Appunti di Principi-BiolMol CTF - Capitolo3 - Omero
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Impieghi della PCR• Strategie <strong>di</strong> clonaggio molecolare;• Analisi dell’espressione genica (RT-PCR);• Analisi <strong>di</strong> me<strong>di</strong>cina legale quando si isolanominuscoli capioni <strong>di</strong> DNA dalla scena <strong>di</strong> uncrimine;• Test <strong>di</strong>agnostici <strong>di</strong> malattie genetiche;• Diagnosi <strong>di</strong> infezioni virali o batterriche (HIV,Epatite C, Mycobacterium tubercolosis).
TemperaturePCR100Melting94 o C500T i m e3’5’5’3’
TemperaturePCR100Melting94 o C500T i m e3’5’Heat5’3’
TemperaturePCR10050Melting94 o CAnnealingPrimers50 o CExtension72 o CMelting94 o C0T i m e3’5’5’5’5’3’
TemperaturePCR10050Melting94 o CAnnealingPrimers50 o CExtension72 o CMelting94 o C30x0T i m e3’5’Heat5’5’Heat5’5’3’
TemperaturePCR10050Melting94 o CAnnealingPrimers50 o CExtension72 o CMelting94 o C30x3’5’5’0T i m e5’5’5’3’Heat5’5’Heat5’
TemperaturePCR10050Melting94 o CAnnealingPrimers50 o CExtension72 o CMelting94 o C30x3’5’5’0T i m e5’5’5’5’3’5’5’5’5’5’5’
TemperaturePCR10050Melting94 o CAnnealingPrimers50 o CExtension72 o CMelting94 o C30x3’5’5’0T i m e5’5’5’5’3’Fragments ofdefined length5’5’5’5’5’5’
Dopo n cicli il miscuglio <strong>di</strong> reazione contiene un numero massimoteorico <strong>di</strong> molecole <strong>di</strong> DNA a doppia elica pari a 2n. (Crescitaesponenziale)
Vantaggi dalla Taq PolimerasiMiscela <strong>di</strong> reazione‣Tampone‣Eccesso dei 4 nucleoti<strong>di</strong> precursori(dNTP)‣2 primers <strong>di</strong> circa 20 basi‣DNA a doppio filamento contenente lasequenza da amplificare‣Taq Polimerasi1) L’enzima può essere aggiunto una sola volta all’inizio della reazione erimane attivo per 30-40 cicli <strong>di</strong> PCR.2) E’ possibile automatizzare la PCR utilizzando apparecchi termostaticiciclici.3) La Taq polimerasi (da Thermophylus Aquaticus) aumenta la specificità ela sensibilità della PCR; è in grado <strong>di</strong> lavorare entro un ampio range <strong>di</strong>temperature (da 37°C a 95°C).Tuttavia… non possiede un sistema <strong>di</strong> “correzione <strong>di</strong> bozze” e puòincorporare un nucleotide errato ogni 2 X 10 4 nucleoti<strong>di</strong>.
Fasi della PCR Denaturazione (melting): a 94°C (1’ – 2’); Appaiamento (annealing): > 50°C, < 70°C (1’ –2’); la temperatura <strong>di</strong> appaiamento <strong>di</strong>pende dallacomposizione in basi dei primers,4 (G + C) + 2(A +T) = T appaiamento Estensione: 72°C (1’ – 2’); i tempi <strong>di</strong>pendono dallalunghezza dello stampo.
Vantaggi della PCR1. E’ più veloce rispetto al clonaggio tramite vettori2. E’ sufficiente una piccola quantità <strong>di</strong> DNA3. E’ una tecnica altamente selettiva e sensibile (DNA non purificato)Svantaggi della PCR1. Per sintetizzare i primers bisogna conoscere le sequenze alle estremitàdel frammento <strong>di</strong> interesse2. Si può impiegare solo per amplificare frammenti corti (noproofrea<strong>di</strong>ng)*3. Problema dei falsi positivi (mismatch dei primers e contaminazioni <strong>di</strong>DNA)§Polimerasi “Hot start” e “nested” PCR
• * Si possono usare al posto della Taq polimerasi altrepolimerasi, come la polimerasi Pfu da Pyrococcus furiosus. Inquesto caso le inserzioni sbagliate che si verificano <strong>di</strong> radodurante la polimerizzazione, sono rapidamente escissedall’attività esonucleasica 3’ 5’ <strong>di</strong> quest’enzima.• § E’ importante la selezione dei primers, che possibilmentedevono avere le seguenti caratteristiche:1. Dimensioni > od = ai 18 – 20 nucleoti<strong>di</strong> per avere altaspecificità;2. Evitare l’utilizzo <strong>di</strong> primers con sequenze polipuriniche opolimirimi<strong>di</strong>niche;3. Evitare la complementarietà tra i 2 primers;4. Evitare primers che possono formare strutture secondarie;5. Le sequenze dei primers possono anche includere regioni utiliper le applicazioni susccessive; es. siti <strong>di</strong> restrizione.
Nested PCRLa nested PCR è una variante della tecnica <strong>di</strong> PCR che consiste nell’utilizzo <strong>di</strong> duecoppie <strong>di</strong> primers, una esterna che genera un normale prodotto <strong>di</strong> PCR ed una coppia<strong>di</strong> primers all’interno del prodotto amplificato: se il prodotto <strong>di</strong> amplificazione fosseaspecifico la seconda PCR non andrebbe a buon fine.5’ 3’5’ Primer 1Primer 2 5’3’ 5’Primo prodotto <strong>di</strong> amplificazione5’ 3’3’5’5’ -3’5’ Primer 3Primer 4 5’3’5’5’3’3’ Secondo prodotto <strong>di</strong> amplificazione5’
Nested PCR
Hot Start PCR• Un problema comune con la PCR è la formazione <strong>di</strong> prodotti nonspecifici,specialmente <strong>di</strong> <strong>di</strong>meri dei primers. Questi prodottiindesiderati non solo interferiscono con la generazione degli ampliconidesiderati, ma oscurano anche le analisi che fanno seguito alla reazione.• I meto<strong>di</strong> <strong>di</strong> hot start PCR forniscono una soluzione a questa mancanza <strong>di</strong>specificità riducendo od eliminando la formazione <strong>di</strong> prodotti nonspecifici prima del ciclo ad alta temperatura.• I meto<strong>di</strong> attuali <strong>di</strong> hot start PCR hanno come bersaglio la polimerasiattraverso il silenziamento della sua attività prima del passaggio iniziale<strong>di</strong> denaturazione, usando più comunimente od anticorpi bloccanti o lamo<strong>di</strong>ficazione chimica. Altrimenti sono state sviluppate meto<strong>di</strong>chechiamate <strong>di</strong> sequestro dei primers in cui una proteina ricombinante silega ai primers a basse temperature rendendoli non <strong>di</strong>sponibili perl’estensione da parte della polimerasi. Ad alte temperature la proteina èdanturata e quin<strong>di</strong> si <strong>di</strong>ssocia dai primers.
Hot Start PCR
RT- PCR(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction)Il DNA da amplificare deriva dalla retrotrascrizione dell’mRNARICHIEDE:1. Un tampone2. Una RT DNA polimerasi (<strong>di</strong> origine retrovirale)3. Miscela <strong>di</strong> mRNA contenente la sequenza da amplificare4. Primer oligo dT o oligomeri random cDNA I 4 dNTP 2 primers Una DNA polimerasi termoresistente
Sintesi del cDNA
Analisi post-PCR• Eventuale purificazione dei prodotti della PCR;• Separazione me<strong>di</strong>ante elettroforesi dei prodotti dellaPCR e visualizzazione;• Clonaggio dei prodotti della PCR;• Rilevazioni <strong>di</strong> mutazioni puntiformi negli amplificati;• Sequenziamento dei prodotti della PCR.
• L’elettroforesi su gel dei prodotti della PCR è il metodostandard per analizzarre la qualità e l’efficacia della reazione. Iprodotti della PCR arrivano ad un massimo <strong>di</strong> lunghezza <strong>di</strong> 10kb, ma la maggior parte delle amplificazioni sono nel range <strong>di</strong>1 kb od al <strong>di</strong> sotto. Per prodotti <strong>di</strong> 400 – 1000 basil’elettroforesi su gel <strong>di</strong> agarosio è certamente in<strong>di</strong>cata.L’elettroforesi rivela la <strong>di</strong>mensione della banda del prodotto,che è confrontata con il risultato presunto. L’elettroforesimostra anche quanto <strong>di</strong> questa banda è stata prodotta, e rivelala presenza o l’assenza <strong>di</strong> prodotti <strong>di</strong> amplificazione nondesiderati.• Idealmente, l’elettroforesi produce un’intensa banda singola <strong>di</strong><strong>di</strong>mensione corretta, come viene determinato dal confrontocon markers <strong>di</strong> <strong>di</strong>mensione che sono stati corsi nello stessogel.
Campioni biologici per PCR• Sangue• Saliva• Urine• Sperma• Striscio vaginale• Capelli• Cellule ammniotiche• Villi coriali• Fibroblasi <strong>di</strong> bipsie• Osteoclasti
IMPIEGHI DELLA PCRDiagnosi infezioni batteriche e viraliDiagnosi HIV, Diagnosi della TubercolosiDiagnosi cliniche <strong>di</strong> malattie causate da mutazioniControllo efficacia terapie anti-cancroDeterminazione del sessoMe<strong>di</strong>cina legale Ricerca <strong>di</strong> base•Frammenti da inserire in un vettore•Sonde per screening <strong>di</strong> librerie genomiche o <strong>di</strong> cDNA
PCR-RFLPThe polymorphism results from a single nucleotide <strong>di</strong>fferencethat provides a recognition site for a restriction enzyme in oneallelic form and not the other. A polymorphism of this type canbe rapidly detected by (1) amplifying the region around thepolymorphic site from each sample, (2) subjecting the amplifiedmaterial to the appropriate restriction enzyme for a brief periodof <strong>di</strong>gestion, and (3) <strong>di</strong>stinguishing the un<strong>di</strong>gested PCR productfrom the smaller <strong>di</strong>gested fragments by gel electrophoresis. Bychoosing primers that are relatively equi<strong>di</strong>stant to andsufficiently far from the polymorphic site, one can easily resolveallelic forms on agarose or polyacrylamide gels.
Test geneticoAmplificazioneme<strong>di</strong>ante PCRper la ricerca <strong>di</strong>delezione omozigotedei geni SMN(atrofia muscolarespinale autosomicarecessiva)
PCR-ARMS (Amplification RefractoryMutation System)• La meto<strong>di</strong>ca identifica sostituzioni nucleoti<strong>di</strong>che, piccoledelezioni od inserzioni.• La tecnica consiste nell’amplificazione del DNA me<strong>di</strong>antePCR utilizzando oligonucleoti<strong>di</strong> complementari alla sequenzanormale ed a quella mutata. Si eseguono, quin<strong>di</strong>, dueamplificazioni per ogni campione, una con i primers normali el’altra con i primers mutati. In presenza <strong>di</strong> un omozigote per lamutazione l’amplificazione avverrà solo con i primers mutatie viceversa. Nei soggetti eterozigoti per la mutazione, il loroDNA sarà amplificato con entrambi i primers.• La tecnica può rilevare una singola copia dell’allele mutato inpresenza <strong>di</strong> 40 copie dell’allele normale.
PCR-ARMS (Amplification RefractoryMutation System)
PCR-ARMS (Amplification RefractoryMutation System)• Una variante della tecnica è rappresentata dalla “ARMS multipla”che utilizza più primers mutati in un’unica reazione.• Questa tecnica consente <strong>di</strong> stu<strong>di</strong>are un soggetto per più mutazioni edè utilizzata correntemente per l’analisi molecolare della -talassemiae della fibrosi cistica.• “Tetra-primer PCR-ARMS” adotta i principi del metodo della PCRcon 4 primers.
PCR-ARMS (Amplification RefractoryMutation System)
PCR-ARMS (Amplification RefractoryMutation System)
PCR-SSCP (Single Strand ConformationPolymorphism)• Questa tecnica può rilevare mutazioni singole nei geni, comeconseguenza dell’alterata mobilità conformazionale dei singolifilamenti <strong>di</strong> DNA (entro un gel <strong>di</strong> elettroforesi) che hanno lamutazione rispetto ai singoli filamenti “wild-type” che nonhanno la mutazione.• Sono preparati dei primers per amplificare me<strong>di</strong>ante PCR lasequenza del gene coinvolto in una patologia. Si amplifica laregione mutata e la stessa regione “wild-type”. I due filamentidel prodotto della PCR del “wild-type” migreranno<strong>di</strong>fferentemente rispetto ai due filamenti del prodotto dellaPCR del mutante in un gel <strong>di</strong> poliacrilammide in con<strong>di</strong>zioninon denaturanti.
PCR-SSCP (Single Strand ConformationPolymorphism)• Il cambiamento <strong>di</strong> una singola base può causare uncambiamento conformazionale nella molecola <strong>di</strong> DNA asingolo filamento che può essere facilmente rivelata me<strong>di</strong>antel’elettroforesi.• Procedura: amplificazione me<strong>di</strong>ante PCR della regioned’interesse (“wild-type” e mutato) denaturazione concalore e formammide dei prodotti della PCR, seguita da unrapido raffreddamento per prevenire il ri-appaiamento deifilamenti elettroforesi su gel <strong>di</strong> poliacrilammide incon<strong>di</strong>zioni non denaturanti.
PCR-SSCP (Single Strand ConformationPolymorphism)• Visualizzazione delle bande: a) uso <strong>di</strong> una molecola intercalante(bromuro <strong>di</strong> eti<strong>di</strong>o o SYBR green II); b) colorazione con nitratod’argento; c) me<strong>di</strong>ante autora<strong>di</strong>ografia se durante la PCR gliampliconi sono stati ra<strong>di</strong>omarcati utilizzando o primers ra<strong>di</strong>omarcatio dNTP ra<strong>di</strong>omarcati; d) me<strong>di</strong>nate fluorescenza se i primers sonomarcati con fluorofori.• Gli in<strong>di</strong>vidui che sono omozigoti “wild-type” per il locus genicoche viene analizzato mostreranno due bande <strong>di</strong>stinte nel gel, cosìcome gli in<strong>di</strong>vidui che sono omozigoti mutanti. Tuttavia, comeconseguenza del cambiamento nucleoti<strong>di</strong>co, i prodotti <strong>di</strong> PCR deimutanti migreranno con una <strong>di</strong>versa mobilità. Gli in<strong>di</strong>vidui chesono eterozigoti mostreranno un “pattern” <strong>di</strong> quattro bande.
PCR-SSCP (Single Strand ConformationPolymorphism)
PCR-SSCP (Single Strand ConformationPolymorphism)
PCR-SSCP (Single Strand ConformationPolymorphism)• L’analisi PCR-SSCP è tecnicamente facile e può essere usataper fare lo “screening” <strong>di</strong> un grande numero <strong>di</strong> campioni.• Diversi parametri influenzano la sensibilità dell’analisi PCR-SSCP, e tra questi: a) il tipo <strong>di</strong> mutazione; b) la <strong>di</strong>mensione delframmento <strong>di</strong> DNA; c) il contenuto <strong>di</strong> G e C del frammento; d)la percentuale <strong>di</strong> poliacrilammide del gel; e) la <strong>di</strong>mensione delgel e la <strong>di</strong>fferenza <strong>di</strong> potenziale applicata; f) la temperatura delgel durante l’elettroforesi; g) la concentrazione del DAN; h) iltempo <strong>di</strong> corsa dell’elettroforesi; i) la composizione deltampone, includendo la forza ionica ed il pH; l) la presena <strong>di</strong>altre sostanza, come glicerolo o saccarosio, nel tampone.
PCR-HAD (HeteroDuplex Analysis)• Il metodo è basato sulla formazione <strong>di</strong> eteroduplex dopo avermiscolato DNA “wild-type” e mutato aplificati me<strong>di</strong>ante PCR.Il frammento <strong>di</strong> DNA in esame è soggetto a denaturazioneseguita da rinaturazione.• Se una mutazione è presente in uno dei due alleli, siformeranno 4 specie <strong>di</strong>stinte <strong>di</strong> DNA a doppio filamento: a)omoduplex <strong>di</strong> DNA “wild-type” (wt/wt); b) omoduplex <strong>di</strong>DNA mutato (mt/mt) e due <strong>di</strong>versi eteroduplex (wt/mt).• Gli omoduplex migrano più velocemente degli eteroduplex nelgel.• La formazionedegli eteroduplex e la loro stabilità <strong>di</strong>pende daltipo <strong>di</strong> mutazione nel frammento <strong>di</strong> DNA.
PCR-HAD (HeteroDuplex Analysis)• Gran<strong>di</strong> inserzioni o delezioni (> 3bp)producono eteroduplex molto stabili.• Al contrario, eteroduplex che coinvolgono lasostituzione <strong>di</strong> una singola base sono menostabili e più sensibili alle variazioni dellecon<strong>di</strong>zioni ambientali.• Tuttavia, l’analisi eteroduplex permette unarapida rilevazione <strong>di</strong> mutazioni singole, ed èstata usata con successo nella <strong>di</strong>agnosi <strong>di</strong>anemia a cellule falciforme, della fibrosi
PCR-HAD (HeteroDuplex Analysis)
PCR-HAD (HeteroDuplex Analysis)
PCR-DGGE (Denaturation Gra<strong>di</strong>ent GelElectrophoresis)• La meto<strong>di</strong>ca è basata sul principio che una singola sostituzionenucleoti<strong>di</strong>ca può far variare la temperatura <strong>di</strong> denaturazione <strong>di</strong>un segmento <strong>di</strong> DNA.• Il DNA amplificato “wild-type” e mutante è separato su <strong>di</strong> ungel <strong>di</strong> poliacrilammide che contiene concentrazioni crescenti <strong>di</strong>un agente denaturante (formammide ed urea).• Quando i due filamenti del DNA iniziano a <strong>di</strong>ssociarsi si hauna riduzione della velocità <strong>di</strong> migrazione rispetto allamolecola <strong>di</strong> dsDNA. Come detto sopra, la presenza <strong>di</strong>mutazioni mo<strong>di</strong>fica le proprietà <strong>di</strong> “melting” del DNA rispettoal DNA “wild-type”. Pertanto, i due tipi <strong>di</strong> molecole si<strong>di</strong>ssociano in punti <strong>di</strong>versi del gra<strong>di</strong>ente denaturante, e saranno<strong>di</strong>stinguibili in base alla <strong>di</strong>versa mobilità elettroforetica.
PCR-DGGE (Denaturation Gra<strong>di</strong>ent GelElectrophoresis)• L’analisi PCR-DGGE è estremamente rapida,ha un’efficienza del 100% , non necessita <strong>di</strong>ra<strong>di</strong>oattività ed è adatta ad analisi <strong>di</strong>agnostichequando basti analizzare frammenti <strong>di</strong> DNA <strong>di</strong>500-600 bp.• Per visualizzare le bande nel gel si usa unagente intercalante (bromuro <strong>di</strong> eti<strong>di</strong>o oSYBR green).
PCR-DGGE (Denaturation Gra<strong>di</strong>ent GelElectrophoresis)Immagine negativa <strong>di</strong> un gel DGGE colorato con bromuro d’eti<strong>di</strong>o
Resa della PCRResa teorica: 2 n P = (2) n T Il prodotto (P) incrementa esponenzialmentecon il numero <strong>di</strong> cicli <strong>di</strong> PCR (n).Il prodotto <strong>di</strong> PCR <strong>di</strong>pende anche da T, ovvero il numero <strong>di</strong> copie <strong>di</strong>template <strong>di</strong> partenza.Log [DNA]n. cicli termici
Resa della PCRResa effettiva: effetto plateau Il processo <strong>di</strong> duplicazione non procede “all’infinito”, essoè limitato da:Quantità dei primersAttività della Taq polimerasiReannealing dei filamenti Raggiunto il plateau non si osserva più un incremento neiprodotti
PCR productIl plateau non <strong>di</strong>pende da TAnche se la quantità iniziale <strong>di</strong> template è la medesima, il plateau è raggiuntoin tempi <strong>di</strong>versi ed in cicli <strong>di</strong>versi.25201510500 10 20 30 40Cycle
Soluzioni per PCR quantitativa Utilizzare i dati ottenuti durante la fase esponenziale ilprodotto <strong>di</strong> PCR è proporzionale al template iniziale Questo è reso possibile me<strong>di</strong>ante il rilevamento, <strong>di</strong> unafluorescenza, che è proporzionale al prodotto <strong>di</strong> PCR La fluorescenza, durante ogni ciclo <strong>di</strong> amplificazione, puòessere rilevata utilizzando uno strumento quantitativo maanche dei marcatori fluorescenti il cui accumulo segue las t e s s a c i n e t i c a d e l l a r e a z i o n e <strong>di</strong> P C R
RT-PCR convenzionaleReversetrascriptionReal-time RT-PCRReversetrascriptionPCRreactionNested PCRreactionGelelectrophoresisDNA sequencingSouthern blotManual or automatedanalysisPCR reactionQuantitative results
Perché Real-Time?• Misura l'amplificazione in tempo realedurante la fase esponenziale della PCR,quando cioè l'efficienza <strong>di</strong> amplificazione èinfluenzata minimamente dalle variabili <strong>di</strong>reazione, permettendo <strong>di</strong> ottenere risultatimolto più accurati rispetto alla PCRtra<strong>di</strong>zionale "end point“.
RT-PCR quantitativa• Rilevamento della fluorescenza associata all’amplificazione• Il prodotto <strong>di</strong> PCR non viene analizzato su gel <strong>di</strong> agarosio• Analisi del prodotto <strong>di</strong> fluorescenza tramite computerIncremento <strong>di</strong>fluorescenzaCicli <strong>di</strong> PCR
Analisi tramite software
Chimiche fluorescenti per PCR Real-TimeLa fluorescenza si genera durante la PCR pereffetto <strong>di</strong> <strong>di</strong>verse possibili reazioni chimiche.Le chimiche principali sono basate sia sul legame<strong>di</strong> coloranti fluorescenti che si intercalano nelladoppia elica <strong>di</strong> DNA, come il SYBR Green, siasull'ibridazione <strong>di</strong> sonde specifiche.
SYBR greenUtilizzauna molecola fluorescente non specifica chesi lega al solco minore del DNA.
SYBR green All’inizio del processo <strong>di</strong> amplificazione, la miscela <strong>di</strong> reazionecontiene DNA denaturato, primers e la molecola fluorescente
SYBR green Dopo l’annealing dei primers, si legano poche molecolefluorescenti alla doppia elica.
SYBR green Durante l’elongazione si verifica un aumento <strong>di</strong>fluorescenza che corrisponde all’ aumento del numero <strong>di</strong>copie dell’amplicone.
SYBR green Meto<strong>di</strong>ca semplicePossono essere utilizzati primers in uso in qualitativa. Non costosa Non-specifica– La molecola fluorescente si lega random a tuttele doppie eliche, includendo i <strong>di</strong>meri <strong>di</strong> primers.– È necessario ottimizzare la meto<strong>di</strong>ca per evitarela formazione <strong>di</strong> prodotti aspecifici.
La Real-Time PCR si può realizzare me<strong>di</strong>antel’impiego <strong>di</strong>: coloranti intercalanti ( es. SYBR green), che si leganoin maniera aspecifica a tutto il DNA. sonde ad ibridazione, specifiche per il frammento <strong>di</strong>interesse, marcate con molecole fluorescenti. Esistono <strong>di</strong>versi tipi <strong>di</strong> sonde:Dual-labeledlabeled (come le sonde TaqMan)Molecular beaconsScorpionSonde FRET (Fluorescence Resonance EnergyTransfer)
Sonde TaqMan La sonda <strong>di</strong> tipo TaqMan è un oligonucleotide che, come iprimers della PCR, viene <strong>di</strong>segnato per esserecomplementare alla sequenza bersaglio da amplificare.3’5’5’Primer3’RQ5’ 3’Primer3’5’5’3’La sonda è <strong>di</strong>segnata in modo da ibridarsi all’internodel frammento amplificato nella reazione <strong>di</strong> PCR
Dimensioni dell’amplicone
ForwardProbeReverse
Sonda TaqMan Presenta all’estremità 5’ un fluoroforo “Reporter” edall’estremità 3’ una molecola “Quencher”.
Reporter-QuencherDyeQuencher5,6 FAM BHQ-1/TAMRAHEX/JOEBHQ-2Texas Red/ROXBHQ-2Cy5/Quasar670 BHQ-2 o (-3)6-carbossifluoresceina6-carbossitetrametilrodamina
Reporter-Quencher5’ REPORTER (R): fluorocromo ad alta energia che emettefluorescenza3’ QUENCHER (Q): fluorocromo a bassa energia chespegne la fluorescenza del reporterSe R e Q si trovano vicini, Q spegne l'effetto <strong>di</strong> Rperchè i fotoni <strong>di</strong> R vengono assorbiti da Q
Real-Time PCR:attività 5’>3’ esonucleasica3’5’3’RQ5’RQ5’3’ 5’RQ5’3’ 5’
L’aumento <strong>di</strong> fluorescenza del Reporter è <strong>di</strong>rettamenteproporzionale al numero <strong>di</strong> ampliconi generatiForward primerProbeReverse primer
Real-time PCR: reagenti COMPONENTI DELLA REAZIONE:1) DNA target2) DNA polimerasi3) Due oligonucleoti<strong>di</strong>4) dNTPs5) Probe fluorescente
Run Real-Time thermal cycle3 min95°C15 s50 cycles50°CActivatesAmplitaq Gold55°C65°C1 min2 min30 sActivatesUNG (Uracile N-Glicosilasi)
Curve <strong>di</strong> amplificazioneFluorescenzaCicli <strong>di</strong> amplificazionePer ogni campione si ottiene una curva <strong>di</strong> amplificazione il cuiC T (=Threshold Cycle) è inversamente proporzionale alla quantità <strong>di</strong>template iniziale
Plot <strong>di</strong> amplificazioneLinea soglia sceltadall’operatoreIn maniera da intersecare lecurve <strong>di</strong> tutti i campioni nellafase esponenzialeIn<strong>di</strong>ca il valoreal <strong>di</strong> sopra delquale inizial’accumulo <strong>di</strong>un amplificatoE’ il ciclo della reazione <strong>di</strong>amplificazione in cui il segnale<strong>di</strong> fluorescenza del campione èmaggiore rispetto a quello dellaThreshold
QuantificazioneASSOLUTA i campioni sono quantificati in modoassoluto Necessita <strong>di</strong> “standard” <strong>di</strong> cui si conosce la concentrazioneassoluta (utilizzo <strong>di</strong> una “standard curve”) Per tutti gli “unknowns” devono essere saggiate identichequantità <strong>di</strong> campioniRELATIVA la quantificazione viene effettuataparagonando i C T Necessita <strong>di</strong> controlli endogeni (non si utilizza una“standard curve”) Gli “unknowns” vengono “quantificati” paragonando il loroC T con quello del controllo endogeno (-actina, GAPDH).
Ct35Quantitativa assoluta10 110 225unknown sample10 310 410 510 6153500 copies10 712 3 4 5 6 7log 10 quantityIl valore così ottenuto viene normalizzato rispetto a quello <strong>di</strong> un genee s p r e s s o c o s t i t u t i v a m e n t e ( - a c t i n a , G A P D H , e c c . )
Quantificazione relativaPlot <strong>di</strong> amplificazioneControlSampleNumero <strong>di</strong> cicliC TNumero <strong>di</strong> cicli
Quantificazione relativa: analisi dei dati‣ Normalizzare il target con un controllo endogeno (r)espresso costitutivamente (C T )‣ Comparare ciascun C T così ottenuto con il C T <strong>di</strong> untrattamento <strong>di</strong> controllo anche detto “calibratore” (cb)(C T )2 - (CT,r- CT,cb) = 2- CT‣ Il valore così ottenuto permette <strong>di</strong> determinare laconcentrazione relativa del target
Sonde FRET(FluorescenceResonanceEnergyTransfer) Simili alle sonde TaqMan perché si legano alDNA bersaglio e vengono idrolizzate, ci sonoperò due sonde ognuna marcata con un solofluorocromo (accettore e donatore). Quando le sonde non sono legate alle sequenzetarget il segnale fluorescente provenientedall'accettore non è rilevato.donatoreaccettore Durante lo step <strong>di</strong> annealing della PCR,entrambe le sonde FRET ibri<strong>di</strong>zzano allesequenze target: ciò avvicina il fluoroforodonatore all'accettore permettendo iltrasferimento <strong>di</strong> energia tra i due fluorofori e laproduzione <strong>di</strong> un segnale fluorescente da partedell'accettore che viene rilevato.
Molecular Beacons I "molecular beacons" contengono un fluoroforo e un quencher nonfluorescente alle estremità opposte <strong>di</strong> un oligonucleotide, che sono<strong>di</strong>segnate in modo da essere complementari tra loro formando unastruttura stem-loop.La vicinanza del quencheral reporter fluorescenteimpe<strong>di</strong>sce l’emissione <strong>di</strong>fluorescenzafluoroforoquencher• Il loop è complementare ad una sequenza all'interno del prodottoamplificato.
Molecular Beacons Durante lo step <strong>di</strong> annealing dellaPCR, la sonda ibri<strong>di</strong>zza alla suasequenza target: ciò separa ilcolorante fluorescente dal reporter,producendo un segnalefluorescente.EXCITATIONEFRET La quantità <strong>di</strong> fluorescenza prodottaad ogni ciclo, o dopo la PCR, <strong>di</strong>pendedalla quantità <strong>di</strong> prodotto specificoin quel dato momento.ANNEALINGAmpliconA <strong>di</strong>fferenza delle sonde TaqMan, le molecular beacons nonvengono <strong>di</strong>strutte durante la reazione <strong>di</strong> amplificazione percui possono reibri<strong>di</strong>zzarsi durante il successivo ciclo
Laprogettazionedellescorpion probes è simile aquelladellemolecularprobes, con la <strong>di</strong>fferenzache al 3’ terminale delprobe vi è una sequenza,PCR primer, che èspecifica per l’estensionedel target.Probes : ScorpionsQuesta sequenza è legataal 5’ terminale <strong>di</strong> unprimer per mezzo <strong>di</strong> un“blocker” blocker”..
Probes : ScorpionsStep 1Lo Scorpions primer è esteso su un target <strong>di</strong> DNAScorpions primerProbeTarget <strong>di</strong> DNA
Step 2Probes : ScorpionsDurante il processo <strong>di</strong> denaturazione si verifical’allontanamento del quencherdal reporter e del primer <strong>di</strong>innesco dal DNA targetQPrimer <strong>di</strong> innescoRDNA target
Step 3Probes : ScorpionsRaffreddandosi lo Scorpion esteso subisce un riarrangiamento internoed emette fluorescenza in maniera target specifica. Un primer nonesteso viene quenciato.
Riassumendo:Meto<strong>di</strong> <strong>di</strong> rilevamento della fluorescenzaSYBR GreenTaqManMolecularBeaconsScorpionprobe
Real-Time PCR: applicazioni‣ Quantificazione virale• Quantificazione dell’espressione genica• Efficacia della terapia farmacologica• Misura dei danni al DNA• Controllo <strong>di</strong> qualità e validazione dei saggi• Detenzione dei patogeni• Controllo degli OGM• Genotyping• MRD
MRD (MinimalResidualDisease): Quota residua <strong>di</strong> cellule neoplastiche nonera<strong>di</strong>cate dalla terapia <strong>di</strong> induzione dellaremissione o dalle successive misureterapeutiche. Tali elementi neoplastici, presenti ad unlivello inferiore alla capacità <strong>di</strong> rilevazione dellemeto<strong>di</strong>che convenzionali, sono in grado <strong>di</strong>espandersi e dare origine alla reci<strong>di</strong>va.
Analisi della sequenzanucleoti<strong>di</strong>ca del DNA
• Uno dei meto<strong>di</strong> più comunemente usati per questaanalisi è quello <strong>di</strong> Sanger, detto anche metodo dellaterminazione della catena o dei<strong>di</strong>desossiribonucleoti<strong>di</strong> (ddNTP).• Si tratta <strong>di</strong> una meto<strong>di</strong>ca elegante e relativamentesemplice che consiste nel far sintetizzare frammenti <strong>di</strong>catena polinuceloti<strong>di</strong>ca <strong>di</strong> lunghezza <strong>di</strong>versa sullostampo del DNA che si vuole sequenziare. Ciò siottiene facendo avvenire la sintesi della nuova catenautilizzando oltre ai 4 dNTP anche uno dei 4 ddNTP. Inpresenza <strong>di</strong> DNA polimerasi un ddNTP può essereincorporato all’estremità 3’ <strong>di</strong> una catena nucleoti<strong>di</strong>cain accrescimento su uno stampo <strong>di</strong> DNA, ma non puòpoi legare un altro nucleotide perchè non è<strong>di</strong>sponibile l’OH in 3’.
ddNTP
Il principio del proce<strong>di</strong>mento può esserebrevemente riassunto: si prepara una miscela <strong>di</strong>reazione contenete• - il frammento <strong>di</strong> DNA da sequenziare,denaturato, quin<strong>di</strong> a singolo filamento;• - un primer, cioè una breve sequenza nucleoti<strong>di</strong>cacon le estremità 3’ e 5’ libere;• - una DNA polimerasi con elevata processività ebassa attività esonucleasica (sia in <strong>di</strong>rezione 5’-3’,sia in <strong>di</strong>rezione 3’-5’; as es. Sequenasi delcommercio);• - i 4 dNTP;• - un dNTP marcato con 32 P o con 35 S (incorporatoin una base mo<strong>di</strong>ficata).
• Si sud<strong>di</strong>vide quin<strong>di</strong> la miscela in 4 frazioni (A, T, G, C), aciascuna delle quali si aggiunge un <strong>di</strong>verso ddNTP, cioèddATP, ddTTP, ddGTP, ddCTP e si incuba per un tempoopportuno.• Poichè l’incorporazione del ddNTP nella catena inaccrescimento è del tutto casuale, durante l’incubazionesi formano in ciascuna frazione frammenti polinucleoti<strong>di</strong>ci<strong>di</strong> lunghezza <strong>di</strong>versa, aventi tutti come sequenza inizialequella del primer, sequenza successiva in <strong>di</strong>rezione 5’ 3’complementare al segmento duplicato del DNA stampo, etutti terminanti con il ddNTP presente in quella frazione.• Dopo incubazione le quattro frazioni vengono denaturateal calore, per separare le catene nucleoti<strong>di</strong>che appaiate, esottoposte ad elettroforesi in un unico gel <strong>di</strong>poliacrilammide.
Terminazione della catena
ddCTPddCTPddCTPPRIMERDNA Polimerasi5’-A T C T T T T A G A GT A C C T G AG*AGAT GA T AG*A3’-T A G A A A A T C T C A T G G A C T C T C T A C T A T C T A C A T G T A -5’+ ddNTP ( per es. ddCTP)STOP5’-A T C T T T T A G A GT A C C T G AG*AGAT GA T AG*AT G T AddC3’-T A G A A A A T C T C A T G G A C T C T C T A C T A T C T A C A T G T A -5’Il risultato è una serie <strong>di</strong> frammenti interrotti ciascunoin corrispondenza <strong>di</strong> ogni ddCTPddCTPddCTPddCTP
Schema <strong>di</strong> sequenziamento a terminazione <strong>di</strong> catenaDNA stampo asingola elica3’-GGCTAAC5’ 3’3’-GGCTAAC+[ 35 S]dATP+dCTP,dGTP,dTT (dNTP) +DNA PolimerasiIbridazione conIl primerddATP, dNTP ddCTP, dNTP ddGTP, dNTP ddTTP, dNTP-CCG ddA-CCGATT ddG-CCGAT ddT-CCGA ddT-CCG ddA-CC ddG-C ddC-ddC-ddC-CddCA C G TSequenza: 5’-CCGATTG-CC ddG-CCGATT ddGGTTAGCCDirezione <strong>di</strong>lettura-CCGA ddT-CCGAT ddT
• Le <strong>di</strong>verse catene polinucleoti<strong>di</strong>cheneosintetizzate migreranno nel gel verso l’anodoin funzione della loro lunghezza e possono esserefacilmente localizzate, poichè ra<strong>di</strong>oattive, perautora<strong>di</strong>ografia. Si possono così evidenziarecentinaia <strong>di</strong> bande e separare catene che<strong>di</strong>fferiscono <strong>di</strong> un solo nucleotide.• Nelle 4 corsie del gel le bande si <strong>di</strong>sporranno inor<strong>di</strong>ne <strong>di</strong> lunghezza dal fondo verso la zona <strong>di</strong>deposizione.• Dalla successione <strong>di</strong> tutte le bande presenti nelle4 corsie del gel si può risalire alla sequenza delframmento <strong>di</strong> DNA usato come stampo.
Metodo <strong>di</strong> sequenziamentodel DNA “<strong>di</strong>deossi” <strong>di</strong>Sanger
Metodo <strong>di</strong> sequenziamentodel DNA “<strong>di</strong>deossi” <strong>di</strong>Sanger
• Alla rilevazione per autora<strong>di</strong>ografia si può sostituire unarilevazione con marcatori fluorescenti <strong>di</strong> quattro colori<strong>di</strong>versi legati all’estremità 5’ del primer. Si incuba il primer<strong>di</strong> colore <strong>di</strong>verso per ciascuna delle quattro frazioni. Altermine dell’incubazione si mescolano le quattro frazioni esi fanno correre in un unico pozzetto. Si otterranno sultracciato bande fluorescenti <strong>di</strong> colori <strong>di</strong>versi, cheidentificano la base con cui termina ciascun frammento.Questa modalità ha consentito <strong>di</strong> mettere a punto meto<strong>di</strong><strong>di</strong> sequenziamento automatizzato del DNA, nei quali sieffettua una scansione del gel con un raggio laser cheeccita i fluorofori e si rilevano e registrano le <strong>di</strong>versecolorazioni delle singole bande.• Ciò consente <strong>di</strong> esaminare in un unico gel più campioni,ognuno in una <strong>di</strong>versa corsia, <strong>di</strong> identificare per ognicampione la sequenza <strong>di</strong> <strong>di</strong>verse centinaia <strong>di</strong> basi, <strong>di</strong>paragonare tra loro <strong>di</strong>versi campioni.
Sequenziamento automatizzato con marcatorifluorescentiConiugando a ciascunddNTPun <strong>di</strong>verso marcatorefluorescente, èpossibile effettuare lequattro reazioni <strong>di</strong>sequenziamento in ununico tubo da saggioe caricare il tutto insolo pozzetto <strong>di</strong> gelddAddTddCddG
Detection of FluorescentlyTagged DNADNA FragmentsSeparated byElectrophoresisOpticalDetection SystemOutput to ComputerScanning LaserExcitesFluorescent Dyes
Le emissioni fluorescenti vengono captate da un rilevatore e leinformazioni vengono integrate e trasformate in picchi <strong>di</strong> colore<strong>di</strong>verso, con aree proporzionali all’intensità <strong>di</strong> emissione.elettroferogramma
Fluorescent DNA Sequencing Data
Metodo <strong>di</strong> Sequenziamento <strong>di</strong> Maxame Gilbert« Marcatura terminale al 5’ o al 3’ del DNA a doppio filamento« Denaturazione e separazione dei due filamenti« Il DNA a singola elica viene sud<strong>di</strong>viso in quattro campioni, ognunodei quali viene trattato con un reagente chimico che demolisce una odue delle 4 basi del DNA.G = DMS + piperi<strong>di</strong>naG + A = DMS + piperi<strong>di</strong>na + acido formicoC + T = idrazina + piperi<strong>di</strong>naC = idrazina + piperi<strong>di</strong>na in NaCl 1,5 M« Le reazioni sono controllate in modo da avere una frammentazioneparziale: statisticamente tutte le possibili basi saranno degradateproducendo una serie <strong>di</strong> frammenti la cui lunghezza <strong>di</strong>penderà dalla<strong>di</strong>stanza tra l’estremità marcata e il sito <strong>di</strong> taglio« Separazione dei frammenti marcati me<strong>di</strong>ante gel elettroforesi e« Visualizzazione dei risultati me<strong>di</strong>ante autora<strong>di</strong>ografia
Metodo <strong>di</strong>Sequenziamentochimico secondoMaxam e Gilbert
Un altro metodo per la determinazionedella sequenza, attualmente <strong>di</strong> larga<strong>di</strong>ffusione, è quello definitoPyrosequencing od anche sequenziamentoper sintesi. La prima denominazione che èun termine brevettato deriva dal fatto chel’analisi sfrutta la liberazione <strong>di</strong> pirofosfatoche si ha quando la DNA polimerasireagisce con un nucleoside trifosfato e legaun nucleotide ad una catenapolinucleoti<strong>di</strong>ca in accrescimento.Come nel metodo <strong>di</strong> Sanger, si opera su unsegmento <strong>di</strong> DNA a singolo filamento cheagisce come template per la sintesi <strong>di</strong> una
Le tappe del pyrosequencing possono essere riassuntecome segue: il DNA <strong>di</strong> cui si vuole determinare la sequenza vieneridotto in frammenti <strong>di</strong> un centinaio <strong>di</strong> paia <strong>di</strong> basi edenaturato così da formare DNA a singolo filamento chesarà il template; al frammento <strong>di</strong> ssDNA viene aggiunto un primer equin<strong>di</strong> un cocktail <strong>di</strong> enzimi e <strong>di</strong> substrati DNApolimerasi, ATP solforilasi, apirasi, luciferasi,adenosinfosfosolfato (APS) e luciferina; si da quin<strong>di</strong> inizio alla reazione <strong>di</strong> sintesi aggiungendo insuccessione , separatemente, uno dei 4 dNTP.Reazione catalizzata della ATP solforilasi:ATP + H 2 SO 4 APS + PPi
• Step 1A sequencing primer is hybri<strong>di</strong>zed to a single-stranded PCRamplicon that serves as a template, and incubated withthe enzymes, DNA polymerase, ATP sulfurylase, luciferase,and apyrase as well as the substrates, adenosine 5'phosphosulfate (APS), and luciferin.
• Step 2The first deoxribonucleotide triphosphate (dNTP) is addedto the reaction. DNA polymerase catalyzes theincorporation of the dNTP into the DNA strand, if it iscomplementary to the base in the template strand. Eachincorporation event is accompanied by release ofpyrophosphate (PPi) in a quantity equimolar to theamount of incorporated nucleotide.
• Step 3ATP sulfurylase converts PPi to ATP in the presence of adenosine 5'phosphosulfate (APS). This ATP drives the luciferase-me<strong>di</strong>atedconversion of luciferin to oxyluciferin that generates visible light inamounts that are proportional to the amount of ATP. The lightproduced in the luciferase-catalyzed reaction is detected by a chargecoupled device (CCD) chip and seen as a peak in the raw data output(Pyrogram). The height of each peak (light signal) is proportional tothe number of nucleotides incorporated.
• Step 4Apyrase, a nucleotide-degra<strong>di</strong>ng enzyme, continuouslydegrades unincorporated nucleotides and ATP. Whendegradation is complete, another nucleotide is added.
• Step 5Ad<strong>di</strong>tion of dNTPs is performed sequentially. It should be noted thatdeoxyadenosine -thio triphosphate (dATP·S) is used as a substitutefor the natural deoxyadenosine triphosphate (dATP) since it isefficiently used by the DNA polymerase, but not recognized by theluciferase. As the process continues, the complementary DNA stran<strong>di</strong>s built up and the nucleotide sequence is determined from the signalpeaks in the Pyrogram trace.
• Il pyrosequencing ha notevoli vantaggi perchè non necessital’utilizzo <strong>di</strong> dNTP marcati, ne <strong>di</strong> ddNTs, e non è necessaria laseparazione elettroforetica dei frammenti.• Il metodo è stato automatizzato e sono stati messi a puntosequenziatori che effettuano le determinazioni su molticampioni in parallelo, utilizzando DNA chip; in pratica in ciascunpozzetto è fissato un frammento <strong>di</strong> ssDNA. Il succedersi dellereazioni che avvengono contemporaneamentein tutti i pozzetti,il rilevamento, l’analisi e l’elaborazione dei risultati è gestito daun software de<strong>di</strong>cato, che riporta I dati in pirogrammi od intabulati riferiti a ciascun campione.• Con queste strumentazioni è possibile determinare in pocheore sequenze geniche <strong>di</strong> milioni <strong>di</strong> paia <strong>di</strong> basi.• E’ anche possibile anche effetuare contemporaneamenteun’analisi comparativa <strong>di</strong> DNA <strong>di</strong> origine <strong>di</strong>versa, e rilevare confacilità mutazioni <strong>di</strong> singole basi.
What is Next-Generation Sequencing?One can sequence hundreds of millions of short sequences(35bp-100bp) in a single run• Illumina/Solexa GA II / HiSeq 2000• Life Technologies/AppliedBiosystems SOLiD• Roche/454 FLX, Titanium• Helicos
Illumina was founded in April 1998• Illumina sells a number of very high-throughput DNAsequencing systems, DNA sequencers, based on technologydeveloped by Solexa. The technology features bridgeamplification to generate clusters and reversible terminatorsfor sequence determination. The technology behind thesesequencing systems involves ligation of fragmented DNA to achip, followed by primer ad<strong>di</strong>tion and sequential fluorescentdNTP incorporation and detection.
Illumina sequencing technology• Library preparation: il DNA è frammentato, adenilato,oligonucleoti<strong>di</strong> adattatori sono legati a ciascuna estremità; iframmenti sono selezionati in base alle <strong>di</strong>mensioni e purificati.• Cluster amplification: i frammenti <strong>di</strong> DNA a singolo filamento sonoisotermicamente amplificate in celle <strong>di</strong> flusso per prepararle alsequenziamento. Le celle <strong>di</strong> flusso hanno degli oligonucleoti<strong>di</strong>legati, che si ibri<strong>di</strong>zzano agli adattatori dei frammenti <strong>di</strong> DNA.Amplificazione del DNA: produzione <strong>di</strong> copie <strong>di</strong> DNAcovalentemente legate alle celle. Ogni copia della libreria èamplificata attraverso una serie <strong>di</strong> estensioni e <strong>di</strong> amplificazioniisotermiche a ponte. I filamenti “reverse” vengono tagliati edeliminati me<strong>di</strong>ante lavaggio. Le estremità libere dei singolifilamenti <strong>di</strong> DNA nelle celle vengono bloccati.
Illumina Genome Analyzer 1 “flow cell” = 8 “lanes” 1 lane = ~10-30 million “reads” ~5-20 million “mapped reads” 36bp, 50bp, 75bp, 100bp Single-end (SE) or Paired-ends (PE) 1 lane: $800-$2000 Multiplexing
Illumina:Sequencing-bysynthesis
Illumina:Sequencing-bysynthesis
Illumina sequencing technology• Sequencing: appaiamento dei primers aiframmenti DNA. Estensione dei primersusando i 4 dNPT con legati 4 fluorofori. Lafluorescenza è rilevabile me<strong>di</strong>antel’eccitazione con un raggio laser. Rimozionedel blocco reversibile al 3’ OH, così che puòvenir legato un nuovo nucleotide fluorescente.• I quattro nucleoti<strong>di</strong> fluorescenti competonoper il legame.
ABI SOLiD (Seq by Oligo Ligation/Detection)• Clonal bead library via emulsion PCR.• The actual base detection is no longer done by the polymerasedrivenincorporation of labeled <strong>di</strong>deoxy terminators.• SOLiD uses a mixture of labeled oligonucleotides and queriesthe input strand with ligase.• Each base is interrogated twice:– built-in error checking capability that <strong>di</strong>stinguishes betweenmeasurement errors and true polymorphisms;– detection of more complicated variations.
Overview of ABI SOLiD SequencingChemistry• Library Preparation Prepare one of the twotypes of libraries for SOLiD Systemsequencing-fragment or mate-paired. Yourchoice of library depends on the applicationyou're performing and the information youdesire from your experiments.
Emulsion PCR/Bead EnrichmentPrepare clonal bead populations in microreactors containingtemplate, PCR reaction components, beads, and primers.After PCR, denature the templates and perform bead enrichment toseparate beads with extended templates from undesired beads. Thetemplate on the selected beads undergoes a 3’ mo<strong>di</strong>fication toallow covalent attachment to the slide.
Bead DepositionDeposit 3’ mo<strong>di</strong>fied beads onto a glass slide. During beadloa<strong>di</strong>ng, deposition chambers enable you to segment a slide intoone, four, or eight sections. A key advantage of the system is theability to accommodate increasing densities of beads per slide,resulting in a higher level of throughput from the same system.
Sequencing by LigationPrimers hybri<strong>di</strong>ze to the P1 adapter sequence on the templatedbeads .A set of four fluorescently labeled <strong>di</strong>-base probes compete forligation to the sequencing primer. Specificity of the <strong>di</strong>-base probeis achieved by interrogating every 1st and 2nd base in eachligation reaction.Multiple cycles of ligation, detection and cleavage are performedwith the number of cycles determining the eventual read length.Following a series of ligation cycles, the extension product isremoved and the template is reset with a primer complementaryto the n-1 position for a second round of ligation cycles.
SOLiD TechnologyLigation-basedchemistry with <strong>di</strong>baselabelled probesOligos:– Positions 1-2 (from 3’ side): one of 16 <strong>di</strong>nucleotides– Positions 3-5: degenerate (Ns)– Positions 6-5’: degenerate and holds one of four fluorescent dyes• 5-7 ligation reactions are followed by a reset cycle• Next a new initial primer is used that is N-1 in length
Primer ResetFive rounds of primer reset are completed for each sequencetag . Through the primer reset process, virtually every base isinterrogated in two independent ligation reactions by two<strong>di</strong>fferent primers.For example, the base at read position 5 is assayed by primernumber 2 in ligation cycle 2 and by primer number 3 inligation cycle 1. This dual interrogation is fundamental to theunmatched accuracy characterized by the SOLiD System.
Exact Call ChemistryUp to 99.99% accuracy is achieved with the Exact CallChemistry Module by sequencing with an ad<strong>di</strong>tionalprimer using a multi-base enco<strong>di</strong>ng scheme.
Working in “Colorspace”
Latest Platforms:Illumina HiSeq:• ~1 billion clusters• 30x coverage of two human genomesin a single run• ~10K per sample?• 1 x 35bp: ~1.5 days, ~30Gb• 2 x 50bp: ~4 days, 75-100Gb• 2 x 100bp: ~8 days, 150-200GbSOLiD 5500xl:• With microbeads or nanobeads• 20-45 Gb/day• 12 lanes• Similar run times as HiSeq• Up to 180-300Gb per run
Rapid Decrease in Cost•The Human GenomeProject: 13 years and $3billion.• Sequencing of the WatsonGenome by 454 in 2007:$2 million• Illumina: eight days at acost of about $10,000.• ~104 reduction in 5 yrs• Claims: a genome in 15minutes for $1000?
Campi <strong>di</strong> applicazione delle piattaforme NGS• Sequenziamento de novo e risequenziamento<strong>di</strong> genomi completi.• Identificazione <strong>di</strong> siti polimorfici e mutazioni.• Analisi su larga scala del trascrittoma.• Mappaggio su scala genomica <strong>di</strong> siti <strong>di</strong>interazione tra DNA (RNA) e proteine edanalisi epigenetiche dell’intero genoma.• Caratterizzazione del metiloma e stu<strong>di</strong>odell’e<strong>di</strong>ting.