I test di funzione piastrinica - Cuorediverona.it

P come Piastrine……come prezzemolo.I TEST DI FUNZIONE PIASTRINICA: QUESTI SCONOSCIUTIDr. Roberto Facchinetti,Laboratorio Analisi OCM VRSabato 18 febbraio 2006

La piastrina: cellulamultifunzionale• Emostasi: adesione, attivazione, aggregazione, attivitàprocoagulante, retrazione coagulo, riparazione tissutale.• Regolazione tono vascolare: rilascio di serotonina,trombossano, prostaglandine.• Flogosi: aterosclerosi, chemiotassi, interazioni PLTS-Leucociti.• Difesa: fagocitosi, attività battericida, produzione di superossido.• Biologia dei tumori: crescita dei tumori, metastasi.

Piastrine ed EmostasiTROMBOSIATEROSCLEROSIA riposoattivaNORMALEEMOSTASIEMORRAGIA

Normale emostasiAnimazione

Formazione trombo piastrinicoFase Agonista RecettoreADESIONE VWF GPIb-IX-VCollageneGPIa-IIa, GPVIFBGαΙΙβ−β3Fibronectinaα5−β1Lamininaα6−β1ATTIVAZIONE Trombina PAR1-PAR4, GPIb-IX-VADPP2YTrombossano A2 TPEpinefrinaαΙΙAAGGREGAZIONE FBG,vWF,fibronectina αΙΙβ−β3STABILIZZAZIONE P-selectinaGPIb-IX-VCD 40 Ligando αΙΙβ−β3INIBIZIONE PGI2 IP

Piastrine ed emorragiaA riposoattivaNORMALEEMOSTASIEMORRAGIA

Difetti emostasi1) Fase vascolare2) Fase piastrinica3) Fase coagulativa

Difetti della fase vascolarebForme primitive- ereditarie: telengectasia di Rendu-Oslermalattie ereditarie del connettivo- porpore idiopaticheForme acquisite- Sindrome di Schonleich-Henoch- Forme secondarie (infezioni, farmaci, nefropatie, diabete,ipertensione, scorbuto, porpora ortostatica)

DIFETTI PIASTRINICI: PiastrinopenieDa ridotta produzione: Aplasia midollare (idiopatica, farmaci, tossici, rx)Sostituzione midollare (leucemie, altre neoplasie)Piastrinopoiesi inefficace: deficit B12 o Folati, emoglobinuriaparossistica notturna, s. di Wiskott-Aldrich,Ridotta sopravvivenza piastrinica:Distruzione immunomediata: Werlhof, HIT, autoAbConsumo: CID, porpora trombotica trombocitopenica (s. di Moschowitz)Sindrome emolitico-uremica (s. di Gasser)Alterata distribuzione: splenomegalie

Difetti piastrinici: piastrinopatieAcidoArachidonico- GP Ia: recettore per TrombinaTrombossanorecettore per VWFA2GP IIb-IIIa: rec per FBG, VWFAspirina e Aspirin-like syndromeBernard SoulierGlanzmannCalcioCONTRAZIONERILASCIOP2Y Recettore ADPRecettore adrenalinaVia del PAFMal. Di Von WillebrandPiastrine grigieStorage pool diseaseα granuliVWF, fattori , P-selectinaGranuli densi: storage poolADP, serotonina

DIFETTI PIASTRINICI: PiastrinopatieAcquisite- FANS, Uremia, Malattie mieloproliferative- Storage pool disease acquisito (durante DIC, in trombosi estese).- Malattia di Von Willebrand acquisitaCongenite ereditarie- Malattia di Von Willebrand: nella forma lieve prevalenza 1/100- Sindrome di Bernard-Soulier- Aspirin-like disease- Storage pool disease (isolato o nelli sindromi di Hermansky-Pudlak,Chediak-Higashi, Wiskott-Aldrich, sindromi congenite con piastrinopeniaed assenza del radio)- Tromboastenia di Glanzmann

TEST DI FUNZIONE PIASTRINICATESTSemplicitàTradizioneInteresseemorragiaInteresseateroTrombosiDisponibilitàAzienda VR1) Anamnesi edesame obbiettivo++++++++++++++SI2) Conta , MPV+++++++++++++SI3) Test in vivo++++++++++SI4) Test in vitro++++++++++++SI5) Studi surecettori emetaboliti++++++++++++Si, no routine

TEST DI FUNZIONE PIASTRINICATESTSemplicitàTradizioneInteresseemorragiaInteresseaterotrombosiDisponibilitàAzienda VR1) Anamnesi edesameobbiettivo++++++++++++++SI2) Conta , MPV+++++++++++++SI3) Test in vivo++++++++++SI4) Test in vitro++++++++++++SI5) Studi surecettori emetaboliti++++++++++++Si, noroutine

1) ANAMNESI FAMILIARE E PERSONALE• Chirurgia maggiore o traumi. The finding that a patienthas recently withstood surgery without bleeding complications in manyways constitutes a better test of systemic hemostasis than anylaboratory test could possibly provide. A.I. Shafer• Chirurgia minore: odontoiatria, tonsille, circoncisione.• Flusso mestruale, parto, secondamento.• Piccoli traumi, iniezioni e vaccinazioni.• Uso di farmaci, anche “da banco”.• Malattie sistemiche concomitanti (rene, fegato,connettivo, linfo e mieloproliferative, sepsi, cancro).

1) ESAME OBBIETTIVO.Caratteristiche del sanguinamentoPROBABILE DIFETTO VASCULO-PIASTRINICO- Spontaneo o immediato dopo trauma.- Superficiale. Petecchie, ecchimosi, mucose (naso, bocca,tratto gastrointestinale e genitourinario).PROBABILE DIFETTO COAGULATIVO- Provocato, ritardato.- Profondo. Ematomi, articolazioni, retroperitoneo.

TEST DI FUNZIONE PIASTRINICATESTSemplicitàTradizioneInteresseemorragiaInteresseaterotrombosiDisponibilitàAzienda VR1) Anamnesi edesame obbiettivo++++++++++++++SI2) Conta , MPV+++++++++++++SI3) Test in vivo++++++++++SI4) Test in vitro++++++++++++SI5) Studi surecettori emetaboliti++++++++++++Si, noroutine

Indagini di laboratorio: la correttafase preanaliticaCORRETTA PREPARAZIONE PAZIENTE: riposo, digiuno,orario, farmaci.CORRETTO PRELIEVO: stasi venosa, materiali, provetta,livelli di riempimento.CORRETTO TRASPORTO: tempo, temperatura.CORRETTO TRATTAMENTO DEL CAMPIONE:centrifugazione, preparazione reagenti e strumenti, vetreria.Fasi fuori dal controllo diretto del Laboratorio

2) Conta piastrinica, ISistema di Rilevazione Resistivo.DCTransducerChamberExternalElectrodeBlood CellSuspensionDC SupplyResistanceAl passaggio in un foro le celluleinterrompono un campo elettrico,generando un impulso.ApertureInternalElectrode

2) Conta piastrinica, IICitometria a Flusso in fluorescenza.Un Laser colpisce il campione.Vengono rilevati i seguentisegnali:•Scatter frontale:Volume della Cellula•Scatter laterale: Contenutocellulare (nucleo, granuli)•Fluorescenza laterale:quantità di RNA e DNApresenti nella cellulaLa combinazione di questi 3 segnali consente ilriconoscimento e la conta di di ogni singola cellula

TEST DI FUNZIONE PIASTRINICATESTSemplicitàTradizioneInteresseemorragiaInteresseateroDisponibilitàin Aziendatrombosi1) Anamnesi edesame obbiettivo++++++++++++++SI2) Conta , MPV+++++++++++++SI3) Test in vivo++++++++++SI4) Test in vitro++++++++++++SI5) Studi surecettori emetaboliti++++++++++++Si, noroutine

3) Test in vivo: il tempo di emorragiaTest globale. Valuta le fasi: Vascolare, Piastrinica, CoagulativaVa eseguito in modo standardizzato: metodo Ivy mod. Mielke1) Bracciale sfigmomanometro a 40 mmHg,2) Taglio standardizzato orizzontale,lunghezza 5 mm, profondità 1 mm (Surgicutt*),3) Asciugare ogni 30 secondi,4) Vn < 7 minuti.LIMITI:Test aspecifico. Sensibilità e riproducibilità non ottimali.Richiede personale esperto. Richiede tempo.*Esiste Surgicutt dedicato per bambino e neonato.

TEST DI FUNZIONE PIASTRINICATESTSemplicitàTradizioneInteresseemorragiaInteresseateroDisponibilitàin Aziendatrombosi1) Anamnesi edesame obbiettivo++++++++++++++SI2) Conta , MPV+++++++++++++SI3) Test in vivo++++++++++SI4) Test in vitro++++++++++++SI5) Studi surecettori emetaboliti++++++++++++Si, noroutine

4) Test funzionali in vitro.Adesività piastrinica su sangue intero.SUPERFICIE ADESIVATest di Hellem: palline di vetroIMPACT Diamed: polistireneCONTAPIASTRINEDIFFERENZACONTAPIASTRINE

4) Test funzionali in vitro.Aggregometria classica (Born).Agente aggregante“AGONISTA”LUCE

Born: vantaggi e svantaggi• Vantaggi: uso di svariati agonisti,diagnostica approfondita.• Svantaggi: campione plasma, indaginosa,richiede tempo, operatori esperti.

Sviluppi della aggregometria• Aggregometria su sangue intero ad impedenza. Più sensibile della turbidimetricaai farmaci anti GPIIb-IIIa (es. abciximab). Combinato con misura di luminescenzapuò studiare il rilascio di ADP.• Aggregometria con light-scattering. E’in grado di rilevare microaggregati.• Rapid Platelet Function Analyzer (RPFA), Ultegra: aggregometro turbidimetrico.Proposto per rivelare resistenza al clopidogrel e aspirina.• Hemostasis Analysis System (HAS), Hemodine: misura la forza contrattile dellePLTS e la generazione di trombina (accorciato in stati trombofilici, in malattiacoronarica e diabete).• IMPACT Diamed: su piatto di polistirene. Sangue intero. Misura la superficie diaggregazione ed i volumi piastrinici. Microscopio per l’osservazione direttadell’aggregazione.

4) Test funzionali in vitro.Capacità emostatica piastrinica.Platelet Function Analyzer (PFA-100)- Dade BehringAgente Agonista1. Col/EPI2. Col/ADPChiusura completaMisura: tempo di chiusura

PFA-100

PFA: vantaggi e limiti• Vantaggi:• Campione sangue intero.• Sensibilità per vWD superiore a Tempo di emorragia.• Facilità di uso routinario. Operatore non esperto.• Meno invasivo di Tempo di emorragia.• Limiti:• Agonisti limitati.• Non praticabile se HT < 0.3 L/L o PLTS < 80 x 10 9 /L.

PFA: prestazioni• CV: < 10 %.• Variabilità biologica day to day: circa 10 %• Variabilità biologica circadiana: allungamento di circa il 30 % alpomeriggio.• Sensibilità: 94 % (aggregometria 95%, Tempo di emorragia 80%)• Correla con i livelli di VWF.• Rileva Glanzmann, Bernard Soulier,, Aspirin like disease, storagepool disease.

Il PFA: algoritmo diagnosticoAnamnesi positiva per diatesi emorragicaPFA: collagene/epinefrinanormaleanormalePFA: collagene/ADPnormaleanormaleFANSAggregazione piastrinica

Indicazioni cliniche ai test di funzionalitàpiastrinica per diatesi emorragica.Linee generali• Screening popolazione generale? NO• Screening preoperatorio in popolazione generale? NO• Screening di Pz con anamnesi familiare positiva? SI• Screening preoperatorio di Pz con anamnesi• positiva e/o sintomi? SI• Diagnosi di Pazienti con anamnesi personale positiva? SI• Diagnosi di Pazienti sintomatici ? SI

TEST DI FUNZIONE PIASTRINICATESTSemplicitàTradizioneInteresseemorragiaInteresseateroDisponibilitàin Aziendatrombosi1) Anamnesi edesame obbiettivo++++++++++++++SI2) Conta , MPV+++++++++++++SI3) Test in vivo++++++++++SI4) Test in vitro++++++++++++SI5) Studi surecettori emetaboliti++++++++++++Si, noroutine

Piastrine ed aterotrombosiTROMBOSIATEROSCLEROSIA riposoattivaNORMALEEMOSTASI

Piastrine e aterotrombosi, IPRINCIPALI OBBIETTIVI DEGLI STUDIFisiopatologia aterotrombosi- malattia cardiovascolareFisiopatologia ipertensione arteriosaResistenze a farmaci antipiastriniciValore predittivo per malattia cardiovascolarePRINCIPALI METODI UTILIZZATIAggregometria classicaAggregometria ad impedenza o con light-scatteringCapacità emostatica piastrinica: PFACitofluorimetriaDosaggi immunometrici (ELISA)

Piastrine ed aterotrombosi, IIPRINCIPALI PARAMETRI INDAGATI•Curve di aggregazione. Tempi di chiusura. Aggregometria, PFA.•Recettori piastrinici. CD41 (GP II b), CD 42a, CD 61 (GP III a),CD 63, P2Y, ecc… Citofluorimetria.•Ligandi solubili. Es. CD40Ls. ELISA.•Markers di attivazione PLTS: es. P-selectina, TxA2, catabolitiurinari. ELISA.

La citoflurimetria: alcune applicazioni• Diagnosi di disordini delle PLTS: Glanzmann, Bernard Soulier,Storage pool disease, HIT, ecc…• Quantificazione dei recettori piastrinici.• Rilevazione di attivazione piastrinica: misura di CD40L, CD62p, CD63, coniugati leucociti-PLTS, microparticelle piastriniche, P-selectina.Aterotrombosi, valutazione di pappe piastriniche. Valore predittivo?• Monitoraggio di risposta delle PLTS ad agonisti: mediante i markers diattivazione, dopo stimolo.• Monitoraggio dei farmaci antipiastrinici: antagonisti GPIIb-IIIa,clopidogrel, aspirina.• Produzione piastrinica: dosaggio piastrine reticolate (dd fra diminuitaproduzione ed aumentata distruzione).• Conta accurata delle PLTS.• Ig associate a PLTS: piastrinopenie su base immunologica.• Sopravvivenza delle PLTS: studi con marcatura.

Piastrine e malattia cardiovascolare, Idosaggi immunometrici• Blann, 1997. P-selectina e BTG più alte negli ipertesi.• Blann 1997. VWF elevato è predittivo di evento cardiovascolare indislipidemici.• Minamino, 1998. P-selectina fattore di rischio per stroke in FA.• Schonbeck, 2001. Alto CD40L e rischio cardiovascolare.• Johansen, 2004. PDGF e BTG correlano con restenosi dopoangioplastica.

Piastrine e malattia cardiovascolare, IIcitofluorimetria• Michelson, 2002. Dopo stent coronarico, la citometria diflusso dei markers di attivazione piastrinica predicel’infarto.• Furman, 2001. Aggregati circolanti monociti-piastrinemarker precoce di IMA.• Strike, 2004. Lo stress mentale acuto fa aumentare gliaggregati PLTS-leucociti.

Piastrine e malattia cardiovascolare, IIIaggregazione e PFA• Lanza,2003. Nell’angina da sforzo i tempi di chiusura al PFA dopo eserciziofisico sono correlati ai reperti angiografici.• Frossard, 2004. Tempi di chiusura accorciati al PFA sono correlati a gravitàdell’infarto (CK-MB e TnI).• Gianetti, 2005. Tempi di chiusura al PFA accorciati dopo angioplasticacoronarica sono predittivi di eventi ischemici.• Kalvergren, 2005. Chlamydia p. stimola aggregazione PLTS e ossidazioneLDL.

Piastrine e malattia cardiovascolare, IVconta ed indici piastrinici• Greisenegger, 2004. MPV elevato è indice prognosticonegativo nello stroke.• Coban, 2005. MPV è più alto nell’obesità.

P come Piastrine……come prezzemolo.I TEST DI FUNZIONE PIASTRINICA: QUESTI SCONOSCIUTIDr. Roberto Facchinetti, LaboratorioAnalisi OCM VRSabato 18 febbraio 2006

CD40• Recettore espresso su endotelio, cellule muscolari liscie, monociti, piastrine.• Il legame con il suo ligando, CD40L, provoca l’espressione di mediatori di flogosi,molecole di adesione, Fattore Tissutale (TF).• Il CD40L si lega a GP III b-II a e provoca attivazione piastrinica.• Quindi: CD40L è implicato nelle varie fasi della aterogenesi, acuta e cronica.• CD40L:• più alto in Pz. con angina instabile.• valore predittivo per rischio cardiovascolare in donne sane.• più attivo nei fumatori di sigarette.• non predice riperfusione dopo trombolisi in IMA