Ricordare il futuro - Universita' degli Studi "Magna Graecia"

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1. UNITÀ PER LO STUDIO DI SERPINE E PROTEASI A SERINA NELLA PROLIFERAZIONE E DIFFERENZIAMENTO CELLULARE Coordinatore dell’Unità: Rosaria Arcone (Professore Associato, SSD BIO/10- Biochimica). Componenti dell’Unità: Mario Masullo (Professore Associato, SSD BIO/10- Biochimica), Maddalena Parafati (Dottoranda Scienze Farmaceutiche). Collaborazioni: Dipartimento di Biochimica e Biotecnologie Mediche, Università Federico II di Napoli; Dipartimento di Scienze Farmaceutiche, Università di Padova. Studio del ruolo della Nexina-1 (PN-1) nella proliferazione e differenziamento di cellule di glioma e neuroblastoma. La modulazione dell’attività delle proteasi a serina extracellulari, i cui effetti sono mediati dall’attivazione proteolitica di recettori (PARs), è fondamentale nell’omeostasi di molti processi fisiologici. Numerose evidenze indicano che un’alterazione dell’equilibrio proteasi-inibitore può contribuire all’instaurarsi di una condizione patologica. La Proteasi Nexina-1 (PN-1), un membro della super-famiglia di Inibitori di Proteasi a Serina (SERPINE), a cui appartengono proteine estremamente conservate, inibisce proteasi tra cui la Plasmina, l’Attivatore del Plasminogeno tipo Urochinasi e la Trombina. La PN-1, abbondantemente espressa nel cervello, è il principale inibitore fisiologico della Trombina, una proteasi della coagulazione, che contribuisce alla fisiopatologia del Sistema Nervoso Centrale (SNC) modulando il fenotipo cellulare di neuroni ed inducendo la proliferazione di astrociti. Numerose evidenze suggeriscono che la PN-1 svolge un ruolo nella neuroprotezione inibendo la Trombina liberata in seguito a danni tissutali. Inoltre, recentemente è stato riportato un coinvolgimento della PN-1 nello sviluppo di alcuni tipi di tumori. La nostra linea di ricerca è rivolta alla comprensione del meccanismo di regolazione di fattori che controllano l’equilibrio tra proliferazione e differenziamento cellulare analizzando le interazioni serpina- proteasi ed il ruolo della PN-1. Sono stati messi a punto sistemi d’espressione che hanno consentito l’ottenimento della PN-1, della Trombina e suoi mutanti con attività enzimatica alterata, per poterne analizzare le loro interazioni in vitro e valutare le proprietà cellulari. I risultati hanno dimostrato che la PN-1 è in grado d’inibire la Trombina formando complessi inibitore-proteasi, confermando il meccanismo d’inibizione delle serpine del tipo substrato suicida. E’ stata inoltre osservata una stretta correlazione tra l’attività enzimatica della Trombina e la sua proprietà mitogenica e di modulazione del fenotipo cellulare, indicando il coinvolgimento dei recettori PARs. Inoltre, la disponibilità di un sistema d’espressione della PN-1 ricombinante consentirà uno studio strutturale della proteina, di cui non è ancora stata risolta la struttura cristallografica.
Lo studio del ruolo della PN-1 nella proliferazione e differenziamento di cellule nervose è affrontato utilizzando modelli di studio in vitro già convalidati, quali linee cellulari di glioma e di neuroblastoma che esprimomo la serpina e rispondono a vari stimoli di differenziamento, quale deprivazione di siero, trattamento con ciclico AMP o NGF. Sarà utilizzato un approccio che prevede l’inibizione dell’espressione genica basata sull’interferenza con piccoli RNAm (shRNAi) per l’ottenimento di cloni cellulari stabili in cui sia inibita l’espressione della PN-1. I risultati derivanti da questi studi, oltre a fornire informazioni sulla struttura e attività della PN-1, potranno essere utili per la progettazione di nuovi approcci diagnostici e terapeutici dei gliomi umani.
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