• Specificità • Sensibilità • Praticità e rapidità di esecuzione • Costo ...

Facoltà di Medicina e ChirurgiaMETODI DIAGNOSTICI IN VIROLOGIA1. Diagnosi diretta2. Diagnosi indirettaDIAGNOSTICA DIRETTALa diagnosi diretta è rivolta alla ricerca dell’agente infettante o disuoi componenti chiaramente identificati;Prof. Oliviero E. Varnierla diagnosi indiretta o sierologica sfrutta a fini diagnostici larisposta immunitaria dell’organismo infettato; entrambe possonoessere qualitative e quantitative.WWW.MICROBIOLOGIA.UNIGE.ITSezione di Microbiologia – Dipartimento di Scienze Chirurgiche Diagnostiche Integrate (DISC)2di 36DIAGNOSI DIRETTA E DIAGNOSI INDIRETTACRITERI PER L’ACCETTABILITÀ E L’IMPIEGO ROUTINARIO DI UN TESTDI DIAGNOSTICA MICROBIOLOGICA• la diagnosi diretta è da preferire, come quella che può consentire lostudio analitico di un determinato agente eziologico, soprattutto per quantoriguarda i determinanti genetici della virulenza e, importantissimo, dellaresistenza a farmaci chemioterapici.• La diagnosi indiretta trova indicazione nelle infezioni acute e nella faseacuta (infezione primaria) delle infezioni persistenti (qui va segnalatal’eccezione, importantissima, delle malformazioni congenite, da virus oaltri microrganismi, che, pur derivando da infezioni persistenti, possonoessere diagnosticate efficientemente con tecniche sierologiche).• Specificità• Sensibilità• Praticità e rapidità di esecuzione• Costo contenuto3di 364di 361

DIAGNOSI DIRETTAISOLAMENTO VIRALE1. Ricerca del Virus Esame colturale Colture cellulari effetto citopatico, ecc.Esame microscopico Microscopia elettronica morfologia2. Ricerca dell’Antigene Esame immunologico immunofluorescenza, ELISA, ecc.3. Ricerca del Genoma Ibridizzazione con sonde - amplificazione genica (PCR) eReal Time PCR1. Colture Cellulari effetto citopatico (CPE)emoadsorbimentoimmunofluorescenza2. Uova effetto citopaticoemoagglutinazionecorpi inclusi3. Animali malattia o morte5di 366di 36ISOLAMENTO VIRALECOLTURE CELLULARILe colture cellulari sono usate per l’isolamento virale: ci sonotre tipi di colture cellulari:Colture primarieColture secondarieLinee continuerene di scimmiafibroblasti di cute, cellule di rene embrionale umanoHeLa, Vero, Hep2, LLC-MK2, MDCKLe colture primarie sono il miglior sistema disponibile che supporta lareplicazione del maggior numero di virus. Comunque, sono moltocostose, e spesso è difficile avere una fornitura affidabile e continua. Lelinee continue sono le più facili da gestire, ma hanno uno spettro d’ospitelimitato.La replicazione virale causa:• Effetto Citopatico (CPE) – simile al rigonfiamento delle cellule oalla formazione di sincizi – può essere specifico oppure nonspecifico.• Emoadsorbimento – le cellule acquisiscono la capacità di legarsi aiglobuli rossi di mammiferi.• La conferma dell’identificazione del virus può essere eseguitamediante prove di neutralizzazione, inibizione dell’emoadsorbimento,prove di immunofluorescenza o prove di ibridizzazionecon sonde specifiche7di 368di 362

EFFETTO CITOPATICO (1)EFFETTO CITOPATICO (2)Formazione di sincizi in colture cellulariindotta da (alto) e da virus del morbillo(in basso).Effetto citopatico dell’enterovirus 71 e di HSV incellule in coltura: osservare il rigonfiamentodelle cellule.9di 3610 di 36EFFETTO CITOPATICO (3): RHINOVIRUSEMOADSORBIMENTO11 di 36La formazione di sincizi causati dal virus del morbillo e l’emoadsorbimento di eritrocitisulla superficie del monostrato.12 di 363

CELLULE EPITELIALI: ADENOVIRUSCELLULE EPITELIALI: VIRUS RESPIRATORIO SINCIZIALE (RSV)Non-infettate Infezione precoce Infezione tardivanon infettateEffetto citopatico da RSVslides from CDC 13 di 36slides from CDC14 di 36CELLULE FIBROBLASTICHE: VIRUS HERPES SIMPLEXCELLULE FIBROBLASTICHE: POLIOVIRUSNon infettate Infezione precoce Infezione tardivaNon infettate Infezione precoce Infezione tradivaslides from CDC 15 di 36slides from CDC16 di 364

SINCIZI: HIVIMMUNOFLUORESCENZA17 di 3618 di 36CORPI INCLUSI DA CMVCORPI INCLUSI DA CMV19 di 3620 di 365

PROBLEMI CON LE COLTURE CELLULARIESAMI COLTURALI RAPIDI• Tempi lunghi (fino a 4 settimane) per il referto.• Spesso hanno una scarsa sensibilità, che dipende dalle condizionidel campione• Suscettibili di contaminazione batterica.• Sensibili a sostanze tossiche, che possono essere presenti nelcampione.• Molti virus non crescono in colture cellulari: virus dell`epatite B,parvovirus, papillomavirus, rotavirus, ecc..Sono disponibili esami colturali rapidi, nei quali si identificanoantigeni virali in 2-4 giorni. Il miglior esempio è il test per l`antigenepp72 del CMV.• Un monostrato cellulare è fatto crescere su singoli vetrini in unafiaschetta di plastica sterile• Dopo l`inoculazione del campione, la fiaschetta viene centrifugata abassa velocità per 1 ora (per accelerare l`adsorbimento del virus) equindi incubata per 2 – 4 giorni.• Il vetrino viene rimosso e analizzato per la presenza dell`antigeneprecoce virale pp72 utilizzando un anticorpo monoclonale anti pp72coniugato con fluoresceina (immunofluorescenza).21 di 3622 di 36TEST COLTURALE RAPIDO PER L`ANTIGENE pp72 DI CMVVIRUS ISOLABILI IN COLTURE CELLULARIVIRUS FACILMENTE ISOLABILIHerpes simplexCitomegalovirusAdenovirusCoxsackie Virus BEchovirusVirus parainfluenzaliParotiteVirus Respiratorio SincizialeVIRUS DIFFICILMENTE ISOLABILIVaricella ZosterMorbilloRosoliaRhinovirusCoxsackieVirus A23 di 3624 di 366

MICROSCOPIA ELETTRONICAELETTROMICROGRAFIE10 6 virioni per ml sono richiesti per la visualizzazione, ingrandimenti di50,000 - 60,000 volte sono normalmente impiegati. I virus possonoessere identificati nei seguenti campioni.FeciRotavirus, Adenovirus, Norwalk like virusesAstrovirus, CalicivirusLiquidi di vescicoleVZVHSVPrelievi di cutepapillomavirus, mollusco contagiosoAdenovirusRotavirus25 di 3626 di 36MICROSCOPIA ELETTRONICA: HIVIMMUNO-ELETTRO MICROSCOPIALa sensibilità e specificità della microscopia elettronica può essere miglioratacon la immuno-elettro microscopia. Ci sono due varianti:– La Immuno Elettro Microscopia Classica: il campione è trattato conantisieri specifici prima di essere posizionato sul microscopio. Leparticelle virali presenti saranno agglutinate insieme dall’anticorpo.– La Immuno Elettro Microscopia su Fase Solida: La griglia ècoattata con antisieri specifici. Le particelle virali presenti nelcampione saranno adsorbite sulla griglia dall’anticorpo.27 di 3628 di 367

IMMUNO ELETTRO MICROSCOPIAPROBLEMI CON LA MICROSCOPIA ELETTRONICA• Strumentazione costosa• Manutenzione costosa• Elevata competenza tecnica• Bassa sensibilità29 di 3630 di 36IMMUNOFLUORESCENZACMV pp65 ANTIGENAEMIA TESTVirology Laboratory, Yale-NewHaven HospitalPositive immunofluorescence test forrabies virus antigen. (Source: CDC)31 di 36Antigeni pp65 di CMV identificati nei nucleidi neutrofili del sangue periferico. VirologyLaboratory, Yale-New Haven Hospital.32 di 368

IMMUNOFLUORESCENZA per CMV nelle URINEIMMUNOFLUORESCENZA per CMV nei : PBL33 di 3634 di 36IMMUNOFLUORESCENZAIBRIDIZZAZIONE HIV35 di 3636 di 369