Profilassi vaccinale nella trota iridea (Oncorhynchus mykiss) contro ...

Profilassi vaccinale nella trota
iridea (Oncorhynchus mykiss)
contro la lattococcosi
Dott. Marino PREARO
Istituto Zooprofilattico Sperimentale del Piemonte, Liguria e Valle d’Aosta
Laboratorio di Ittiopatologia e Acquacoltura
Via Bologna, 148 – 10154 TORINO
Workshop “Profilassi vaccinale in pescicoltura: stato dell’arte e prospettive”
Trieste, 10 luglio 2008

Argomenti trattati:
* 1 - INTRODUZIONE – La lattococcosi nella trota iridea
* 2 - CENNI STORICI SULLA VACCINAZIONE IN ITALIA
* 3 - PREPARAZIONI VACCINALI
* 4 - MODALITA’ DI VACCINAZIONE
* 5 - PRODUZIONE DI UN VACCINO

1
INTRODUZIONE
La lattococcosi nella trota iridea

STREPTOCOCCOSI ITTICHE
Streptococcosi d’acqua calda:
15° C
Lactococcus garvieae
Streptococcus iniae
Streptococcus agalactiae
Streptococcus parauberis
Streptococcosi d’acqua fredda:
Vagococcus salmoninarum
Lactococcus piscium
Carnobacterium piscicola

STREPTOCOCCOSI ITTICHE
SP
SP
L
V C C
L
V
C
L
V
L
L
C
L L
L
SA
SI
L

STREPTOCOCCOSI ITTICHE
II° livello di diagnosi
I° livello di diagnosi
La sintomatologia in vasca permette di
formulare un sospetto di streptococcosi ittica.
Il quadro anatomopatologico può far formulare un
sospetto di malattia con eziologia ben precisa
(lattococcosi, streptococcosi o vagococcosi).
IV° livello di diagnosi
Le prove sierologiche e
maggiormente quelle
biomolecolari (PCR) permettono
di confermare l’eziologia
(diagnosi specifica)
III° livello di diagnosi
Le prove colturali, fenotipiche e
biochimiche permettono di
formulare con buon livello di
attendibilità l’eziologia della
malattia.

STREPTOCOCCOSI ITTICHE
Tutte le patologie sostenute dalle specie afferenti a
questa grande categoria, presentano delle
caratteristiche comuni, abbastanza peculiari rispetto
alle altre malattie che colpiscono le specie ittiche:
causano una precoce anoressia dei
soggetti colpiti;
i pesci si presentano letargici, con
evidente melanosi e marcato esoftalmo
mono o bilaterale;
vengono colpiti soprattutto pesci prossimi
alla taglia commerciale, risparmiando in parte
i soggetti giovani (novellame).

1 bis
LA LATTOCOCCOSI
(Lactococcus garvieae)

LATTOCOCCOSI - 1
La lattococcosi rappresenta la patologia maggiormente
diffusa in troticoltura di pianura. E’ da considerarsi la
patologia preminente durante la stagione primaverileestivo-autunnale
nella maggior parte degli impianti che
utilizzano acque superficiali.
Presenta una diffusione cosmopolita e colpisce
sia specie dulciacquicole che marine; è stata
descritta in Nord-America, Australia, Asia,
Sudafrica ed Europa.
Tale patologia colpisce elettivamente
soggetti subadulti ed adulti, di taglia
superiore agli 20 g., allevati in acque con
temperature intorno ai 16-18° C.

LATTOCOCCOSI - 2
La Lattococcosi dà luogo ad una infezione a
carattere iperacuto-acuto, con perdite annue
che possono raggiungere il 80-90%.
E’ caratterizzata da un andamento a macchia
d’olio, in cui l’infezione si propaga molto
velocemente a tutti gli individui presenti nella
vasca e nelle vasche vicine alimentate con la
stessa fonte idrica.

LATTOCOCCOSI - 3
La virulenza del germe per la trota iridea è
stata valutata mediante prove di infezione
sperimentale e calcolo della DL 50 .
L’inoculazione tramite iniezione
intraperitoneale ha permesso di valutare la
virulenza del ceppo che è presente sul
territorio nazionale, con una DL 50 di poco
superiore a 10 2 ufc/pesce.
La mortalità del 50% dei soggetti inoculati con tale
concentrazione, è completa al 4-5° giorno
post-inoculazione, con manifestazioni cliniche
evidentissime; dapprima insorge una completa anoressia già
in prima giornata, seguita dalle manifestazioni
sintomatologiche tipiche quali esoftalmo e melanosi dopo
36-48 ore p.i.; la mortalità compare già in 3° giornata
(mortalità 25-30%).

LATTOCOCCOSI - 4
La sintomatologia in vasca è tipica delle
streptococcosi ittiche, con anoressia, letargia,
melanosi, esoftalmo bilaterale evidente,
spesso con completa protrusione oculare e
complicato dalla rottura dei globi oculari.

LATTOCOCCOSI - 5
L’esame necroscopico mostra il caratteristico
quadro di protrusione oculare con cheratite e
molto spesso rottura dei globi stessi.
Non appare l’anemia branchiale; anzi le
branchie appaiono di un rosso brillante.
Inoltre è presente una evidentissima
congestione cerebrale, idropericardio,
splenomegalia ed evidentissime
emorragie al fegato ed alle sierose.

LATTOCOCCOSI - 6

LATTOCOCCOSI - 7

LATTOCOCCOSI - 8
La terapia risulta essere molto spesso inefficace.
Questo è in parte dovuto alla precoce anoressia che
porta ad una mancata assunzione dell’alimento
medicato ed alle continue ricadute per l’inquinamento
ambientale.
Da studi recenti la ipotizzata antibiotico-resistenza che
si sarebbe sviluppata negli allevamenti, non ha trovato
nessuna conferma da ricerche condotte sulle MIC
utilizzando i farmaci consentiti in acquacoltura e quelli
normalmente usati in farmaco-sorveglianza.

LATTOCOCCOSI - 9
La terapia si basa sull’uso di mangime medicato con
eritromicina, antibiotico d’elezione
Nel tempo la terapia in campo è risultata sempre meno
efficace e tali insuccessi sono stati ascritti a diversi
fattori:
elevata patogenicità del germe
frequenti fenomeni di reinfezione
precoce e totale anoressia dei
soggetti colpiti
antibioticoresistenza

Per quasi tutti i ceppi di L. garvieae isolati negli ultimi cinque anni sul territorio
nazionale, i responsi agli antibiogrammi forniscono dati sempre più scoraggianti,
tanto da far intraprendere da parte dei produttori, una campagna vaccinale che
però ha stentato a decollare.

Sensibilità agli antibiotici
Determinazione delle Minime Concentrazioni Inibenti (MIC)
Le 13 molecole antibiotiche saggiate comprendono sia
quelle impiegate in acquacoltura che quelle solitamente
inserite nei programmi di sorveglianza
dell’antibioticoresistenza europei
• E-test (AB BIODISK)
Benzilpenicillina (PG), Amoxicillina (AC),
Cefalotina (CE), Eritromicina (EM),
Ciprofloxacina (CI), Cloramfenicolo (CL),
Gentamicina (GM), Streptomicina (SM),
Tetraciclina (TC), Rifampicina (RI),
Vancomicina (VA) Trimethoprim-sulfametossazolo(TS)
• MIC in agar
Flumequine (AR)

E-test
Diffusione in agar
Fornisce valori di MIC

Considerando l’andamento delle MIC 90 degli isolati
raggruppati per triennio, ad eccezione della Ciprofloxacina
e del Trimethoprim-sulfametossazolo che hanno mostrato
una evidente riduzione del valore dopo il 1994, non sono
state registrate variazioni di rilievo
L’andamento della sensibilità agli antibiotici ottenuto,
indica una bassa pressione di selezione nel lungo periodo
considerato, ascrivibile probabilmente ad un corretto uso
del farmaco in acquacoltura e all’utilizzo di presidi vaccinali
per il controllo della lattococcosi e di altre patologie ittiche.

2
CENNI STORICI SULLA
VACCINAZIONE IN ITALIA

Specie
Trota iridea
Rombo
chiodato
Trota iridea
Trota iridea
Rombo
chiodato
Ricciola
Trota iridea
Prove sperimentali di vaccinazione
Peso
in g
50
45
150
1360
150
30-260
150-700
Via di
somministrazione
Iniezione
Iniezione
Immersione o
iniezione
Iniezione
Iniezione
Orale
Iniezione
Protezione
> 5 mesi
12 mesi
2.5 mesi
> 5 mesi
RPS
89
89
70
> 80
80
55
> 90
Autore
Ghittino e coll.
1994
Toranzo e coll.
1995
Sakai 1996
Ceschia e coll.
1997
Romalde e coll.
1997
Sano e coll.
1997
Manfrin e coll.,
2004

Gli studi vaccinali contro Lactococcus garvieae
hanno avuto inizio in Italia nel 1994
Vaccini inattivati a base di cellule batteriche
intere (bacterin) con titolo 1,5 x 10 10
cellule/ml
Durata minore – circa 3 mesi
Vaccini adiuvati con oli minerali a diversa formulazione
(w/o e w/o/w) con titolo rispettivamente di 2,5 x 10 9 e
7,5 x 10 9 cellule/ml
Durata superiore – circa 6 mesi

L’efficacia della vaccinazione è stata valutata
ricorrendo a challenge endoperitoneale mensile,
utilizzando dosi di 2 x 10 4 ufc Lg/pesce ed esposizione
naturale all’infezione, direttamente in vasca

Nei primi anni di sperimentazione, sono stati utilizzati esclusivamente vaccini
inattivati senza adiuvante
Con tale utilizzo non si avevano incidenti vaccinali,
mortalità nei primi 4-5 giorni dall’inoculazione e
l’insorgenza dell’immunità era evidente già in seconda
settimana. L’efficacia però risultava ridotta nel tempo, tale
però da coprire la maggior parte del periodo in cui si
manifestava la malattia
Successivamente l’adattamento della patologia alle
nostre condizioni e al conseguente allargamento del
periodo di maggiore mortalità, il vaccino bacterin ha
dimostrato scarsa utilità nella gestione della malattia

Lo studio di formulazioni variamente adiuvate, ha
portato ad un netto miglioramento della durata
dell’immunità, con scarse ricadute verso fine
stagione
Comparsa di mortalità
significativa nei primi giorni
dopo l’inoculazione (anche 5%)
L’uso di oli minerali per potenziare l’azione
immunizzante del vaccino, ha portato comunque
all’insorgenza di numerosi incidenti di percorso, che
a seconda delle partite, potevano essere anche
decisamente importanti
Pesci che faticavano a
riprendere le normali
funzioni vitali
Insorgenza in un numero elevato di soggetti di tenaci
aderenze dei visceri, particolarmente problematica
per i trasformatori

Oltre alle aderenze dei visceri, in un numero inferiore di
soggetti, si aveva la comparsa di aree di necrosi nel punto di
inoculo, che a volte si espandevano lungo la parete ventrale
Questo portava ad un’evidente perdita economica, in quanto
nei casi più eclatanti doveva essere distrutto l’intero pesce,
mentre i quelli meno colpiti, bisognava operare una profonda
toelettatura, con perdite di resa e dispendio di tempo degli
operatori
Risulta molto difficile far combaciare le esigenze di
allevamento e quelle della trasformazione

Nel corso degli ultimi anni è stata studiata una
nuova formulazione adiuvante, utilizzando prodotti
del commercio ma usati per altre specie
L’efficacia risulta essere paragonabile a quella
dimostrata dal vaccino adiuvato con oli minerali,
ma si sono ottenuti dati confortanti dal punto di
vista della produzione e della trasformazione.

3
PREPARAZIONI VACCINALI

I vari isolati di L. garvieae costituiscono
un gruppo geneticamente omogeneo.
Nonostante l’alta omologia genetica
(oltre il 90%), la diversificazione
fenotipica è alta.
Da un’indagine epidemiologica, svolta mediante RFLP
ribotyping, si è potuto dimostrare che l’evoluzione dei
ceppi italiani e spagnoli ha seguito dei percorsi
autonomi. Per quanto riguarda invece i ceppi francesi,
la situazione è alquanto eterogenea.

Ecco perché appare importante utilizzare, per la
situazione italiana, ceppi autoctoni. Infatti, la scarsa
efficacia dimostrata negli anni passati di vaccini
sperimentali provenienti da ditte europee in cui erano
stati utilizzati ceppi diversi da quelli presenti sul
nostro territorio, hanno portato ad insuccessi totali.
E’ per tale motivo che l’utilizzo di vaccini stabulogeni,
oltre che previsti dalla nostra legislazione, hanno
presentato un successo sempre maggiore rispetto alle
sperimentazioni effettuate dalle sopraccitate ditte.

Attualmente, sono a disposizione degli allevatori due
formulazioni vaccinali distinte, entrambi iniettabili
per via intraperitoneale:
VACCINO NON ADIUVATO o BACTERIN
VACCINO ADIUVATO CON OLI MINERALI
La dose iniettabile per soggetto varia da 0,1 a
0,2 ml/capo, in base alle richieste
dell’allevatore.

Dai dati sperimentali condotti nella seconda metà degli
anni ’90, si è potuto evincere come la quantità di batteri
presenti all’interno della dose vaccinale di un vaccino
bacterin, debba essere molto elevata (all’incirca 60 g/litro
per 10.000 dosi iniettabili).
Per quanto riguarda invece la quantità di batteri presenti
all’interno della dose vaccinale di un vaccino adiuvato di
ultima generazione, questa può essere notevolmente più
bassa (da 1/4 a 1/10 rispetto la dose per il bacterin).

L’utilizzo di una formulazione piuttosto che
un’altra deve essere basato su una corretta
gestione dell’allevamento e di un oculato
management.
Infatti, non sempre l’uso di un vaccino adiuvato
può essere la mossa vincente.
La scelta del tipo di vaccino deve essere fatta valutando, la
movimentazione del pesce alla lavorazione, l’andamento
climatico, il regime idrico, ecc.

Ad esempio in allevamenti dove l’approvvigionamento idrico
è parzialmente dovuto ad acqua di pozzo, l’uso di vaccini
adiuvati potrebbe risultare uno spreco sia in termini di
denaro, ma soprattutto in termini di perdite iniziali.
Anche in allevamenti in cui si debbano trattare
riproduttori, dove anche una minima aderenza può
causare delle perdite notevoli, è importante
pianificare una vaccinazione con bacterin, magari in
due cicli successivi o con un richiamo con vaccini ad
uso orale che sono attualmente allo studio.

VACCINAZIONE DI CAMPO
L’IZS IZS di Torino presentava una potenzialità potenzialit di
produzione di bacterin di circa 250.000-300.000 250.000 300.000 dosi
fino dalla fine degli anni ’90. 90.
Nel 2004 ottenuta l’autorizzazione lautorizzazione
ad importare
l’anestetico anestetico MS 222.
Nel 2005 IZSVE ha ottenuto l’autorizzazione lautorizzazione
a
produrre un vaccino stabulogeno con adjuvante
oleoso vegetale, mentre l’IZS l IZS Torino ha potenziato la
sua capacità capacit produttiva.
Nel 2005-2006 2005 2006 sono state prodotte in totale (IZSPLVA,
IZSVE e UNIUd) circa 5.000.000 dosi di vaccino
stabulogeno.
stabulogeno

Allevamento
A
G
A
G
H
I
J
K
N. Pesci
vaccinati
50.000
20.000
70.000
10.000
10.000
30.000
30.000
20.000
RISULTATI IZSPLVA 2004
Mortalità Mortalit nei
primi 15 gg. (%)
-
3
RISULTATI IZSPLVA 2005
> 1
-
1
nd
nd
nd
Mortalità Mortalit finale
(%)
2
7-8 8
1-2
1
1-2
nd
nd
nd
Note
-
-
-
-
-
nd
nd
nd

Allevamento
A
D
F
G
H
I
J
K
L
N. Pesci vaccinati
200.000
220.000
250.000
120.000 (no utiliz.)
130.000 (no ritirati)
10.000
10.000
70.000
30.000
20.000
10.000
RISULTATI IZSPLVA 2006
Mortalità Mortalit nei
primi 15 gg. (%)
-
-
n.d.
Mortalità Mortalit
elevata
-
1
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
Mortalità Mortalit finale
(%)
2-3
n.d.
Mortalità Mortalit
elevata
-
2-4
< 1
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.
Note
RTGE
n.d.
Episodio di
VHS
-
-
-
n.d.
n.d.
n.d.
n.d.

4
MODALITA’ DI VACCINAZIONE

La sedazione preventiva del pesce avviene al
fine di limitarne i movimenti e viene effettuata
mediante l’uso di anestetici per acquacoltura
(ad es. clorobutanolo 0,7 g/l d’acqua)

Il sistema manuale consiste nell’impiego di
tavoli di lavoro appositamente approntati,
tali da consentire una rapida
manipolazione del pesce

Il sistema semiautomatico invece
consiste nell’impiego di macchine
vaccinatrici a 2 o 4 vie, in cui
l’operatore inserisce il pesce in
appositi scomparti, nei quali i
soggetti vengono bloccati

Sistema manuale
Sistema operativo 40.000 pesci/giorno
Vantaggi Svantaggi
Vaccinazione soggetti con taglia
disomogenea
Bassa presenza di pesci non
vaccinati
Possibili incidenti vaccinali al
pesce con bassa incidenza
Numero elevato di personale
addetto (4 al banco + 3 prebanco)
Necessita di personale esperto
per le operazioni di iniezione
Possibili incidenti vaccinali al
personale

Sistema semiautomatico
Sistema operativo 40.000 pesci/giorno
Vantaggi
Numero ridotto di personale addetto
(2 al banco + 2 prebanco)
Necessita di personale non esperto
per le operazioni di iniezione
Scarsi incidenti vaccinali al
personale
Svantaggi
Vaccinazione soggetti con taglia il
più omogenea possibile
Alta presenza di pesci non vaccinati
Possibili incidenti vaccinali al pesce
con alta incidenza

RIEPILOGO
N° personale
Tipologia personale
Taglia pesce
Presenza pesci non
vaccinati
Presenza incidenti
vaccinali pesci
Presenza incidenti
vaccinali personale
Sistema operativo 40.000 pesci/giorno
MANUALE
4 + 3
Esperto
Disomogenea
Bassa
Bassa
SI
SEMIAUTOMATICO
2 + 2
Non esperto
Omogenea
Alta
Alta
NO

INCIDENTI

INCIDENTI

La vaccinazione intraperitoneale in Italia non è una pratica
ancora diffusamente utilizzata dagli operatori d’acquacoltura……
… in parte per la difficoltà di operazione, per il costo …
… ma soprattutto per la mancanza di vaccini registrati contro tali patologie.
E’ possibile comunque utilizzare tale metodica, impiegando vaccini
stabulogeni prodotti dagli Istituti Zooprofilattici Sperimentali.

5
PRODUZIONE DI UN VACCINO

Per la produzione di un vaccino stabulogeno, si deve
assolutamente partire da una diagnosi effettuata in laboratorio
della malattia oggetto della richiesta e da un isolamento batterico.

Una volta isolato il germe, previa richiesta di un
veterinario, si procede alla preparazione
dell’intermedio di produzione a base di cellule
batteriche morte.
* Preparazione del master seed
* Inoculazione del master seed nel biofermentatore
* Controllo specie batterica, grado di purezza e conta batterica
* Inattivazione del prodotto alla 18-20 a ora di crescita
mediante formalina
* Controllo di avvenuta inattivazione
INTERMEDIO DI PRODUZIONE

INTERMEDIO DI PRODUZIONE
* Prima filtrazione
* 0,4% formalina
* Controllo di sterilità
* 3 lavaggi (centrifugazione e lavaggio con PBS)
* Imbottigliamento
VACCINO DA CONTROLLARE
* Aggiunta adiuvante
* Controllo di sterilità * Controllo di innocuità

* Etichettatura
VACCINO CONTROLLATO
* Confezionamento
* Emissione ricetta, bolla e fattura
VACCINO CONSEGNATO

Tutte le fasi di produzione di un vaccino
stabulogeno vengono controllate e certificate
all’interno del Sistema Qualità dell’Istituto.
Per ogni attività inerente la produzione di un
vaccino viene compilata una apposita scheda
operativa che attesti tutte le operazioni svolte.

La produzione di un vaccino stabulogeno, in
base alle dosi richieste, necessita di una
tempistica notevole, variabile
dalle 3 alle 10 settimane.

Grazie per l’attenzione!