In situ hybridizationによるアメーバ性脳炎の鑑別診断法

38 原 生 動 物 学 雑 誌 第 40 巻 第 1 号 2007 年SUMMARYAmong free-living amoebae, Naegleria fowleri, Balamuthia mandrillaris and Acanthamoeba spp. are knowncausative agents of amoebic encephalitis in humans. Immunohistochemical methods using anti-amoeba antibodies havebeen used for diagnostic separation of these amoebal pathogens. However, anti-amoeba antibodies are limited in practicaluse because they are not available commercially and are not easy to develop in house. We have used in situ hybridization(ISH) for diagnosis of amoebic encephalitis on histological preparations of central nervous system tissue frommice experimentally infected with the amoebae. Oligonucleotide probes (approximately 40 bp) specific to each amoebawere designed based on the sequence of the 18S ribosomal RNA gene and were used for whole-cell hybridization. Theprobes, which contained a biotin at the 5'-end, were detected with streptavidin-conjugated HRP or Alexa 488. Specificityand reactivity of the probes were confirmed by staining the respective amoebae prior to histological application. HighresolutionISH images of the amoeba cells with excellent contrast were consistently obtained with fluorescence lightmicroscopy. The advantage of ISH for the detection of specific pathogens in pathological specimens might be queriedbecause of the complexity of the stain technology. However, probes specific to pathogenic microbes can be developedeasily once the DNA sequence data are available.[ 目 的 ] 自 由 生 活 性 アメーバであるNaegleria fowleri,Balamuthiamandrillaris およびAcanthamoebaspp.はヒト 中 枢 に 感 染 し 致 死 的 なアメーバ 性 脳 炎 を引 き 起 こす。 国 内 においてはBalamuthia mandrillarisがアメーバ 性 脳 炎 の 主 要 な 病 原 体 であることが 疫 学的 調 査 から 判 明 しているが,これらのアメーバに 関する 感 染 実 態 は 明 らかではない。 従 来 の 一 般 的 組 織染 色 法 ,また 抗 アメーバ 抗 体 を 用 いた 免 疫 組 織 染 色法 は 特 異 性 および 汎 用 性 の 面 から 確 定 診 断 法 としての 利 用 に 限 界 が 見 られる。in situ hybridization 法(ISH)は,より 高 い 特 異 性 と 利 便 性 を 有 し,Acanthamoebaの 細 胞 レベルのDNA 同 定 にも 応 用 されている 1) 。 本 研 究 ではアメーバ 性 脳 炎 の 鑑 別 診 断 法としてのISHの 有 用 性 を, 病 理 切 片 標 本 を 用 いて 検 討した。[ 材 料 および 方 法 ] Naegleria fowleri,Balamuthiamandrillaris およびAcanthamoebaの18S rRNA 領 域 の登 録 配 列 を 利 用 して, 各 アメーバ 特 異 プローブ( 約40bp)を 数 種 類 設 計 した。 各 プローブは5‘ 側 にビオチン 標 識 を 施 し,PeroxidaseあるいはAlexa488 標 識アビジンで2 次 染 色 が 可 能 にした。プローブの 特 異 性を 調 べるための 交 叉 反 応 試 験 には,スライドグラス上 に 上 記 3 種 類 のアメーバ 培 養 株 およびヒトの 培 養 細胞 を 塗 抹 した 標 本 を 用 いた。また 病 理 組 織 標 本 には上 記 アメーバを 脳 内 接 種 した 感 染 マウスのパラフィン 脳 病 理 切 片 を 用 いた。 染 色 手 順 としては, 病 理 組織 標 本 を 定 法 に 基 づき 脱 パラフィン 処 理 し,Proteinase K 処 理 (37℃,15 分 間 )の 後 , プローブ( 最終 濃 度 0.01pmol)をのせハイブリダイゼーション(52℃,2 時 間 ),さらに 保 温 洗 浄 液 (10 倍 希 釈 SSC緩 衝 液 ) 中 に 浸 漬 (20 分 間 )して 洗 浄 を 行 い,PeroxidaseあるいはAlexa488 標 識 アビジンで2 次 染 色を 行 った。Peroxidase の 発 色 反 応 にはGenPoint システム(DAKO)を 用 いた。なおPeroxidase 発 色 標 本 ではヘマトキシリンによる 核 染 色 ,Alexa488 染 色 標 本ではEvans Blueによりカウンター 染 色 を 行 った。[ 結 果 と 考 察 ] 塗 抹 標 本 を 用 いた 交 差 反 応 試 験 では, 各 アメーバプローブは 高 い 特 異 性 を 示 し,また細 胞 全 体 が 染 色 され,いずれも 使 用 可 能 と 判 断 された。 病 理 切 片 上 での 反 応 においてはN. fowleriではNaeg2ish,B. mandrillaris ではBala3ish,AcanthamoebaではAcanth3ish の 各 特 異 プローブが 優 れた 反 応 性 を示 した。 PeroxidaseあるいはAlexa488いずれの 場 合も,アメーバの 細 胞 全 体 が 染 色 されることで 周 囲 の組 織 より 明 確 に 識 別 することが 可 能 であった。Naegleria fowleriではGenPoint システム(DAKO)の染 色 特 性 として, 細 胞 質 全 体 は 比 較 的 弱 く 茶 褐 色 に染 色 され, 部 分 的 に 強 く 点 状 に 染 まる 傾 向 が 示 された。 本 方 法 ではB. mandrillarisとN. fowleriの 間 に 交 差反 応 は 示 されなかったが,B. mandrillaris とAcanthamoebaとの 間 では, 反 応 条 件 を 緩 やかにすることで 微 弱 な 交 差 反 応 が 観 察 された。したがって,