Antivirali 2008-2009

Antivirali• Virus: classificazione, ciclo direplicazione;• Target di farmaci antivirali• Antinfluenzali;• Antierpetici;• Anti-HIV• Farmaci antiepatite

Virus•Sono microorganismi infettivi responsabili di numerose patologie umane ed animali.•Si comportano da parassiti intracellulari obbligati sfruttando i processi metabolicidella cellula che hanno invaso.•Sono costituiti da :• MATERIALE GENETICO: RNA o DNA a singolo o doppio filamento• CAPSIDE: rivestimento di natura proteica ; protegge il genoma virale e media lapenetrazione virale intracellulare, interagendo con la superficie delle cellulebersaglio.In alcuni virus (orthomyxovirus, herpesvirus, poxvirus) all'esterno delnucleocapside vi è un rivestimento lipoproteico, detto PERICAPSIDE• NUCLEOCAPSIDE: materiale genetico + capsideAlcuni virus possono integrare una copia del proprio materiale genetico all‟internodei cromosomi della cellula ospite, realizzando così una “latenza virale”, condizioneper cui l‟infezione può nuovamente manifestarsi senza riesposizione al virus.

CLASSIFICAZIONE dei VIRUSdal 1966 Comitato Internazionale per la Tassonomia dei Virus (ICTV)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ICTVdb/Ictv/index.htm)Criteri:• acido nucleico (DNA o RNA)• simmetria del capside (icosaedrica, elicoidale, complessa)• envelope/capside si-no• architettura del genoma (ds o ss, +/-)• modalità replicative• polimerasi associata al virione• diametro virione (nm) e n. capsomeri• dimensioni genoma (kb)

VIRUS a DNA(…viridae)100 nm• Ordine suffisso -virales• Famiglia suffisso –viridae• Sottofamiglia suffisso –virinae• Genere suffisso –virusPoxvirus (vaiolo)Herpes virus (varicella,herpes zoster, herpesPoxiviridaeIridoviridaesimplex)Adenovirus (congiuntiviti,laringiti, raffreddore)Hepadnavirus (epatite C)Papillomavirus (verruche)VIRUS a RNAHerpetoviridae Adenoviridae Papoviridae ParvoviridaeCoronaviridaeRetroviridaeParamyxoviridae Orthomyxoviridae ArenaviridaeOrbivirusOrthomyxovirus (influenza)Paramyxovirus (morbillo,parotite)Rubella virus (rosolia)Picornavirus (poliomelite,meningite, raffreddore)Arenavirus (meningitelinfocitaria, febbreemorragica)Arbovirus (febbre gialla,encefalite da artropodiReoviridae Picornaviridae Rabdoviridae Togaviridae BunyaviridaeArbovirusRetrovirus (AIDS, leucemiada linfociti T)

CICLO DI REPLICAZIONE VIRALE1) AdsorbimentoAttacco del virus ad alcuni recettori che si trovano sulla membranacitoplasmatica della cellula bersaglio.2) Penetrazione- per endocitosi- per fusione3) Liberazione dell' acido nucleico viraleDecapsidizzazione (uncoating).4) Sintesi dei componenti viraliAcidi nucleici, materiale proteico5) Sintesi ed assemblaggio dei componenti capsidiciFormazione di virioni.6) Liberazione della progenie viraleEventuale formazione del pericapside e fuoriuscita del virusneoformato dalla cellula.

TERAPIA ANTIVIRALEI farmaci AV dovrebbero inibire i processi replicativi specifici delvirus o bloccare in maniera preferenziale le sintesi degli acidi nucleicio delle proteine dirette dal virus e non quelle dirette dalla cellulaospite.LIMITI DEI FARMACI ANTIVIRALI1. Hanno uno spettro ristretto e il bersaglio della loro azione è spessouna proteina virale (es. M2) o un enzima (sialidasi, polimerasi otrascrittasi);2. Generalmente non attivi nei confronti dei virus in fase non replicativao quiescente del ciclo vitale;3. Spesso tossici e poco selettivi;4. La modificazione prodotta anche su un solo nucleotide, che comportala sostituzione di un solo aminoacido in posizione critica nella.proteina bersaglio, è spesso sufficiente per lo sviluppo di resistenzaal farmaco antivirale

FARMACI ANTI INFLUENZALIVirus responsabili di patologiedel tratto respiratorio (VRTIs)(incidenza)Raffreddore comune******Bronchite-polmonite****stagione, età, campionamento e tecnica di rilevazioneInfluenza A virus•Anche Picornavirus (poliomelite e meningite);** virus ubiquitario, altamente infettivo, proporzioneepidemiche durante l‟inverno;*** infezioni tratto respiratorio (3% bambini);**** infezioni tratto respiratorio superiore (7-18% adulti)• Virioni: sferici, pleomorfi talvolta filamentosi.• 80-120nm Ø; 200-300nm ;http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ICTVdb/ICTVdB/glycoprotein hemagglutinin and neuraminidase

Costituenti proteici principali del capside dei virusdell‟ influenza:• Emoagglutinina (Glicoproteina)• Sialidasi/Neuraminidasi) (Glicoproteina)• Proteina integrale di membrana M2 ( canale ionico; Vir influenza tipo A)• Proteina integrale di membrana NB (canale ionico; Vir. influenza di tipo B)L’emoagglutinina si lega ai recettori cellulari (si lega ai residui di acidosialico di sialoglicoconiugati) per iniziare la penetrazione del virus.La sialidasi (neuraminidasi) è un enzima che distrugge i recettori perl‟emoagglutinina, situati sulla superficie cellulare (a livello molecolare scinde iresidui terminali di acido sialico dai glucocomplessi cellulari) ed in tal modoconsente il rilascio del virus dalle cellule infettate dopo la sua moltiplicazioneintracellulare.Poiché le secrezioni respiratorie sono composte da mucopolisaccaridicontenenti acido sialico, la sialidasi agendo anche a questo livello facilitala diffusione del virus nell’albero respiratorio.

~500 clustered; 10-14 nm ; 4-6 nm Ø; HA/NA-4,5/1; proprietà antigeniche, classificazione.(16 sottotipi)GlicoproteinedisuperficieGD1Nota anchecomeneuraminidasi(5 sottotipi)GD1(glicoconiugati)HOOHHNOHOO OHOOHOH-Neu5AcN-acetylneuramicacid ; (Sialic acid)

Proteina M2: canale H+ (pH attivato);pr. omotetramerica, transmembranaleGD1

CH 3NH 2H C NH 2AMANTADINAMantadan - RocheRIMANTADINAFlumadine, in USA(non disponibile in Italia)NH 2CH 3C H 3Memantina (AD [PD])MECCANISMO D’AZIONEAmantadina: blocco della proteina M2 del virus dell‟influenza A.Rimantadina: blocco della proteina M2 del virus dell‟influenza A possibileinterferenza con il ciclo replicativo virale (ruolo di una proteina virale espressadal gene virale M2)USI TERAPEUTICIProfilattici per os (virus influenzale A). Efficacia del 70-90% nel prevenire l'influenza.Entro 48 ore dall‟avvenuto contagio, limitano la sintomatologia influenzale riducendosignificativamente la frequenza e la gravità delle complicanze respiratorie.Non presentano attività contro il virus dell‟influenza B.Hanno anche azione, non correlata, nel migliorare i sintomi del PDResistenza a questi farmaci (umani, uccelli, suini) > del 90%

Modello di inibizione M2-Adamantinaperturbazione del pKa delresiduo critico His37NATURE, Vol 451, 31, 2008

8 aa altamenteconservati +ulteriori 10 aainvariati, in tutti iceppi di virusinfluenzali,in prossimità delsito attivo

Structure-based TS inhibitor designKi = 4• 10 -6 MHOOHOHOOOHR=HN NH 2NH4-deoxy-4-guanidino-Neu5Ac2Zanamivir,1999 (GSK)(Relenza ®, inal.Rapida escrez.)Ki = 2• 10 -10 MHNO RNH 24-amino-4-deoxy-Neu5Ac2enKi = 4• 10 -8 MN 3Inibitori, in vitro ed in vivo, dellareplicazione virale nell‟influenza A e BIntermediodi sintesi

RHNOO OHOOHR = X-alchile, arile,…X→O, N, S(Roche)Primo inibitore dellasialidasi attivo pero.s. approvato per lacura dell‟influenza(1999-2000)Utilizzato anche nella crisi influenzaleepidemica causata da H5N1 nel 2005 (cfrinluenza “spagnola” 1918-1919)

HERPES VIRUSSOTTOFAM.virusINFEZIONE PRIMARIAINFEZIONERICORRENTELATENZATropismotessutaleampioH. simplex 1 e 2(HSV1, HSV2)Virus varicellazoster (VZV)Asintom., les. vescicolari cutanee omucose, les. oculari, encefalite,infezione generalizzata (neonatale)VaricellaencefaliteHerpeszoster(fuoco di S.Antonio)cellule deigangli nervosiTropismotessutaleristrettoCytomegalovirus(CMV)Herpesvirusumano 6 (HHV6)e 7 (HHV7)Asintomatica,Infezione congenitamononucleosi.Asintomatica, esantema critico osesta malattia, associazione conconvulsioni febbrili nell‟infanzia,sesta malattia (HHV7)Nessuna nelsoggettosenza deficitimmunitaricelluleepiteliali,endoteliali emonocitiTropismolimitato allecellulelinfoidiVirus di Epstein-Barr (EBV)Herpesvirusumano 8 (HHV8)Asintomatica,mononucleosi infettivaAssociato al sarcoma di KaposiNessuna nelsoggettosenza deficitimmunitaricellule linfoidi

Il 3 DNA classi codifica geni virali perpiù sono di trascritti 50 proteine eessenziali traslati in e attive inmolti specifiche stadi del proteine cicloviraleImmediateearlyproteins:partecipanoalle successivefasi ditrascrizione etraslazioneLe Early particelle proteins: viralimature sintetizzanoraggiungononuovoI nucleocapsidiDNAvescicole viralelascianousandoil nucleoilesocitiche DNApre gemmazionecircolare chefondono qualeattraversotemplato con lamembranaplasmaticaLate proteins:interna nuclearerilasciandoassemblano i(envelopment) nuovivirionicapsidi chefino allo spazioincorporanoperinuclearenuovo DNAviralereplicatoCiclo di replicazione degliHerpesvirusAciclovir (fine „70)9-(2-idrossietossimetil) guaninaHSV-1/2N H 2HNDNA polimerasiHOONINNOONONHOOHHOIdoxuridina (1960)-cheratite erpetica

Transfer nucleotidico (DNA Polimerase)Deossinucleoside trifosfato (dNTP)

N H 2HNONNNOHN H 2HNONONNOHN H 2HNONONNACICLOVIR(Zovirax)Analogo delladeossiguanosinaOHPENCICLOVIR(Vectavir)Analogo delladeossiguanosinaOHGANCICLOVIR(Citovirax)Analogo delladeossiguanosinaOHOON H 2HNNOONNOFAMCICLOVIR(Famvir)Profarmaco(diacetilestere) delpenciclovirOH 2 NCOONH 2HOH NONONNVALGANCICLOVIR(Valcyte)Profarmaco(L-valil estere) delganciclovirH 2 NCOONH 2H NONOVALACICLOVIR(Talavir)Profarmaco(L-valil estere)dell'aciclovirNNH 2 NHOHNHNOHOHNNDEOSSIGUANOSINA

INIBITORI NUCLEOTIDICIDELLA DNA POLIMERASICIDOFOVIR (Vistide, Pharmacia & Upjohn)NH 2NH 2N[(2S)-1-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)-3-hydroxypropan-2-yl]oxymethylphosphonicacidHOOP CH 2OHOONONHO P OOHAnalogo della citidina monofosfatoOOOHNOHMECCANISMO d‟AZIONE: Non richiede l'attivazione da parte della timidina chinasivirale. Chain terminatorFARMACOCINETICA: Emivita compresa tra 20 e 60 ore.OHCIDOFOVIRCITIDINAMONOFOSFATOUSI TERAPEUTICI: Somministrato per infusione e.v. una volta a settimana per duesettimane, poi una volta ogni due settimane come mantenimento, può rallentare laprogressione della retinite da CMV.EFFETTI COLLATERALI: Nefrotossicità, neutropenia, acidosi metabolica, in alcuni casiirite, uveite o ipotonia oculare. Per ridurre il rischio di nefrotossicità la terapia con talefarmaco deve essere associata alla somministrazione di probenecid orale e adun'adeguata preidratazione con soluzione salina isotonica. Oncogeno negli animali.RESISTENZA: Ceppi di CMV resistenti al ganciclovir presentano raramente unaresistenza crociata al cidofovir.

EVOLUZIONE DEGLI INIBITORINUCLEOSIDICI DELLA DNA POLIMERASIHOOOICF 3H NH NO NO NOHOOH 2NOOHNNHNNN NH 2HOHO ONN NOH NH 2 NHO ONNHOHOOHOHIdoxuridinaTrifluridinaPenciclovirGanciclovirAciclovirEvidenzemutagenicitàad alte dosidiEvidenze dimutagenicità adalte dosiEvidenze dimutagenicità adalte dosiNon mutagenico• Tutti gli analoghi nucleosidici anti-HCMV sono significativamente tossici;• Quasi tutti quelli clinicamente efficaci agiscono ai medesimi siti attividella kinasi virale e della DNA polimerasi con conseguente comuneresistenza;• In pazienti affetti da AIDS il 6% di isolati HSV sono aciclovirresistentied il solo trattamento disponibile in questi casi è dato dalfoscarnet.

INIBITORI NON NUCLEOTIDICI DELLA DNA POLIMERASIFOSCARNETphosphonoformic acidNaOONaP COOONaMECCANISMO d’AZIONE: Inibisce la sintesi dell‟acido nucleico virale interagendodirettamente con la DNA polimerasi dell‟herpes virus o con la transcrittasi inversadell‟HIV.USI TERAPEUTICI: Per infusione e.v. (con velocità di infusione controllata in un grandevolume di liquidi) efficace nelle infezioni da HSV o VZV aciclovir-resistenti e nella retiniteda CMV (anche da ceppi ganciclovir-resistenti). E‟ più costoso e generalmente meno bentollerato del ganciclovir. L‟uso associato di foscarnet e ganciclovir può portare beneficio adalcuni pazienti in cui la monoterapia risulta inefficace.EFFETTI COLLATERALI: Tossicità renale, in alcuni casi nausea, vomito, anemia,affaticamento, cefalea, ulcerazioni genitali, disturbi a carico del SNC, ipo- e ipercalcemia,ipo- e iperfosfatemia, ipopotassiemia e ipomagnesiemia. Il foscarnet può accrescere ilrischio di anemia correlata a zidovudina. Causa un danno cromosomico in vitro e in vivoRESISTENZA: Ceppi di HSV, VZV e CMV resistenti al foscarnet possono emergeredurante la terapia. Sono stati segnalati ceppi di CMV resistenti sia al ganciclovir che alfoscarnet.

INIBITORI ESPRESSIONE GENICAOLIGONUCLEOTIDI ANTISENSOOligonucleotidi (13-20, dNP) con sequenza complementare alle regioni di controllo delfilamento di DNA codificante (senso). L‟oligonucleotide (rosso) si lega alle regioni dicontrollo del DNA, formando un complesso a tripla elica che impedisce all‟RNA polimerasidi legarsi al DNA per dare inizio alla trascrizione.FOMIVIRSEN(Vitravene)DNA, d(P-tio) (5‟G-C-G-T-T-T-G-C-T-C-T-T-C-T-T-C-T-T-G-C-G5‟), sale eicosasodico (oligonucleotide fosforotioato)• approvato da FDA come anti-HCMV;• possibile meccanismo di inibizione dell‟espressione genica (antisensocomplementare al mRNA HCMV IE2);• non inibisce l‟espressione della proteina HCMV IE2;• la sequenza del target IE2 non è alterata in mutanti resistenti alfomivirsen;• relativamente potente ma farmacocinetica sfavorevole;• terapeuticamente utile in retinite da HCMV;• necessita di pazienti motivati (iniezione intraoculare).

Ponti diesterei in oligonucleotidi Naturalie S-oligo (Tioati)B= Base Nucleica

Nov 2005

Global summary of the AIDS epidemic 2009Number of peopleliving with HIVTotalAdultsWomenChildren (

Global estimates for adults and children 2009People living with HIV 33.3 million [31.4 million – 35.3million]New HIV infections in 2009 2.6 million [2.3 million – 2.8million]Deaths due to AIDS in 2009 1.8 million [1.6 million – 2.1million]

Adults and children estimated to be living with HIV 2009North America1.5 million[1.2 million – 2.0 million]Western &Central Europe820 000[720 000 – 910 000] [1.3 million – 1.6 million]Middle East & North AfricaCaribbean 460 000240 000[400 000 – 530 000][220 000 – 270 000]Central &South America1.4 million[1.2 million – 1.6 million]Sub-Saharan Africa22.5 million[20.9 million – 24.2 million]Eastern Europe& Central Asia1.4 millionEast Asia770 000[560 000 – 1.0 million]South & South-East Asia4.1 million[3.7 million – 4.6 million]Oceania57 000[50 000 – 64 000]Total: 33.3 million [31.4 million – 35.3 million]

Estimated number of adults and childrennewly infected with HIV 2009North America70 000[44 000 – 130 000]Caribbean17 000[13 000 – 21 000]Central &South America92 000[70 000 – 120 000]Western &Central Europe31 000[23 000 – 40 000]Middle East & North Africa75 000[61 000 – 92 000]Sub-Saharan Africa1.8 million[1.6 million – 2.0 million]Eastern Europe& Central Asia130 000[110 000 – 160 000]East Asia82 000[48 000 – 140 000]South & South-East Asia270 000[240 000 – 320 000]Oceania4500[3400 – 6000]Total: 2.6 million [2.3 million – 2.8 million]

20th anniversary of World AIDS Day (2008)World AIDS Day, observed each year on 1 December, is dedicated to raisingawareness of the HIV/AIDS epidemic. It provides an opportunity to expresssolidarity and support for those living with HIV/AIDS, and to ensure thepandemic is kept on the national and international agenda. Globally, an estimated33 million people are living with HIV, with nearly 7500 new infections each day.Message for World AIDS DayDr Margaret Chan, WHO Director-General…Well over 3 million people in low- and middle-income countries are now receiving lifeprolongingantiretroviral therapy. Such an achievement was unthinkable 20 years ago, whenthe world was just beginning to comprehend the significance of this disease and itscatastrophic impact on individuals, families, and societies….….AIDS is the most challenging and probably the most devastating infectious diseasehumanity has ever had to face….….The AIDS epidemic showed the relevance of equity and universal access in a substantialway. With the advent of antiretroviral therapy, an ability to access medicines and servicesbecame equivalent to an ability to survive for many millions of people…..On this World AIDS Day, let us redouble our determination to build on past success and torally our forces against the remaining obstacles – in a spirit of solidarity and for the sake ofhuman dignity.

Sindrome da immunodeficienza acquisita• Hiv: le cellule bersaglio sono i linfociti T di tipo CD4, fondamentali nella risposta adattativa controsvariati tipi di agenti patogeni.• L'infezione da Hiv provoca indebolimento progressivo del sistema immunitario (immunodepressione),aumentando il rischio di infezioni e malattie da parte di virus, batteri, protozoi e funghi, che incondizioni normali potrebbero essere curate più facilmente.• I sieropositivi producono anticorpi diretti e possono trasmettere l‟infezione anche prima che glistessi siano dosabili nel sangue 4-6 w, 6m).•Incubazione anche anni fino a quando la malattia non diventa clinicamente conclamata causainsorgenza infezioni cosiddette "opportunistiche“: :• protozoi (Pneumocistis carinii, polmonite (pneumocistosi e Toxoplasma gondii) che provoca latoxoplasmosi, malattia che colpisce il cervello, l'occhio e raramente il polmone ), batteri(Mycobacterium tuberculosis), virus (Herpes e Cytomegalovirus), funghi (Candida albicans) bocca,esofago e polmoni.•Nella fase conclamata dell'Aids si possono sviluppare diverse forme di tumore, soprattutto linfomi esarcoma di Kaposi.

L'HIV è un virus con genoma ad RNA appartenente allafamiglia dei Retrovirus, genere Lentivirus.L‟ HIV potrebbe essersi evoluto da un virus delle scimmie(SIV), originario dell‟Africa.) Attualmente se ne conoscono due tipi principali: HIV-1,(sottotipi A,B e C) diffuso in tutto il mondo e HIV-2,presente solo in alcuni paesi africani, e meno virulento deltipo 1.L'infezione da HIV causa la sindrome daimmunodeficienza acquisita (AIDS), una sindromeidentificata per la prima volta nel 1983-84 (Montaigner-Gallo).Françoise Barré-Sinoussi (Parigi, 30 luglio 1947) e Luc Montagnier (Chabris, 18agosto 1932) Nobel per la Medicina 2008Harald zur Hausen (11 marzo 1936) ruolo del papilloma virus nello sviluppo delcancro della cerive uterina

Principali cellule bersaglio dell‟ HIVCellule che contengono i recettori CD4(punto di attacco dell’ HIV)• Linfociti T• Macrofagi• Cellule nervose

CICLO DI REPLICAZIONE DEI RETROVIRUSgp120Adsorbimento, penetrazioneDecapsidizzazionevRNATrascrizioneinversaRecettoreCD4TATTrascrizioneDNADNAvRNAcDNAAssemblaggioIntegrazionenel genomaGemmazionemRNAvRNATraduzionePrecursoriproteineProteineRilascioIdrolisi

HIVRetrovirus che replicamediante un DNA prochirale(doppia elica) intermedioFase cruciale nel cicloreplicativo→trascrizione delgenoma virale (s. el.) a DNAprovirale (d. el.)Fase HIV specificanature reviews drugdiscovery volume 6,|december, 2007, 10

Viral entry inhibitorsEnfuvirtide:peptide omologo dellaregione HR2Infezione di cellule CD4 + :• La glicoproteina virale gp120 interagisce in sequenza con il recettore CD4 e con il corecettoreCCR5 o CXCR4;• Questa sequenza opera una modificazione conformazionale della proteina gp120 e laconseguente apertura all‟interazione dell‟estremità del peptide di fusione gp41 (quaturodomini funzionali: HR1, HR2, peptidi di fusione).con la membrana della cellula ospite;

Capostipite di una nuova classe difarmaci anti–HIV (approvazioneaccellerata)E‟ un polipeptide di 36 AA :MeCOTyr--------- Phe NH2• Usato in combinazione conHAARTs;• Iniez. Sc.• Resistenza per mutazione HR1non crociata con altri entryinhibitors;• Sinergia con rapamicina incaso di HIV che usano corecettoriCCR5 (riduzioneespressione CCR5).L‟enfuvirtide si lega ad una regione del gp41che ne media il cambiamento conformazionaledall‟intermedio “pre-forcina” alla struttura difusione attiva, prevenendo così la fusione el‟ingresso del virus (in basso a destra).

Viral entry inhibitors: antagonisti co-recettoribridging sheet (V3 loop)Chemochine umaneAntagonisti CCR5• una delezione naturale nel gene CCR5conferisce resistenza ai virus CCR5-tropic strain tra i più frequentementetrasmessi sessualmente;•Trials clinici del MARAVIROC sospesinel 2005 per incremento enzimi epaticie bilirubina; definitivamente approvatoFDA nel 2007 (Selzentry); variantiCXCR4 insensibili;

TERAPIA ANTIRETROVIRALEFino al 1996, sopravvivenza media di un paziente sieropositivo dalmomento della diagnosi di AIDS : circa 10-12 mesi.Negli ultimi anni : miglioramento oltre che della durata anche della qualitàdella vita.Cronicizzazione l'infezione, cioè arresto dell'evoluzione atempo indeterminato.I dati indicano che l'emivita dei linfociti CD4+ di memoria contenenti ilprovirus in forma latente va da 6 a 44 mesi.L'eradicazione dell'infezione con la sola terapia antiretroviralerichiederebbe quindi oltre dieci anni, e non è pertanto un obiettivorealisticamente realizzabile.

RESISTENZA.La resistenza puo‟ essere determinata da :• Mutazioni (Single or Multiple point mutations) nei geni che codificanoper la sintesi degli enzimi virali ( in particolare della HIV proteasi e RT) .• Amplificazione genica.Poiché le mutazioni compaiono durante la replicazione, è evidente che laloro insorgenza è la diretta conseguenza di una incompleta soppressionedell'attività virale, quale si verifica per esempio in caso di terapiasbagliata o insufficiente ( pressione selettiva).Riduzione rischio resistenza :- utilizzare combinazioni di più farmaci, con meccanismo di azione diverso- ottimizzare l'adesione del paziente alla terapia.

TRASCRITTASI INVERSA (RTI)• La trascrittasi inversa (RTI) catalizza la trascrizione dell'RNA virale inuna doppia catena di DNA lineare,• La RTI agisce in una prima fase come una DNA polimerasi RNAdipendente,sintetizzando una prima catena di DNA complementare auna catena di RNA virale, mentre nella fase successiva si comporta daDNA polimerasi DNA-dipendente, sintetizzando una seconda catena diDNA sullo stampo del DNA neoformato.• Tutti gli inibitori della trascrittasi inversa prevengono l'infezione dinuove cellule, senza peraltro interferire con la replicazione dell'HIV giàintegrato nel genoma della cellula; bloccano pertanto l'infezione acutadelle cellule, ma solo in misura minima sono in grado di agire sulle celluleinfettate cronicamente.

Nucleoside analogues as polymerase substratesand chain terminatorsMaintain recognition of 5’-OHHOOBaseMaintain base-pairing correctlyHOPrevent chain extension by removal of 3’-OHHOOThymineHOOBaseN 33’-azido T (AZT, Zidovudine)Anti HIV agent (Retrovir)2’-3’-dideoxy nucleosidesChain terminators for DNA sequencing

INIBITORI DELLA TRASCRITTASI INVERSA• Analoghi nucleosidici e nucleotidici (NRTIs)(attivi su HIV-1, HIV-2 e altri virus)• Vengono fosforilati a 5'-trifosfato• I derivati trifosfato possono comportarsi sia da inibitori, che da“falsi substrati” della trascrittasi inversa;• Essendo privi dell’ ossidrile in 3’ provocano l'arrestodell'allungamento della catena di DNA (chain terminator).• Inibitori non nucleosidici (NNRTIs)(possiedono un'attività antivirale limitata all'HIV-1)Inibiscono l’ enzima legandosi ad un sito allosterico.

INIBITORI DELLA TRASCRITTASI INVERSA•Meccanismo d‟azione semplificato ( es. 2‟,3‟-dideossicitidina) di inibitori nucleosidicidella trascrittasi inversa (NRTIs);•Tre stadi di fosforilazione convertono il 2‟,3‟-dideossinucleoside nel suo derivato 5‟-trifosfato (chain terminator)

INIBITORI NUCLEOSIDI DELLA TRASCRITTASI INVERSA (NRTIs)HOH 3 CHN 3OONNHOHOH 3 CHOONNHOHOHONH 2NNOHOHOSNH 2NNOZIDOVUDINA(3'-azido-3'-deossitimidina; AZT)(Retrovir, Glaxo Wellcome)Analogo della timidinaSTAVUDINA(2',3'-deidro-3'-deossitimidina)(Zerit, Bristol M. Squibb)Analogo della timidinaZALCITABINA(2',3'-dideossicitidina DDC)(Hivid, Roche)Analogo delladeossicitidinaLAMIVUDINA(2'-deossi-2'-tiacitidina)(Epivir, 3CT, Glaxo Wellcome)Analoghi delladeossicitidinaHONHOHNONNH 2 NHONHNHNONNHOHFONH 2NNSODIDANOSINA(2',3'-dideossiinosina DDI)(Videx, Bristol M. Squibb)Analogo dell'inosinaABACAVIR(Ziagen, Glaxo Wellcome)Analogo della deossiguanosina edella deossiadenosina.EMTRICITABINA(2'-deossi-2'-tiacitidina)(Emtriva, Gilead Sciences)

INIBITORI NUCLEOTIDICI DELLA TRASCRITTASIINVERSA (NtRTIs)TenofovirNNH 2NNN•Meccanismo d‟azione simile ai NRTIs ma la presenzadi un gruppo fosfonato abilita queste molecole al bypassdella prima reazione di fosforilazione che puòlimitare l‟attività;O•A differenza del fosfato, il fosfonato non può essereidrolizzato da esterasi che normalmente convertono ilnucleoside monofosfato a nucleoside;HO P OHO•Ad oggi il soloTenofovir è stato approvato da FDA peril trattamento dell‟HIV.• Usato in combinazione con Emtricitabine ( fixedratio/Truvada). Anche come profillatticoEffetti collaterali importanti: tossicità epatica (epatomegalia) e acidosi lattica (comune a tutta laclasse)

Nuovi NRTIs (Fase IIIa/b)Approvato2008Festinavir

INIBITORI NON NUCLEOSIDICI DELLATRASCRITTASI INVERSA (NNRTIs)Si legano probabilmente ad un sito allosterico della RTNHNNNEVIRAPINA(Viramune, Boehringer Ing)11-CYCLOPROPYL-5,11-DIHYDRO-4-METHYL-6H-DIPYRIDO[3,2-B:2„,3'-E][1,4] DIAZEPIN-6-ONEONClF 3 CNHEFAVIRENZ(Sustiva, DuPont-Merck)(S) -6- chloro-4-(cyclopropylethynyl)-1,4-dihydro-4-(trifluoromethyl)2H-3,1-benzoxazin-2-oneOOHNSO ONHNONNHNTutti gli NNRTI possono provocareun rash cutaneo a volte graveDELAVIRDINA(Rescriptor, Pharmacia & Upjohn)1-[3-[(1-methyl-ethyl)amino]-2-pyridinyl]-4-[[5-[(methylsulfonyl)amino]-1H-indol-2-yl]carbonyl]monomethanesulfonate

RILPIVIRINENNRTI di seconda generazione.Approvato nel 2011.Piu‟ potente dei precedentiNNRTIsETRAVIRINENNRTI di seconda generazione.Approvato nel 2008.Piu‟ potente dei precedentiNNRTIs

INIBITORI DELLA HIV PROTEASILe proteasi sono enzimi richiesti per la reazione di degradazione dimolecole proteiche precursori di proteine funzionali “mature” (qualitrascrittasi inversa, integrasi ed altre proteasi).Gli inibitori delle proteasi bloccando quindi la maturazione delle nuoveparticelle virali, danno luogo alla formazione di particelle virali incomplete,prive di capacità infettante.Dal punto di vista metabolico, gli inibitori della proteasi vengonotrasformate da un citocromo P450, in particolare l'isoenzima 3A. Poichénumerose altre sostanze (farmaci) vengono metabolizzate dallo stessocitocromo, si possono verificare interazioni importanti e pericolose.Molti inibitori delle proteasi possono provocare disturbi gastrointestinali,aumento del rischio di sanguinamento negli emofilici, iperglicemia, insulinoresistenzae iperlipidemia associati con un aumento del rischio di ateropatiacoronarica. E’ stata osservata anche una sindrome lipodistroficacaratterizzata da perdita, riaccumulo e ridistribuzione di grasso

Meccanismo di Azione delle Aspartil ProteasiOOOHNH OR 1OONHA s pHR 2Oc a t a l i s ia c i d o - b a s e g e n e r a l eHN- O A s pO H R 2O HNHOHNR 1+H 2NR 2O HR 1H OHOOO- OA s pA s p

A-D inibitori dello stato di transizione

SNON NCH 3 H OHNOHNHONOSRITONAVIR(Norvir,Abbott)NSAQUINAVIR(Invirase, Roche)OHNONHONH 2OHONHHNHHNONOHNOHNHOOH 3 CCH 3LOPINAVIR(lopinavir/ ritonavir:Kaletra, Abbott, in USA)NELFINAVIR(Viracept,Roche)HNONOHSNHOCH 3OHSO 2 NOHNHOOOOHNHOOHONHNNH 2 NAMPRENAVIR(Agenerase, GlaxoWellcome, in USA)INDINAVIR(Crixivan, MerckSharp & Dohme)N

OOONHOHO ON SOONH 2HO NSOHO ON SNH 2AmprenavirS, S, R = IC 50 = 0,001 μMS, S, R = IC 50 = 1,4 μΜS, S, S = IC 50 = 11,6 μMS, R, S = IC 50 = 12,5 μMS, R, R = IC 50 = 16,7 μMemivita (idrolisi) ~ 10minemivita (idrolisi) ~ 10min

Nuovi inibitori dell‟ HIV proteasiNH 2OONHNOHNNOHNHOHNAtazanavirReyatazOOOOSNOP O- OO -Ca ++HNOFosamprenavirLexivaOO(Profarmaco)Darunavir(Prezista)

FARMACI ATTIVI CONTRO I RETROVIRUSINIBITORIPROTEASIAMPRENAVIR (Agenerase)INDINAVIR (Crixivan)NELFINAVIR (Viracept)RITONAVIR (Norvir)mRNASAQUINAVIR (Invirase)LOPIN. + RITON. (Kaletra, inUSA)vRNAvRNADNADNAvRNAcDNAINIBITORITRASCRITTASIINVERSAZIDOVUDINA (Retrovir)STAVUDINA (Zerit)ZALCITABINA (Hivid)LAMIVUDINA (Epivir)DIDANOSINA (Videx)ABACAVIR (Ziagen)NEVIRAPINA (Viramune)EFAVIRENZ (Sustiva)DELAVIRDINA (Rescriptor)ZIDOV. + LAMIV. (Combivir)ZIDOV. + LAMIV. +ABACAVIR (Trizivir)++PrecursoriproteineProteine

Terapia HAARTNelgi ultimi anni sono stati sviluppati diversi protocolli terapeutici cheprevedono l’uso combinato di piu’ farmaci antiretrovirali.Questo approccio, che va sotto il nome di “highly active antiretroviraltherapy” (HAART), ha portato ad un significativo prolungamento dellasopravvivenza e ad una marcata riduzione di infezioni opportunistiche e didecessi.Se la HAART viene iniziata precocemente ed utilizzata costantemente ecorrettamente, si possono avere alte percentuali di sopravvivenza.Inoltre è di fondamentale importanza l’aderenza alla terapia.La “highly active antiretroviral therapy” comporta l’ associazione di dueNRTI con un inibitore NNRTI, oppure con uno o due inibitori di proteasi

Terapia HAART: combinazioni ( dosi fisse)Combinazione di due FarmaciCOMBIVIR : AZT/Lamivudine;KALETRA: lopinavir/ritonavir;TRUVADA: tenofovir/ emtricitabine (FTC )EPZICOM: abacavir/lamivudineCombinazione di tre FarmaciTRIZIVIR: AZT/lamivudine/abacavir;ATRIPLA: efavirenz/emtricitabine /tenofovir .COMPLERA: rilpivirine /tenofovir /emtricitabine .

INTERFERONIGli interferoni (IFN) sono una famiglia di proteine inducibili, adattività antivirale, immunomodulatrice ed antiproliferativa,sintetizzate dalle cellule dei mammiferi in risposta a vari induttori.Gli interferoni umani sono stati suddivisi in tre classi principali:• alfa (IFN- , leucocitario),• beta (IFN- fibroblastico) e• gamma (IFN – linfocitario o immunitario).L’IFN- e l’IFN- possono essere sintetizzati da quasi tutte le cellulein risposta all’infezione virale o a molti altri stimoli.L’IFN- , è prodotto solo dai linfociti T e dalle cellule natural killer inrisposta a stimoli antigenici e a specifiche citochine. Possiede minoreattività antivirale rispetto agli interferoni e , ma una più potenteazione immunostimolante.

Principali applicazioni terapeutiche• Condiloma acuminato , infezione da papillomavirus• Epatite C e B cronica, infezioni da Herpes virus• Tumori maligni ( CML) e sclerosi multipla.Meccanismo di azione multiplo• Induzione della sintesi di proteine antiviraliLe proteine AV agiscono bloccando diverse fasi della replicazione virale(trascrizione, traduzione e modificazioni post-traduzionali delle proteine,assemblaggio e liberazione del virus).• Inibizione della sintesi di proteine virali.• Modifica della risposta immunitaria all’infezione.

MECCANISMO di AZIONE DELL’ INTERFERONEInibizione dellamoltiplicazione viraleMaterialegeneticodel virusStimoloProteineviraliMaterialegeneticodel virusProteineantiviraliNucleodellacellulaNucleodellacellulaCELLULA INFETTAINTERFERONEStimoloCELLULA SOTTO L’AZIONEDELL’ INTERFERONE

IFN-Attività antivirale e antiproliferativa; Disponibile come• alfa-2a (Roferon-A, Roche), alfa-2b (Intron-A, Schering Plough),alfa-nl (Humoferon, Sigmatau; Wellferon, Glaxo Wellcome)alfacon-1 (Infergen-Yamanouchi Pharma)• interferone alfa-2b “pegilato” (coniugato con polietilenglicole)(PegIntron-Schering-Plough) (la pegilazione ritarda la clearancedell’interferone e permette una somministrazione monosettimanale).IFN-•(Betron, Italfarmaco) Ottimo antivirale, incoraggianti risultatinella sclerosi multipla.IFN-•(Gammakine, Dompé) Impiegato nella terapia dei tumori peraumentare la risposa immunitaria del paziente.

MECCANISMO DI REPLICAZIONE DEL VIRUS HBV

FARMACI PER L’ EPATITE CRONICA B• Interferoni alfa (2a o 2b)• Lamivudina ( anti AIDS)• Adefovir dipivoxileIl trasferimento del farmaco in questo ambito ha seguito l'osservazione che lalamivudina, oltre ad inibire la replicazione dell'HIV, era anche capace di reprimere losviluppo dell'HBV nei pazienti con AIDS, coinfettati da quest'ultimo virus.NH 2OHOONSNLAMIVUDINA(2'-deossi-2'-tiacitidina)• Agisce quale analogo delladeossicitidina; il metabolita attivo è lalamivudina 5'-trifosfato.• Interagisce selettivamente con latrascrittasi inversa sia dell'HIV chedell'HBV, bloccando la sintesi del DNAvirale.• Viene incorporato nel DNA nascente dicui termina prematuramentel'estensione della catena. (chainterminator)

INIBITORI NUCLEOTIDICI DELLA TRASCRITTASI INVERSA (NtRTIs)(EPATITE B)NH 2NNNNO POO OOOOOADEFOVIR DIPIVOXILE(Preveon)(pro-drug orale; forma attiva: adefovir)9-[2-[bis[(pivaloyloxy)methoxy]phosphinyl]methoxy]ethyl]adenineMECCANISMO D‟AZIONE: L‟adefovir agisce quale analogo dell‟adenosinamonofosfato.EFFICACIA CLINICA: ATTIVO vs il virus dell'epatite B; E‟ statoapprovato dall‟ FDA nel 2002 per infezioni da HBV. Inattivo verso HIV;

Ciclo di replicazione delvirus dell‟ Epatite C (HCV)

FARMACI PER L’EPATITE CRONICA C• Interferoni alfa-2a, alfa-2b o interferone alfacon-1• Associazione interferone PEG alfa-2a più ribavirina orale.OHN2 NNNHOOOH OHRibavirina ( RBV)• Nucleoside sintetico, con struttura “simile”alla guanosina.• Inibisce una vasta gamma di virus a DNA ea RNA.• Viene fosforilato a derivati mono-, di- etrifosfato• Inibisce la sintesi dell'RNA messaggerovirale.

MECCANISMO D’AZIONE DELLA Ribavirina

Evoluzione della Risposta Virologica allaterapia contro l‟ HCV (Genotipo I)RISPOSTE AL TRATTAMENTO CON IFN E SUECOMBINAZIONI CON RIBAVIRINA

DAAs: Direct-Acting Antiviral AgentsInibitori del Processing di Poliproteine:NS3/4A protease inhibitorsQuesta serin-proteasi è responsabile del cleavage di poliproteine che originaproteine vitali per la replicazione dell‟ HCV.Telaprevir (appr. 2011).Boceprevir (fase III)Terapia dell‟HCV in combinazione con RBV e PEG-IF2a

Diapositive Addizionali

CLASSIFICAZIONE dei VIRUSFamigliaSottofamigliaGenereSpecie• comportamento in colture cellulari (tropismo, cpe,velocità repl.)• epidemiologia (recettività, modalità di trasmissione,patogenicità)• sensibilità agenti fisico-chimici : resistenza a pH 3 per30‟; stabilità a 50-56°C per 30‟• caratteristiche antigeniche: sierotipi• caratteristiche genomiche: genotipi• Ordine suffisso -virales• Famiglia suffisso –viridae• Sottofamiglia suffisso –virinae• Genere suffisso –virus

Nomenclatura virale• Es.: Ordine MononegaviralesFamiglia RhabdoviridaeGenere Lyssavirus“specie” virus della rabbia• Es.: Ordine MononegaviralesFamiglia ParamyxoviridaeSottofamiglia ParamyxovirinaeGenere Morbillivirus“specie” virus del cimurro del cane• non tutte le famiglie sono comprese in un ordine• non tutte le famiglie hanno una sottofamiglia• alcune famiglie hanno 1 solo genere, altre numerosi generi

CLASSIFICAZIONE dei VIRUSsecondo Baltimore• Classe I: ds DNA (Adeno, Asfar, Herpes, Papilloma,Polio, Pox)• Classe II: ss DNA (Circo, Parvo)• Classe III: ds RNA (Birna, Reo)• Classe IV: ss (+) RNA (Calici, Corona, Flavi, Pico, Toga)• Classe V: ss (–) RNA (Arena, Bunya, Filo, Ortho, Para,Rhabdo)• Classe VI: ss (+) RNA con intermedio DNA (Retro)• Classe VII: ds DNA con intermedio RNA (Hepadna)

Karpf/Trussardi synthesis• 14 stadi• % Y (overall) 17-22%acid;(−)-shikimico• Si evita l‟ uso di azidipotenzialmente esplosive(cfr sintesi Roche)• Si è vincolati dall‟uso diacido (-)-shikimico quales.p. chirale.high purity(99.7%)New, Azide-Free Transformation of Epoxides into 1,2-DiaminoCompounds: Synthesis of the Anti-Influenza NeuraminidaseInhibitor Oseltamivir Phosphate (Tamiflu) Martin Karpf and RenéTrussardi J. Org. Chem.; 2001; 66(6) pp 2044 - 2051; (Article)

Corey synthesisiodolattamizzazione• 11 stadiDBU (eliminazione)A Short Enantioselective Pathway for the Synthesis of the Anti-Influenza Neuramidase InhibitorOseltamivir from 1,3-Butadiene and Acrylic Acid Ying-Yeung Yeung, Sungwoo Hong, and E. J. CoreyJ. Am. Chem. Soc. 2006; 128(19) pp 6310 - 6311; (Communication)

1. De Novo Synthesis of Tamiflu via aCatalytic Asymmetric Ring-Opening ofmeso-Aziridines with TMSN3 YuheiFukuta, Tsuyoshi Mita, Nobuhisa Fukuda,Motomu Kanai, and Masakatsu ShibasakiJ. Am. Chem. Soc.; 2006; 128(19) pp 6312- 6313; ^2. Second Generation Catalytic AsymmetricSynthesis of Tamiflu: Allylic SubstitutionRoute Tsuyoshi Mita, Nobuhisa Fukuda,Francesc X. Roca, Motomu Kanai, andMasakatsu Shibasaki Org. Lett.; 2007;9(2) pp 259 - 262; (Letter)Shibasaki Synthesis

A Practical Synthesis of (-)-OseltamivirNobuhiro Satoh, Takahiro Akiba, SatoshiYokoshima, Tohru Fukuyama Angew.Chem. Int. Ed. 2007, 46, 5734 –5736Fukuyama synthesis

Struttura e riconoscimento molecolaredell‟ HIV

Riconoscimento e penetrazione delvirus HIV

INIBITORI NON NUCLEOTIDICI DELLA DNA POLIMERASI(NNDPIs cfr NNRTIs)highthroughput screening di grandi librerie di composti• attività anti-herpesvirus ad ampio spettro (# da NNRTIs);• poco attivi vs DNA polimerasi umana;• PNU-183792 privo di tossicità fino a 100 M;• possibile meccanismo di inibizione della DNA polimerasi competitivo con dNTPs• Attivo o.s. in animale; fase I-II

Replicazione delDNA degliHerpesvirusComunemente utilizzati inHSV e infezioni da varicellazoster virus (VZV)primosomaRNA Primerposizionato dall‟attivitàprimasica del complessoDNADNA polimerasiO.S.Prima molecola utilizzatain HSV e HSV cheratitisinfezioni da humancytomegalovirus (HCMV)

Global Transmission of Oseltamivir-Resistant Influenzan engl j med 360;10; march 5, 2009