⢠Specificità ⢠Sensibilità ⢠Praticità e rapidità di esecuzione ⢠Costo ...
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Facoltà <strong>di</strong> Me<strong>di</strong>cina e ChirurgiaMETODI DIAGNOSTICI IN VIROLOGIA1. Diagnosi <strong>di</strong>retta2. Diagnosi in<strong>di</strong>rettaDIAGNOSTICA DIRETTALa <strong>di</strong>agnosi <strong>di</strong>retta è rivolta alla ricerca dell’agente infettante o <strong>di</strong>suoi componenti chiaramente identificati;Prof. Oliviero E. Varnierla <strong>di</strong>agnosi in<strong>di</strong>retta o sierologica sfrutta a fini <strong>di</strong>agnostici larisposta immunitaria dell’organismo infettato; entrambe possonoessere qualitative e quantitative.WWW.MICROBIOLOGIA.UNIGE.ITSezione <strong>di</strong> Microbiologia – Dipartimento <strong>di</strong> Scienze Chirurgiche Diagnostiche Integrate (DISC)2<strong>di</strong> 36DIAGNOSI DIRETTA E DIAGNOSI INDIRETTACRITERI PER L’ACCETTABILITÀ E L’IMPIEGO ROUTINARIO DI UN TESTDI DIAGNOSTICA MICROBIOLOGICA• la <strong>di</strong>agnosi <strong>di</strong>retta è da preferire, come quella che può consentire lostu<strong>di</strong>o analitico <strong>di</strong> un determinato agente eziologico, soprattutto per quantoriguarda i determinanti genetici della virulenza e, importantissimo, dellaresistenza a farmaci chemioterapici.• La <strong>di</strong>agnosi in<strong>di</strong>retta trova in<strong>di</strong>cazione nelle infezioni acute e nella faseacuta (infezione primaria) delle infezioni persistenti (qui va segnalatal’eccezione, importantissima, delle malformazioni congenite, da virus oaltri microrganismi, che, pur derivando da infezioni persistenti, possonoessere <strong>di</strong>agnosticate efficientemente con tecniche sierologiche).• Specificità• Sensibilità• Praticità e rapi<strong>di</strong>tà <strong>di</strong> <strong>esecuzione</strong>• <strong>Costo</strong> contenuto3<strong>di</strong> 364<strong>di</strong> 361
DIAGNOSI DIRETTAISOLAMENTO VIRALE1. Ricerca del Virus Esame colturale Colture cellulari effetto citopatico, ecc.Esame microscopico Microscopia elettronica morfologia2. Ricerca dell’Antigene Esame immunologico immunofluorescenza, ELISA, ecc.3. Ricerca del Genoma Ibri<strong>di</strong>zzazione con sonde - amplificazione genica (PCR) eReal Time PCR1. Colture Cellulari effetto citopatico (CPE)emoadsorbimentoimmunofluorescenza2. Uova effetto citopaticoemoagglutinazionecorpi inclusi3. Animali malattia o morte5<strong>di</strong> 366<strong>di</strong> 36ISOLAMENTO VIRALECOLTURE CELLULARILe colture cellulari sono usate per l’isolamento virale: ci sonotre tipi <strong>di</strong> colture cellulari:Colture primarieColture secondarieLinee continuerene <strong>di</strong> scimmiafibroblasti <strong>di</strong> cute, cellule <strong>di</strong> rene embrionale umanoHeLa, Vero, Hep2, LLC-MK2, MDCKLe colture primarie sono il miglior sistema <strong>di</strong>sponibile che supporta lareplicazione del maggior numero <strong>di</strong> virus. Comunque, sono moltocostose, e spesso è <strong>di</strong>fficile avere una fornitura affidabile e continua. Lelinee continue sono le più facili da gestire, ma hanno uno spettro d’ospitelimitato.La replicazione virale causa:• Effetto Citopatico (CPE) – simile al rigonfiamento delle cellule oalla formazione <strong>di</strong> sincizi – può essere specifico oppure nonspecifico.• Emoadsorbimento – le cellule acquisiscono la capacità <strong>di</strong> legarsi aiglobuli rossi <strong>di</strong> mammiferi.• La conferma dell’identificazione del virus può essere eseguitame<strong>di</strong>ante prove <strong>di</strong> neutralizzazione, inibizione dell’emoadsorbimento,prove <strong>di</strong> immunofluorescenza o prove <strong>di</strong> ibri<strong>di</strong>zzazionecon sonde specifiche7<strong>di</strong> 368<strong>di</strong> 362
EFFETTO CITOPATICO (1)EFFETTO CITOPATICO (2)Formazione <strong>di</strong> sincizi in colture cellulariindotta da (alto) e da virus del morbillo(in basso).Effetto citopatico dell’enterovirus 71 e <strong>di</strong> HSV incellule in coltura: osservare il rigonfiamentodelle cellule.9<strong>di</strong> 3610 <strong>di</strong> 36EFFETTO CITOPATICO (3): RHINOVIRUSEMOADSORBIMENTO11 <strong>di</strong> 36La formazione <strong>di</strong> sincizi causati dal virus del morbillo e l’emoadsorbimento <strong>di</strong> eritrocitisulla superficie del monostrato.12 <strong>di</strong> 363
CELLULE EPITELIALI: ADENOVIRUSCELLULE EPITELIALI: VIRUS RESPIRATORIO SINCIZIALE (RSV)Non-infettate Infezione precoce Infezione tar<strong>di</strong>vanon infettateEffetto citopatico da RSVslides from CDC 13 <strong>di</strong> 36slides from CDC14 <strong>di</strong> 36CELLULE FIBROBLASTICHE: VIRUS HERPES SIMPLEXCELLULE FIBROBLASTICHE: POLIOVIRUSNon infettate Infezione precoce Infezione tar<strong>di</strong>vaNon infettate Infezione precoce Infezione tra<strong>di</strong>vaslides from CDC 15 <strong>di</strong> 36slides from CDC16 <strong>di</strong> 364
SINCIZI: HIVIMMUNOFLUORESCENZA17 <strong>di</strong> 3618 <strong>di</strong> 36CORPI INCLUSI DA CMVCORPI INCLUSI DA CMV19 <strong>di</strong> 3620 <strong>di</strong> 365
PROBLEMI CON LE COLTURE CELLULARIESAMI COLTURALI RAPIDI• Tempi lunghi (fino a 4 settimane) per il referto.• Spesso hanno una scarsa sensibilità, che <strong>di</strong>pende dalle con<strong>di</strong>zionidel campione• Suscettibili <strong>di</strong> contaminazione batterica.• Sensibili a sostanze tossiche, che possono essere presenti nelcampione.• Molti virus non crescono in colture cellulari: virus dell`epatite B,parvovirus, papillomavirus, rotavirus, ecc..Sono <strong>di</strong>sponibili esami colturali rapi<strong>di</strong>, nei quali si identificanoantigeni virali in 2-4 giorni. Il miglior esempio è il test per l`antigenepp72 del CMV.• Un monostrato cellulare è fatto crescere su singoli vetrini in unafiaschetta <strong>di</strong> plastica sterile• Dopo l`inoculazione del campione, la fiaschetta viene centrifugata abassa velocità per 1 ora (per accelerare l`adsorbimento del virus) equin<strong>di</strong> incubata per 2 – 4 giorni.• Il vetrino viene rimosso e analizzato per la presenza dell`antigeneprecoce virale pp72 utilizzando un anticorpo monoclonale anti pp72coniugato con fluoresceina (immunofluorescenza).21 <strong>di</strong> 3622 <strong>di</strong> 36TEST COLTURALE RAPIDO PER L`ANTIGENE pp72 DI CMVVIRUS ISOLABILI IN COLTURE CELLULARIVIRUS FACILMENTE ISOLABILIHerpes simplexCitomegalovirusAdenovirusCoxsackie Virus BEchovirusVirus parainfluenzaliParotiteVirus Respiratorio SincizialeVIRUS DIFFICILMENTE ISOLABILIVaricella ZosterMorbilloRosoliaRhinovirusCoxsackieVirus A23 <strong>di</strong> 3624 <strong>di</strong> 366
MICROSCOPIA ELETTRONICAELETTROMICROGRAFIE10 6 virioni per ml sono richiesti per la visualizzazione, ingran<strong>di</strong>menti <strong>di</strong>50,000 - 60,000 volte sono normalmente impiegati. I virus possonoessere identificati nei seguenti campioni.FeciRotavirus, Adenovirus, Norwalk like virusesAstrovirus, CalicivirusLiqui<strong>di</strong> <strong>di</strong> vescicoleVZVHSVPrelievi <strong>di</strong> cutepapillomavirus, mollusco contagiosoAdenovirusRotavirus25 <strong>di</strong> 3626 <strong>di</strong> 36MICROSCOPIA ELETTRONICA: HIVIMMUNO-ELETTRO MICROSCOPIALa sensibilità e specificità della microscopia elettronica può essere miglioratacon la immuno-elettro microscopia. Ci sono due varianti:– La Immuno Elettro Microscopia Classica: il campione è trattato conantisieri specifici prima <strong>di</strong> essere posizionato sul microscopio. Leparticelle virali presenti saranno agglutinate insieme dall’anticorpo.– La Immuno Elettro Microscopia su Fase Solida: La griglia ècoattata con antisieri specifici. Le particelle virali presenti nelcampione saranno adsorbite sulla griglia dall’anticorpo.27 <strong>di</strong> 3628 <strong>di</strong> 367
IMMUNO ELETTRO MICROSCOPIAPROBLEMI CON LA MICROSCOPIA ELETTRONICA• Strumentazione costosa• Manutenzione costosa• Elevata competenza tecnica• Bassa sensibilità29 <strong>di</strong> 3630 <strong>di</strong> 36IMMUNOFLUORESCENZACMV pp65 ANTIGENAEMIA TESTVirology Laboratory, Yale-NewHaven HospitalPositive immunofluorescence test forrabies virus antigen. (Source: CDC)31 <strong>di</strong> 36Antigeni pp65 <strong>di</strong> CMV identificati nei nuclei<strong>di</strong> neutrofili del sangue periferico. VirologyLaboratory, Yale-New Haven Hospital.32 <strong>di</strong> 368
IMMUNOFLUORESCENZA per CMV nelle URINEIMMUNOFLUORESCENZA per CMV nei : PBL33 <strong>di</strong> 3634 <strong>di</strong> 36IMMUNOFLUORESCENZAIBRIDIZZAZIONE HIV35 <strong>di</strong> 3636 <strong>di</strong> 369