ERM Application note 5 bulgarian - Europa

Application Note 5
Използване на сертифицирани сравнителни
материали за количествен анализ на
генетично модифицирани организми (ГМО) на
база на коефициента на броя на ДНК копията
Настоящият документ предлага упътване за правилната употреба на
Европейски сравнителни материали, сертифицирани относно техния
дял на генетично модифицирани (ГМ) копия, получени в резултат на
определено трансформационно събитие. Подробностите, описани подолу,
се отнасят по-специално за сертифицираните сравнителни
материали ERM-BF413d и ERM-AD413 и бъдещите такива материали, сертифицирани относно
коефициента на броя на копията.
УВОД
Институтът за референтни материали и измервания
(ИРМИ) на Съвместния изследователски център на
Европейската комисия (СИЦ) разработи неотдавна два
нови вида сертифицирани сравнителни материали
(СРМ) за генетично модифицирани организми (ГМО),
които използват метрологично проследяема система и
по този начин позволяват правилното прилагане на
Препоръка (ЕО) № 787/2004 [1]. Настоящият документ
дава указания за правилното използване на новите
СРМ.
ХАРАКТЕРИСТИКИ НА НОВИТЕ СРМ ЗА
ГМО
А. Нови матрични СРМ за ГМО
Сертифицираните стойности се основават на
измерването на две различни величини. Наред със
сертифицираната стойност за тегловния дял на
определена генетична трансформация (вж. application
note 4), новият СРМ е сертифициран и по отношение
на коефициента на броя на копията на ДНК.
Процентната стойност на този параметър се изчислява
по формулата:
GM DNA copy number [cp]
DNA copy number ratio [%] = x 100
Target taxon-specific DNA copy number [cp]
Това сертифициране се извършва въз основа на
измервания по метода QRT-PCR (количествен анализ
на полимеразна верижна реакция в реално време).
Тези измервания са калибрирани с помощта на
специален сертифициран плазмиден ДНК-калибратор,
при който всеки плазмид съдържа точно по едно копие
на генетично модифицираната и на таксонспецифичната
мишена (секвенция) (вж. Раздел Б).
Поради тази причина, коефициентът на броя на
копията на ДНК при ГМ царевица е пряка зависимост
от анализираната генетична трансформация. Нещо
повече, в разгледания пример сертифицираният
референтен материал ERM-BF413d следва да се
използва единствено с плазмидния калибратор ERM-
AD413 и трансформационно-специфичния метод на
откриване на MON 810 [2]. Сертифицираният
коефициент на броя на копията на ДНК (0,57 %) при
MON 810 се различава от сертифицирания тегловен
дял (10,0 g/kg или 1,0 %), тъй като коефициентът на
броя на копията при сертифицирания MON 810 отчита
състоянието на зиготност, плоидност и
ендоредупликация на семената, използвани при
получаването на този материал.
Матричният СРМ е предназначен за качествен контрол
на аналитичните процедури, в това число и на
екстракцията и пречистването, както и на етапите на
измерването с помощта на полимеразна верижна
реакция (ПВР) на определена генетична
трансформация.
Б. Нови плазмидни СРМ за ГМО
Сертифицираните калибратори съдържат определен
ДНК фрагмент, специфичен за генетичната
модификация, както и определен ДНК фрагмент,
специфичен за анализирания таксон. Този плазмид
съдържа фрагмент със 170 базови двойки от
материала MON 810 5' plant-P35S и фрагмент със 351
базови двойки от ендогенния високоподвижен групов
ген (hmg) на царевицата.
Сертифицираните стойности представляват броя на
клонираните генетични модификации и съответно на
таксон-специфичните ДНК-фрагменти за един плазмид.
Численото отношение между тези два ДНК-фрагмента
се използва като ориентировъчна стойност, получена
при дуплексна и моноплексна ПВР в реално време.
ИЗПОЛЗВАНЕ НА ПЛАЗМИДЕН
КАЛИБРАТОР ЗА ГМО
© European Communities, 2007. Reproduction is authorised, provided the source is acknowledged.
Neither the European Commission nor any person acting on behalf of the Commission is responsible for the use which might be made of the
following information.
ноември 2007 г.
Автор: Philippe Corbisier
Европейска комисия - Съвместен
изследователски център
Институт за референтни материали и
измервания
Retieseweg 111, 2440 Geel, Белгия
е-мейл: philippe.corbisier@ec.europa.eu
www.erm-crm.org
Калибраторът трябва да бъде използван в комбинация
с определен метод за количествена ПВР в реално
време [1].
Всеки калибратор се доставя в затворена пластмасова
епруветка, охладена със сух лед, и трябва да се
съхранява при температура от -20 °C до момента на
употребата. Съдържанието трябва първо да се
размрази, след това да се разбърка и накрая да се
отвори и разреди в условията на ламинарен поток за
да се избегне замърсяване. Всяка епруветка съдържа
около 2 x 10 6 плазмидни копия на един µL и
препоръчаният начален обем за серията от
разреждания е 50 µL. Указаната в сертификата
процедура на разреждане трябва да бъде спазвана. В
доставката не е включен буфер за разреждане.
Сериите от разтвори следва да бъдат прясно
приготвени и да се предпазват от всякакви
въздействия в затворени епруветки. Те се използват за
изготвянето на две калибрационни криви (по една за
трансгена и за таксон-специфичния ген), като всяка от
тях има 5 точки и всяка точка е установена чрез тройно
измерване на ПВР (вж. примера). Една епруветка
осигурява достатъчно калибратор за изготвянето на 10
калибрационни криви за двете мишени, т.е.
съдържанието на една епруветка е достатъчно за
количествен анализ на 100 до 250 проби.
Препоръчаното количество на пробата при
Page 1 of 2

количествена ПВР в реално време е 5 µL от образеца
ДНК на един ПВР-резервоар.
Измерените стойности за прага на флуоресценция (Ctстойности)
се нанасят в графиката заедно с
теоретичния брой на копията на двата фрагмента, за
да се получат две калибрационни криви. Тези
калибрационни криви се използват за количествен
анализ на мишената от генетично модифицирания
материал спрямо таксон-специфичната мишена в
изследваната проба. Резултатите могат да бъдат
изчислени като съотношение между стойностите за
двете мишени и изразени в проценти, в съответствие с
ПРИМЕР
Геномна ДНК, екстрахирана от изследваната проба, както и ДНК
от материала ERM-BF413d, използван като база за количествена
проверка, се подлагат на анализ по метода на ПВР в реално
време, като за калибратор се използва ERM-AD413. Ctстойностите
за калибратора ERM-AD413 се получават след
амплификация на фрагментите на hmg и MON 810 (таблица 1).
При амплификация на фрагментите на hmg и MON 810 за
изследваната проба се получават средни Ct-стойности съответно
32,76 и 25,44. Средните Ct-стойности, получени при материала за
КП за фрагменти на hmg и MON 810 са съответно 31,22 и 22,20.
Наклонът и пресечната точка с оста Y трябва да бъдат
определени за всяка от двете калибрационни криви, за да бъде
изчислено съдържанието на MON 810 в двете проби, като за найподходяща
моделираща функция се приема правата линия. За
изчисляване на наклоните и пресечните точки с оста Y могат да
бъдат използвани вградените функции на Microsoft Excel или кой да
е друг наличен софтуер за калибрация.
Препоръка (ЕО) № 787/2004. Вътрешна качествена
проверка (КП) на ПВР може да бъде направена като се
изчислят средните аритметични на измерените Ctстойности
както за трансгенната, така и за таксонспецифичната
мишена при калибрационни точки,
съответстващи на 2000 копия/µL. Отношението трябва
да съответства приблизително на 1,04 % (при
неопределеност на измерването от 0,06 %) за
моноплексна ПВР, както е посочено в упътването за
сертифициране (вж. също ERM Application Note 1).
Наклоните (b) на двете характеристики на линейна регресия могат да бъдат изчислени по следната формула:
∑ ( log( x)
− log( x)
)( y − y)
където по оста Х е нанесен броят на копията на амплифицирания фрагмент, а по оста Y -
b = 2
∑ ( log( x)
− log( x)
)
съответните Ct-стойности. Наклоните на калибрационните криви за фрагментите на hmg и MON 810, дадени в Таблица 1, са
съответно -3,25 и -3,32. Пресечните точки (а) на двете регресионни линии с оста Y се изчисляват по следната формула:
a = y − bx
ако log (x) =0. В нашия пример стойностите за а са 39,26 и 40,93 съответно за регресионните линии на hmg и
MON 810. Тези стойности представляват теоретичните Ct-стойности, съответстващи на 1 копие за всеки от двата фрагмента.
Наклонът служи за изчисляване на ефективността (ε) на ПВР по формулата: ε = (10 -1/b -1)*100. В нашия пример изчислената
ефективност беше 99,7 % и 103,1 % съответно за амплификацията на фрагментите на MON 810 и hmg. Броят на копията (cp)
на MON 810 в изследваната проба се изчислява като:
cp
MON810
= 10
⎛ Ct MON 810 −a
MON 810 ⎞
⎜
⎟
⎝ bMON
810 ⎠
, където CtMON810, aMON810 и bMON810 са
съответно Ct-стойностите, пресечната точка с оста Y и наклонът, получен при амплификацията на MON 810. Същото
⎛ Ct hmg −a
hmg ⎞
⎜
⎟
⎜ b ⎟
изчисление се използва и за определяне броя на копията на hmg-фрагмента по формулата:
⎝ hmg ⎠
cp = 10 . В нашия
пример прогнозираните количества на копията на MON 810 и hmg в изследваната проба са съответно 289 и 17878.
Следователно, процентният дял на MON 810 в изследваната проба е: 289 cp MON 810
* 100 = 1.
62
. Същото изчисление се
%
17878 cp
прави и за съдържанието на материала за КП: 841 cp MON 810
* 100 = 0.
47
от MON 810. Като се вземат предвид специфичната
%
177513 cp
hmg
неопределеност, внесена от материала ERM-BF413d и неопределеността на измерването (вж. ERM Application Note 1), е
възможно да се установи дали измерените стойности съответстват на сертифицираните за ERM-BF413d. В горния пример
коефициентът от 1,05 за средноаритметичните Ct-стойности, получен за 10000 копия (5 µL от ERM-AD413 при 2000 копия/µL)
е в съответствие с ориентировъчната стойност от 1,04 ± 0,06 указана в сертификата на ERM-AD413, което показва, че
количественият анализ на ГМ е протекъл контролирано (т.е. данните са достоверни).
[1] Препоръка (ЕО) № 787/2004 на Европейската комисия от 4 октомври 2004 г. относно технически насоки за изследване и
откриване на генетично модифицирани организми и материал, произведен от генетично модифицирани организми, във вид
на или в продукти в смисъла на Регламент (ЕО) № 1830/2003. ОВ L 348 (2004 г.) стр. 18-26
[2] ISO 21570:2005 Хранителни продукти – Аналитични методи за откриване на генетично модифицирани организми и
производни продукти – Количествени методи на базата на нуклеинови киселини. Приложение D2 Трансформационноспецифичен
метод за относителен количествен анализ на царевица линия MON 810 с помощта на ПВР в реално време. 93-
99.
___________
1 Ако Ct-стойностите за NTC се различават от броя на отработените цикли на ПВР, трябва да се предположи кръстосано
замърсяване или неспецифична амплификация.
Total number of cp of the
MON 810 fragment Ct values measured average
replicate 1 replicate 2 replicate 3 Ct
50000 25.30 25.19 25.15 25.21
10000 27.57 27.62 27.66 27.62
1000 31.19 30.89 31.14 31.07
100 33.99 35.12 34.80 34.64
25 35.79 35.67 36.37 35.95
NTC 45.00 45.00 45.00 45.00
Total number of cp of
the hmg fragment
500000 20.76 20.67 20.63 20.69
100000 22.92 23.00 23.04 22.99
10000 26.39 26.36 26.33 26.36
5000 27.31 27.29 27.37 27.32
1000 29.38 29.19 29.57 29.38
NTC 45.00 45.00 45.00 45.00
Table 1: Example of experimental Ct values obtained using
the ERM-AD413 as calibrant. NTC 1 = no template control.
hmg
hmg
Page 2 of 2