Guido Francini 1-101.pdf (3.0 Mb) - Medicina

Immune system and Cancer
Guido Francini MD
Sezione di Oncologia Medica
Dipartimento di Patologia Umana e Oncologia,
Facoltà di Medicina e Chirurgia
Università Universit degli Studi di Siena

A causa della loro instabilità instabilit genetica le cellule tumorali manifestano nel corso
della storia naturale della malattia, progressive alterazioni genotipiche e
fenotipiche che ne permettono la proliferazione, la sopravvivenza, la
metastatizzazione e l’adattamento l adattamento ad un ambiente ostile.
Nelle cellule tumorali compaiono quindi strutture molecolari anomale anomale
o over-
espresse

Immune system and Cancer
Expl’
Antigeni Differenziativi : PSA, PSMA, MAGE, BAGE, etc
Antigeni fetali: CEA, αFP, FP, βHCG, HCG, etc
Strutture Funzionali
mutate: mutate:
p53, K-ras ras, , etc
Strutture Funzionali
over-espresse
over espresse: Growth factor receptors (ERB-B
family), hormones (PTH-rP)
adhesion molecules (EP-CAM-17.A) ,
enzymes (proteases, thymidylate
synthases) and/or the proteins
responsible for drug resistance (PgP,
MRPs and LRP),

IMMUNOTHERAPY
Immunotherapy
ANTIBODIES
PASSIVE ADOPTIVE
ACTIVE
SUBSTITUTIVE
SPECIFIC
ASPECIFIC

I vaccini Antitumorali
e la storia dell’Oncologia
dell Oncologia
Il principio di Jensen della protezione reattiva
indotta con agenti immunizzanti
Coley somministrava tossine batteriche in pazienti oncologici per
generare una risposta immune con attività terapeutica
[Coley W: Further observations upon the treatment of malignant tumors with the toxins of erysipelas
and Bacillus prodigiosus with a report of 160 cases. Bull Johns Hopkins Hospital 7:157, 1896]
Paul Ehrlich (1908) produceva vaccini antitumorali con estratti di cellule
tumorali capaci di prevenire la comparsa di tumori cutanei in modelli
murini
[Ehrlich P: Üer den jetzigen Stand der Karzinomforschumg. Ned Tijdschr Geneesk 53:273-290, 1909].

Immunotherapy
A new era
Rosenberg SA High-dose IL-2 +/- LAK cells
Induzione di risposte obbiettive e lunghe
sopravvivenze in 15% to 20% di pazienti con
melanoma e carcinoma renale metastatico
Rare risposte in pazienti con linfoma di Hodgkin e
non-Hodgkin's, non–small cell lung cancer,
carcinoma colorettale e carcinoma ovarico

Immune system and Cancer
Le cellule T (CD3 +) sono indispensabili per
un’efficiente reazione immune anti-tumorale
Il rigetto tumorale è dipendente dai linfociti CD8 +
T citotossici (CTL).
I linfociti T CD4 + sono considerati come
immunomodulatori che possono sostenere o
ostacolare la risposta CTL
(enhancers and regulators).

I linfociti T riconoscono (mediante T cell receptor) receptor)
antigeni
bersaglio come piccoli peptidi legati a molecole HLA
IL-4 IL
IL-10 IL 10
IL-2 IL
IL-12 IL 12
IFN-γ IFN
Inhibitors
Enhancers

L’interazione interazione del T-Cell Cell Receptor con i
peptidi antigenici determina il rilascio di
mediatori citotossici

Per montare una efficiente risposta immunitaria è necessario che si attivi
la proliferazione dei precursori CTLs antigene specifici.
Tale attivazione è indotta solo dalla contemporanea stimolazione del T
cell receptor e dei contro-recettori contro recettori di molecole co-stimolatorie
co stimolatorie promossa
da cellule presentanti l’antigene antigene (APC) e non da cellule tumorali bersaglio

Le molecole Co-stimolatorie
Co stimolatorie sono fortemente espresse in cellule
dendritiche, dendritiche,
che sono capaci di prelevare, processare e presentare ai
Cell-surface CTL antigeni rilasciati da molecules
cellule tumorali

Immune system and Cancer
Il messaggio è :
“…la generazione di una efficiente risposta
immune dipende dalla abilità dell’agente
immunizzante di trasportare l’antigene o gli
antigeni bersaglio alle cellule presentanti
l’antigene e alle cellule dendritiche”

Miglioramento delle strategie
Targeting di antigeni con attività funzionale
• Parathyroid Hormone Related peptide (PTH-rP)
• Thymidylate Synthase (TS)
Sensibilizzazione delle cellule tumorali
• Upregulating target antigens (5-FU, Triazenes,
gemcitabine, Hormones)
Strategie combinate
• Chemo-immunotherapy
• Multicytokine combination
vacciniche

Improvement of Active Specific
Immunotherapy
Generazione di costrutti vaccinici più efficienti
• Geni di antigeni bersaglio inclusi nel “Immune Reconstituted
Influenza Virosome (IRIV) (PTH-rP, CEA, etc.)
(Correale P… and Francini G, Eur J Cancer 37(16):2097-2103, 2001;
Correale P…and Francini G, Br J Cancer 89(1):199-205 2003. ).
• Peptidi multiepitopici (PSA, TS)
• Immune-enhancers (IRIV contenete il gene della molecola
co-accessoria CD40 ligand da usare in combinazione con
vaccini antitumorali)
• (Correale P, and Francini G….J Immunol in press 2005)

PTH-rP directed vaccines
Generazione di vaccini peptidici capaci di
generare una risposta CTL e TIL umana con
attività attivit antitumorale in vitro verso cellule di
carcinoma prostatico autologhe e HLA-A2 HLA A2.1+ .1+
producenti PTH-rP PTH rP.
Tali vaccini peptidici esercitavano anche attività attivit
antitumorale in topi HHD (transgenici
( transgenici per
espressione di molecole HLA-A2 HLA A2.1 .1) ) inoculati con
cellule tumorali producenti PTH-rP PTH rP. .
(Francini Francini G…and and Correale P, J Immunol, Immunol,
169:4840-4849, 169:4840 4849, 2002)
Specific Release (%)
Antigen Specific Cytotoxic Activity of human TIL
stimulated in vitro with IL-2 and PTR-4 peptide
pulsed autologous dendritic cells
60
50
40
30
20
10
0
1:1 5:1 12.5:1 25:1
E:T Ratio
CIR-A2
CIR-A2 + PTR-4
M-CaP
M-CaP + A2.69
LNCaP
SW1463

Chemo-immunotherapy
La chemioterapia determina una rapida
riduzione della massa tumorale che è
immuno-soppressiva
immuno soppressiva
Diversi farmaci come il 5-FU 5 FU cambiano il
fenotipo delle cellule tumorali ed
inducono over-espressione
over espressione di antigeni
come CEA e TS

Chemo-immunotherapy
Effects of chemotherapy on human immune-system
immune system
La chemioterapia è mielotossica e riduce la
risposta granulocitaria ad infezioni batteriche e
micotiche
Non sono noti gli effetti della chemioterapia sulla
ipersensibilità ritardata o sui CTL attivati
Diversi farmaci sono stati utilizzati in
combinazione con trattamenti immunologici in
modelli terapeutici murini

Chemo-immunotherapy
Fluorouracil (5-FU) (5 FU) enhances the susceptibility
of colon and breast carcinoma cells to human
carcino embryonic (CEA) peptide specific
Cytotoxic T cells in vitro
(Correale Correale P., and Francini G. Int J Cancer. 2003,104(4):437-45.)
2003,104(4):437 45.)

Generazione di linee CTL umane CEA specifiche
PBMC
Dendritic Cells
+
CEA Peptide
+
GM-CSF + IL4
Low dose IL2
New Cycle of in vitro stimulation
Day: 1-5 1
Day: 6-15 6 15
Day: 16

Linee CTL CEA-specifiche
CEA specifiche umane lisano cellule producenti CEA
derivate da carcinoma mammario (MDA-MB (MDA MB-231) 231) e
del colon (A2-HT (A2 HT-29) 29) in vitro
Il 5-Fluorouracile
5 Fluorouracile aumenta la sensibilità sensibilit delle cellule tumorali ai
CTL CEA specifici

5-Fluorouracile,
Fluorouracile, oxaliplatino, oxaliplatino,
e gemcitabina somministrati
dopo stimolazione in vitro non riducono l’attivit l attività citotossica
dei CTL CEA specifici contro cellule di carcinoma
mammario (MDA-MB-231)
Specific Release (%)
CTLs exposed to cytotoxic drugs before the in vitro stimulation
40
30
20
10
0
25/1. 12,5/1. 6,25/1. 1/1.
E/T Ratio
Linee linfocitarie esposte a
chemioterapia 10 giorni dopo dopo la
stimolazione in vitro con I peptidi
Specific Release (%)
CTLs exposed to cytotoxic drugs during the in vitro stimulation
40
30
20
10
0
25/1. 12,5/1. 6,25/1. 1/1.
E/T Ratio
Linee linfocitarie esposte a
chemioterapia durante la
stimolazione in vitro con I peptidi

Percent of fluorescent cells .
5-Fluorouracile,
Fluorouracile, oxaliplatino, oxaliplatino,
e gemcitabina riducono l’espressione di
linfociti immuno-soppressivi
T regulator (CD4+CD25+)
Immunephenotype of CEAP-1 specific CTL lines
exposed to different cytotoxic drugs
60
40
20
0
CTR mAb
CD4+/CD25+
CD8+
CD4+
CEAP-1 CTR
CEAP-1 5-FU
CEAP-1 OXA
CEAP-1 GEM
Percent of fluorescent cells .
60
40
20
0
Immunephenotype of CEAP-2 specific CTL lines
exposed to different cytotoxic drugs
CTR mAb
CD4+/CD25+
CD8+
CD4+
CEAP-2 CTR
CEAP-2 5-FU
CEAP-2 OXA
CEAP-2 GEM
Percent of fluorescent cells .
60
40
20
0
Immunephenotype of CAP-1 specific CTL lines
exposed to different cytotoxic drugs
CTR mAb
CD4+/CD25+
Linee linfocitarie esposte a chemioterapia 10 giorni dopo la
stimolazione in vitro con i peptidi
CD8+
CD4+
CAP-1 CTR
CAP-1 5-FU
CAP-1 OXA
CAP-1 GEM

Conclusions
Il 5-FU 5 FU sensibilizza cellule di carcinoma del colon e
della mammella all’effetto all effetto citotossico di CTL CEA-
specifici inducendo over espressione di CEA nelle
cellule bersaglio.
Il 5-FU, 5 FU, GEA, e OXA aumentano l’attivit l attività litica in vitro di
tali CTL, determinando la distruzione dei linfociti T
Immunoregulatori (CD4+CD25+ T cells). cells
).

Chemo-immunotherapy
5-fluorouracil
fluorouracil-based based-chemotherapy
chemotherapy
enhances the anti-tumor anti tumor activity of a novel
thymidylate synthase-directed synthase directed poly-epitopic
poly epitopic
peptide-vaccine
peptide vaccine
(Correale P. …, Francini G, J Natl Cancer Inst, in press August 2005)

Thymidylate Synthase (TS)
La TS è un enzima critico per la sintesi di Timidina e per
duplicazione del DNA. Nelle cellule normali è espressa solo
durante la fase S del ciclo cellulare.
La TS è inibita dal 5-FU che tuttavia ne aumenta
l’espressione nelle cellule bersaglio per un fenomeno di
Feed back

Il TS/PP è un nuovo vaccino poli-peptidico
poli peptidico che contiene diversi noti epitopi
della TS con capacità capacit legante molecole HLA-A2 HLA A2.1 .1

Linee CTL TS-specifiche
TS specifiche umane lisano cellule che over-espimono
over espimono TS
derivate da carcinoma mammario (MDA-MB (MDA MB-231) 231)
e del colon (A2-HT (A2 HT-29) 29) in vitro
Il 5-Fluorouracile
5 Fluorouracile aumenta la sensibilità sensibilit delle cellule tumorali
ai CTL TS specifici

L’efficacia efficacia anti-tumorale anti tumorale della vaccinazione con TS/PP di topi
transgenici HHD (HLA-A2 (HLA A2.1+ .1+) ) inoculati con cellule tumorali
autologhe è aumentata dal trattamento chemioterapico con 5-FU 5 FU

L’efficacia anti-tumorale della vaccinazione con TS/PP di topi transgenici HHD
(HLA-A2.1+) inoculati con cellule tumorali autologhe è aumentata dal
trattamento chemioterapico con 5-FU (studio immunoistochimico- TS immuno-staining)

Conclusioni
TS/PP può essere utilizzato per generare una
risposta CTL multi-epitopica verso TS in vitro e in
topi HHD.
Il 5-FU sensibilizza cellule di carcinoma del colon
e della mammella all’effetto citotossico di CTL
TS-specifici inducendo over espressione di TS
nelle cellule bersaglio.
Il 5-FU aumenta l’efficacia della vaccinazione con
TS/PP di topi HHD inoculati con cellule autologhe
di linfoma.

Chemo-immunotherapy
Dendritic cell (DC)-mediated Cross-presentation of
Antigens derived from colon carcinoma cells
exposed to an highly cytotoxic multi-drug regimen
with gemcitabine, oxaliplatin, 5-fluorouracil and
leucovorin (GOLF), elicits a powerful Human
antigen-specific CTL response with anti-tumor
activity in vitro.
(Correale P, …. and Francini G. J Immunol in press)

Chemo-immunotherapy
Il regime di poli-chemioterapia GOLF (gemcitabina +
oxaliplatino + LV + 5-FU) determina una potente attività
citotossica e pro-apoptotica in cellule di carcinoma
del colon in vitro. Tale combinazione induce
alterazioni fenotipiche che includono un’aumentata
espressione di CEA, TS e heat shock proteins
Ci siamo quindi chiesti se cellule di carcinoma del colon
esposte a chemioterapia GOLF potevano essere utilizzate
come strumento vaccinico per generare una più efficiente
risposta linfocitaria T citotossica

Chemo-immunotherapy

CTR VP16 GEM
FOLFOX FOLFIRI
GOLF
GILF
Le cellule tumorali sono
state esposte a FITCconjugated-Annexin
V
(fluorescenza verde) e
propidium iodide
(fluorescenza rossa).
Le cellule di carcinoma
del colon (HT-29) in
apoptosi in avanzato stato
di degenerzione
acquistano una
fluorescenza giallo –
rosso.

Generazione di linee CTL umane con lisato di cellule di carcinoma del colon
PBMC
Dendritic Cells
+
Lysate of colon cancer cells
+
GM-CSF + IL4
Low dose IL2
1 or 2
New Cycle of in vitro stimulation
Day: 1-5 1
Day: 6-15 6 15
Day: 16

Linee CTL immunizzate in vitro con lisato di cellule di carcinoma del colon
(GOLF-CTLs) esercitano rispetto ai controlli (CTR-CTL) un’aumentata attività
citotossica verso cellule di carcinoma del colon (A2-WiDr and SW-1463)

Chemo-immunotherapy
Abbiamo ipotizzato che il regime GOLF
aumenti nelle cellule tumorali necrotiche ed
apoptotiche l’espressione espressione ed il rilascio di
antigeni come CEA e TS, e heat shock
proteins che attivano un messaggio di
pericolo (danger ( danger signal) signal)
nelle cellule
dedritiche riceventi e nei CTL

Chemo-immunotherapy
A Phase II Trial:
Chemoimmunotherapy of advanced colorectal
carcinoma with
GOLF polychemotherapy followed by sc administration
of GM-CSF GM CSF and low dose IL-2. IL 2.
(GOLFIG-1 (GOLFIG 1 Trial)
(Correale P , … and Francini G. J Clin Oncol, In press, December 2005)

Chemo-immunotherapy
In questo studio, abbiamo investigato in pazienti con
carcinoma del colon metastatico, l’attività immunologica
e anti-tumorale e la tossicità del regime polichemioterapico
GOLF associato alla somministrazione
sequenziale di GM-CSF e IL-2

GOLFIG
�GOLF [Correale P,…and Francini G. BJC 90:1710-14, 2004]
• gemcitabine
• oxaliplatin
• folinic acid
• 5-FU
�IG-1 [Correale P, …, and Francini G. EJC 37:892:902, 2001]
• GM-CSF
• Low dose IL-2

a GOLF
chemotherapy
Schedule treatment
Days 1-2, 16-17 Days 3-7 Days 8-15, 18-30
XXXXXXXXXXx
XxxxxxxxxxxxxxX
b GM-CSF XXXXXXXX
XXXXXXXX
c Proleukin XXXXXXXXXX
XXXXXXXXXX
a GOLF = gemcitabine, 1g /m 2 ; oxaliplatin, 85 mg/m 2 ;
levofolinic acid, 100mg/m 2 ; bolus 5-fluorouracil, 400
mg/m 2 ; 24 h infusion 5-fluorouracil 800 mg/m 2
b GM-CSF = Molgramostim, 150 µg/day /Salgramostim
100 µg/day
c Proleukin = Aldesleukin, 500,000 IU x 2 day

Chemotherapy
GM-CSF
Rationale
IL-2
CTL

Characteristics
Patients evaluable for response
Patients evaluable for toxicity
Sex
Male
Female
Performance status (ECOG)
Disease extension
A Liver
B No liver (Bone + lung +
peritoneum + ovary)
Previous chemotherapy
Number of
Patients
31
32
18
14
0 – 2
The median age of the patients was 69 years (range 44-84).
20
12
23

Hematological
Anemia
Neutropenia
Thrombocytopenia
Gastroenteric toxicity
Nausea/vomiting
Diarrhea
Mucositis
Transaminase elevation
Fever
Asthenia
Anorexia
Neurological toxicity
Arrhythmia
Hypersensitivity
World Health Organization (WHO) Toxicities
Number of
events (%)
13 (44.8%)
5 (17.2%)
3 (10.3%)
6 (20.7%)
8 (27.6%)
2 (6.9%)
5 (17.2%)
6 (20.7%)
None
19 (6.9%)
2 (6.9%)
None
7 (24.1%)
1 (3.45 %)
4 (13.8%)
Grade 1
N (%)
2 (6.9 %)
3
(10.3%)
1
(3.45%)
2 (6.98%)
3 (10.3%)
8
(27.6%)
1
(3.45%)
1 (3.45%)
Grade 2
N (%)
2 (6.9%)
3
(10.3%)
1
(3.45%)
8
(27.6%)
7
(24.1%)
1 (3.4%)
Grade 3
N (%)
1 (3.45%)
3
(10.3%)
2 (6.9%)
2 (6.9%)
1 (3.45%)
1 (3.45%)
1 (3.45%)
Grade 4
N (%)
1 (3.45%)
1 (3.44%)
1 (3.45%)
1 (3.45%)
1) (3.45%)
A total of 240 chemotherapy cycles were administered (a median range of eight cycles per patient)

N°
%
Clinical response of advanced colorectal cancer
patients to GOLF-IG GOLF IG chemo-immunotherapy
chemo immunotherapy
Patients
32
100%
NV
1
3.1%
PD
0
0
CR
7
21.9%
PR
17
53%
SD
7
22%
OR
(CR+PR)
75%
DCR
(OR+SD)
96.9%
PD = Progressive Disease, CR =Complete Response, PR =Partial
Response, SD =Stable Disease, OR=Over all Response Rate,
DCR=Disease Control Rate,
NE = non evaluable for response; *one patient was not evaluable
for early death at the first cycle. The median time to progression
and overall survival were respectively 12 and 27 months.

C
A
FQ
B
D
PC

Clinical response of advanced colorectal cancer
patients to GOLF chemotherapy
Number
29
100%
(Correale Correale P,.. And Francini G, Br J Cancer. 2004 May 4;90(9):1710-4 4;90(9):1710 )
NE
1
3.4%
PD
6
20.7%
CR
3
10.3%
PR
9
31.2%
34.4%
CR+PR
41.5%
OR+SD
75.9%
PD = Progressive Disease, CR =Complete Response, PR =Partial
Response, SD =Stable Disease, OR=Over all Response Rate,
DCR=Disease Control Rate,
NE = non evaluable for response; *three patients because had
not completed at least three cycles and one for early death at the
first cycle. The time to progression was 7.26 months.
SD
10
OR
DCR

Chemo-immunotherapy
.

Il regime GOLFIG-1 aumenta in pazienti con carcinoma
del colon metastatico una risposta proliferativa dei
PBMC, in presenza materiale antigenico estratto da
cellule di carcinoma del colon

Il regime GOLFIG-1 aumenta nei pazienti trattati la
percentuale di precursori linfocitari con alta espressione
di recettore (T cell receptor) specifico per noti epitopi
peptidici di TS e CEA
Results are expressed as percentage of positive cells (%) / mean fluorescence intensity per cell

Il regime GOLFIG-1 riduce l’espressione di linfociti
immuno-soppressivi [T regulator (CD4+CD25+)] e linfociti
sensibili alla lisi indotta da FAS (CD3+CD95+)
Percent of fluorescent cells
50
40
30
20
10
0
Figure 3: An immunocytoflorimetric analysis
CTR
CD4+CD25+Treg/ PBMCs
Lymphocyte subset
CD4+CD25+Treg/ CD4+
CD3+CD95+/ PBMCs
Normal donors' PBMCs
Baseline PBMCs
Post-Day 30 PBMCs
Results are expressed as percentage of positive cells (%)

Il regime GOLFIG-1 aumenta nei pazienti trattati il rapporto
CD4/CD8 ripristinandone l’immunocompetenza
CD4+/CD8+ Tcell ratio
1,5
0,5
Figure 4: Modifications of CD4+/CD8+ T cell ratio
3
2,5
2
1
0
Normal
donors'
PBMCs
Baseline
PBMCs
Post-Day 30
PBMCs
Normal donors' PBMCs
Baseline PBMCs
Post-Day 30 PBMCs

Chemo-immunotherapy
I nostri risultati dimostrano che la chemioterapia
GOLF modula l’espressione e la presentazione
antigenica anche in pazienti con carcinoma del
colon e producono il razionale clinico per testare
la combinazione chemio-immunoterapica
GOLFIG in uno studio randomizzato di Fase III in
pazienti con carcinoma del colon metastatico

Chemo-immunotherapy
Many Many thanks to..
• Pierpaolo Correale, Correale Marco La Placa, Cinzia Remondo, Francesco Montagnani, Stefania
Marsili, Alessandra Pascucci, Angela Sciandivasci, Loretta Paolelli and the Nurse Team
Sezione di Oncologia Medica, Dipartimento di Patologia Umana e Oncologia; Università di
Siena
• Maria Grazia Cusi and her group, Sezione di Virologia, Dipartimento di Biologia
Molecolare; Università di Siena
• Maria Teresa del Vecchio, Vecchio Sezione di Anatomia Patologica, Dipartimento di Patologia Umana
e Oncologia; Università di Siena
• Giorgio Giorgi, Lucia Micheli, Cristina Nencini, Dipartimento “Giorgio Segre” di
Farmacologia; Università di Siena
• Enzo Bonmassar, Bonmassar and Angelo Aquino, Università di Roma “Tor Vergata”;
• Michele Caraglia Istituto Tumori di Napoli, Fondazione “Pascale”;
• Jeffrey Schlom e Kwong Y Tsang, Tsang LTIB, NCI, NIH, Bethesda MD, USA;
• Kostas Kosmatopoulus e Antonio Scardino INSERM, Villejuiff, France;
• Fracois Lemonnier Ist Pasteur, Paris France;
• Rinaldo Zurbriggen, Zurbriggen Pevion Corp, Berna, Swiss.

Agisci in modo da
trattare l’uomo
sempre come fine e
mai come mezzo
[I. Kant, Critica della ragion
pratica -1787]