taisyklës 127atliekama, kol greièiau judantis daþas – bromfenolio mëlynasis „nueina“ dutreèdalius gelio ilgio.4. Pasibaigus elektroforezei gelis iðimamas <strong>ir</strong> DNR analizuojama apðvietus UV.Dëmesio – agaroziniame gelyje yra etidþio bromido, kuris yra mutagenas. Agarozinágelá lieskite tik mûvëdami gumines p<strong>ir</strong>ðtines!9.6. Bakterijø RNR gryninimas <strong>ir</strong> analizë9.6.1. Bakterijø RNR gryninimasMedþiagos <strong>ir</strong> reagentai:1. LB terpë (t. y. Luria-Bertani bakterijø auginimo terpë).2. T<strong>ir</strong>palas A (10 mM TRIS HCl pH 7.3, 10 mM KCl, 5 mM MgCl 2).3. T<strong>ir</strong>palas B (20 mM TRIS HCl pH 7.9, 0,2 M NaCl, 40 mM EDTA, 1% SDS).4. Vandens prisotintas fenolis (pH 5.5).5. Chloroformas.6. Etanolis.7. Sterilus H 2O (apdorotas DEPC- dietilp<strong>ir</strong>okarbonatas inaktyvina RNazes).Darbo eiga:1. Bakterijø kolonija suspenduojama 20 ml LB terpës <strong>ir</strong> auginama esant 37 o Ctemperatûrai 14 – 16 val.2. Làstelës centrifuguojamos 10 min. 7000 × g <strong>ir</strong> suspenduojamos 1,5 ml ðaltot<strong>ir</strong>palo A.3. Pripilama 1,5 ml t<strong>ir</strong>palo B.4. 2 min. inkubuojama verdanèio vandens vonioje. Atðaldoma leduose.5. Á mëginá ápilamas lygus tûris (3,0 ml) vandens prisotinto karðto (65 o C) fenolio.Supurtoma putykle.6. Centrifuguojama 15 min. 10000 × g +4 o C.7. V<strong>ir</strong>ðutinë vandeninë fazë surenkama á ðvarø mëgintuvëlá, stengiantis nepaliestidenatûruotø baltymø plëvelës, susidariusios organinës (apatinës) <strong>ir</strong> vandeninës(v<strong>ir</strong>ðutinës) faziø sàlyèio pav<strong>ir</strong>ðiuje.8. V<strong>ir</strong>ðutinës vandeninës fazës fenolinë ekstrakcija pakartojama antrà kartà (5 – 7punktai).9. Surinkus v<strong>ir</strong>ðutinæ vandeninæ fazæ po antrosios fenolinës ekstrakcijos, á mëgináápilamas lygus tûris (3,0 ml) chloroformo.10. Centrifuguojama 15 min. 10000 × g +4 o C.11. V<strong>ir</strong>ðutinë vandeninë fazë surenkama á ðvarø mëgintuvëlá <strong>ir</strong> RNR iðsodinama 2,5tûriais etanolio.
128 _________________________________ BIOCHEMIJOS LABORATORINIAI DARBAI12. Paliekama esant –20 o C temperatûrai per naktá (galima <strong>ir</strong> ilgiau).13.Centrifuguojama 15 min. 10000 × g.14.Supernatantas iðpilamas, ant nuosëdø uþpilama 100 µl 70% etanolio <strong>ir</strong> ðvelniaisupurtoma.15.Centrifuguojama 15 min. 10000 × g.16.Supernatantas iðpilamas, nuosëdos iðdþiovinamos <strong>ir</strong> iðt<strong>ir</strong>pinamos 50 µl sterilausH 2O (apdoroto DEPC).9.6.2. Bakterinës RNR fermentinë analizëMedþiagos <strong>ir</strong> reagentai:1. Deoks<strong>ir</strong>ibonukleazëI (DNazëI 1 u/µl).2. RibonukleazëA (RNazëA 10 mg/ml).4. 10× reakcijos buferis (R+ buferis, AB „Fermentas“ (100 mM TRIS HCl (pH8,5), 100 mM MgCl 2, 1 M KCl, 1 mg/ml BSA).5. Sterilus H 2O.Darbo eiga:Iðgryninta bakterinë RNR bus veikiama:a) Deoks<strong>ir</strong>ibonukleazeI (DNazeI).b) RibonukleazeA (RNazeA).c) Kontrolë – fermentais neveikta DNR.1. Paruoðiami fermentiniø reakcijø miðiniai 3 mikrocentrifuginiuose mëgintuvëliuose.P<strong>ir</strong>miausia ápilama RNR t<strong>ir</strong>palo, vëliau sterilaus H 2O, paskui 10×reakcijos buferio, o galiausiai pripilama fermentø.ReagentaiAsu DNazeIRNR veikiamaBsu RNazeACkontrolėRNR t<strong>ir</strong>palas 10 µl 10 µl 10 µlSterilus H 2 O 7 µl 7 µl 8 µl10× reakcijos buferis 2 µl 2 µl 2 µlFermentas 1 µl DNazėI 1 µl RNazėA -V t - bendras reakcijos tūris 20 µl 20 µl 20 µlDëmesio – fermentø t<strong>ir</strong>palø nepalikite ant stalo kambario temperatûros sàlygomis,o panaudojæ ástatykite atgal á ledus !2. Reakcijos miðiniai inkubuojami 1 val., esant 37 o C temperatûrai.
1. 9. Saugaus Nukleorûgðèiø darbo gryninimas biochemijos <strong>ir</strong> analizë laboratorijoje ________________________________________________pagrindinës taisyklës 1299.6.3. Formaldehidinio 1,5% agarozës gelio paruoðimasMedþiagos <strong>ir</strong> reagentai:1. Agarozë.2. 10× elektroforezës MOPS/ EDTA buferis (0,2 M MOPS, 0,05 M CH 3COONa,0,01 M EDTA pH 7,0).3. 37% formaldehido t<strong>ir</strong>palas.4. Etidþio bromido tripalas (5mg/ml).Darbo eiga:1. Paruoðiama 100 ml 1,5% agarozës: 1,5 g agarozës, 10 ml MOPS/ EDTA 10×buferio, 87 ml H 2O.2. T<strong>ir</strong>palas inkubuojamas mikrobangø krosnelëje arba verdanèio vandens voniojekeletà minuèiø, kol pasidaro slaidrus (agarozë iðsilydo).3. Leidþiama t<strong>ir</strong>palui atvësti iki ~ 60 o C temperatûros. Pripilama 5,1 ml 37%formaldehido <strong>ir</strong> etidþio bromido iki galutinës koncentracijos 0,5 µg/ml, t. y. 10 µl.4. T<strong>ir</strong>palas gerai iðmaiðomas <strong>ir</strong> supilamas á gelio formavimo sistemà.5. Po ~30 min. agarozë sukietëja. Iðimamos ðukutës <strong>ir</strong> gelis perkeliamas áelektroforezës aparatà <strong>ir</strong> uþpilamas 1× MOPS/ EDTA buferiu.Dëmesio – etidþio bromidas <strong>ir</strong> formaldehidas yra mutagenai. Todël gelis ruoðiamastraukos spintoje, o agaroziná gelá lieskite tik mûvëdami gumines p<strong>ir</strong>ðtines!9.6.4. RNR analizë agaroziniame gelyje denatûravimo sàlygomis.Medþiagos <strong>ir</strong> reagentai:1. 6×RNR mëginiø buferis, turintis daþø (1,5 ml: 0,75 ml dejonizuoto formamido,0,15 ml 10× MOPS/EDTA buferio, 0,24 ml 37%formaldehido, 0,1 ml glicerolio,0,1 ml H 2O, 0,08 ml 10% bromfenolio mëlio vandeninio t<strong>ir</strong>palo <strong>ir</strong> 0,08 ml 10%ksilencianolio vandeninio t<strong>ir</strong>palo).2. Reagentai elektroforezei: 1,5% agarozinis formaldehidinis gelis, 1×elektroforezës MOPS/ EDTA buferis.3. DNR ilgio þymenys.Darbo eiga:1. Po inkubacijos reakcijos miðiniai paruoðiami elektroforezei: á reakcijos miðiniuspilama 5 µl 6×RNR mëginiø buferio.2. Mëginiai 15 min. inkubuojami, esant 65°C temperatûrai <strong>ir</strong> atðaldomi lede.3. Po 10 µl paruoðtø miðiniø <strong>ir</strong> 10 µl DNR ilgio þymens uþneðama á agaroziniogelio ðulinëlius.1 šulinėlis 2 šulinėlis 3 šulinėlis 4 šulinėlisDNR ilgio žymenys A B C
130 _________________________________ BIOCHEMIJOS LABORATORINIAI DARBAI4. Atliekama RNR elektroforezë naudojant 5 V/cm ~30 – 40 min. Jos eiga stebimaatsiþvelgiant á daþø, frakcionuojamø kartu su RNR mëginiais judëjimà.Elektroforezë atliekama, kol greièiau judantis daþas – bromfenolio mëlynasis„nueina“ du treèdalius gelio ilgio.5. Pasibaigus elektroforezei gelis iðimamas <strong>ir</strong> RNR analizuojama apðvietus UV.Dëmesio – agaroziniame gelyje yra etidþio bromido <strong>ir</strong> formaldehido, kurie yramutagenai. Todël elektroforezë atliekama traukos spintoje, o agaroziná gelá lieskitetik mûvëdami gumines p<strong>ir</strong>ðtines!9.7. Nukleoproteinø ið mieliø iðskyrimas <strong>ir</strong> analizë9.7.1. Nukleoproteinø iðskyrimas.Nukleoproteinai yra sudëtingi kompleksai sudaryti ið baltymø <strong>ir</strong> nukleorûgðèiø.Atsiþvelgiant á nukleoproteino sudëtá áeinanèios nukleorûgðties, yra ribo – <strong>ir</strong> deoks<strong>ir</strong>ibonukleoproteinai.Deoks<strong>ir</strong>ibonukleoproteinai daþniausiai yra làstelës branduolyje, áeinaá chromatino struktûrà. Ribonukleoproteinø daugiausia yra citozolyje. Ribosoma –geriausiai iðt<strong>ir</strong>tas ribonukleoproteinas.Medþiagos:1. Eteris. 5. 0,4% NaOH.2. Sterilus H 2O. 6. 10% H 2SO 4.3. Smëlis. 7. TE buferis (10 mM TRIS HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0).4. 5% CH 3COOH.Darbo eiga:Nukleoprotinøfenolinë reakcijaMielës1. Trynimas smëliu2. Veikimas NaOH3. Veikimas CH 3COOHNukleoprotinai,iðt<strong>ir</strong>pinti TE buferyjeNukleorûgðèiøfermentinë analizëNukleoprotinøpeptidø analizë9.8 pav. Nukleoproteinø iðskyrimo <strong>ir</strong> analizësschema:1. Á porceliano lëkðtelæ dedama 1 g dþiovintømieliø, pilama 0,5 ml eterio, 0,5 ml sterilausH 2O <strong>ir</strong> 0,5 g sterilaus smëlio. Mielës trinamosgrûstuve 2–3 min.2. Mikroskopu patikrinama, ar suardytosmieliø làsteliø sienelës.3. Á lëkðtelæ pilama 4 ml 0,4% NaOH <strong>ir</strong>trinama dar 4–5 min.4. Gautas miðinys perkeliamas á centrifuginámëgintuvëlá <strong>ir</strong> centrifuguojamas 10 min.3000 × g.5. Supernatantas perpilamas á ðvarø centrifuginámegintuvëlá <strong>ir</strong> atsargiai maiðant pilama1,5 ml 5% CH 3COOH. Parûgðtinussusidaro nukleoproteinø nuosëdos.6. Nuosëdos atsk<strong>ir</strong>iamos centrifuguojant 10min. 3000 × g.7. Nukleoproteinø nuosëdos suspenduojamos0,5 ml TE buferio. Suspensija padalijamapo 250 ml á du mëgintuvëlius, iðkuriø vienas bus sk<strong>ir</strong>tas nukleorûgðtims,o kitas – peptidams nagrinëti.
1. 9. Saugaus Nukleorûgðèiø darbo gryninimas biochemijos <strong>ir</strong> analizë laboratorijoje ________________________________________________pagrindinës taisyklës 1319.7.2 Nukleoproteininio komplekso nukleorûgðèiø analizë.Medþiagos:1. SS fenolis, (angl. salt saturated). Druskø t<strong>ir</strong>palu prisotintas fenolis Chloroformo– fenolio miðinys (lygiomis tûrio dalimis).2. Chloroformas.3. 3M CH 3COONa pH 5,5.4. Etanolis.5. TE buferis (10 mM TRIS HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0).6. 0,1M MgSO 4.7. Deoks<strong>ir</strong>ibonukleazëI (DNazëI 1 u/µl).8. RibonukleazëA (RNazëA 10mg/ml).9. 6×DNR mëginiø buferis, turintis daþø (10mM TRIS HCl (pH 7,6) 0,03%bromfenolio mëlynasis, 0,03% ksilencianolio, 60% glicerolio, 60 mM EDTA).10. Reagentai elektroforezei 1% agaroziniame gelyje (þr. 9.5.3 sk.).11. DNR ilgio þymenys.Darbo eiga:I. Atliekama nukleoproteinø fenolinë ekstrakcija, kurios metu paðalinami baltymai.1. Á 250 µl nukleoproteino, suspenduoto TE buferyje, pripilamas lygus tûris (250µl) SS- fenolio <strong>ir</strong> gerai supurtoma.2. Centrifuguojama 5 min. kambario temperatûros sàlygomis 10000 × g.3. V<strong>ir</strong>ðutinë (vandeninë) fazë surenkama á ðvarø mëgintuvëlá <strong>ir</strong> pripilama 250 µlfenolio –chloroformo (lygiomis tûrio dalimis) miðinio <strong>ir</strong> gerai supurtoma.2. Centrifuguota 5 min. kambario temperatûros sàlygomis 10000 × g.3. V<strong>ir</strong>ðutinë (vandeninë) fazë surenkama á ðvarø mëgintuvëlá <strong>ir</strong> pripilama 25 µl (1/10 tûrio) 3M CH 3COONa pH 5,5 <strong>ir</strong> 2 tûriai (550 µl) etanolio.4. Inkubuojama 2 val esant –20°C temperatûrai.5. Centrifuguojama 15 min. 12000 × g 4°C temperatûros sàlygomis.6. Supernatantas paðalinamas <strong>ir</strong> nuosëdos iðdþiovinamos kambario temperatûrossàlygomis arba vakuminëje centrifugoje.7. Nuosëdos iðt<strong>ir</strong>pinamos 30 µl TE buferio.8. Pamatuojama gautos medþiagos sugertis UV srityje, esant bangos ilgiui 260 <strong>ir</strong>280 nm. Apytiksliai paskaièiuojama nukleorûgðèiø koncentracija. Apskaièiuojamstûris, kuriame turëtø bûti 2–5 µg nukleorûgðèiø.II. Atliekama iðsk<strong>ir</strong>tø nukleoproteinø nukleorûgðèiø fermentinë hidrolizë.Nukleorûgðtys bus veikiamos:a) deoks<strong>ir</strong>ibonukleazeI (DNazeI).b) ribonukleazeA (RNazeA).c) kontrolë – fermentais neveikta DNR.
132 _________________________________ BIOCHEMIJOS LABORATORINIAI DARBAI1. Paruoðiami fermentiniø reakcijø miðiniai 3 mikrocentrifuginiuose mëgintuvëliuose.P<strong>ir</strong>miausia ápilama nukleorûgðèiø t<strong>ir</strong>palo, vëliau sterilaus H 2O, paskui0,1M MgSO 4, o galiausiai pripilama fermentø.ReagentaiNukleorūgščių t<strong>ir</strong>palas25 µgAsu DNazeINukleorūgštys veikiamosBsu RNazeACkontrolėX µl X µl X µlSterilus H 2 O Iki 20 µl Iki 20 µl Iki 20 µl0,1 M MgSO 4 1µl 1µl 1µlFermentas 2 µl DNazėI 2 µl RNazėA –V t - bendras reakcijos tūris 20 µl 20 µl 20 µlDëmesio – fermentø t<strong>ir</strong>palø nepalikite ant stalo kambario temperatûros sàlygomis,o pasinaudojæ ástatykite atgal á ledus !2. Reakcijos miðiniai inkubuojami 1 val. 37 o C temperatûros sàlygomis.Fermentinës hidrolizës produktai analizuojami elektroforezës 1 % agarozës gelyjemetodu. 1 % agarozës gelis paruoðiamas kaip apraðyta anksèiau 9.5.3 sk.1. Po inkubacijos reakcijos miðiniai paruoðiami elektroforezei: á reakcijos miðiniuspilama 5 µl 6×DNR mëginiø buferio.2. Po 10 µl paruoðtø miðiniø <strong>ir</strong> 10 µl DNR ilgio þymens uþneðama á agaroziniogelio ðulinëlius.Mëginiø seka:1 šulinėlis 2 šulinėlis 3 šulinėlis 4 šulinėlisDNR ilgio žymenys A B C3. Atliekama elektroforezë naudojant 5 V/cm ~30 – 40 min. Jos eiga stebimaatsiþvelgiant á daþø, frakcionuojamø kartu su DNR mëginiais, judëjimà.Elektroforezë atliekama, kol greièiau judantis daþas – bromfenolio mëlynasis„nueina“ du treèdalius gelio ilgio.4. Pasibaigus elektroforezei gelis iðimamas <strong>ir</strong> DNR analizuojama apðvietus UV.Dëmesio – agaroziniame gelyje yra etidþio bromido, kuris yra mutagenas. Agarozinágelá lieskite tik mûvëdami gumines p<strong>ir</strong>ðtines!
1. 9. Saugaus Nukleorûgðèiø darbo gryninimas biochemijos <strong>ir</strong> analizë laboratorijoje ________________________________________________pagrindinës taisyklës 1339.7.3. Nukleoproteinø komplekso peptidø analizëMedþiagos:1. Reagentai baltymø elektroforezei denatûravimo sàlygomis NDS (NDS – natriododecilsulfatas) poliakrilamidiniame gelyje (þr. laboratorinio darbo „Baltymøelektroforezë“ apraðymà).2. Baltymø molekulinës masës þymenys.3. 2× baltymø mëginiø buferis.Darbo eiga:III. Naudojantis baltymø koncentracijos kalibracine kreive (Bredfordo metodas)apytiksliai ávertinama iðsk<strong>ir</strong>to nukleoproteinø t<strong>ir</strong>palo baltymø koncentracija(antrasis mëginys, 9.7.1 sk).1. Apskaièiuojama, kokiame nukleoproteinø t<strong>ir</strong>palo tûryje yra 100 µg <strong>ir</strong> 150 µgbaltymø.2. Paruoðiami 3 miðiniai mikrocentrifuginiuose mëgintuvëliuose baltymø elektroforezei:1 2 3Baltymų molekulinės masėsžymenys10 µl100 µg nukleoproteinųX µl150 µg nukleoproteinųY µlbaltymų mėginių buferis10 µlbaltymų mėginių buferisX µlbaltymų mėginių buferisY µl1 – baltymø molekulinës masës þymenys (kaip nurodyta lentelëje), 2 <strong>ir</strong> 3 –nukleoproteinø baltymai. P<strong>ir</strong>miausia ápilama nukleoproteinø t<strong>ir</strong>palo, kuriame yra100 µg <strong>ir</strong> 150 µg baltymø, vëliau – lygus tûris 2× baltymø mëginiø buferio.3. Mëginiai denatûruojami verdanèio vandens vonioje 4 min.4. Atliekama baltymø elektroforezë denatûravimo sàlygomis NDS poliakrilamidiniamegelyje (þr. laboratorinio darbo „Baltymø elektroforezë“ apraðymà).9.8. Chromosominës DNR iðskyrimas ið eukariotiniø làsteliøMedþiagos:1. Homogenizavimo buferis (0,1 M NaCl, 0,2 M sacharozë, 0,01 M EDTA, 0,3MTRIS, pH 8,0). Laikyti esant 4°C temperatûrai.2. 10% natrio dodecilsulfatas (NDS).3. Chloroformas.4. SS fenolis, (angl. salt saturated). Druskø t<strong>ir</strong>palu prisotintas fenolis.5. 8 M kalio acetatas.6. Etanolis.
134 _________________________________ BIOCHEMIJOS LABORATORINIAI DARBAIDarbo eiga:1. Á 10 ml polipropileniná mëgintuvëlá ádedama apie 100 mg audinio (pvz., þiurkëskepenø), ið kurio bus iðsk<strong>ir</strong>iama DNR.2. Pilama 2 ml homogenizavimo buferio.3. Audiniai homogenizuojami tol, kol nelieka matomø kietø daleliø.4. Pilama 125 µl 10% natrio dodecilsulfato t<strong>ir</strong>palo <strong>ir</strong> sumaiðoma purtant.5. Inkubuojama vandens vonioje 30 min. 65°C temperatûros sàlygomis.6. Pilama 350 µl 8 M kalio acetato t<strong>ir</strong>palo <strong>ir</strong> sumaiðoma purtant. Inkubuojama 60min., esant 0°C temperatûrai.7. Centrifuguojama 5000 × g 10 min. 4°C temperatûros sàlygomis.8. Supernatantas perpilamas á ðvarø 10 ml mëgintuvëlá. Nuosëdos paðalinamos.9. Pilama 2 ml chloroformo <strong>ir</strong> 2 ml SS-fenolio. Sumaiðoma atsargiai vartantmëgintuvëlá. Centrifuguojama 1500 × g 10 min.10. V<strong>ir</strong>ðutinë vandeninë fazë perpilama á ðvarø mëgintuvëlá. Apatinë organinë fazëpaðalinama. Á vandeninæ fazæ pilama 2 ml chloroformo. Sumaiðoma atsargiaivartant mëgintuvëlá.11. Centrifuguojama 10000 × g 15 min. V<strong>ir</strong>ðutinë vandeninë fazë perpilama á naujàmëgintuvëlá. Apatinë chloroformo fazë paðalinama.12. Á vandeninæ fazæ pilama 5 ml etanolio <strong>ir</strong> nusodinama DNR. Sumaiðoma atsargiaivartant mëgintuvëlá. Centrifuguojama 1500 × g 10 min.13. Supernatantas paðalinamas <strong>ir</strong> ant nuosëdø pilama 5 ml 80% etanolio. Sumaiðomaatsargiai vartant mëgintuvëlá.14. Centrifuguojama 1500 × g 5 min.15. Etanolis paðalinamas <strong>ir</strong> nuosëdos iðdþiovinamos kambario temperatûrossàlygomis, palikus atv<strong>ir</strong>à mëgintuvëlá.16. Nuosëdos iðt<strong>ir</strong>pinamos 300 µl steriliaus TE buferio. DNR preparatas laikomas–20°C temperatûros sàlygomis.17. DNR koncentracija nustatoma spektrofotometriniu metodu – matuojama t<strong>ir</strong>palosugertis ties 260 nm ðviesos bangos ilgiu. Jeigu DNR t<strong>ir</strong>palo optinis tankis 1,0,tai dvigrandës DNR koncentracija yra 50 µg/ml.18. Ávertinamas DNR ðvarumas. Tam tikslui pamatuojama DNR t<strong>ir</strong>palo sugertisties 280 nm, kurià lemia baltymai. Jeigu sugerties ties 260 nm santykis su sugertimities 280 nm yra daugiau negu 1,8, laikoma, kad DNR t<strong>ir</strong>pale nëra baltymøpriemaiðø. (A 260/A 280>1,8).Literatûra1. Davis L.G., Dibner M.D., Battey J.F. 1986. Basic methods in molecular biology.Elsevier Science Publishing Co. Inc.2. Ausubel F.M., Brent R., Kingston R.E., Moore D.D., Seidman J.G. Smith J.A.,strukhl K (eds.). 2000. Current protocols in Molecular Biology. J. Wiley & SonsInc.
1. 9. Saugaus Nukleorûgðèiø darbo gryninimas biochemijos <strong>ir</strong> analizë laboratorijoje ________________________________________________pagrindinës taisyklës 135a. Triacilgliceroliø hidrolizëLipidais vadinamos nepolinës medþiagos, kurios ið organizmø ekstrahuojamosorganiniais t<strong>ir</strong>pikliais pvz., chloroformu, etanoliu, eteriu, <strong>ir</strong> kurios blogai t<strong>ir</strong>psta vandenyje.Tai yra didelë grupë medþiagø, kurios sk<strong>ir</strong>iasi struktûra, funkcijomis <strong>ir</strong> cheminëmissavybëmis. Riebalai, aliejai, vaðkai, membranø lipidai, tam tikri vitaminai <strong>ir</strong>hormonai priklauso ðiai margai junginiø grupei.Jie plaèiai paplitæ gyvàjame pasaulyje <strong>ir</strong> atlieka tam tikras funkcijas. Riebalaidaugiausia kaupiasi riebalinëse làstelëse, riebalø làðeliø forma. Jie yra organizmoenergijos ðaltinis. Fosfolipidai, susijungæ su baltymais sudaro membranas, kuriosapgaubia làstelæ <strong>ir</strong> organeles. Riebalai apsaugo organizmà nuo termininio <strong>ir</strong> fizikiniopoveikio. Augaluose vaðkai sudaro papildomà apsauginá sluoksná. Bitës ið vaðko gaminakorius. Lipidams priklauso cholesterolis, kuris labai svarbus membranø struktûraipalaikyti, ið jo sintetinamas vitaminas D, tulþies rûgðtys, lytiniai hormonai ( estrogenas,testosteronas) <strong>ir</strong> adrenokortikotropiniai hormonai. Terpenai, pvz., karotinoidai,reikalingi fotosintezës, regëjimo procesams. Augalø eteriniø aliejø kvapà lemia terpenai.Vieni ið lipidø atstovø yra acilgliceroliai, kurie yra glicerolio <strong>ir</strong> riebalø rûgðèiøesteriai. Vaðkai yra aukðtesniøjø alkoholiø <strong>ir</strong> riebalø rûgðèiø esteriai. Glicerofosfolipidaisudaryti ið glicerolio, riebalø rûgðèiø <strong>ir</strong> fosfato rûgðties, prie kurios gali bûti prijungtaspakaitas – cholinas, serinas, 2-aminoetanolis, ar kiti alkoholiai. Jeigu alkoholis yra neglicerolis, o aminoalkoholis sfingozinas, susidaro sfingolipidai. Sfingolipidams priklausosfingomielinai, cerebrozidai, gangliozidai. Sfingomielinai sudaryti ið sfingozino, riebalørûgðèiø, fosfato rûgðties <strong>ir</strong> daþniausiai cholino. Á cerebrozidø sudëtá áeina sfingozinas,riebalø rûgðtys <strong>ir</strong> monosacharidai. Gangliozidai susidaro susijungus sfingozinui, riebalørûgðtims <strong>ir</strong> oligosacharidui. Prie pastarojo prisijungusi sialo rûgðtis suteikia ganglioziduineigiamà krûvá. Lipidai, á kuriø sudëtá áeina fosforo rûgðtis yra vadinami fosfolipidais,o turintys angliavandeniø – glikolipidais.Acilgliceroliai, – nepolinës, hidrofobinës, vandenyje net<strong>ir</strong>pios medþiagos – darvadinamos trigliceridais, riebalais arba neutraliaisiais riebalais. Jie yra glicerolio <strong>ir</strong>riebalø rûgðèiø esteriai.Prie glicerolio gali bûti prijungusios 1, 2 <strong>ir</strong> 3 riebalø rûgðèiø liekanos , taigisintetinami mono-, di- <strong>ir</strong> triacilgliceroliai.Á triacilgliceroliø sudëtá áeinanèios riebalø rûgðtys gali bûti vienodos, pavyzdþiuitristearino ar trioleino rûgðtys. Gamtoje daþniausiai bûna sk<strong>ir</strong>tingo ilgio <strong>ir</strong> sotumo
136 _________________________________ BIOCHEMIJOS LABORATORINIAI DARBAIlaipsnio riebalø rûgðtys. Svieste yra daug palmitino rûgðties, pagrindinæ sëmenø aliejausdalá sudaro linoleno rûgðtis. Triacilgliceroliø lydymosi temperatûra priklauso nuonesoèiøjø riebalø rûgðèiø buvimo. Augaluose vyrauja nesoèiosios riebalø rûgðtys, todëlið jø gauti triacilgliceroliai kambario temperatûros sàlygomis yra skysti <strong>ir</strong> vadinamialiejais.Triacilgliceroliai yra veiksminga energijos saugojimo forma. Jø dëka, organizmuibadaujant, galima aps<strong>ir</strong>ûpinti energija 2–3 mënesiams. Glikogeno atsargø uþtenka tiktaivienai parai.Vaðkai yra esteriai, sudaryti ið ilgøjø anglies grandiniø (C 16– C 30) alkoholiø <strong>ir</strong>riebalø rûgðèiø (C 14– C 36). Á vaðkø sudëtá áeina cetilo (C 16), cerilo (C 26), m<strong>ir</strong>icilo (C 30)<strong>ir</strong> kiti alkoholiai bei soèiosios ar nesoèiosios, didelio lyginio anglies atomø skaièiausmonokarboks<strong>ir</strong>ûgðtys.Bendra vaðkø formulë: CH 3–(CH 2) n–O–CO–(CH 2) n–CH 3Vaðkus iðsk<strong>ir</strong>ia augalai <strong>ir</strong> gyvûnai. Vaðkø funkcija yra sudaryti apsaugines dangas.Paukðèiø plunksnos <strong>ir</strong> gyvuliø kailis turi vaðkiná apdangalà, kuris apsaugo nuosuðlapimo. Vaðkinë lapø <strong>ir</strong> vaisiø danga maþina vandens nuostolius, apsaugo nuoinfekcijos.Pagrindinis bièiø vaðko sandas yra m<strong>ir</strong>icilpalmitatas, CH 3–(CH 2) 29–O–CO–(CH 2) 14–CH 3.Riebalø rûgðtys Daugumos lipidø sudëtyje randamos riebalø rûgðtys. Riebalø rûgðtysyra ilgos angliavandenilinës grandinës monokarboks<strong>ir</strong>ûgðtys. Gamtoje aptinkama apie100 riebalø rûgðèiø, turinèiø 4–36 anglies atomus, jos retai bûna laisvos, daþniausiaiyra esterifikuotos.Bendra riebalø rûgðèiø formulë yra ði:CH 3–(CH 2) n–CH 2–CH 2–COOH.Gamtoje daþniausiai sutinkamos riebalø rûgðtys, kuriø molekulës yra neðakotos <strong>ir</strong>turi lyginá anglies atomø skaièiø. Riebalø rûgðtys gali bûti soèiosios <strong>ir</strong> nesoèiosios. Galibûti vienas ar keli dvigubieji ryðiai. Labai svarbios organizmo vystymuisi yrapolinesoèiosios riebalø rûgðtys (PUFA). Nesoèiosiose riebalø rûgðtyse dvigubieji ryðiainesudaro konjuguotos sistemos. Jie yra atsk<strong>ir</strong>ti metileno (–CH 2–) grupe –CH=CH–CH 2–CH=CH–. Be to, nesoèiosios riebalø rûgðtys yra cis konfiguracijos. Dvigubojoryðio padëtis þymima simboliu ∆, skaièiais paþymima tarp kuriø C atomø ðis ryðyssusidaro. Pavyzdþiui, C18:1∆ 9 reiðkia , kad riebalø rûgðtis sudaryta ið 18 anglies atomø,turi vienà dvigubàjá ryðá, kuris yra tarp 9 <strong>ir</strong> 10 anglies atomø. Kartais vartojama alternatyviterminologija: omega (ω).Nefermentinë triacilgliceroliø (riebalø) hidrolizë vyksta veikiant riebalus rûgðtimis,ðarmais <strong>ir</strong> perkaitintais vandens garais. Hidrolizuojant riebalus, susidaro glicerolis <strong>ir</strong>
1. 9. Saugaus Nukleorûgðèiø darbo gryninimas biochemijos <strong>ir</strong> analizë laboratorijoje ________________________________________________pagrindinës taisyklës 137riebalø rûgðtys. Veikiant ðarmais, gaunamos riebalø rûgðèiø druskos. Riebalø rûgðtysnet<strong>ir</strong>psta vandenyje. Jø <strong>ir</strong> ðarminiø metalø druskos - t<strong>ir</strong>pieji muilai. Riebalø rûgðèiøþemës ðarminiø <strong>ir</strong> sunkiøjø metalø druskos vandenyje net<strong>ir</strong>psta. T<strong>ir</strong>pieji muilai -pav<strong>ir</strong>ðinio aktyvumo medþiagos.Darbo metu hidrolizuojami riebalai, esant sp<strong>ir</strong>itiniam kalio hidroksido t<strong>ir</strong>palui.Susidarantys kalio muilai gerai t<strong>ir</strong>psta vandenyje. Parûgðtinus jø t<strong>ir</strong>palà susidaro net<strong>ir</strong>piosriebalø rûgðtys.Reagentai1. Riebalai, 0,5 g.2. Sp<strong>ir</strong>itinis kalio ðarmo t<strong>ir</strong>palas (5 g kalio hidroksido ðildant iðt<strong>ir</strong>pinami 10 mlvandens <strong>ir</strong> ápilami á 100 ml etanolio).3. 10% druskos rûgðtis, 50 ml.4. Eteris, 20 ml.5. Etanolis, kuriame yra 1 ml 10% nario karbonato t<strong>ir</strong>palo <strong>ir</strong> 0,2 ml sp<strong>ir</strong>itiniofenolftaleino t<strong>ir</strong>palo, 50 ml.6. 0,2 M CuSO 4, 10ml.Darbo eigaa) riebalø hidrolizë1. 0,5 g riebalø dedama á mëgintuvëlá <strong>ir</strong> ápilama 5 ml sp<strong>ir</strong>itinio kalio hidroksidot<strong>ir</strong>palo. Mëgintuvëlis uþkemðamas kamðèiu su ástatytu vamzdeliu (gráþtamasisðaldytuvas).2. Hidrolizuojama verdanèio vandens vonioje 30 min.3. Hidrolizei pasibaigus, skystis perpilamas á porceliano lëkðtelæ, ápilama 10 mlvandens <strong>ir</strong> ðildoma ant verdanèio vandens vonios, kad iðgaruotø sp<strong>ir</strong>itas.b) glicerolio nustatymas riebalø hidrolizës produktuose1. Á mëgintuvëlá, kuriame yra 1 ml po riebalø hidrolizës gauto vandeninio t<strong>ir</strong>palo(a bandymas), ápilama 0,1ml 0,2 M CuSO 4t<strong>ir</strong>palo <strong>ir</strong> supurtoma.c) riebalø rûgðèiø iðskyrimas1. Á gautà porceliano lëkðtelëje t<strong>ir</strong>palà (a bandymas) pilama 10% HCl, kol nustossusidaryti nuosëdos. Pilant HCl, skystis maiðomas lazdele.2. Riebalø rûgðèiø nuosëdos filtruojamos <strong>ir</strong> plaunamos ant filtro distiliuotuvandeniu, kad pasiðalintø HCl. Filtratas neturi sukelti rûgðèios reakcijos(nustatoma naudojant universalaus indikatoriaus popieriuk¹).3. Riebalø rûgðèiø nuosëdos iðt<strong>ir</strong>pinamos 1ml eterio, vëliau pilama 1ml etanolio,kuriame yra natrio karbonato t<strong>ir</strong>palo <strong>ir</strong> fenolftaleino. Rausva etanolio spalvaiðnyksta.
138 _________________________________ BIOCHEMIJOS LABORATORINIAI DARBAIKontroliniai klausimai:1. Ið ko sudaryti glicerofosfolipidai?2. Ið ko sudaryti sfingolipidai, cerebrozidai, gangliozidai?3. Paraðykite triacilgliceroliø, diacilgliceroliø <strong>ir</strong> monoacilgliceroliø formules.4. Dël kieno poveikio hidrolizuojami riebalai?5. Kodël iðnyksta rausva etanolio spalva, ápylus riebalø rûgðèiø eterinio t<strong>ir</strong>palo?
1. 10. Saugaus Pradinio darbo fermentinës biochemijos reakcijos laboratorijoje greièio nustatymas pagrindinës ______________________________________taisyklës 13910. Pradinio fermentinës reakcijosgreièio nustatymas10.1. Fermentai – biologiniai katalizatoriaiGyvuose organizmuose cheminës reakcijos vyksta labai greitai, nes jas katalizuojabaltymai, vadinami fermentais.Fermentø katalizuojamos reakcijos – tai procesai, kuriø metu kataliziðkai aktyvûsbaltymai (fermentai) katalizuoja substratø v<strong>ir</strong>timà reakcijos produktais.Fermentø savybësFermentai yra saviti savo substratams , jie efektyviai veikia (t. y. pakanka labai maþøjø koncentracijø) ðvelniomis sàlygomis (atmosferos slëgyje, reakcijos terpës pH neutralus,temperatûra nedidelë). Katalizuodami reakcijas fermentai nesusinaudoja <strong>ir</strong> dëlreakcijos nepakinta. Jie nepakeièia reakcijos pusiausvyros (katalizuoja <strong>ir</strong> tiesioginæ<strong>ir</strong> atv<strong>ir</strong>kðtinæ reakcijas), bet 10 10 – 10 16 kartø padidina reakcijos pusiausvyrospasiekimo greitá (palyginant su reakcijomis, vykstanèiomis be katalizatoriaus).Atsiþvelgiant á làstelës ar organizmo poreikius, fermentø veikla yra reguliuojama(fermentø aktyvumas didinamas arba maþinamas). Fermentø aktyvumas reguliuojamasprijungiant tam tikrus reguliacinius baltymus, aktyviklius ar slopiklius (inhibitorius),alosterinius elektorius <strong>ir</strong> panaðiai.Paprasèiausia fermentinë reakcija reaguojant vienam substratui apraðoma lygtimi:Substrato (S) molekulë reaguoja su fermentu (E), susidaro fermento <strong>ir</strong> substrato(ES) kompleksas, kuris v<strong>ir</strong>sta produktu (P).10.2. Katalizës samprataTarp sistemoje esanèiø medþiagø ávyksta cheminë reakcija, jei ðiø medþiagø molekulësyra suþadinamos <strong>ir</strong> aktyvinamos. Energija reikalinga tam, kad molekulës pereitø ápereinamàjà bûsenà <strong>ir</strong> galëtø sàveikauti, vadinama aktyvacijos energija E A.E A– energijos kiekis, bûtinas , kad visos 1 molio medþiagos molekulës, esant tamtikrai temperatûrai, pasiektø pereinamàjà bûsenà.
140 _________________________________ BIOCHEMIJOS LABORATORINIAI DARBAIReakcijos greitis yra proporcingasmolekuliø, pasiekusiø pereinamàjàbûsenà, koncentracijai.Reakcijos greitá galima padidintidviem bûdais:1. Didinant temperatûrà –suteikti papildomos energijos(t. y. didinti ðiluminámolekuliø judëjimà, kartu –vidinæ jø energijà). Padidinustemperatûrà 10 o Creakcijos greitis padidëjaapytikriai 2–3 kartus. Biologinëmssistemoms ðis bûdasSistemos laisvoji energijaNekatalizuojamosreakcijos??Aktyvacijos barjerasSistemos laisvosiosenergijos pokytisReakcijos eiga10.1 pav. Nekatalizuojamos <strong>ir</strong> katalizuojamosreakcijos potencinë kreivënëra veiksmingas, nes temperatûros didinimo ribos yra gana maþos. Fermentaiyra baltymai, daugumos jø denatûracija prasideda, esant ~ 60 o C temperatûrai.2. Maþinant aktyvacijos energijà.Reaguojant substratui su fermentu, tarpinio fermento <strong>ir</strong> substrato komplekso (ES)susidarymo aktyvacijos energija yra daug maþesnë, negu tiesiogiai substrato molekulëmsv<strong>ir</strong>stant produktu. Taigi, fermentai pagreitina medþiagø v<strong>ir</strong>smus sumaþindamiaktyvacijos energijà.?????????10.2.1 Fermentø struktûra <strong>ir</strong> veikimo ypatumaiKatalizinis fermentø aktyvumas priklauso nuo natyvios baltymo struktûros buvimo.Kaitinant, veikiant denatûruojanèiais reagentais, keièiant H + koncentracijà ar veikiantpeptidazëmis (fermentais skaidanèiais baltymus), katalizinis aktyvumas sumaþëja arbavisai panaikinamas. Baltymas yra kataliziðkai aktyvus, kai p<strong>ir</strong>minë, antrinë <strong>ir</strong> tretinëjo struktûros nepaþeistos.Yra fermentø, kurie sudaryti tik ið aminorûgðèiø liekanø <strong>ir</strong> neturi jokiø kitø cheminiøgrupiø (pvz., kasos ribonukleazë). Taèiau daugelio fermentø aktyvumui pas<strong>ir</strong>eikðti yrabûtini papildomi cheminiai sandai – kofaktoriai. Tai gali bûti metalø jonai (Mg 2+ , Mn 2+ ,Ca 2+ , Fe 2+ , Cu 2+ , K + <strong>ir</strong> kt.) ar sudëtingø organiniø junginiø molekulës, vadinamoskofermentais (daþnai kofermentais bûna vitaminai ar jø dariniai: tiamindifosfatas – B 1,p<strong>ir</strong>idoksalfosfatas – B 6, nikotinamidiniai , flavininiai kofermentai <strong>ir</strong> kt.).Kofermentai tiesiogiai dalyvauja reakcijoje <strong>ir</strong> daþnai atlieka atomø ar funkciniøgrupiø neðikliø vaidmená.Daugelio fermentø kataliziniam aktyvumui yra bûtinas tiek kofermentas, tiek metalojonai. Baltymas (apofermentas) kartu su kofermentu yra vadinamas holofermentu.
1. 10. Saugaus Pradinio darbo fermentinës biochemijos reakcijos laboratorijoje greièio nustatymas pagrindinës ______________________________________taisyklës 141Nedidelë, bet labai svarbi fermento molekulës dalis yra jos aktyvusis (katalizinis)centras, kurá suformuoja baltymà sudaranèiø aminorûgðèiø liekanø atitinkamosfunkcinës grupës. Aktyvøjá centrà sudaranèios aminorûgðèiø liekanos gali bûti gananutolusios viena nuo kitos p<strong>ir</strong>minëje baltymo struktûroje. Jos suartëja dël polipeptidinësgrandinës erdvinio iðsidëstymo. 1894 m. Emilis Fiðeris (E. Fischer) pasiûlë hipotezæ,kuria remiantis aktyvusis fermento centras turi atitikti substrato molekulës konformacijà(„spyna“ <strong>ir</strong> „raktas“ modelis).Substrato molekulë privalo turëti du struktûros elementus – savitàjá cheminá ryðá,kurá atakuoja fermentas <strong>ir</strong> funkcines grupes, suriðanèias substratà su aktyviuoju fermentocentru taip, kad atakuojamas ryðys bûtø tinkamu bûdu orientuotas fermentokataliziniø grupiø atþvilgiu.Vieni fermentai yra visiðkai saviti konkreèiam substratui, kiti sàveikauja su áva<strong>ir</strong>iøsubstratø konkreèiomis vietomis. Pavyzdþiui, aspartazë prijungia amoniakà tik priefumaro rûgðties dvigubojo ryðio (susidaro L-aspartatas). Ðio fermento substratu negalibûti jokia kita nesoèioji rûgðtis. Platesnio savitumo pavyzdys galëtø bûti peptidazës,skaidanèios peptidø <strong>ir</strong> polipeptidø peptidinius ryðius.Daugelio fermentø veikimà galima nuslopinti paveikus tam tikrais cheminiaisreagentais, vadinamais slopikliais (inhibitoriais). Slopikliø veikimo tyrimai suteikiaduomenø apie fermentø aktyviojo centro funkcines grupes, katalizës mechanizmà,substratiná fermentø savitumà <strong>ir</strong> làsteliø medþiagø apykaitos kelius.Fermentui reaguojant su slopikliu (I) susidaro fermento slopiklio (EI) kompleksas.Atsiþvelgiant á EI komplekso tv<strong>ir</strong>tumà, slopinimas gali bûti gráþtamasis <strong>ir</strong>negráþtamasis.Negráþtamojo slopinimo atveju slopiklis stipriai sus<strong>ir</strong>iða su fermento molekule <strong>ir</strong>EI kompleksas labai lëtai skyla .Gráþtamojo slopinimo metu slopiklis silpnai sus<strong>ir</strong>iða su fermentu <strong>ir</strong>, sumaþinusslopiklio koncentracijà (dializuojant ar skiedþiant t<strong>ir</strong>palà) fermento <strong>ir</strong> slopiklio kompleksaslengvai skyla á laisvà fermentà <strong>ir</strong> slopiklá, fermento aktyvumas atsinaujina. Gráþtamasisslopinimas sk<strong>ir</strong>stomas á konkurenciná, nekonkurenciná, bekonkurenciná, miðrøjá<strong>ir</strong> kitus.Esant konkurenciniam slopinimui, slopiklis <strong>ir</strong> substratas jungiasi prie tos paèiosfermento vietos, prie aktyviojo fermento centro. Didelës substrato koncentracijos maþinaslopiklio veikimà. Substratas <strong>ir</strong> slopiklis turi panaðias struktûras <strong>ir</strong> konkuruoja vienassu kitu dël sus<strong>ir</strong>iðimo su fermentu.Nekonkurencinio slopinimo atveju substratas <strong>ir</strong> slopiklis reaguoja ne su ta paèiafermento vieta <strong>ir</strong> substrato perteklius nesumaþina slopiklio poveikio. Nekonkurencinioslopinimo metu substratas <strong>ir</strong> slopiklis nekonkuruoja tarpusavyje.Bekonkurencinio slopinimo atveju slopiklis nesijungia su fermentu, kai reakcijosterpëje nëra substrato. Slopiklis susijungia su ES. Reakcija slopinama susidarius EISkompleksui.
142 _________________________________ BIOCHEMIJOS LABORATORINIAI DARBAI10.3. Fermentiniø reakcijø greièio priklausomumasnuo substrato koncentracijos10.2 pav. Fermentinës reakcijosgreièio priklausomumas nuosubstrato koncentracijosSubstrato koncentracija, reakcijos terpës pH <strong>ir</strong>temperatûra turi didelës átakos fermentiniø reakcijøgreièiui.Fermentinës reakcijos greièio priklausomumasnuo substrato koncentracijos apraðomas hiperbole<strong>ir</strong> pavaizduotas 10.2 pav. Esant maþoms substratokoncentracijoms, reakcijos greitis tiesiogiai priklausonuo substrato koncentracijos. Toliau didinantsubstrato koncentracijà reakcijos greitis lëtëja <strong>ir</strong>asimptotiðkai artëja prie V max, bet niekuomet jonepasiekia.Paprasèiausia fermentinë reakcija yra apraðomatokia lygtimi:k +1k –1k +2– fermento <strong>ir</strong> substrato komplekso susidarymo reakcijos greièio konstanta– fermento <strong>ir</strong> substrato komplekso skilimo á substratà <strong>ir</strong> fermentà reakcijosgreièio konstanta– fermento <strong>ir</strong> substrato komplekso skilimo á produktà <strong>ir</strong> fermentà reakcijosgreièio konstantaÐiuo atveju reakcija atliekama taip, kad susidariusio produkto koncentracija yranedidelë <strong>ir</strong> nevyksta gráþtamoji reakcija. Tokios reakcijos greitis priklauso nuosusidariusio fermento <strong>ir</strong> substrato komplekso koncentracijos <strong>ir</strong> jo skilimo á produktàgreièio. Tuo atveju, kai substrato koncentracija yra tiek didelë, kad visas reakcijojedalyvaujantis fermento kiekis sudaro fermento <strong>ir</strong> substrato kompleksà, reakcija vykstadidþiausiu greièiu – V max. L. Michaelis <strong>ir</strong> M. Menten apskaièiavo fermentinës reakcijosgreièio priklausomumà nuo substrato koncentracijos. Jie matavo pradiná reakcijos greitá(V 0), kai susidariusio reakcijos produkto koncentracija yra labai maþa. Fermentinësreakcijos greièio priklausomumas nuo substrato koncentracijos iðreiðkiamas lygtimi:Vienas svarbiausiø kinetiniø fermentinës reakcijos parametrø (rodikliø) yra Michaeliokonstanta – K M, kuri yra tiesioginës <strong>ir</strong> atv<strong>ir</strong>kðtinës fermentinës reakcijos greièiø konstantøsantykis:
1. 10. Saugaus Pradinio darbo fermentinës biochemijos reakcijos laboratorijoje greièio nustatymas pagrindinës ______________________________________taisyklës 143K Myra iðreiðkiama koncentracijos vienetais (M). Michaelio konstanta yra lygisubstrato koncentracijai, kuriai esant reakcijos greitis yra lygus pusei didþiausio(maksimalaus) greièio.K Mgalima nustatyti ið grafiko paþymëjus reakcijos greièio priklausomumà nuosubstrato koncentracijos (10.2 pav.), taèiau ði reikðmë yra netiksli, nes neámanomatiksliai nustatyti V max.Norint ið bandymo duomenø nustatyti K M<strong>ir</strong> V maxreikðmes, daþniausiai vartojamosdvigubos atv<strong>ir</strong>kðtinës Lainuivero <strong>ir</strong> Berko (Lineweaver-Burk) koordinatës – paþymima1/V 0priklausomybë nuo 1/[S].Paþymëjus bandymo metu gautus taðkus, per juos nubrëþiama tiesë, kertanti koordinaèiøaðis. Abscisiø aðyje tiesë susikerta taðke, atitinkanèiame –1/K M, o ordinaèiøaðyje – taðke 1/V max. Tiesës posvyrio kampas yra lygus K M/V max.Pastaba:Sudëtingiems fermentams, turintiems ne tikaktyviuosius, bet <strong>ir</strong> reguliacinius (alosterinius)centrus, Michaelio <strong>ir</strong> Menten kinetikos dësningumainetaikomi.Pradinis reakcijos greitis yra matuojamas,esant pastoviam fermentinës reakcijos greièiui,t. y. tada, kai tenkinamos stacionariosios (nuostoviosios)bûsenos sàlygos. Juo ilgiau trunkanuostovusis vyksmas, tuo patogiau <strong>ir</strong> tiksliaugalima iðmatuoti pradiná reakcijos greitá.Pradinio reakcijos greièio fazæ apibûdinapastovus greitis, t. y. vienodai didëjantisreakcijos produkto kiekis. Tai trunka keletà –keliasdeðimt sekundþiø po reagentø sumaiðymo <strong>ir</strong> priklauso nuo reakcijos sàlygø.Nubraiþius fermentinës reakcijos greièio priklausomumo nuo substrato koncentracijosgrafikà, iðvedama liestinë, einanti per koordinaèiø pradþios taðkà. Pradinis reakcijosgreitis nustatomas ið tiesës posvyrio kampo:V 0= d[P]/dt = tgα10.3 pav. Reakcijos greièio priklausomumasnuo substrato koncentracijosLainuivero-Berko koordinatëseKampo, kurá sudaro liestinë su abscisiø aðimi, tangentà apskaièiuojame ið staèiojotrikampio statiniø santykio. Reakcijos greitis iðreiðkiamas substrato koncentracijospokyèiu per minutæ.
144 _________________________________ BIOCHEMIJOS LABORATORINIAI DARBAI10.4 pav. Pradinio reakcijos greièio nustatymas10.4. Alkoholio dehidrogenazës katalizuojamos reakcijospradinio reakcijos greièio nustatymasAlkoholio dehidrogenazë (ADH) katalizuoja ðià reakcijà:Alkoholio dehidrogenazë (1.1.1.1) yra oksidoreduktazë (katalizuoja oksidacijos–redukcijos reakcijas). Mieliø ADH molekulinë masë yra 141 kDa. Fermento molekulësudaryta ið keturiø subvienetø, ji turi keturis tv<strong>ir</strong>tai suriðtus Zn atomus. Mieliø làstelësereakcijos pusiausvyra yra nukreipta acetaldehido redukcijos iki etanolio kryptimi. Taipaskutinë alkoholinës fermentacijos stadija. In vitro fermentas daþniausiai t<strong>ir</strong>iamas <strong>ir</strong>naudojamas ðarminëje pH srityje, t. y. sàlygomis, kurios nukreipia reakcijos pusiausvyràetanolio oksidacijos kryptimi.Reakcijos greitis nustatomas matuojant NADH koncentracijos didëjimà. Tai patoguatlikti pamatuojant spektrofotometru optiná tanká, esant ðviesos bangos ilgiui λ = 340 nm.Ðia savybe pasinaudojama t<strong>ir</strong>iant procesus, kuriuos katalizuoja nikotinamidiniuskofermentus turinèios dehidrogenazës. Vykstant oksidacijos – redukcijos procesamslabai patogu stebëti vienos kofermento formos v<strong>ir</strong>timà kita, stebint NADHkoncentracijos kitimà (didëjimà ar maþëjimà) reakcijos miðinyje.Ðis metodas taikomas <strong>ir</strong> vadinamiesiems “coupled assay” – sujungtiems(konjunguotiems) testams (pvz., heksokinazës ) aktyvumui ávertinti, ATP koncentracijainustatyti, kai sistemoje kaip pagalbinis fermentas naudojama gliukozës 6-fosfatodehidrogenazë.
1. 10. Saugaus Pradinio darbo fermentinës biochemijos reakcijos laboratorijoje greièio nustatymas pagrindinës ______________________________________taisyklës 145Pamatavus optiná tanká tam tikru laiko momentu, galima apskaièiuoti NADH(NADPH) koncentracijà reakcijos miðinyje tuo laiko momentu.c = A/∑ M• lc – matuojamos medþiagos koncentracija (M),A – optinis tankis (esant λ = 340 nm),ε M– molinës ekstinkcijos koeficientas (M –1 cm –1 ),l – kiuvetës plotis (cm).NADH molinës ekstinkcijos koeficientas ∑ M= 6220 M –1 cm –1 .Alkoholio dehidrogenazës aktyvumo vienetas – fermento kiekis, kuris redukuoja1 µmol NAD + per 1 min. standartinëmis (grieþtai apibrëþtomis) sàlygomis.Savitasis fermento aktyvumas iðreiðkiamas aktyvumo vienetais vienam mgbaltymo (U/mg).Darbo tikslas:1. Nustatyti pradinio reakcijos greièio priklausomumà nuo fermento kiekio.2. Iðt<strong>ir</strong>ti pradinio reakcijos greièio priklausomumà nuo substrato (etanolio)koncentracijos.3. Ávertinti t<strong>ir</strong>iamos reakcijos kinetinius parametrus (K M, V max).10.4.1. Pradinio reakcijos greièio priklausomumonuo fermento kiekio nustatymasReagentai:1. 100 mM TRIS HCl buferis, pH 8,8 .2. 25 mM kalio fosfato buferis pH 7,5.3. 1 mg/ml NAD+ (t<strong>ir</strong>pinama 25 mM kalio fosfato buferyje, pH 7,54. 3 M etanolis5. 1 mg/ml ADH (liofilizuotas fermentas t<strong>ir</strong>pinamas 25 mM kalio fosfato buferyje,pH 7,5).
146 _________________________________ BIOCHEMIJOS LABORATORINIAI DARBAIDarbo eiga:1. Á spektrofotometro kiuvetæ ápilama: 2,8 ml Tris-HCl buferio pH 8,8; 0,1 ml(100 µl) 3 M etanolio <strong>ir</strong> 0,1 ml (100 ìl) NAD + .2. Kiuvetë dedama á spektrofotometro ðulinëlá <strong>ir</strong> prietaisas nustatomas taip, kadrodytø optiná tanká lygø 0, esant bangos ilgiui ⎣ = 340 nm.3. Kelias minutes stebima (arba uþraðoma sav<strong>ir</strong>aðiu), ar vyksta tuðèioji (blank)reakcija ( ar nesikeièia t<strong>ir</strong>palo sugertis, t. y. NADH susidaro <strong>ir</strong> nesant kiuvetëjefermento).4. Á kiuvetæ, kurioje stebëtas tuðèiojo bandymo greitis, pridedamas tam tikrasfermento t<strong>ir</strong>palo kiekis (10, 20, 30, 40, 50 µl), greitai ιðmaiðoma <strong>ir</strong> kas 15 – 30sek. 3–4 min. matuojamas t<strong>ir</strong>palo optinis tankis. Reikia parinkti tokià fermentokoncentracijà, kad susidariusio NADH kiekis tiesiðkai didëtø laiko atþvilgiu, t.y. per vienodà laiko tarpà (pvz., kas 30 sek.) t<strong>ir</strong>palo optinis tankis padidëtø tuopaèiu dydþiu. Taisyklingi matavimai yra, jei optinis tankis, esant bangos ilgiui340 n m, per minutæ pakinta 0,02 – 0,04 vieneto (∆Α 340/min= 0,02 – 0,04).5. Atsiþvelgiant á nustatytus duomenis, grafiðkai paþymimas optinio tankiopriklausomumas nuo laiko (ordinaèiø aðyje paþymimas A 340, abscisiø – laikassekundëmis). Pridedamo fermento kiekis taip parenkamas, kad grafikas bûtøkuo panaðesnis á tiesæ.Atsiþvelgus á ðio bandymo rezultatus apskaièiuojamaNADH koncentracija (µM) kiekvienu laiko momentu, t. y. praëjus 15, 30, 45,60, 75, 90, 120, 150, 180 sek. nuo reakcijos pradþios.6. Uþpildoma 10.1 lentelë :10.1 lentelë. Susidariusio NADH koncentracijos priklausomumas nuo reakcijos trukmësReakcijos trukmė, sek. A 340 [NADH], µM151530456075901201501807. Nubraiþomas susidariusio NADH koncentracijos priklausomumo nuo laikografikas (ordinaèiø aðyje paþymima NADH koncentracija, abscisiø – reakcijostrukmë). Esant optimaliam fermento kiekiui, susidariusio NADH koncentracijatiesiðkai priklauso nuo laiko. Tuo atveju pradinis reakcijos greitis skaièiuojamas
1. 10. Saugaus Pradinio darbo fermentinës biochemijos reakcijos laboratorijoje greièio nustatymas pagrindinës ______________________________________taisyklës 147atsiþvelgiant á tiesës posvyrio kampo tangentà. Esant didesniam uþ optimaløfermento kiekiui, grafikas yra kreivës formos. Gautai kreivei nubrëþiama liestinë,<strong>ir</strong> apskaièiuojamas pradinis reakcijos greitis (V 0).8. V 0taip pat nustatomas esant dar kelioms ADH koncentracijoms.9. Nubraiþomas V 0priklausomumo nuo fermento kiekio grafikas : ordinaèiøaðyje paþymimas V 0,abscisiø – fermento kiekis .10.4.2. Pradinio reakcijos greièio priklausomumasnuo etanolio koncentracijosReagentai:1. 100 mM TRIS HCl buferis, pH 8,8 .2. 25 mM kalio fosfato buferis pH 7,5.3. 1 mg/ml NAD+ (t<strong>ir</strong>pinama 25 mM kalio fosfato buferyje, pH 7,54. 3 M etanolis5. 1 mg/ml ADH (liofilizuotas fermentas t<strong>ir</strong>pinamas 25 mM kalio fosfatobuferyje, pH 7,5).Darbo eiga:1. Nustatomas pradinis reakcijos greitis (V o), esant sk<strong>ir</strong>tingoms etanoliokoncentracijoms.2. Á kiuvetæ pilami sk<strong>ir</strong>tingi etanolio kiekiai (25µl, 50 µl, 100 µl, 150 µl, 200 µl,300 µl). Ðios reakcijos pradedamos pridedant á kiuvetæ anksèiau atrinktà optimaløfermento kieká.3. Nubraiþomas susidariusio NADH koncentracijos priklausomumo nuo laikografikas, esant sk<strong>ir</strong>tingoms etanolio koncentracijoms <strong>ir</strong> vertinamas pradinisreakcijos greitis. Uþpildoma 10.2 lentelë10.2 lentelë. Reakcijos greièio priklausomumas nuo etanolio koncentracijosPridedamoetanolio kiekis,µl2550100150200300Etanoliokoncentracijamėginyje, µMPradinisreakcijos greitis,µM/min.1/V 0 1/[S]
148 _________________________________ BIOCHEMIJOS LABORATORINIAI DARBAI4. Nubraiþomas reakcijos greièio priklausomumo nuo etanolio koncentracijosgrafikas (Lainuiverio <strong>ir</strong> Berko koordinatëse).5. Apskaièiuojma Michaelio konstanta K M<strong>ir</strong> maksimalus reakcijos greitis V max10.5. Ðarminës fosfatazës ið E. colipradinio reakcijos greièio nustatymasÐarminë fosfatazë (EC 3.1.3.1) katalizuoja fosforo rûgðties liekanos atskëlimà nuomonoesterintø junginiø galo. Ji plaèiai taikoma ribo- <strong>ir</strong> deoks<strong>ir</strong>ibonukleotidø galiniamfosfatui paðalinti.Ðarminë fosfatazë (AP – Alkaline Phosphatase) ið E. coli yra dimerinis baltymas, ákurio sudëtá áeina Zn 2+ <strong>ir</strong> Mg 2+ . Du Zn 2+ jonai yra bûtini fermento molekulës aktyvumuiats<strong>ir</strong>asti. Mg 2+ didina Zn-turinèio apofermento aktyvumà. Fermento veikimà slopinaneorganinis fosfatas.Fermento aktyvumas nustatomas vartojant Gereno <strong>ir</strong> Levintalio (Garen <strong>ir</strong> Levinthal,1960) metodikà. Apie reakcijos greitá sprendþiama ið optinio tankio 405–420 nm srityjepadidëjimo, ats<strong>ir</strong>andanèio dël susidariusio p-nitrofenolio (p-NP).Fermento vienetu laikomas fermento kiekis, kuris iðsk<strong>ir</strong>ia 1 µmol p-nitrofenolioper 1 min., esant 25 0 C temperatûrai, pH 8, apibrëþtomis sàlygomis.Darbo tikslas:1. Nustatyti pradinio reakcijos greièio priklausomumà nuo fermento kiekio.2. Iðt<strong>ir</strong>ti pradinio reakcijos greièio priklausomumà nuo substrato (p-NPP)koncentracijos.3. Ávertinti t<strong>ir</strong>iamos reakcijos Michaelio konstantà <strong>ir</strong> maksimalø reakcijos greitá.Reagentai:7. 1,5 M TRIS HCl buferis pH 8,0.8. 0,003 M p-nitrofenilfosfatas (p-NPP).9. 0,03 M p-nitrofenilfosfatas (p-NPP).10. Fermento t<strong>ir</strong>palas.Parenkama tokia fermento koncentracija , kad stebint sugerties kitimà ties 410 nmilgio banga, sugerties pokytis per minutæ (∆Α 410/min.) bûtø 0,02 – 0,04.
1. 10. Saugaus Pradinio darbo fermentinës biochemijos reakcijos laboratorijoje greièio nustatymas pagrindinës ______________________________________taisyklës 149Darbo eiga:1. Spektrofotometras nustatomas ties 410 nm ilgio banga.2. Á kiuvetæ pilama 2 ml Tris-HCl buferio pH 8,0 <strong>ir</strong> 1 ml 0,003 M p-NPP.3. 4–5 min. stebimas tuðèiasis (blank) greitis, vëliau pridedama 0,1 ml praskiestofermento.4. 3–5 min. stebimas sugerties kitimas.Fermento aktyvumas apskaièiuojamas ið formulës :U/mg =∆Α 410/min. × 10001,62×10 4 × mg fermento/ml reakcijos miðiniokur 1,62×10 4 yra p-nitrofenolio (p-NP) molinës ekstinkcijos koeficientas.10.5.1. Pradinio reakcijos greièio priklausomumonuo fermento kiekio nustatymasReagentai:1. 1,5 M TRIS HCl buferis pH 8,0.2. 0,003 M p-nitrofenilfosfatas (p-NPP).3. 0,03 M p-nitrofenilfosfatas (p-NPP).4. Fermento t<strong>ir</strong>palas.Parenkama tokia fermento koncentracija , kad stebint sugerties kitimà ties 410 nmilgio banga, sugerties pokytis per minutæ (∆Α 410/min.) bûtø 0,02 – 0,04.Darbo eiga:1. Á kiuvetæ, kurioje stebëtas tuðèiasis (blank) greitis, pilamas tam tikras fermentot<strong>ir</strong>palo kiekis (10–100 µl), greitai iðmaiðoma <strong>ir</strong> kas 15–30 sek. 3–4 min.matuojamas t<strong>ir</strong>palo optinis tankis.2. Reikia parinkti tokià fermento koncentracijà, kad susidariusio p-NP kiekistiesiðkai didëtø laiko atþvilgiu, t. y. per vienodà laiko tarpà (pvz., kas 30 sek.)t<strong>ir</strong>palo optinis tankis padidëtø tuo paèiu dydþiu.3. Grafiðkai paþymima optinio tankio priklausomybë nuo laiko (ordinaèiø aðyjepaþymima A 410, abscisiø – laikas sekundëmis). Pilamo fermento kiekisparenkamas taip, kad grafikas bûtø kuo panaðesnis á tiesæ.4. Apskaièiuojama p-NP koncentracija (µM) kiekvienu laiko momentu, t. y. praëjus15, 30, 45, 60, 75, 90, 120, 150, 180, 210, 240 sek. nuo reakcijos pradþios.Uþpildoma 10.3 lentelë.
150 _________________________________ BIOCHEMIJOS LABORATORINIAI DARBAI10 3 lentelë. Susidariusio p-NP koncentracijos priklausomumas nuo reakcijos trukmësReakcijos trukmė, sek. A 410 [p-NP],µM15304560901201501802102405. Nubraiþomas susidariusio p-NP koncentracijos priklausomybës nuo laikografikas (ordinaèiø aðyje paþymima p-NP koncentracija, abscisiø – reakcijostrukmë). Sudarytai kreivei nubrëþiama liestinë <strong>ir</strong> apskaièiuojamas pradinisreakcijos greitis (V 0) (þr.10.4).10.5.2. Pradinio reakcijos greièio priklausomumonuo p-NPP koncentracijos nustatymasReagentai:1. 1,5 M TRIS HCl buferis pH 8,0.2. 0,003 M p-nitrofenilfosfatas (p-NPP).3. 0,03 M p-nitrofenilfosfatas (p-NPP).4. Fermento t<strong>ir</strong>palas.Parenkama tokia fermento koncentracija , kad stebint sugerties kitimà ties 410 nmilgio banga, sugerties pokytis per minutæ (∆Α 410/min.) bûtø 0,02–0,04.Darbo eiga:1. Nustatomas pradinis reakcijos greitis (V o), esant sk<strong>ir</strong>tingoms p-NPP koncentracijoms.2. Á kiuvetæ, kurioje stebëtas tuðèiasis (blank) greitis, á kiuvetæ pilami sk<strong>ir</strong>tingi 0,03M p-NPP kiekiai (100 µl, 250 µl, 500 µl, 750 µl, 1000 µl). Pilant maþesnius, kaip1000 µl p-NPP tûrius, atitinkamai didinamas pilamo buferio tûris, kad suminisbuferio <strong>ir</strong> substrato tûris bûtø 3 ml.3. Ðios reakcijos pradedamos pilant á kiuvetæ anksèiau atrinktà optimalø fermentokieká.4. Apskaièiuojama susidaranèio p-NP koncentracija.5. Nubraiþomas susidariusio p-NP koncentracijos priklausomumo nuo laikografikas <strong>ir</strong> apskaièiuojami pradiniai reakcijos greièiai (V 0). Uþpildoma 10.4lentelë.
1. 10. Saugaus Pradinio darbo fermentinës biochemijos reakcijos laboratorijoje greièio nustatymas pagrindinës ______________________________________taisyklës 15110.4 lentelë. Reakcijos greièio priklausomumas nuo p-NPP koncentracijosDedamop-NPP kiekis, µl1002505007501000p-NPPkoncentracijamėginyje, µMReakcijos greitis,µM/min.1/V 0 1/[S]6. Grafike paþymima V 0priklausomumas nuo p-NPP koncentracijos Nubraiþomasreakcijos greièio priklausomumas nuo substrato koncentracijos grafikasLainuivero <strong>ir</strong> Berko koordinatëse.7. Apskaièiuojame Michaelio konstantà <strong>ir</strong> maksimalø reakcijos greitá.Literatûra:D. E. Metzler. Biochemistry. Harcourt/Academic Press. 2001. Vol.1. P. 454–503.A. Glemþa. Fermentai. Mokslas, 1987, p.109 – 158.A. Praðkevièius, L. Ivanovienë, N. Stasiûnienë, J. Burneckienë, H. Rodovièius, L.Lukoðevièius, D. Kondratas. Biochemija. KMU leidykla, Kaunas, 2003, p. 122 – 160.http://www.worthington-biochem.com/ADH/Kontroliniai klausimai1. Kaip apibûdinama fermentinë reakcija? Reakcijos substratø <strong>ir</strong> produktø samprata.2. Fermentø struktûra (apofermentai, kofermentai, kofaktoriai, holofermentai).Kas yra aktyvusis fermento centras?3. Kas lemia fermentinës reakcijos rûðá <strong>ir</strong> katalizës veiksmingumà. Fermentøsavitumas.4. Gráþtamosios <strong>ir</strong> negráþtamosios reakcijos. Fermentiniø reakcijø aktyvikliai <strong>ir</strong>slopikliai.5. Kuriose làstelës dalyse yra sutelkti fermentai?6. Kuo iðreiðkiamas reakcijos greitis? Kuo pas<strong>ir</strong>eiðkia fermentinës reakcijosproduktø átaka reakcijos greièiui?7. Kas yra pradinis fermentinës reakcijos greitis? Kaip grafiðkai jis iðreiðkiamas?8. Kokià reakcijà katalizuoja alkoholio dehidrogenazë? Apibûdinkite nikotinamidiniøkofermentø ðviesos sugerties ypatumus.9. Kur pritaikoma ðarminë fosfatazë?10. Kas yra molinës ekstinkcijos koeficientas? Kaip apskaièiuoti medþiagoskoncentracijà atsiþvelgiant á pamatuotà optiná tanká?11. Kaip priklauso fermentiniø reakcijø greitis nuo temperatûros, terpës pH <strong>ir</strong>substrato koncentracijos?
152 _________________________________ BIOCHEMIJOS LABORATORINIAI DARBAI11. Priedai11.1 lentelë. Daugikliaim (mili) 10 -3 k (kilo) 10 3µ (µ) (mikro) 10 -6 M (mega) 10 6n (nano) 10 -9 G (giga) 10 9p (piko) 10 -12 T (tera) 10 12f (femto) 10 -15 P (peta) 10 15a (ato) 10 -18 E (ekza) 10 18z (zepto) 10 -21 Z (zeta) 10 21Y (yota) 1011.2.lentelë. Tam tikrø medþiagø moliniai ekstinkcijos koeficientaiJunginysλ maxnmε maxM -1· cm -1λ maxnmε maxM -1· cm -1λ maxnmε maxM -1· cm -1Triptofanas 280 5600 219 47000 7,0T<strong>ir</strong>ozinas 274 1400 222 8000 193 48000 7,0Fenilalaninas 257 200 206 9300 188 60000 7,0Histidinas 211 5900 7,0Cisteinas 250 300 7,0Hipoksantinas 248 10300 7,0Guaninas 249 9100 273 7500 7,0Guanozinas 252 13600 273 7500 7,0Adeninas 261 13400 7,0Adenozinas 259 14900 7,09-metiladeninas 260 14200 7,0Citozinas 267 6100 7,0Citidinas 271 9100 7,0Uracilas 259 8200 7,0Uridinas 261 10100 7,0Timinas 264 7900 7,0Timidinas 267 9700 7,0DNR 258 6600 7,0RNR 258 7400 7,0Kofeinas 278 10900 7,0Izokofeinas 239 7600 267 9000 7,0Šlapimo rūgštis 238 9800 293 12200 7,0NAD + 260 18000 7,0NADH 260 16900 340 6220 7,0pH
1. 11. Saugaus Priedai _____________________________________________________________________darbo biochemijos laboratorijoje pagrindinës taisyklës 15311.3 lentelë. UV <strong>ir</strong> regimosios ðviesos bangø ilgiaiT<strong>ir</strong>palo spalva Spektro sritis Šviesos bangų ilgiai, nmBespalvis Ultravioletinė 220 ? 400Geltonai žalia Violetinė 400 ? 450Geltona Mėlyna 450 ? 480Oranžiška Žaliai mėlyna 480–490Raudona Mėlynai žalia 490 ? 500Purpurinė Žalia 500 ? 560Violetinė Geltonai žalia 560 ? 575Mėlyna Geltona 575 ? 590Žaliai mėlyna Oranžiška 590 ? 625Mėlynai žalia Raudona 625 ? 77011.4 lentelë. Skysèiø pHSistema (t<strong>ir</strong>palas) pH Sistema (t<strong>ir</strong>palas) pHSeilės 6,35–6,85 Jūros vanduo 8,0Žmogaus kraujas 7,35–7,45 Kiaušinio baltymas 8,0Skrandžio sultys 1,6–1,8 Apelsinų sultys 2,6–4,4Ašaros 7,4 Pomidorų sultys 4,3Šlapimas 4,8–7,5 Pienas 6,6-6,911.5 lentelë. Indikatoriniø daþø savybësDažasRūgštis/bazėIndikatoriaus naudojimospalvos kitimaspH intervalasTimolio mėlynasis Raudona – geltona 1,2–6,8Bromfenolio mėlynasis geltona – mėlyna 1,2–6,8Kongo raudonasis mėlyna – raudona 3,0–5,2Metiloranžinis Raudona – geltona 4,3–6,1Fenolis raudonasis Geltona – raudona 6,8–8,2Fenolftaleinas Bespalvis – raudona 8,3–10,0
154 _________________________________ BIOCHEMIJOS LABORATORINIAI DARBAI11.6 lentelë. Daþnai naudojami buferiniai t<strong>ir</strong>palaiBuferiaiRekomenduojama naudotipH sritisNatrio citratas–citrinų rūgštis 3,.0–6,2Natrio acetatas–acto rūgštis 3,6–5,6MES–NaOH 5,6–6,8NaH 2 PO 4 – Na 2 HPO 4 5,8–8,0Imidazolas–HCl 6,2–7,8MOPS–KOH 6,6–7,8Trietanolamino hidrochloridas–NaOH 6,8–8,8TRIS–HCl 7,0–9,0HEPES–NaOH 7,2–8,2Tricinas–NaOH 7,6–8,6Natrio tetraboratas–boro rūgštis 7,6–9,,2Bicinas– NaOH 7,7–8,9Glicinas–NaOH 8,6–10,6KonstantosAvogadro skaièius, N A= 6.022045 10 23 mol –1Bolcmano konnstanta, k=1.380622·10 –23 J/ÊUniversalioji dujø konstanta, R=8.31434 J/Ê*molNukleorûgðèiø molinës masës:bazës= 324.5Dabaziø pora = 649Daribo bazë = 340.5Da1kb ds DNA (Na) = 6.5x10 5 Da1kb ss DNA (Na) = 3.3x10 5 Da1kb ss RNA (Na) = 3.4x10 5 Da