陳明正

生化科技學系微生物學組專題討論
題目:Mycobacterium tuberculosis Rv2224c modulates innate immune responses
作者:Jyothi Rengarajan, Elissa Murphy, Arnold Park, Casssandra L. Krone, Erik C.
Hett, Barry R. Bloom, Laurie H. Glimcher, and Eric J. Rubin
文章來源:The Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States
of America 105:264-269, 2008.
演講人:Ming-Cheng Chen 陳明正 B94613014
指導老師:Chii-Shen Yang PhD 楊啟伸 博士
演講日期:December 16 th , 2008
演講地點:The 6th classroom
摘要
Mycobacterium tuberculosis (Mtb)俗稱結核桿菌,導致傳染病 Tuberculosis(結
核病,簡稱 TB),為人類極重要的病原。結核桿菌通常感染並破壞肺以及淋巴系
統(稱「結核性淋巴病變」,又稱「淋巴結核」),但其它器官如腦、中樞神經系
統、循環系統、泌尿系統、骨骼、關節、甚至皮膚皆可受感染。其他種的分枝桿
菌,如牛分枝桿菌(Mycobacterium bovis)、非洲分枝桿菌(Mycobacterium
africanum)、亦可引起結核,但通常不感染健康成人 [1] 。
Mtb算是相當成功的人類病原,進入宿主後寄生於巨噬細胞中,大多數情況
下不被人類的先天(innate immunity)及適應免疫(adaptive immunity)所消滅, 可潛
伏人體達數年之久形成潛伏結核感染(latent TB infection) [2] 。當宿主的免疫力
降低時便重新活化而造成危害,但長久以來對於相關機制仍不了解。先前研究中
已藉由 transposon mutant library的建立 [3] ,挑選出Mtb在巨噬細胞存活複製有極
大影響的Rv2224c,本篇研究即試圖釐清Rv2224c突變株對於Mtb繁殖速度及宿主
存活率之影響,接著再比對Rv2224c突變株與野生型在胞外分泌蛋白質種類的差
異,確立了Rv2224c對於Mtb中熱休克蛋白(heat shock protein) GroEL2的調控關
係,進而調節宿主產生的免疫反應,期望未來藉由更深入研究,開發出結核病之
新型治療方法。
Keywords:Tuberculosis、Mycobacterium tuberculosis、Rv2224c、GroEL2
本研究之重要性
前言
Mtb所引發的結核病每年感染全世界近8百萬人,一年導致2百萬人死亡,
為人類極為重要的病原。其影響力在於能規避宿主的免疫系統,造成慢性發
炎,等待宿主的免疫力降低便活化而造成危害。雖然我們已知其入侵人體後生
1

存在巨噬細胞中並進行複製,但分子層面的詳細機制卻仍未明朗。本研究釐清
Mtb水解酶(hydrolase) Rv2224c [4] 扮演之角色,以及對於調控GroEL2進而影響先
天性免疫反應的調控網絡。
前人做過的研究
在作者團隊先前研究中,已利用 MTB transposon mutant library 以 genome
microarray 方法分析存在 Mtb 的 2863 個基因對於 Mtb 寄生巨噬細胞存活之重
要性差異(in vitro) [5][6] ,其中 Rv2224c 被證明為 Mtb 存活於巨噬細胞的重要調
控蛋白。
另外,GroEL2 已被證實為 Mtb 的胞外分泌蛋白,屬於熱休克蛋白,會受
到環境壓力如熱、組織缺氧、營養缺乏而產生,並可調節巨噬細胞的免疫反應
[7] ,造成慢性發炎。
作者為何要做此研究
延續作者在先前實驗的發現,進一步以 in vivo 實驗確立 Rv2224c 對於 Mtb
生長以及影響宿主先天性免疫反應的調控網絡,期待開發出新型結核病治療方
式。
本研究欲完成之項目
作者先證實了 Rv2224c 存在於細胞外膜,具有 S228-D463-H490 的催化活性
區,配合構型預測屬於水解酶,接著利用 Rv2224c::tn 突變株進行 in vivo 實驗
證實 Rv2224c 為 Mtb 存活於巨噬細胞中所需的重要調控蛋白,接著再分析突
變株與野生型胞外分泌蛋白質差異,推測 Rv2224c 的調控目標為熱休克蛋白
GroEL2,建立影響宿主先天性免疫反應的調控網絡。
材料與方法
菌株與細胞株
本實驗利用 Mtb H37Rv strain 以及 M. bovis bacillus Calmette-Guérin 在 37 ℃條
件下培養於 Middlebrook 7H9 broth 或是 7H10 agar,含 25 μg/ml kanamycin。
巨噬細胞則分離自 C57BL/6 小鼠骨髓,培養於 DMEM/F12 medium 含 10 %
FCS/2 mM glutamine/20 % L cell conditioned medium/2 ng/ml rIL-3。
質體建構
將 Rv2224c 基因插入 pMV762 的 Xbal 及 Spel 切位之間以建構 Myc-tagged
Rv2224c。C31S 及 S228A 突變株利用 site-directed mutagenesis 產生。
Rv2223c-2224c 操縱子質體建構則將兩基因插入 pMV762 的 Xbal 及 Spel 切位
之間。
Macrophage Survival Assay 和 Cytokine Assays
巨噬細胞分離自 C57BL/6 小鼠骨髓,接續培養在 24 孔盤,Mtb 與巨噬細胞以
1:1 進行感染,在不同天數以 0.5 % Triton in PBS 溶解細胞層,進行序列稀釋將
巨噬細胞培養在 7H10 及 7H10 kanamycin plate 中,以 Luminex ELISA kit 及
2

Bioplex 200 Luminex system,計算 CFU (colony-forming units)及分析細胞因子
含量。
Lysozyme Susceptibility Assay
將 hen egg lysozyme (MP Biomedicals)加入 7H10 plate 中,序列稀釋加入 Mtb
strain 配合不同濃度的溶菌酶,在 37 ℃條件下培養 4-5 週,計算 cfus。
以 Mtb 感染小鼠
對於 RAG -/- 小鼠的吸入劑型感染,乃利用 College of Engineering Shops at the
University of Wisconsin 發展的 aerosol apparatus,暴露 40 分鐘,造成每隻小鼠
肺部 10 cfus 的感染。靜脈注射感染,則將 Mtb 注入末端靜脈,若是多種菌株
混合感染注入 5 x 10 5 cfus,單一感染則注入 2 x 10 6 cfus。
組織染色
欲染色組織先利用 10 %福馬林固定,再以石臘封埋,接續以 hematoxylin 及
eosin Y 進行 H&E 染色。
Mtb 在組織中標定則先將封片組織在 60 ℃下加熱,接續以 xylene 清洗,再利
用酒精以梯度濃度將組織脫水,以 auramine-rhodamine 在 37 ℃下 15 分鐘進行
染色,以 1 %氫氯酸/70 %乙醇清洗,以 Harris’modified haematoxylin 進行複染,
再以酸性及鹼性溶液進行清洗。
結果與討論
利用 in vivo 實驗證實 Rv2224c 影響 Mtb 在宿主生長
先前研究中 Rv2224c 己證實為細胞外膜的脂蛋白,同時具有水解酶的催化活性
(圖一),由於許多病原細胞表面蛋白會調節宿主反應並影響生長,因此作者希
望研究 Rv2224c 在感染過程中所扮演角色,實驗利用以轉座子插入 Rv2224c 產
生的 Rv2224c::tn 突變株進行,圖二 A 中可見在競爭性感染的情況下,突變株
生長能力較野生型來的差。而在圖二 B 則可見,在混合感染中加入 full-length
Rv2224c 蛋白後(黑柱),突變株的繁殖數量上升,但在加入 S228A Rv2224c 後(點
柱),突變株的感染能力反而大幅下降,綜合以上可證實 Rv2224c 對於 Mtb 在
巨噬細胞中生長能力扮演重要角色。
Rv2224c 的破壞可增長小鼠存活時間,並降低免疫病理反應
分別以野生型及 Rv2224c::tn 感染 C54BL/6 小鼠,由圖三 A、B 可見以野生型
感染產生的 cfus 數量較多。而在圖三 C 可見受到野生型感染的小鼠存活時間
較短,中位數僅 196 天,而受突變株感染小鼠存活中位數可達 336 天。另外在
組織染色結果中,也可見受野生型感染小鼠其肺部浸潤現象嚴重,而受突變株
感染小鼠較輕微,所保有的肺泡空腔較大。
Rv2224c 會影響宿主先天免疫反應
利用 RAG -/- 小鼠進行感染(缺乏正常功能 T 和 B 細胞,相當於適應性免疫能力
喪失),可見經由皮下或吸入性感染的小鼠,不論是野生型或是突變株,存活
3

中位天數均大幅下降(皮下注射:wt 37 天,突變株 64 天;吸入性感染:wt 50 天,
突變株 84 天,圖四 AB),另外經突變株感染小鼠存活時間較野生型感染小鼠
來得長。而在圖四 C 可見在小鼠死亡後,對於野生型及突變株感染產生的 cfu
數目上即無差異,綜合以上結果,可證實 Rv2224c 和 Mtb 在巨噬細胞內抵抗先
天免疫反應的能力有關,並未對 Mtb 本身複製能力造成影響。
接續由圖五 A 的 in vitro 實驗證實 Rv2224c 對 Mtb 在巨噬細胞中生長能力的影
響,並量測兩種情況下由巨噬細胞分泌多種細胞因子和趨化因子的胞外濃度差
異,證實 Rv2224c 會影響受感染巨噬細胞的發炎反應。而在圖五 C 可發現突
變株對於溶菌酶的抵抗能力有所下降,推測為前述實驗中突變株感染巨噬細胞
後產生 cfus 較少之原因。
Rv2224c 參與 Mtb 熱休克蛋白 GroEL2 的轉譯後修飾
由於 Rv2224c 為位於 Mtb 細胞外膜的水解酶,推測可幫助其他表面蛋白的釋
放。由圖六 A、B 證實,GroEL2 存在於細胞外膜,經 Rv2224c 修飾後產生較
小片段蛋白(活化型)而釋放。在圖六 C 可見加入 wt Rv2224c 及調控子
(Rv2223c+Rv2224c)後,可以恢復修飾 GroEL2 的能力,但在 S228A 及 C31A
Rv2224c mutant 的加入則無法恢復此能力,可證實 GroEL2 胞外釋放需要水解
酶 Rv2224c 切割活性的調節。配合前述實驗結果,證實 Rv2224c 透過參與
GroEL2 修飾釋放,影響免疫反應,造成慢性發炎並在肺部形成肉芽瘤,長期
可能導致宿主發病而死亡。
參考文獻
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Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2001. 2:569-77.
[2] Bhatt K, Salgame P. Host innate immune response to Mycobacterium
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[3] Houben EN, Nguyen L, Pieters J. Interaction of pathogenic mycobacteria with
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[7] Qamra R, Mande, Coates AR, Henderson B. The unusual chaperonins of
Mycobacterium tuberculosis. Tuberculosis (Edinburgh).2005. 85:385–394.
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圖表
圖一、Rv2224c是位於細胞膜的水解酶。(A)藉由N-terminal type II signal peptide
預測Rc2224c為脂蛋白,在N端有lysine和/或arginine;而在H region有hydrophobic
residue。位於lipobox residue 31內的cysteine被認為是脂蛋白接合位置。而Rv2224c
擁有α/β fold序列以及一般存在於serine proteases、esterases、lipases的催化鐵三角
(S228 -D463-H490) (B)利用M. bovis bacillus Calmette-Guérin 表現的myc-tagged
Rv2224c、GroEL1和Ag85蛋白。1~4代表細胞不同部份進行蛋白質標定:1為全
細胞萃取物、2為細胞壁、3為細胞質、4為細胞膜。
圖二、Rv2224c影響Mtb在in vivo生長。(A)分別以5 x 10 5 cfus混合感染(1:1,wild
type:Rv2224c::tn) C57BL/6小鼠(皮下注射),而在1、7、28、56天計算cfus,數
據以相較於day1 cfu數目的對數倍數呈現 (B)由左至右:灰柱(wild type:
Rv2224c::tn)、黑柱(wild type:Rv2224c::tn+2224c)、點柱(wild type:Rv2224c::tn+
S228A),分別以上述三種形式進行in vivo的混合感染,在感染後第1和28日後計
算肺部的cfu數,以mutant/wild type的對數值來呈現。
5

圖三、Rv2224c 對小鼠存活率之影響 (A)(B)分別以野生型及 Rv2224c::tn 感染
C54BL/6 小鼠並在不同天數計算肺部和脾臟的 cfus,數據以相較於 day1 cfu 數目
的對數倍數呈現 (C)以野生型及 Rv2224c::tn 感染 C54BL/6 小鼠的存活天數。
圖四、利用 RAG -/- 小鼠證實 Rv2224c 調控宿主先天免疫反應。(A)(B)存活下來的
RAG -/- 小鼠分別被 2 x 10 6 cfus 的野生型和 Rv2224c::tn Mtb strain 所感染,A 皮下
注射、B 吸入感染 (C)以野生型和 Rv2224c::tn Mtb strain 吸入感染 RAG -/- 小鼠分
別在不同天數產生的 cfu 數目。
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圖五、Rv2224c 為 Mtb 在巨噬細胞中生長所必需。(A)巨噬細胞與 Mtb 1:1 進行感
染,在 1、3、5、7 天細胞溶離計算 cfu 數目 (B)感染 48 小時後,巨噬細胞多種
細胞因子和趨化因子的分泌量 (C)在不同溶菌酶濃度下分別以野生型和
Rv2224c::tn Mtb strain 感染的巨噬細胞存活比例(感染的巨噬細胞 cfu 數/未感染的
巨噬細胞 cfu 數)。
圖六、Rv2224c 與 GroEL2 的調控關係。(A)以西方墨點法分析遭感染巨噬細胞
的 GroEL2 及 GroEL1 蛋白質表現,P 為 whole-cell pellets;S 為 culture supernatant。
在 S 可見 GroEL2 存在,而在野生型中大部份 GroEL2 會被切割成較小片段釋
放,但在 Rv2224c::tn 中 S 的 GroEL2 則大多以較大片段形式(未受切割)存在;
GroEL1 則明顯表現在兩者的 P 中,未出現於 S (B)在 M. bovis bacillus
Calmette-Guérin 中不同細胞部份的蛋白質表現,1~4 代表不同細胞部份進行蛋白
質標定:1 為全細胞萃取物、2 為細胞壁、3 為細胞質、4 為細胞膜。可見 GroEL2
在 2、3、4 均有出現,而 GroEL1 主要出現在 3 (C)利用互補作用觀察 Rv2224c::tn
對於將 GroEL2 切割成較小蛋白質片段的影響,由左至右分別加入 wild-type
Rv2224c、S228A 的 mutant Rv2224c、C31A 的 mutant Rv2224c、以及同時帶有
Rv2223c 及 Rv2224c 的操縱子。
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