Antiradikalinio ir redukcinio aktyvumo nustatymo metodai (apžvalga)

LIETUVOS AGRARINIŲ IR MIŠKŲ MOKSLŲ CENTRO FILIALOSODININKYSTĖS IR DARŽININKYSTĖS INSTITUTO IRALEKSANDRO STULGINSKIO UNIVERSITETO MOKSLO DARBAI.SODININKYSTĖ IR DARŽININKYSTĖ. 2012. 31(3–4).Antiradikalinio ir redukcinio aktyvumo nustatymometodai (apžvalga)Raimondas Raudonis 1, 2 , Lina Raudonė 1 , Valdimaras Janulis 1 ,Pranas Viškelis 21Lietuvos sveikatos mokslų universiteto Medicinos akademijosFarmacijos fakulteto Farmakognozijos katedra, Mickevičiaus g. 9,LT-44307 Kaunas, el. paštas raimondas.raudonis@gmail.com2Lietuvos agrarinių ir miškų mokslų centro filialas Sodininkystės irdaržininkystės institutas, Kauno g. 30, LT-54333 Babtai, Kauno r.,el. paštas biochem@lsdi.ltAntioksidantas – tai medžiaga, kuri efektyviai redukuoja prooksidantą, sudarydamanetoksiškus arba mažai toksiškus junginius. Didėja susidomėjimas augaluose aptinkamųnatūralių antioksidantų apsauginėmis savybėmis ir jų taikymu profilaktiniams tikslams.Preliminarūs augalinių žaliavų antioksidantinio aktyvumo tyrimai atliekami in vitro analitiniaismetodais. Populiariausi elektronų perdavimu (SET) pagrįsti antioksidantinio aktyvumotyrimo metodai yra DPPH radikalų ir ABTS radikalų-katijonų surišimo įvertinimasbei geležies (FRAP) ir vario (CUPRAC) jonų redukcijos antioksidantinės galios nustatymas.Dažniausiai taikoma spektrofotometrinė regimosios šviesos absorbcijos pokyčio detekcija.Tai paprastas, patikimas ir tinkamas metodas grynų junginių antioksidantinėms savybėmsįvertinti bei struktūros-aktyvumo ryšiui nustatyti. Sudėtiniuose mišiniuose, tokiuose kaipaugalinės žaliavos ekstraktai ir maisto bandiniai, spektrofotometriniu metodu nustatomas tikvisų bandinyje esančių junginių suminis antioksidantinis aktyvumas ir negalima nustatytiatskirų komponentų bendroje antioksidantų sudėtyje. Didelės skiriamosios gebos tiesioginiais(on-line) metodais atliekama greita antioksidantiniu aktyvumu išsiskiriančių junginių atranka.Taikant šiuos metodus sujungiama efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC) skirstymasir pokolonėlinės reakcijos detekcija. ESC pokolonėliniais metodais įvertinamos atskirųjunginių antioksidantinės savybės bei jų indėlis į bendrą kompleksinių mišinių antioksidantinįaktyvumą. Šiais metodais patikimai, tiksliai bei atkartojamai įvertinama augalinių žaliavųekstraktų kokybė, nustatant biologiškai aktyvių junginių antioksidantinio aktyvumo kokybiniusir kiekybinius rodiklius. Jie leidžia kontroliuoti antioksidantų pasiskirstymą ir stabilumą,nustatyti optimalias žaliavos ar produkto saugojimo sąlygas. ESC pokolonėliniai metodaiyra veiksminga priemonė augalų atrankai atlikti atsižvelgiant į skirtingas rūšis, varietetus,fenologinį tarpsnį ir auginimo sąlygas, kad būtų užtikrinta gausi antioksidantų sudėtis.Reikšminiai žodžiai: ABTS, antioksidantai, CUPRAC, DPPH, FRAP, pokolonėliniaimetodai.15

Įvadas. Antioksidantai įvairiais veikimo mechanizmais geba neutralizuotižalingas reaktyvias deguonies (ROS) ir azoto (RNS) formas. Jų vartojimas sustiprinaląstelės antioksidantinės apsaugos sistemas bei padeda atkurti pažeistas struktūras(Devasagayam ir kt., 2004). Epidemiologiniais tyrimais įrodytas antioksidantųgebėjimas mažinti ar visai sustabdyti daugelio lėtinių ligų progresavimą(Surveswaran ir kt., 2007). Didėja susidomėjimas augaluose aptinkamų natūraliųantioksidantų apsauginėmis savybėmis ir jų taikymu profilaktiniams tikslams (Yanishlievair kt., 2006).Preliminarūs augalinių žaliavų antioksidantinio aktyvumo tyrimai atliekamiin vitro analitiniais metodais. In vitro modelinėse sistemose natūralių antioksidantųsavybės įvertinamos sąlyginai paprastomis ir kontroliuojamų parametrų sąlygomis(Halliwell, 1995), tik po to jie tiriami realiose organizmo terpėse in vivo (Halliwell,Whiteman, 2004). Taikomi įvairūs antioksidantinio aktyvumo įvertinimo metodai,pagrįsti skirtingais veikimo mechanizmais (Miguel, 2010). Šiais metodais tiriamiaugaliniai antioksidantai konkuruojančios ar nekonkuruojančios reakcijos principuinaktyvuoja žinomą oksidantą dviem pagrindiniais būdais: vandenilio atomo perdavimoarba elektronų perdavimo reakcijomis (Miguel, 2010).Populiariausi elektronų perdavimu pagrįsti antioksidantinio aktyvumo tyrimometodai yra DPPH radikalų ir ABTS radikalų-katijonų surišimo įvertinimas bei geležies(FRAP) ir vario (CUPRAC) jonų redukcijos antioksidantinės galios nustatymas (Apakir kt., 2008; Wootton-Beard ir kt., 2011; Zhang ir kt., 2009). Taikant šiuos metodusvyksta nekonkuruojanti reakcija tarp tiriamo antioksidanto ir žinomo prooksidanto,jos metu kinta tirpalo absorbcijos spektras regimosios šviesos srityje. Dažniausiaitaikomas spektrofotometrinis absorbcijos pokyčio detekcijos būdas (Ivanova ir kt.,2005; Tawaha ir kt., 2007; Wojdylo ir kt., 2007). Jo pranašumas yra greita, paprasta irpatikima analizė. Spektrofotometriniu metodu įvertinamas suminis visų sudėtiniuosemišiniuose esančių aktyvių junginių antioksidantinis aktyvumas (Wojdylo ir kt., 2007)bei skirtingų antioksidantų sąveikos (įvairios priemaišos, skatinantys ar slopinantysefektai). Atskiro junginio išgryninimas iš augalinio ekstrakto ir jo individualus tyrimasyra brangus ir neefektyvus dėl didelio junginių skaičiaus, įvairovės ir kompleksiškumoaugalinėse žaliavose.Didelės skiriamosios gebos tiema tiksliai (on-line) metodais atliekama greitaantioksidantiniu aktyvumu pasižyminčių junginių atranka (Niederlander ir kt., 2008).Taikant šiuos metodus sujungiama efektyviosios skysčių chromatografijos (ESC)skirstymas ir pokolonėlinės reakcijos detekcija. ESC pokolonėliniais metodais įvertinamosatskirų junginių antioksidantinės savybės bei jų indėlis į bendrą kompleksiniųmišinių antioksidantinį aktyvumą (Tsao, Deng, 2004). Didžiausi šių tiesioginių metodųpranašumai yra atrankumas, trumpa analizės trukmė ir didelis jautrumas. ESC pokolonėliniaimetodai tuo pačiu metu leidžia nustatyti tikslų junginio kiekį augalinių žaliavųekstraktuose bei įvertinti jo antioksidantinį aktyvumą (Bandonienė, Murkovic, 2002).Nėra vieno universalaus metodo, kuriuo būtų galima įvertinti tiriamajamebandinyje esančių junginių antioksidantinį poveikį prieš visus in vivo aptinkamusprooksidantus, parodyti antioksidantų tarpusavio sąveikas ar jų elgesį kompleksinėseantioksidantinėse sistemose (Prior ir kt., 2005). Įvairiapusiškam biologiškai aktyviųjunginių antioksidantiniam poveikiui parodyti atliekami tyrimai dirbtinėse modelinėse16

sistemose in vitro skirtingais reakcijų mechanizmais su įvairiais prooksidantais ir jųtaikiniais. Taip sudaromas vadinamasis antioksidantinis vaizdas, pagal kurį prognozuojamastirtų junginių elgesys in vivo sistemose. Šio straipsnio tikslas – apžvelgtidažniausiai taikomus spektrofotometrinius ir ESC pokolonėlinius antiradikalinio irredukcinio aktyvumo nustatymo metodus augalinių antioksidantų tyrimams atlikti,atkreipiant dėmesį į pagrindinius metodų pranašumus ir trūkumus.Antioksidantinio poveikio mechanizmai. Antioksidantas – tai medžiaga, kuriefektyviai redukuoja prooksidantą, sudarydama netoksiškus arba mažai toksiškusjunginius. Taip išvengiama arba sumažinama biologinių taikinių oksidacinių pažeidimų.Tikslesnį antioksidanto apibrėžimą pasiūlė Halliwell ir kiti (1995). Jie teigia,kad antioksidantas – tai tokia medžiaga, kurios net maža koncentracija, palyginti suoksiduojama medžiaga, geba visiškai apsaugoti biologinius taikinius nuo oksidacijosarba reikšmingai sumažinti jos poveikį. Taigi pagal šį apibrėžimą ne visi reduktoriai,dalyvaujantys biocheminėse reakcijose, yra antioksidantai. Tik tie junginiai, kuriegeba apsaugoti biologinius taikinius, atitinka antioksidantui keliamus reikalavimus(Stanner ir kt., 2004).Antioksidantai žmogaus organizme sudaro sudėtingą daugiakomponentę gynybinęsistemą, kuri užtikrina ROS/RNS radikalų ir neradikalų sujungimą, modifikaciją,slopinimą arba ardymą. Antioksidantinę ląstelės apsaugą sudaro fermentiniai antioksidantai,pereinamuosius metalų jonus surišantys baltymai ir mažos molekulinėsmasės antioksidantai (Young, Woodside, 2001). Daugelis mažos molekulinės masėsantioksidantų (vitaminai E ir C, karotenoidai) žmogaus organizme nesintetinami. Jiegaunami su maistu. Augalinėse žaliavose gausu stiprių antioksidantų, kurie pastaruojumetu vis plačiau naudojami maisto ir kosmetikos pramonėje kaip natūralūs priedai(Bouaziz ir kt., 2005; Liu ir kt., 2004).Antioksidantų struktūros-aktyvumo ryšys biologinėse sistemose tampa daugsudėtingesnis, nes antioksidantinis aktyvumas labai priklauso nuo jų pačių fizikinių ircheminių savybių, tokių kaip lipofiliškumas, tirpumas, pasiskirstymas tarp lipofilinėsir hidrofilinės terpės. Antioksidantų aktyvumas ir efektyvumas priklauso ne vien tiknuo naudojamų modelinių sistemų ir biologinių taikinių, bet ir nuo taikomų priemoniųoksidacijai sukelti bei metodo oksidacijos mastui įvertinti (Frankel, Meyer, 2000).Augalinėse žaliavose aptinkamų biologiškai aktyvių junginių antioksidantinio poveikiostiprumas ir veikimo mechanizmai yra skirtingi.Antioksidantai ROS/RNS radikalus ir neradikalus inaktyvuoja dviem pagrindiniaismechanizmais: vandenilio atomo perdavimo (HAT, angl. hydrogen atom transfer)ir elektronų perdavimo (SET, angl. single electron transfer) reakcijomis. Galutinisrezultatas vienodas (neutralizuotas prooksidantas), tačiau skiriasi reakcijos kinetikair potencialios šalutinės reakcijos (Prior ir kt., 2005). HAT ir SET reakcijos dažnaivyksta vienu metu ir dominuojantis mechanizmas priklauso nuo antioksidanto struktūrosir jo savybių (tirpumo, pasiskirstymo koeficiento) bei terpės (tirpiklio tipo, pH).Jungties disociacijos energija ir jonizacijos potencialas yra du pagrindiniai veiksniai,kurie lemia antioksidantinio poveikio mechanizmą ir antioksidantų efektyvumą(Wright ir kt., 2001). Antioksidantų poveikis įvairiems prooksidantams skirtingas.Pavyzdžiui, karotenoidai, kitaip nei fenoliniai junginiai, mažai inaktyvuoja peroksiloradikalus (ROO•), tačiau išskirtinai suriša superoksidą ( 1 O 2). Nėra vieno universalaus17

metodo, kuriuo galima tiksliai įvertinti tiriamajame bandinyje esančių junginių suminįantioksidantinį poveikį prieš visus in vivo aptinkamus prooksidantus, parodyti antioksidantųtarpusavio sąveikas ar jų elgesį kompleksinėse antioksidantinėse sistemose(Prior ir kt., 2005). Suminis antioksidantinis aktyvumas yra sudėtinis rodiklis, kurisapima: 1) ROS/RNS generacijos slopinimą ir gebėjimą juos surišti; 2) redukcinę galią;3) gebėjimą sujungti pereinamuosius metalus; 4) antioksidantinių fermentų aktyvavimą;5) oksidacinių fermentų slopinimą. Įvairiapusiškam biologiškai aktyvių junginiųantioksidantiniam poveikiui ištirti atliekami tyrimai dirbtinėse modelinėse sistemosein vitro su įvairiais oksidantais ir jų taikiniais taikant skirtingus reakcijų mechanizmus(Miguel, 2010).Taikant HAT reakcijomis pagrįstus antioksidantinio aktyvumo nustatymo metodus,antioksidantas suriša laisvąjį radikalą atiduodamas vandenilio atomą ir sudarydamasstabilius junginius (AH + X • → XH + A • ). Potencialių antioksidantų santykinis reaktyvumastaikant šiuos metodus priklauso nuo vandenilio donorinių grupių jungtiesdisociacijos energijos (≈ −10 kcal/mol) ir jonizacijos potencialo (< −36 kcal/mol).HAT reakcijoms įtakos neturi tirpiklio rūšis ir terpės pH. Jos yra labai greitos, trunkanuo kelių sekundžių iki minutės. Taikant HAT metodus, dėl redukuojančių priemaišų(pavyzdžiui, metalų jonų) klaidingai gaunamas didesnis antioksidantinis aktyvumas(Prior ir kt., 2005).Plačiausiai taikomi šie HAT reakcijomis pagrįsti antioksidantinio aktyvumonustatymo metodai: indukuotos mažo tankio lipoproteinų oksidacijos inhibavimas(Kontush ir kt., 1997), deguonies radikalų absorbcijos galia (ORAC, angl. oxygenradical absorbance capacity) (Garrett ir kt., 2010), antioksidanto sugaudytų radikalųsuminis matas (TRAP, angl. total radical trapping antioxidant parameter) ir krocinoišblukinimo metodas (Huang ir kt., 2005). Šiais metodais vertinama konkuruojančiosreakcijos kinetika ir antioksidantinis aktyvumas apskaičiuojamas pagal kinetines kreives.VAP reakcijomis pagrįsti antioksidantinio aktyvumo nustatymo metodai susidedaiš sintetinio laisvuosius radikalus generuojančio reagento (2,2′-azobis-(2-amidinopropano)hidrochloridas (ABAP), 2,2′-azobis-(2,4-dimetilvaleronitrilas) (AMVN),2,2’-azino-bis-(3-etilbenztiazolin-6-sulfono rūgštis) (ABTS)) (Valkonen, Kuusi, 1997;Wolfe, Liu, 2007), standartinių oksiduojamų molekulių (fluorescuojančio substrato)(dichlorofluoresceinas (Adom, Liu, 2005), fluoresceinas (Moore ir kt., 2006), fluorescuojantisbaltymas (R-fikoeritrinas) (Prior ir kt., 2005)) ir antioksidanto, kuris sufluorescuojančiu substratu konkuruoja dėl laisvųjų radikalų. Fluorescuojančio substratooksidacija imituoja lipidų peroksidaciją in vivo. Taikant šį metodą dažnai standartiniųoksiduojamų molekulių koncentracija yra mažesnė nei antioksidanto koncentracija.Tai prieštarauja realiai situacijai in vivo. Biologinėse sistemose antioksidantų kiekisžymiai mažesnis nei substrato (pavyzdžiui, lipidų) koncentracija. Abejojama, ar tiriamojunginio antioksidantinis aktyvumas, nustatytas HAT metodais, atitinka realų aktyvumąbiologinėse sistemose (Huang ir kt., 2005).Antioksidantinio aktyvumo nustatymo metodais, pagrįstais SET reakcijoms, matuojamasantioksidanto gebėjimas atiduoti vieną elektroną ir redukuoti oksidantą, kurisyra stabilus laisvasis radikalas arba kintamo valentingumo metalo jonas (Miguel, 2010):X • + AH → X– + AH •+AH • + + H 2O ↔ A • + H 3 O +18

X– + H 3O + → XH + H 2OM(III) + AH → AH + + M(II)Taikant SET reakcijomis pagrįstus antioksidantinio aktyvumo nustatymo metodustiriamo junginio reaktyvumas priklauso nuo jo reaktyvių funkcinių grupių jonizacijospotencialo ir deprotonizacijos esant tam tikroms pH sąlygoms (Prior ir kt., 2005).Antioksidantinio poveikio mechanizmas, pagrįstas SET reakcijomis, dominuoja, kaitiriamo junginio jonizacijos potencialas yra didesnis nei 45 kcal/mol. Šios reakcijospriklauso nuo pH. Didėjanti terpės pH reikšmė mažina jonizacijos potencialą beididina deprotonizaciją. Todėl tiriamasis junginys lengviau atiduoda savo elektronus.Taikant SET reakcijomis pagrįstus metodus pH daro reikšmingą įtaką tiriamų junginiųredukcinei galiai. Rūgštinėmis sąlygomis antioksidanto redukcinė galia gali labai sumažėti,o bazinėmis sąlygomis – gerokai padidėti (Foti ir kt., 2004; Huang ir kt., 2005;Lemanska ir kt., 2001). SET reakcijos sąlyginai lėtos, reikalaujančios daug laiko, kolpasiekiama pusiausvyros būsena.SET reakcijomis pagrįsti metodai susideda iš dviejų komponentų: žinomo (standartinio)oksidanto ir tiriamo antioksidanto. Vyksta nekonkuruojanti reakcija, kuriosmetu antioksidantas atiduoda elektroną standartiniam oksidantui. Redukuojantisstandartiniam oksidantui, matyti absorbcijos spektro pokytis regimosios šviesos srityje(Ozgen ir kt., 2006). Reakcijos mišinio spalvos pokyčiai yra proporcingi antioksidantoredukcinei galiai. Galimas rezultatų kintamumas dėl fiksuoto laiko skirtumų, taip pat dėlįvairių priemaišų (ypač metalo jonų) įtakos (Prior ir kt., 2005). Ne visi antioksidantinįpoveikį turintys junginiai, taikant šiuos metodus, gali būti antioksidantai biologinėsesistemose (Prior, Cao, 1999).Dažniausiai naudojami SET reakcijomis pagrįsti antioksidantinio aktyvumonustatymo metodai yra DPPH radikalų surišimo metodas, ABTS radikalų-katijonųsurišimo metodas, geležies redukcijos antioksidantinė galia (FRAP, angl. ferric reducingantioxidant power) ir vario redukcijos antioksidantinė galia (CUPRAC, angl.cupric reducing antioxidant capacity) (Miguel, 2010).DPPH radikalų surišimo metodai. DPPH yra stabilus, ilgai gyvuojantis organinisazoto radikalas. Tai tamsiai violetinės spalvos kristalai, tirpstantys organiniuosetirpikliuose. DPPH radikalų prieš naudojimą nereikia aktyvinti, pakanka ištirpintireikiamą jų kiekį. Violetinės spalvos DPPH radikalai yra redukuojami antiradikaliniuaktyvumu pasižyminčių junginių į blankiai geltoną hidraziną. DPPH radikalų surišimogalia organinėje terpėje vertinama matuojant absorbcijos sumažėjimą esant fiksuotambangos ilgiui (515–528 nm intervale), kai absorbcija tampa stabili (Brand-Williamsir kt., 1995; Karadag ir kt., 2009), arba fiksuojant elektronų sukinio rezonansą (Callisteir kt., 2001).Anksčiau manyta, kad DPPH radikalų surišimo metu vyksta vandenilio atomųperdavimas. Tačiau Foti ir kt. (2004) nustatė, kad pirmiausia labai greitai perduodamielektronai, o po to vandenilio atomas atiduodamas lėtai ir tai priklauso nuo terpės vandeniliniųryšių stiprumo. DPPH radikalų surišimo aktyvumą stipriai veikia tirpiklis irreakcijos pH. Stasko ir kt. (2007) ištyrė vandeninės terpės kiekio įtaką DPPH radikalųsurišimo efektyvumui. Organinio tirpiklio ir vandens (0–50 proc. v/v) mišiniuosepasiektas vienodas vitamino E antiradikalinis aktyvumas, tačiau didėjant vandens kiekiuimišinyje greitėja reakcija tarp DPPH radikalo ir antioksidanto. Reakcijos terpėje19

esant didesniems vandens kiekiams (70–90 proc. v/v), antiradikalinis aktyvumas imamažėti, nes dalis DPPH radikalų koaguliuoja ir tampa neprieinami antioksidantams(Stasko ir kt., 2007).S p e k t r o f o t o m e t r i n i s m e t o d a s. DPPH radikalų surišimo rezultataipateikiami kaip efektyvi koncentracija (EC 50) – tai yra antioksidanto kiekis, reikalingas50 proc. pradinės DPPH koncentracijos surišti (Brand-Williams ir kt., 1995). Nekintamosabsorbcijos būsenai su EC 50pasiekti reikalingas laikas nustatomas iš kinetinės kreivėsir žymimas TEC 50. Vėliau Sanchez-Moreno ir kiti (1998) sujungė šiuos abu parametrusir pavadino antiradikaliniu efektyvumu, kuris apskaičiuojamas pagal formulę:AE = (1/ EC 50× T EC50). Kuo mažesnės EC 50ir T EC50reikšmės, tuo didesnis tiriamoantioksidanto antiradikalinis efektyvumas. Labai panašų parametrą, pavadintą radikalųsurišimo efektyvumu (RSE), pasiūlė De Beer ir kiti (2003). RSE apskaičiuojamas kaippradinio DPPH radikalų surišimo greičio (gauto per pirmą minutę) ir EC 50santykis.Pagrindinis EC 50trūkumas yra tas, kad radikalų surišimo procentas priklauso nuopradinės DPPH radikalų koncentracijos (Karadag ir kt., 2009). Nėra tiesinės priklausomybėstarp skirtingų DPPH radikalų koncentracijų ir antioksidanto kiekio. Dėlšios priežasties tiksliau būtų naudoti DPPH radikalų tirpalo absorbcijos pokytį arbasurištų radikalų kiekį nei procentinę DPPH radikalų surišimo išraišką. Absorbcijospokyčio reikšmės naudojamos standartinio antioksidanto (askorbo rūgštis, troloksas)kalibracinei kreivei sudaryti ir tiriamo junginio DPPH radikalų surišimo aktyvumasišreiškiamas kaip standartiniam antioksidantui ekvivalentiška koncentracija.Sferinis DPPH radikalo prieinamumas yra svarbus reakcijos veiksnys. Mažų antioksidantomolekulių, geriau prieinančių prie radikalo aktyvių centrų, antiradikalinisaktyvumas santykinai didesnis (Huang ir kt., 2005). Daugelis didelės molekulinėsmasės antioksidantų, kurie greitai inaktyvuoja ROO• radikalus, gali būti lėti arba visaiinertiški taikant šį metodą. DPPH radikalai netirpsta vandeninėje terpėje, todėl sunkiauįvertinti hidrofilinius antioksidantus. Taip pat kaip trūkumas įvardijamas DPPH ar įjį panašių radikalų nebuvimas biologinėse sistemose. Gana komplikuotas junginių,tokių kaip karotenoidai, antocianinai, antiradikalinio aktyvumo rezultatų vertinimas,nes sutampa šių junginių ir DPPH radikalų absorbcijos spektrai (Prior ir kt., 2005).Šiuo atveju labai tiktų elektrocheminė DPPH radikalų surišimo detekcija, pasiūlytaMilardovic ir kitų (2005, 2006), kuri leidžia analizuoti spalvotus ar drumstus bandiniussu mažu antioksidantų kiekiu.Nepaisant minėtų trūkumų, DPPH radikalų surišimo metodas yra techniškai paprastasir greitas, taikomas naudojant spektrofotometrą. Jis tinkamas uogų, daržovių,vaisių ir jų sulčių ar ekstraktų antiradikalinio aktyvumo tyrimams atlikti (Szajdekir kt., 2009).E S C p o k o l o n ė l i n i s m e t o d a s. Pirmieji ESC-DPPH pokolonėlinį metodąišvystė Koleva ir kt. (2000) laisvuosius radikalus surišančių junginių atrankai kompleksiniuosemišiniuose, panaudojant metanolinį DPPH tirpalą. ESC išskirstytos analitėsreaktoriuje reaguoja su DPPH radikalais, kurių redukcija yra fiksuojama absorbciniudetektoriumi ir užrašomos neigiamos smailės esant 517 nm bangos ilgiui. Reakcijoskilpa buvo padaryta iš 15 m ilgio 0,25 mm vidinio skersmens polietereterketono (PEEK,angl. polyetheretherketone) vamzdelio. DPPH tirpalas į reaktorių tiektas pertraukiamoveikimo švirkštiniu siurbliu. Autoriai optimizavo tokius parametrus, kaip DPPH tirpalo20

koncentracija, reakcijos laikas, organinio tirpiklio ir terpės pH įtaka pokolonėlineireakcijai. Koleva ir kt. (2000) nustatė, kad geriausios tiriamo junginio aptikimo ribospasiekiamos naudojant 10 -5 M koncentracijos DPPH metanolinį tirpalą ir reakcijaivykstant 30 sekundžių. Rūgštinė reakcijos terpė ir didelis organinio tirpiklio kiekismažino metodo jautrumą. Autorių nuomone, ESC-DPPH pokolonėlinis metodas yrapaprastas, pigus ir universalus antiradikalinio aktyvumo nustatymo kompleksiniuosemišiniuose metodas.Vėliau Dapkevičius ir kt. (2001) pagerino (apie 30 kartų) ESC-DPPH pokolonėliniometodo jautrumą. Mokslininkas degazavo DPPH tirpalą helio dujomis, optimizavoDPPH koncentraciją ir tiekimo greitį į pokolonėlę bei į sistemą papildomai įmontavoreagento tėkmės pulsacijos slopintuvą. Patobulintas metodas buvo pritaikytas laisvuosiusradikalus surišantiems junginiams nustatyti čiobrelių lapuose (Dapkevičiusir kt., 2002).Kosar ir kt. (2004) DPPH tirpalui tiekti į reaktorių vietoj pertraukiamo veikimošvirkštinio siurblio panaudojo nuolatinio veikimo ESC siurblį. Bandonienė ir Murkovic(2002) pritaikė 2,15 m ilgio 0,6 mm vidinio skersmens reakcijos kilpą. Sprendžiant išautorių straipsnyje pateiktų obuolių DPPH chromatogramų galima teigti, kad didesniovidinio skersmens reakcijos kilpa šiek tiek išplečia neigiamas smailes. Bandonienėir kt. (2005) kiekybiškai įvertino Salvia genties rūšyse ir Borago officinalis augalinėježaliavoje esančios rozmarino rūgšties antiradikalinį aktyvumą išorinės kalibracijosmetodu. Autoriai nustatė stiprią korealiaciją (R 2 = 0,98) tarp rozmarino rūgšties kiekioir augalinės žaliavos antiradikalinio aktyvumo.ESC-DPPH pokolonėlinio metodo universalumą puikiai iliustruoja Nuengchamnongir kitų (2005), Pukalsko ir kitų (2005), Exarchou ir kitų (2006) moksliniai darbai.Nuengchamnong ir kiti (2005) sujungė ESC-DPPH pokolonėlinį metodą su masiųspektrometrija (MS). Šią sistemą mokslininkai pritaikė vaistinio augalo Butea superbaekstrakte esančių antioksidantų greitam identifikavimui. Po gradientinio skirstymo0,8 ml/min. eliuentų tėkmė buvo padalyta į dvi dalis. Viena dalis (0,16 ml/min.)nukreipta į reaktorių DPPH radikalų surišimo gebai įvertinti, kita (0,64 ml/min.) – įmasių detektorių antioksidanto struktūrai nustatyti. DPPH tirpalo tėkmės greitis buvo0,1 ml/min., reaktoriui panaudota 100 μl 0,33 mm vidinio skersmens politetrafluoretileno(TFE, angl. teflon) reakcijos kilpa. Nors autoriai teigia, kad sistema lemia minimalųsmailės išsiplėtimą, tačiau pateiktose MS ir DPPH chromatogramose matyti šiek tiekprasiplėtusios analičių smailės. Šis trūkumas tikriausiai susijęs su santykinai dideliureakcijos kilpos vidiniu skersmeniu esant mažam tėkmės greičiui.Pukalskas ir kt. (2005) išvystė sudėtingą ESC-RSD-DMD-KFE-BMR sistemąantioksidantams tiesiogiai identifikuoti kompleksiniuose mišiniuose. Eliuentas suatskirtomis analitėmis po diodų matricos detektoriaus (DMD) dalijamas į dvi skirtingastėkmes, kurių viena patenka į radikalų surišimo detekcijos (RSD) sistemą, kita – įkietafazės ekstrakcijos (KFE) ir branduolių magnetinio rezonanso (BMR) detekcijossistemą. RSD sistemoje eliuentas sumaišomas su santykinai koncentruotu 0,1 mMmetanoliniu DPPH ir amonio acetato buferio tirpalu. Metodas buvo pritaikytas komerciniamerozmarinų ekstrakte esančių laisvuosius radikalus surišančių junginių tyrimamsatlikti. Autoriai kaip pagrindinę problemą įvardija menką BMR detektoriaus jautrumą.Exarchou ir kt. (2006) patobulino ESC-RSD-DMD-KFE-BMR sistemą21

įmontuodami dviejų kelių vožtuvą. Eliuentas su atskirtomis analitėmis po diodųmatricos detektoriaus nedalijamas ir vožtuvo nukreipiamas į radikalų surišimo detekcijossistemą. Pokolonėlėje junginiai reaguoja su DPPH radikalais arba su ABTSradikalais-katijonais ir fiksuojami kaip neigiamos smailės absorbciniu detektoriumiesant atitinkamai 512 ir 734 nm bangos ilgiui. Kitų trijų injekcijų metu eliuentą suatskirtomis analitėmis vožtuvas nukreipia į KFE-BMR sistemą, kur kietafazės ekstrakcijosmodulyje koncentruojami antiradikaliniu aktyvumu pasižymintys junginiai irbranduolių magnetinio rezonanso spektroskopu nustatoma jų struktūra. Šis sprendimaspašalina metodo trūkumą dėl sąlyginai mažo BMR detektoriaus jautrumo. Taip patpatobulintas ESC-RSD-DMD-KFE-BMR metodas leidžia tirti tik tuos junginius, kurieturi antiradikalinių savybių. Sujungus gautus duomenis su ESC-MS tyrimų duomenimisgalima identifikuoti visus antioksidantus (flavonoidus ir fenolines rūgštis) be papildomųatskyrimo ir koncentravimo procesų preparatyvinės chromatografijos metodu.Bartašiūtė ir kt. (2007) nuodugniai ištyrė reakcijos tarp DPPH radikalo ir antioksidantomechanizmus bei patobulino laisvuosius radikalus surišančių junginių elgsenosprognozavimą in vivo terpėje pagal ESC-DPPH pokolonėliniu metodu gautus rezultatus.Autoriai pagrindė hipotezę, kad stabilių DPPH radikalų surišimas metanolio-vandensterpėje, esant fiziologiniam pH 7,4, rodo antioksidantų oksidacijos-redukcijos cikliniųreakcijų charakteristikas in vivo.ABTS radikalų-katijonų surišimo metodai. ABTS radikalas-katijonas(ABTS •+ ) yra stabilus, ilgai gyvuojantis spalvotas radikalas, kuris regimosios šviesosspektre turi kelis absorbcijos maksimumus esant 415, 650, 734 ir 815 nm bangosilgiams.S p e k t r o f o t o m e t r i n i s m e t o d a s. Pirmasis šį metodą aprašė Miller ir kt.(1993) ir pavadino TEAC metodu. Originalus TEAC metodas pagrįstas metmioglobinoaktyvacija. Jis veikia kaip peroksidazė, sujungdamas H 2O 2, ir sudaro ferilmioglobinoradikalus. Pastarieji reaguoja su ABTS ir generuojami ABTS •+ . Originaluu TEACmetode tiriamas bandinys įdedamas prieš ABTS •+ generaciją. Antiradikalinių savybiųturintys junginiai suriša susidariusius ABTS radikalus-katijonus. Išmatavus reakcijosmišinio absorbciją, nustatomas nesurištų ABTS •+ kiekis ir įvertinamas tiriamo bandinioantiradikalinis aktyvumas. Ši reagentų ir bandinio įdėjimo tvarka buvo sukritikuota,nes kai kurie antioksidantai, pavyzdžiui, kvercetinas, gali sujungti H 2O 2ir reaguoti suoksidantų derivatais. Klaidingai sumažinama ABTS •+ generacija, o tai lemia didesnįtiriamo bandinio antiradikalinį aktyvumą, nei yra iš tikrųjų (Strube ir kt., 1997). Reir kt. (1999) pasiūlė patobulintą ABTS radikalų-katijonų surišimo metodą. Šiuo atvejutiriamasis bandinys įdedamas sugeneravus tam tikrą kiekį ABTS •+ . Po tam tikrą nustatytąlaiką trunkančios tiesioginės reakcijos su antioksidantu išmatuojama tirpaloabsorbcija, kuri proporcinga likusiai ABTS •+ koncentracijai. ABTS radikalų-katijonųsurišimo aktyvumas išreiškiamas standartinio antioksidanto trolokso ekvivalentu(TEAC) (Miguel, 2010). Tai trolokso tirpalo koncentracija (mM), turinti ekvivalentiškąantiradikalinį aktyvumą, kaip ir 1 mM tiriamas bandinys. Kim ir kt. (2002) ABTS •+surišimui įvertinti vietoj trolokso pasiūlė žinomesnį antioksidantą – askorbo rūgštį.Rezultatai pateikiami kaip askorbo rūgšties masė (mg) 100 g ar 100 ml tiriamo bandinioir žymima VCEAC – vitaminui C ekvivalentiška antioksidantinė galia.ABTS radikalai-katijonai gali būti generuojami: 1) cheminiais reagentais,22

tokiais kaip magnio dioksidas (Miller ir kt., 1996), 2,2‘-azobis-(2-amidinopropano)hidrochloridas (ABAP) (van den Berg ir kt., 1999), kalio persulfatas (Re ir kt., 1999);2) fermentinių reakcijų metu, naudojant metmioglobiną (Miller ir kt., 1993), krienųperoksidazę (Cano ir kt., 1998); 3) elektrochemine reakcija (Alonso ir kt., 2002).Cheminėmis reakcijomis paremtai ABTS •+ generacijai reikalingas ilgas laiko tarpas(daugiau nei 16 valandų su kalio persulfatu) arba aukšta temperatūra (60 °C su ABAPreagentu). Fermentinės reakcijos yra daug greitesnės ir nereikalauja agresyvių sąlygų(Prior ir kt., 2005).ABTS radikalų-katijonų surišimo spektrofotometrinis metodas yra techniškaipaprastas ir gali būti taikomas antioksidantų atrankai bei rutininiams tyrimams atlikti.Šiuo metodu nustatomas pradinių junginių ir reakcijos produktų antiradikalinis aktyvumas(Miguel, 2010). Santykinai didelės kai kurių antiradikališkai aktyvių junginių,pavyzdžiui, chryzino, TEAC reikšmės siejamos su susidariusiais reakcijos produktais,kurie taip pat suriša ABTS •+ . ABTS radikalų-katijonų surišimas gali būti nustatomasplačiu pH intervalu. Ši savybė leidžia tyrinėti pH įtaką junginių antiradikaliniamaktyvumui (Lemanska ir kt., 2001). Ozgen ir kt. (2006) nustatė, kad antiradikalinisaktyvumas, esant terpės pH 7,4, yra 5–20 proc. didesnis nei esant pH 4,5. Taikant ABTSradikalų-katijonų surišimo spektrofotometrinį metodą dažniausiai naudojama pH 7,4,tačiau esant tokiai pH reikšmei ABTS •+ stabilumas ilgesnį laiką tampa problematiškas(Karadag ir kt., 2009). Standartiniai antioksidantai (troloksas ir askorbo rūgštis), esantpH 7,4, pusiausvyrinę reakcijos būseną su ABTS radikalais-katijonais pasiekia per10 minučių. Fenoliniams junginiams pasiekti pusiausvyros tašką reikalingas ilgesnisnei 10 min. reakcijos laikas. Esant fiksuotam trumpam (pavyzdžiui, 10 min.) reakcijoslaikui, gali būti gaunamos klaidingos TEAC reikšmės (Huang ir kt., 2005). ABTS •+yra tirpūs vandenyje ir organiniuose tirpikliuose, tai leidžia nustatyti hidrofilinių irlipofilinių junginių antiradikalinį aktyvumą. Šis metodas taip pat turi keletą trūkumų.ABTS radikalai-katijonai nereprezentuoja biomolekulių, jų neaptinkama biologinėsesistemose. Taip pat bet koks junginys, kurio redokso potencialas mažesnis nei ABTS •+(0,68 V), gali reaguoti su šiuo radikalu-katijonu. ABTS radikalų-katijonų surišimometodo trūkumai nėra esminiai ir netrukdo plačiai jį taikyti augalinių žaliavų ekstraktų(Surveswaran ir kt., 2007), maisto ir gėrimų (Pellegrini ir kt., 2003; Pulido ir kt., 2003;Saura-Calixto, Goni, 2006) bandiniuose esančių lipofilinių ir hidrofilinių junginiųantiradikaliniam aktyvumui tirti.E S C p o k o l o n ė l i n i s m e t o d a s. Pirmą kartą ESC-ABTS pokolonėlinįmetodą publikavo Koleva ir kiti (2001). ABTS radikalai-katijonai yra tirpūs vandenyjeir organiniuose tirpikliuose, todėl plačiai taikomi hidrofiliniams ir lipofiliniamsantiradikaliniams junginiams tirti. ABTS •+ aktyvuoti kalio persulfatu fosfatinių buferiniųdruskų tirpale (pH 7,4), turinčiame 10 proc. metanolio. Autorių teigimu, ESC-ABTS pokolonėlinis metodas tinkamas izokratinei ir gradientinei eliucijai 100 proc.organiniu tirpikliu ar jo įvairių proporcijų mišiniais su vandeniu. Eliuentai gali būtisilpnai parūgštinti ar buferizuoti (pH 3–7,4). 5,5 μM koncentracijos ABTS •+ tirpalasį pokolonėlę tiekiamas švirkštiniu siurbliu 0,5 ml/min. tėkmės greičiu. Reaktoriuspagamintas iš 13,7 m ilgio 0,25 mm vidinio skersmens PEEK vamzdelio, kuriamereakcijos mišinys išlaikomas 30 sek. ir užtikrinamas minimalus smailės išsiplėtimas.Metodas pritaikytas Sideritis syriaca ir Rosmarinus officinalis augalinei žaliavai bei23

standartiniams antioksidantams tirti. Autoriai išvadose teigia, kad ESC-ABTS pokolonėlinismetodas yra selektyvus, santykinai paprastas, nebrangus ir kur kas jautresnisnei ESC-DPPH metodas.Miliauskas ir kt. (2004) pritaikė ESC-ABTS pokolonėlinį metodą Potentillafruticosa ekstrakto antiradikaliniam aktyvumui tirti. Vėliau ta pati mokslininkų grupėpanaudojo sudėtingą ESC-DMD-KFE-BMR sistemą kartu su ESC-ABTS laisvuosiusradikalus surišantiems junginiams tiesiogiai identifikuoti Rhaponticum carthamoidesekstraktuose.Atskiros mokslininkų grupės nežymiai modifikuodavo ESC-ABTS pokolonėlinįmetodą ir pritaikydavo įvairių augalinių žaliavų antiradikalinio aktyvumo tyrimamsatlikti (Beekwilder ir kt., 2005; Cano ir kt., 2002; Stalmach ir kt., 2006; Stewart ir kt.,2005). Dažniausiai optimizuodavo ABTS •+ tirpalo koncentraciją, reakcijos terpės pH,reakcijos laiką ir reakcijos kilpos parametrus, siekdami padidinti metodo jautrumą.Stewart ir kt. (2005) ESC-ABTS pokolonėliniu metodu ištyrė juodosios ir žaliosiosarbatos bandinius. Gautus duomenis susiejo su ESC-MS sistemoje gautais rezultatais.Pagal sulaikymo laikus ir masių spektrus identifikavo naujus antiradikaliniu aktyvumupasižyminčius junginius – chino rūgšties darinius su kafeoil ir feruloil pakaitais. Li ir kt.(2007) tiesiogiai sujungė ESC-ABTS pokolonėlinį metodą su masių spektrometrija.Eliuentas po diodų matricos detektoriaus dalijamas į dvi skirtingas tėkmes, kurių vienapatenka į pokolonėlinę ABTS sistemą, kita – į masių spektrometrą.FRAP metodu įvertinamas antioksidantų gebėjimas rūgštinėje terpėje redukuotigeležies 2,4,6-tripyridyl-s-triazino [Fe(III)-(TPTZ) 2] 3+ kompleksą į intensyviai mėlynosspalvos [Fe(II)-(TPTZ) 2] 2+ kompleksą (Benzie, Strain, 1996, 1999).S p e k t r o f o t o m e t r i n i s m e t o d a s. Su elektronų perdavimo reakcijomissusijęs tirpalo absorbcijos padidėjimas išmatuojamas esant 593 nm bangos ilgiui.Gautos reikšmės palyginamos su etaloniniu dvivalentės geležies jonų tirpalu arbastandartinių antioksidantų (troloksas, askorbo rūgštis) tirpalais ir apskaičiuojamosFRAP arba TEAC, VCEAC reikšmės. FRAP metodas mažai skiriasi nuo ABTS radikalo-katijonosurišimo metodo, išskyrus tai, kad reakcija tarp antioksidanto ir ABTS •+dažniausiai vyksta neutralioje (pH 7,4) terpėje, o FRAP metodui būtinos rūgštinės(pH 3,6) sąlygos, kad nesusidarytų [Fe(III)-(TPTZ) 2] 3+ komplekso nuosėdos (Huangir kt., 2005; Karadag ir kt., 2009). Trivalentės geležies (Fe(III)) druskos redokso potencialas(0,70 V) panašus į ABTS •+ redokso potencialą (0,68 V) (Huang ir kt., 2005).Dvivalentė geležis (Fe(II)) yra gerai žinomas prooksidantas. Ji gali reaguoti suH 2O 2ir produkuoti OH • – žalingiausius laisvuosius radikalus in vivo. FRAP metodutiriamų junginių gebėjimas redukuoti Fe(III) į Fe(II) prilyginamas antioksidantiniamaktyvumui. Žinomi antioksidantai, tokie kaip askorbo rūgštis ar šlapimo rūgštis, galiredukuoti ir ROS/RNS, ir Fe(III), todėl jų gebėjimas redukuoti Fe(III) didina reaktyviųdeguonies ir azoto rūšių neutralizavimo tikimybę. Tačiau ne visi junginiai, galintysatiduoti elektronus trivalentės geležies jonams, yra antioksidantai (Prior ir kt., 2005).Šis FRAP metodo trūkumas susijęs su redokso potencialu. Junginys (net neturintisantioksidantinių savybių), turintis mažesnį redokso potencialą nei 0,70 V, teoriškai galiredukuoti Fe(III) jonus ir nulemti klaidingai didesnius FRAP rezultatus (Nilsson ir kt.,2005). Be to, antioksidantai, kurie efektyviai neutralizuoja prooksidantus, gali visaineredukuoti Fe(III). Pavyzdžiui, vienas svarbiausių antioksidantų in vivo – glutationas,24

taikant FRAP metodą, neturi antioksidantinių savybių (Prior, Cao, 1999). Taip pat antioksidantai,kurių veikimas paremtas vandenilio atomo perdavimo reakcijomis (tioliai,karotenoidai), FRAP metodu negali būti nustatinėjami (Ou ir kt., 2002; Pulido ir kt.,2000). Šiam metodui būtina rūgštinė (pH 3,6) terpė gali turėti įtakos baltymų (pavyzdžiui,kazeino piene) nusėdimui (Chen ir kt., 2003). Pulido ir kt. (2000) pastebėjo,kad taikant FRAP metodą fenolinių junginių antioksidantinis aktyvumas priklauso nuoreakcijos laiko. Kavos rūgštis, ferulo rūgštis, kvercetinas ir elago rūgštis po 4 min.nepasiekė reakcijos pusiausvyros būsenos. Net ir po keletos valandų absorbcija lėtaididėja (Pulido ir kt., 2000). Tai apsunkina galimybę taikyti fiksuotą reakcijos laiką.Nepaisant rūgštinės (pH 3,6) terpės (fiziologinėmis sąlygomis pH 7,4) ir kitųaprašytų trūkumų, FRAP metodas plačiai taikomas maisto ir augalų ekstraktuose,plazmoje ir kituose biologiniuose skysčiuose esančių junginių redukcinei galiai įvertinti(Haldar ir kt., 2007; Pulido ir kt., 2003; Surveswaran ir kt., 2007). FRAP metodas yrapaprastas, palyginti nebrangus, nereikia specialios aparatūros.E S C p o k o l o n ė l i n i s m e t o d a s. ESC pokolonėlinei reakcijai atlikti FRAPreagentą pirmą kartą panaudojo Raudonis ir kiti (2012). ESC-FRAP pokolonėliniumetodu įvertinamos atskirtų individualių junginių redukcinės savybės pagal geležiesjono redukcijos galią. Pratekančio eliuento ir FRAP reagento mišinio absorbcija, esant593 nm bangos ilgiui, padidėja įvykus reakcijai su redukcinių savybių turinčiomisanalitėmis (Gungor ir kt., 2011; Halvorsen, Blomhoff, 2011). Pokolonėlinėje chromatogramojeabsorbcijos pokyčiai fiksuojami kaip teigiamos smailės. Pagal gautos smailėsplotą kiekybiškai (trolokso ekvivalentais) įvertinamas junginio redukcinis aktyvumas.FRAP reagentas ruoštas pagal Benzie ir Strain (1996, 1999) aprašytas spektrofotometriniotyrimo metodikas. Darbinis FRAP tirpalas į pokolonėlinę sistemą tiektasnuolatinio veikimo ESC siurbliu. Pokolonėliniam reaktoriui panaudota reakcijos kilpa,pagaminta iš 15 m ilgio 0,3 mm vidinio skersmens TFE vamzdelio. Autoriai optimizavodarbinio FRAP tirpalo koncentraciją ir reakcijos laiką. Raudonis ir kt. (2012) nustatė,kad optimalios sąlygos pokolonėlinei reakcijai vykti yra tada, kai FRAP reagentokomponentų koncentracija reaktoriuje siekia 123 μM TPTZ ir 246 μM FeCl 3•6H 2O,o reakcijos trukmė – apie 40 sekundžių. Taip pat autoriai pažymi, kad į pokolonėlinęsistemą tiekiamas darbinis FRAP reagentas yra nespalvotas. Spalva atsiranda tik poreakcijos su redukcinių savybių turinčiu junginiu. Dėl šios priežasties FRAP reagentokoncentracijos ir tėkmės greičio įtaka bazinės linijos triukšmui pokolonėlinėje chromatogramojeyra labai neryški. Tai suteikia metodui pranašumo prieš ESC-DPPH irESC-ABTS pokolonėlinius metodus.ESC-FRAP pokolonėlinis metodas buvo sėkmingai pritaikytas žemuogių lapų irvaisių augalinės žaliavos etanolinių ekstraktų redukciniam aktyvumui tirti (Raudonisir kt., 2012). ESC-FRAP yra patikimas pokolonėlinis metodas įvairių junginių antioksidantiniamaktyvumui įvertinti, nes tiriamo junginio antioksidantinė galia yra tiesiogiaisiejama su jo redukcine galia (Firuzi ir kt., 2005). Šis metodas tinkamas augaliniuoseekstraktuose esančių junginių redukcinėms savybėms nustatyti ir kiekybiniam redukcinioaktyvumo įvertinimui atlikti.CUPRAC metodas pagrįstas dvivalenčio vario ir neokuproino (2,9-dimetil-1,10-fenan-trolino) (Cu(II)-Nc) komplekso redukcija antioksidantu į chromogeninįCu(I)-Nc kompleksą.25

S p e k t r o f o t o m e t r i n i s m e t o d a s. CUPRAC reagentą sudaro vienodomisdalimis sumaišyti CuCl 2, neokuproino ir buferio amonio acetato (pH 7,0) tirpalai.Neokuproino tirpumas vandenyje labai mažas, todėl jis tirpinamas organiniuose tirpikliuose(dažniausiai naudojamas 95 proc. etanolis) ir praskiedžiamas kitais tirpikliais.CUPRAC reagento tirpalo absorbcijos pokytis įvykus reakcijai su antioksidantu išmatuojamasesant 450 nm bangos ilgiui (Apak ir kt., 2004). Tiriamo junginio antioksidantinisaktyvumas apskaičiuojamas pagal standartinių antioksidantų (trolokso, šlapimorūgšties) kalibracines kreives ir išreiškiamas atitinkamais ekvivalentais (Apak ir kt.,2007; Prior ir kt., 2005). β-karotenas vandens-etanolio terpėje su CUPRAC reagentunereaguoja, jam reikalingas riboto maišymosi dichloretanas (Apak ir kt., 2004). Lėtoskinetikos antioksidantų reakcijai su CUPRAC reagentu pagreitinti taikoma inkubacija50 °C temperatūroje (Apak ir kt., 2007).Fenolinių junginių antioksidantinis aktyvumas, nustatytas CUPRAC metodu,yra panašus į ABTS radikalo-katijono surišimo metodu gautas reikšmes, o FRAPmetodu įvertintas redukcinis aktyvumas yra šiek tiek mažesnis. CUPRAC metodas yraselektyvesnis, nes Cu(II) redokso potencialas (apie 0,60 V) yra mažesnis nei ABTS •+ar Fe(III). Cukrūs ir citrinos rūgštis, kurie nėra tikri antioksidantai, neoksiduojamiCUPRAC reagentu (Apak ir kt., 2007). Vienodomis sąlygomis vertinant junginiųredukcinį poveikį prooksidantams, mažesnį redokso potencialą turintys standartiniaioksidantai yra jautresni (Prior ir kt., 2005). CUPRAC metodu nustatomas tiolo grupęturinčių antioksidantų (pavyzdžiui, glutationo) redukcinis aktyvumas, to negalima pasakytiapie FRAP metodą. CUPRAC reagentas yra stabilesnis ir lengviau pagaminamasnei chromogeniniai radikalų reagentai (pavyzdžiui: ABTS, DPPH). Jo neveikia tokiefaktoriai, kaip oras, saulės spinduliai, tirpiklio tipas ir pH. Cu(II) redukcinės galiosnustatymas biologiniuose bandiniuose gali ne tiesiogiai, bet efektyviau nei taikant kituslaisvuosius radikalus naudojančius metodus įvertinti antioksidantinį aktyvumą (Apakir kt., 2007). Tyrimai CUPRAC metodu atliekami neutraliomis sąlygomis (pH 7,0)(Apak ir kt., 2008; Gorinstein ir kt. 2006), kurios artimos fiziologinėms, o FRAP metoduireikalingos rūgštinės sąlygos (pH 3,6). Šiuo metodu galima įvertinti lipofiliniųir hidrofilinių antioksidantų aktyvumą. Reakcijos tirpalo absorbcijos priklausomybėnuo tiriamo junginio koncentracijos yra tiesinė plačiame intervale (Apak ir kt., 2007).Elektronų perdavimo reakcija tarp CUPRAC reagento ir tokių žinomų antioksidantų,kaip askorbo rūgštis, šlapimo rūgštis, galo rūgštis ir kvercetinas, įvyksta per minutę,tačiau kompleksinių mišinių tyrimams atlikti reikia 30–60 min., kol pasiekiama pusiausvyra(Ozyurek ir kt., 2011). Tai pagrindinis šio metodo trūkumas, nes priklausomainuo reakcijos laiko kinta tiriamo bandinio redukcinis aktyvumas (Prior ir kt., 2005).CUPRAC spektrofotometrinis metodas yra paprastas, nebrangus ir sudėtingosaparatūros nereikalaujantis redukcinės galios nustatymo metodas. Juo galima įvertintimaistinių fenolinių junginių (natūralių ir sintetinių, lipofilinių ir hidrofilinių), vitaminųC ir E, kraujo serumo redukcinį aktyvumą (Apak ir kt., 2004, 2007, 2008). CUPRACmetodo pranašumai išskiria jį iš kitų elektronų perdavimo reakcija pagrįstų antioksidantinioaktyvumo nustatymo metodų.E S C p o k o l o n ė l i n i s m e t o d a s. ESC-CUPRAC pokolonėlinį metodąpirmieji išvystė Celik ir kiti (2010). Šioje sistemoje ESC metodu išskirstytos analitėsreakcijos kilpoje sumaišomos su CUPRAC reagentu, kuris po reakcijos su antioksidantu26

yra redukuojamas iki geltonos spalvos Cu(I)-Nc komplekso. Tuo metu detektoriumi,esant 450 nm bangos ilgiui, fiksuojamas absorbcijos padidėjimas ir chromatogramojeužrašomas individualaus junginio antioksidantinis poveikis. Nors CUPRAC metodasparemtas spalvos susidarymu po reakcijos su antioksidantu, tačiau Celik ir kt. (2010)pateikia pokolonėlines chromatogramas, kuriose antioksidantai fiksuojami kaip neigiamossmailės. Autoriai pažymi ESC-CUPRAC pokolonėlinio metodo pranašumąprieš ESC-DPPH ir ESC-ABTS pokolonėlionius metodus. Literatūroje aprašyti ESC-DPPH ir ESC-ABTS pokolonėliniai metodai paremti spalvos blukinimu antioksidantuisurišant laisvuosius radikalus, todėl labai svarbu tinkamai parinkti optimalią radikalųkoncentraciją, kad koncentruoti antioksidantų tirpalai nepasiektų detekcijos ribos. Tainėra problema taikant ESC-CUPRAC pokolonėlinį metodą, nes čia susidaro spalva(priešingas procesas spalvos blukinimui) ir absorbcija didėja tiesine priklausomybeplačiame darbiniame intervale.Celik ir kt. (2010) pateikta ESC-CUPRAC pokolonėlinė sistema sudaryta iš firminės5 m ilgio 0,5 mm vidinio skersmens TFE reakcijos kilpos RXN-1000 (Waters),kurios tūris – apie 1 ml. Po chromatografinio skirstymo eliuatas sumaišomas suCUPRAC tirpalu (Cu(II) : Nc : NH 4Ac santykiu 1 : 1 : 1, v/v/v), šis į pokolonėlinįreaktorių tiekiamas ESC siurbliu. Autoriai optimizavo CUPRAC tirpalo tėkmės greitį,kuris tiesiogiai susijęs su Cu(II), Nc ir NH4Ac koncentracija pokolonėlėje. Įvertinęsmailės aukščio ir bazinės linijos (S/N) santykį, mokslininkai nustatė, kad optimalusCUPRAC tirpalo tėkmės greitis yra 0,5 ml/min. Šiomis sąlygomis pasiektos gana gerosantioksidantų detekcijos ribos (intervalas nuo 0,17 iki 3,46μM). Celik ir kt. (2010)išvystytas ESC-CUPRAC pokolonėlinis metodas buvo sėkmingai pritaikytas Camelliasinensis, Origanum marjorana ir Mentha ekstraktuose esantiems antioksidantiškaiaktyviems junginiams identifikuoti. Autoriai teigia, kad ESC-CUPRAC pokolonėlinismetodas yra greitas, nebrangus, universalus ir nesudėtingas metodas antioksidantųkokybinei sudėčiai bei kiekiui augaliniuose ekstraktuose tiesiogiai nustatyti (Celikir kt., 2010; Ozyurek ir kt., 2011).Apibendrinimas. Populiariausi antiradikalinio aktyvumo nustatymo metodaiyra DPPH radikalų ir ABTS radikalų-katijonų surišimo įvertinimas, o redukcinioaktyvumo – FRAP ir CUPRAC metodai, kuriais išmatuojama geležies ir vario jonųredukcijos antioksidantinė galia. Visi šie metodai priskiriami elektronų perdavimo(SET) reakcija pagrįstiems antioksidantinio aktyvumo nustatymo metodams. Dažniausiainaudojama spektrofotometrinė regimosios šviesos absorbcijos pokyčio detekcija.Tai paprastas, patikimas ir tinkamas metodas grynų junginių antioksidantinėmssavybėms įvertinti bei struktūros-aktyvumo ryšiui nustatyti. Sudėtiniuosemišiniuose, tokiuose kaip augalinės žaliavos ekstraktai ir maisto bandiniai, spektrofotometriniumetodu nustatomas visų bandinyje esančių junginių suminis antioksidantinisaktyvumas ir negalima nustatyti atskirų komponentų įnašo į bendrąantioksidantų poveikį.ESC pokolonėliniais metodais įvertinama atskirų junginių antioksidantinėssavybės ir jų indėlis į bendrą kompleksinių mišinių antioksidantinį aktyvumą. Šiaismetodais patikimai, tiksliai bei atkartojamai įvertinama augalinių žaliavų ekstraktųkokybė, nustatant biologiškai aktyvių junginių antioksidantinio aktyvumo kokybinius irkiekybinius rodiklius. Jie leidžia kontroliuoti antioksidantų pasiskirstymą ir stabilumą,27

nustatyti optimalias žaliavos ar produkto saugojimo sąlygas. ESC pokolonėliniaimetodai yra veiksminga priemonė augalų atrankai atlikti atsižvelgiant į skirtingasrūšis, varietetus, fenologinį tarpsnį ir auginimo sąlygas, kad būtų užtikrinta gausiantioksidantų sudėtis.Modernių kompleksinių ESC pokolonėlinių sistemų taikymas antioksidantinioaktyvumo tyrimams atlikti yra perspektyvi ir efektyvi priemonė greitai identifikuotiantioksidantus, kurie būtų naudojami kaip žymenys augalinių žaliavų ir jų produktųkokybės kontrolei atlikti. Šios sistemos leidžia nustatyti kompleksines „pirštų atspaudų“chromatogramas, nurodančias ne tik augalinės žaliavos ar jos produkto fitocheminį profilį,bet ir junginių, kuriems būdingas antioksidantinis aktyvumas, „pirštų atspaudus“.Padėka. Darbą finansavo Lietuvos mokslo taryba (projekto Nr. SVE-02/2011).Gauta 2012 07 03Parengta spausdinti 2012 10 04Literatūra1. Adom K. K., Liu R. H. 2005. Rapid peroxyl radical scavenging capacity (PSC)assay for assessing both hydrophilic and lipophilic antioxidants. J. Agric. FoodChem., 53: 6 572–6 580.2. Alonso A. M., Dominguez C., Guillen D. A., Barroso C. G. 2002. Determinationof antioxidant power of red and white wines by a new electrochemicalmethod and its correlation with polyphenolic content. J. Agric. Food Chem., 50:3 112–3 115.3. Apak R., Guclu K., Demirata B., Ozyurek M., Celik S. E., Bektasoglu B., BerkerK. I., Ozyurt D. 2007. Comparative evaluation of various total antioxidantcapacity assays applied to phenolic compounds with the CUPRAC assay.Molecules, 12: 1 496–1 547.4. Apak R., Guclu K., Ozyurek M., Celik S. E. 2008. Mechanism of antioxidantcapacity assays and the CUPRAC (cupric ion reducing antioxidant capacity)assay. Microchim Acta, 160: 413–419.5. Apak R., Guclu K., Ozyurek M., Karademir S. E. 2004. Novel total antioxidantcapacity index for dietary polyphenols and vitamins C and E, using their cupricion reducing capability in the presence of neocuproine: CUPRAC method. J.Agric. Food Chem., 52: 7 970–7 981.6. Bandonienė D., Murkovic M. 2002. On-line HPLC-DPPH screening method forevaluation of radical scavenging phenols extracted from apples (Malus domesticaL.). J. Agric. Food Chem., 50: 2 482–2 487.7. Bandonienė D., Murkovic M., Venskutonis R. P. 2005. Determination of rosmarinicacid in sage and borage leaves by high-performance liquid chromatographywith different detection methods. J. Chromatogr. Sci., 43: 372–76.28

8. Bartašiūtė A., Westerink B. H. C., Verpoorte E., Niederlander H. A. G. 2007.Improving the in vivo predictability of an on-line HPLC stable free radical decolorationassay for antioxidant activity in methanol-buffer medium. Free Radic.Biol. Med., 42: 413–423.9. Beekwilder J., Jonker H., Meesters P., Hall R. D., van der Meer I. M., de Vos C.H. R. 2005. Antioxidants in raspberry: on-line analysis links antioxidant activityto a diversity of individual metabolites. J. Agric. Food Chem., 53: 3 313–3 320.10. Benzie I. F., Strain J. J. 1999. Ferric reducing/antioxidant power assay: directmeasure of total antioxidant activity of biological fluids and modified version forsimultaneous measurement of total antioxidant power and ascorbic acid concentration.Methods Enzymol., 299: 15–27.11. Benzie I. F., Strain J. J. 1996. The ferric reducing ability of plasma (FRAP) as ameasure of „antioxidant power“: the FRAP assay. Anal. Biochem., 239: 70–76.12. Bouaziz M., Grayer R. J., Simmonds M. S. J., Damak M., Sayadi S. 2005.Identification and antioxidant potential of flavonoids and low molecular weightphenols in olive cultivar chemlali growing in Tunisia. J. Agric. Food Chem., 53:236–241.13. Brand-Williams W., Cuvelier M. E., Berset C. 1995. Use of a free radicalmethod to evaluate antioxidant activity. Lebensm. Wiss. Technol., 28: 25–30.14. Calliste C. A., Trouillas P., Allais D. P., Simon A., Duroux J. L. 2001. Free radicalscavenging activities measured by electron spin resonance spectroscopy andB16 cell antiproliferative behaviors of seven plants. J. Agric. Food Chem., 49:3 321–3 327.15. Cano A., Alcaraz O., Acosta M., Arnao M. B. 2002. On-line antioxidant activitydetermination: comparison of hydrophilic and lipophilic antioxidant activityusing the ABTS *+ assay. Redox Rep., 7: 103–109.16. Cano A., Hernandez-Ruiz J., Garcia-Canovas F., Acosta M., Arnao M. B. 1998.An end-point method for estimation of the total antioxidant activity in plant material.Phytochem. Anal., 9: 196–202.17. Celik S. E., Ozyurek M., Guclu K., Apak R. 2010. Determination of antioxidantsby a novel on-line HPLC-cupric reducing antioxidant capacity (CUPRAC) assaywith post-column detection. Analytica Chimica Acta, 674: 79–88.18. Chen J., Lindmark-Mansson H., Gorton L., Akesson B. 2003. Antioxidant capacityof bovine milk as assayed by spectrophotometric and amperometric methods.Int. Dairy J., 13: 927–935.19. Dapkevičius A., van Beek T. A., Lelyveld G. P., van Veldhuizen A., de Groot A.,Linssen J. P. H., Venskutonis P. R. 2002. Isolation and structure elucidation ofradical scavengers from Thymus vulgaris leaves. J. Nat. Prod., 65: 892–896.20. Dapkevičius A., van Beek T. A., Niederlander H. A. G. 2001. Evaluation andcomparison of two improved techniques for the on-line detection of antioxidantsin liquid chromatography eluates. J. Chromatogr. A, 912: 73–82.21. De Beer D., Joubert E., Gelderblom W. C. A., Manley M. 2003. Antioxidantactivity of South African red and white cultivar wines: free radical scavenging.J. Agric. Food Chem., 51: 902–909.29

22. Devasagayam T. P., Tilak J. C., Boloor K. K., Sane K. S., Ghaskadbi S. S., LeleR. D. 2004. Free radicals and antioxidants in human health: current status andfuture prospects. J. Assoc. Physicians India, 52: 794–804.23. Exarchou V., Fiamegos Y. C., van Beek T. A., Nanos C., Vervoort J. 2006.Hyphenated chromatographic techniques for the rapid screening and identificationof antioxidants in methanolic extracts of pharmaceutically used plants. J.Chromatogr. A, 1 112: 293–302.24. Firuzi O., Lacanna A., Petrucci R., Marrosu G., Saso L. 2005. Evaluation of theantioxidant activity of flavonoids by „ferric reducing antioxidant power“ assayand cyclic voltammetry. Biochim. Biophys. Acta, 1 721: 174–184.25. Foti M. C., Daquino C., Geraci C. 2004. Electron-transfer reaction of cinnamicacids and their methyl esters with the DPPH radical in alcoholic solutions. J.Org. Chem., 69: 2 309–2 314.26. Frankel E. N., Meyer A. S. 2000. The problems of using one-dimensional methodsto evaluate multifunctional food and biological antioxidants. J. Sci. FoodAgric., 80: 1 925–1 941.27. Garrett A. R., Murray B. K., Robison R. A., O’Neill K. L. 2010. Measuring antioxidantcapacity using the ORAC and TOSC assays. Methods Mol. Biol., 594:251–262.28. Gorinstein S., Leontowicz M., Leontowicz H., Najman K., Namiesnik J., ParkY-S., Jung S-T., Kang S-G., Trakhtenberg S. 2006. Supplementation of garliclowers lipids and increases antioxidant capacity in plasma of rats. Nutr. Res., 26:362–368.29. Gungor N., Ozyurek M., Guclu K., Cekic S. D., Apak R. 2011. Comparativeevaluation of antioxidant capacities of thiol-based antioxidants measured by differentin vitro methods. Talanta, 83: 1 650–1 658.30. Haldar S., Rowland I. R., Barnett Y. A., Bradbury I., Robson P. J., Powell J.,Fletcher J. 2007. Influence of habitual diet on antioxidant status: a study in apopulation of vegetarians and omnivores. Eur. J. Clin. Nutr., 61: 1 011–1 022.31. Halliwell B. 1995. Antioxidant characterization: methodology and mechanism.Biochem. Pharmacol., 49: 1 341–1 348.32. Halliwell B., Murcia M. A., Chirico S., Aruoma O. I. 1995. Free radicals and antioxidantsin food and in vivo: what they do and how they work. Crit. Rev. FoodSci., 35: 7–20.33. Halliwell B., Whiteman M. 2004. Measuring reactive species and oxidative damagein vivo and in cell culture: how should you do it and what do the resultsmean? Br. J. Pharmacol., 142: 231–255.34. Halvorsen B. L., Blomhoff R. 2011. Validation of a quantitative assay for thetotal content of lipophilic and hydrophilic antioxidants in foods. Food Chem.,127: 761–768.35. Huang D., Ou B., Prior R. L. 2005. The chemistry behind antioxidant capacityassays. J. Agric. Food Chem., 53: 1 841–1 856.30

36. Ivanova D., Gerova D., Chervenkov T., Yankova T. 2005. Polyphenols andantioxidant capacity of Bulgarian medicinal plants. J. Ethnopharmacol., 96:145–150.37. Yanishlieva N. V., Marinova E., Pokorny J. 2006. Natural antioxidants fromherbs and spices. Eur. J. Lipid Sci. Technol., 108: 776–793.38. Young I. S., Woodside J. V. 2001. Antioxidants in health and disease. J. Clin.Pathol., 54: 176–186.39. Karadag A., Ozcelik B., Saner S. 2009. Review of methods to determine antioxidantcapacities. Food Anal. Methods, 2: 41–60.40. Kim D-O., Lee K. W., Lee H. J., Lee C. Y. 2002. Vitamin C equivalent antioxidantcapacity (VCEAC) of phenolic phytochemicals. J. Agric. Food Chem., 50:3 7130–3 717.41. Koleva I. I., Niederlander H. A., van Beek T. A. 2000. An on-line HPLCmethod for detection of radical scavenging compounds in complex mixtures.Anal. Chem., 72: 2 323–2 328.42. Koleva I. I., Niederlander H. A., van Beek T. A. 2001. Application of ABTS radicalcation for selective on-line detection of radical scavengers in HPLC eluates.Anal. Chem., 73: 3 373–3 381.43. Kontush A., Spranger T., Reich A., Djahansouzi S., Karten B., Braesen J. H.,Finckh B., Kohlschutter A., Beisiegel U. 1997. Whole plasma oxidation assay asa measure of lipoprotein oxidizability. Biofactors, 6: 99–109.44. Kosar M., Dorman D., Baser K., Hiltunen R. 2004. An improved HPLC postcolumnmethodology for the identification of free radical scavenging phytochemicalsin complex mixtures. Chromatographia, 60: 635–638.45. Lemanska K., Szymusiak H., Tyrakowska B., Zielinski R., Soffers A. E. M. F.,Rietjens I. M. C. M. 2001. The influence of pH on antioxidant properties and themechanism of antioxidant action of hydroxyflavones. Free Radic. Bio. Med., 31:869–881.46. Li S-Y., Yu Y., Li S-P. 2007. Identification of antioxidants in essential oil of radixAngelicae sinensis using HPLC coupled with DAD-MS and ABTS-based assay.J. Agric. Food Chem., 55: 3 358–3 362.47. Liu R. H. 2004. Potential synergy of phytochemicals in cancer prevention: mechanismof action. J. Nutr., 134: 3 479S–3 485S.48. Miguel M. G. 2010. Antioxidant activity of medicinal and aromatic plants.Flavour Frag. J., 25: 291–312.49. Milardovic S., Ivekovic D., Grabaric B. S. 2006. A novel amperometric method forantioxidant activity determination using DPPH free radical. Bioelectrochemistry,68: 175–180.50. Milardovic S., Ivekovic D., Rumenjak V., Grabaric B. S. 2005. Use of DPPH • /DPPH redox couple for biamperometric determination of antioxidant activity.Electroanal., 17: 1 847–1 853.51. Miliauskas G., van Beek T. A., Venskutonis R. P., Linssen J. P. H., de Waard P.,Sudholter E. J. R. 2004. Antioxidant activity of Potentilla fruticosa. J. Sci. FoodAgric., 84: 1 997–2 009.31

52. Miller N. J., Rice-Evans C. A., Davies M. J., Gopinathan V., Milner A. 1993. Anovel method for measuring antioxidant capacity and its application to monitoringthe antioxidant status in premature neonates. Clin. Sci., 84: 407–412.53. Miller N. J., Sampson J., Candeias L. P., Bramley P. M., Rice-Evans C. A. 1996.Antioxidant activities of carotenes and xanthophylls. FEBS Lett., 384: 240–242.54. Moore J., Yin J. J., Yu L. L. 2006. Novel fluorometric assay for hydroxyl radicalscavenging capacity (HOSC) estimation. J. Agric. Food Chem., 54: 617–626.55. Niederlander H. A., van Beek T. A., Bartasiute A., Koleva I. I. 2008. Antioxidantactivity assays on-line with liquid chromatography. J. Chromatogr. A, 1 210:121–134.56. Nilsson J., Pillai D., Onning G., Persson C., Nilsson A., Akesson B. 2005.Comparison of the 2,2′-azinobis-3-ethylbenzotiazoline-6-sulfonic acid (ABTS)and ferric reducing antioxidant power (FRAP) methods to assess the total antioxidantcapacity in extracts of fruit and vegetables. Mol. Nutr. Food Res., 49:239–246.57. Nuengchamnong N., de Jong C. F., Bruyneel B., Niessen W. M. A., Irth H.,Ingkaninan K. 2005. HPLC coupled on-line to ESI-MS and a DPPH-based assayfor the rapid identification of anti-oxidants in Butea superba. Phytochem. Anal.,16: 422–428.58. Ou B., Huang D., Hampsch-Woodill M., Flanagan J. A., Deemer E. K. 2002.Analysis of antioxidant activities of common vegetables employing oxygenradical absorbance capacity (ORAC) and ferric reducing antioxidant power(FRAP) assays: a comparative study. J. Agric. Food Chem., 50: 3 122–3 128.59. Ozgen M., Reese R. N., Tulio A. Z., Scheerens J. C., Miller R. 2006. Modified2,2-azino-bis-3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid (ABTS) method to measureantioxidant capacity of selected small fruits and comparison to ferric reducingantioxidant power (FRAP) and 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) methods.J. Agric. Food Chem., 54: 1 151–1 157.60. Ozyurek M., Guclu K., Apak R. 2011. The main and modified CUPRAC methodsof antioxidant measurement. Trend. Anal. Chem., 30: 652–664.61. Pellegrini N., Del Rio D., Colombi B., Bianchi M., Brighenti F. 2003. Applicationof the 2,2’-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) radical cation assayto a flow injection system for the evaluation of antioxidant activity of some purecompounds and beverages. J. Agric. Food Chem., 51: 260–264.62. Prior R. L., Cao G. 1999. In vivo total antioxidant capacity: comparison of differentanalytical methods. Free Radical Bio. Med., 27: 1 173–1 181.63. Prior R. L., Wu X., Schaich K. 2005. Standardized methods for the determinationof antioxidant capacity and phenolics in foods and dietary supplements. J.Agric. Food Chem., 53: 4 290–4 302.64. Pukalskas A., van Beek T. A., de Waard P. 2005. Development of a triple hyphenatedHPLC-radical scavenging detection-DAD-SPE-NMR system for the rapididentification of antioxidants in complex plant extracts. J. Chromatogr. A, 1 074:81–88.32

65. Pulido R., Bravo L., Saura-Calixto F. 2000. Antioxidant activity of dietary polyphenolsas determined by a modified ferric reducing/antioxidant power assay.J. Agric. Food Chem., 48: 3 396–3 402.66. Pulido R., Hernandez-Garcia M., Saura-Calixto F. 2003. Contribution of beveragesto the intake of lipophilic and hydrophilic antioxidants in the Spanish diet.Eur. J. Clin. Nutr., 57: 1 275–1 282.67. Raudonis R., Raudonė L., Jakštas V., Janulis V. 2012. Comparative evaluationof post-column free radical scavenging and ferric reducing antioxidant powerassays for screening of antioxidants in strawberries. J. Chromatogr. A, 1 233:8–15.68. Re R., Pellegrini N., Proteggente A., Pannala A., Yang M., Rice-Evans C. A.1999. Antioxidant activity applying an improved ABTS radical cation decolorizationassay. Free Radic. Bio. Med., 26: 1 231–1 237.69. Sanchez-Moreno C., Larrauri J. A., Saura-Calixto F. 1998. A procedure to measurethe antiradical efficiency of polyphenols. J. Sci. Food Agric., 76: 270–276.70. Saura-Calixto F., Goni I. 2006. Antioxidant capacity of the Spanish Mediterraneandiet. Food Chem., 94: 442–447.71. Stalmach A., Mullen W., Nagai C., Crozier A. 2006. On-line HPLC analysis ofthe antioxidant activity of phenolic compounds in brewed, paper-filtered coffee.Braz. J. Plant Physiol., 18: 253–262.72. Stanner S. A., Hughes J., Kelly C. N., Buttriss J. 2004. A review of the epidemiologicalevidence for the „antioxidant hypothesis“. Public Health Nutr., 7:407–422.73. Stasko A., Brezova V., Biskupic S., Misik V. 2007. The potential pitfalls of using1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl to characterize antioxidants in mixed water solvents.Free Radic. Res., 41: 379–390.74. Stewart A. J., Mullen W., Crozier A. 2005. On-line high-performance liquidchromatography analysis of the antioxidant activity of phenolic compounds ingreen and black tea. Mol. Nutr. Food Res., 49: 52–60.75. Strube M., Haenen G. R., van den Berg H., Bast A. 1997. Pitfalls in a method forassessment of total antioxidant capacity. Free Radic. Res., 26: 515–521.76. Surveswaran S., Cai Y-Z., Corke H., Sun M. 2007. Systematic evaluation of naturalphenolic antioxidants from 133 Indian medicinal plants. Food Chem., 102:938–953.77. Szajdek A., Borowska E. J., Czaplicki S. 2009. Effect of bilberry mash treatmenton the content of some biologically active compounds and the antioxidant activityof juices. Acta Aliment. Hung., 38: 281–292.78. Tawaha K., Alali F. Q., Gharaibeh M., Mohammad M., El-Elimat T. 2007.Antioxidant activity and total phenolic content of selected Jordanian plant species.Food Chem., 104: 1 372–1 378.79. Tsao R., Deng Z. 2004. Separation procedures for naturally occurring antioxidantphytochemicals. J. Chromatogr. B, 812: 85–99.80. Valkonen M., Kuusi T. 1997. Spectrophotometric assay for total peroxyl radicaltrappingantioxidant potential in human serum. J. Lipid Res., 38: 823–833.33

81. van den Berg R., Haenen G. R. M. M., van den Berg H., Bast A. 1999.Applicability of an improved Trolox equivalent antioxidant capacity (TEAC)assay for evaluation of antioxidant capacity measurements of mixtures. FoodChem., 66: 511–517.82. Wojdylo A., Oszmianski J., Czemerys R. 2007. Antioxidant activity and phenoliccompounds in 32 selected herbs. Food Chem., 105: 940–949.83. Wolfe K. L., Liu R. H. 2007. Cellular antioxidant activity (CAA) assay for assessingantioxidants, foods, and dietary supplements. J. Agric. Food Chem., 55:8 896–8 907.84. Wootton-Beard P. C., Moran A., Ryan L. 2011. Stability of the total antioxidantcapacity and total polyphenol content of 23 commercially available vegetablejuices before and after in vitro digestion measured by FRAP, DPPH, ABTS andFolin–Ciocalteu methods. Food Res. Int., 44: 217–224.85. Wright J. S., Johnson E. R., DiLabio G. A. 2001. Predicting the activity of phenolicantioxidants: theoretical method, analysis of substituent effects, and applicationto major families of antioxidants. J. Am. Chem. Soc., 123: 1 173–1 183.86. Zhang Q., van der Klift E. J. C., Janssen H-G., van Beek T. A. 2009. An on-linenormal-phase high performance liquid chromatography method for the rapiddetection of radical scavengers in non-polar food matrixes. J. Chromatogr. A, 1216: 7 268–7 274.SODININKYSTĖ IR DARŽININKYSTĖ. SCIENTIFIC ARTICLES. 2012. 31(3–4).Assessment of the Antiradical and Reducing activity (Review)R. Raudonis, L. Raudonė, V. Janulis, P. ViškelisSummaryAntioxidant is a substance that effectively reduces pro-oxidant resulting in compoundswith low or no toxicity. Interest in protective properties of natural antioxidants of plant originand their application in prophylaxis is increasing. Preliminary researches on antioxidant activityof herbal raw materials are carried out by in vitro methods. The most popular methods based onsingle electron transfer (SET) are assessment of DPPH radical, ABTS radical-cation scavenging,ferric (FRAP) and cupric (CUPRAC) ion reducing antioxidant power. The most commonly,detection of change in spectrophotometric visual light absorption is used. It’s a simple, reliableand suitable method for evaluation of antioxidant properties of pure compounds and foridentification of structure-activity relationship. In complex mixtures such as plant extracts andfood matrixes spectrophotometric methods evaluate total antioxidant activity of all compoundspresent in a sample and cannot evaluate the contribution of separate compounds to overallactivity. High-resolution online assays are used for a rapid separation of active antioxidantcompounds. These assays combine HPLC separation and post-column reaction detection. HPLCpost-column assays assess antioxidant properties of separate compounds and their contributionto the overall antioxidant activity of complex mixtures. HPLC post-column assays provide reliable,accurate and reproducible assessment of quality of plant extracts by determining markersof qualitative and quantitative antioxidant activity of biologically active compounds. Assays34

enable the control of distribution and stability of antioxidants and determination of optimalstorage conditions of materials or preparations. HPLC post-column assays are effective meansfor plant selection among different species, varieties, phenological stage and growing conditionsin order to ensure abundant antioxidant composition.Key words: ABTS, antioxidants, CUPRAC, DPPH, FRAP, HPLC post-column.35