Toro - Istituto Sperimentale Italiano Lazzaro Spallanzani

Grafiche CAM - Pandino (CR)La valutazione del livellodi fertilità dei toriSviluppo di un test in vitroCOLTIVARE IL FUTURO

La valutazione del livello di fertilità dei toriIl progetto“Sviluppo di un test in vitro per la valutazionedel livello di fertilità dei tori”è stato finanziato con ilPiano della Ricerca 2007/2009.Testo ed immagini a cura di:Roberto Puglisi, Lidija Krvavac,Donatella Balduzzi, Andrea GalliIstituto Sperimentale Italiano“Lazzaro Spallanzani”, Rivolta d'Adda (CR)www.istitutospallanzani.it3

PartnerAssociazione Nazionale Allevatoridi Frisona ItalianaVia Bergamo 292 (loc. Migliaro)26100 CremonaIstituto Sperimentale Italiano“Lazzaro Spallanzani”Località La Quercia26027 Rivolta d'Adda (CR)Laboratorio di Tecnologie dellaRiproduzione - AVANTEA srlVia Porcellasco 7/F26100 Cremona4

La valutazione del livello di fertilità dei toriPremessaNel sistema produttivo zootecnico nazionale, negli anni 1995-2004, si èregistrato un calo di oltre il 40% degli imprenditori con una riduzione delnumero di animali di circa il 20%, e nella sola Lombardia le aziende sonopassate da quasi 14.000 a meno di 9.000. Stante questa notevole diminuzionesi è però evidenziato un aumento della produzione di latte, attribuibile allagrossa crescita della capacità produttiva delle singole aziende (“Febbraio2005. 1995-2004: il trend del latte in Lombardia”, Lombardia Verde On Line,www.agricoltura.regione.lombardia.it).Alla presenza di un sistema di quote produttive, il prezzo del latte si è mantenutosostanzialmente stabile, pur evidenziandosi un sensibile rialzo delcosto di gestione (mangimi e foraggi, costi energetici aziendali, forza lavoroper le operazioni di stalla).In questa situazione la riduzione dei costi di produzione è l’unica via dapercorrere. Una voce importante di tali costi è associata alla gestione riproduttivadella mandria (quota di rimonta, costi veterinari per la gestione dipatologie della sfera genitale, costo del seme congelato…) caratterizzata dallasua fertilità. Questa però, purtroppo, presenta un chiaro trend negativo,come numerose ricerche hanno evidenziato praticamente in tutto il mondo.Di particolare interesse è l’associazione negativa fra il livello produttivo degliallevamenti e la fertilità.5

Il miglioramento della fertilità rappresenta pertanto un importante contributoche la ricerca scientifica applicata può e deve dare al settore dell’allevamentodelle bovine da latte, soprattutto in aree produttive comequella lombarda, dove particolarmente forte è la pressione selettiva e lerichieste alimentari degli animali allevati. In queste situazioni si vengono acreare i presupposti genetici (alta produzione ed inbreeding) e fisiologici(dismetabolie da alta produzione) che possono seriamente inficiare l’efficienzariproduttiva dell’allevamento.Molto è stato fatto per il controllo della riproduzione aziendale a livello dimanagement (ricoveri, attrezzature, alimentazione, igiene) e di lotta all’ipofertilitàfemminile (controllo ginecologico programmato). Poco è stato fattoe viene fatto per controllare l’effetto del toro sull’efficienza riproduttiva,effetto che si manifesta nell’ambito dell’uso della inseminazione artificiale(IA), su cui sostanzialmente si basa la gestione riproduttiva dell’allevamentoe degli schemi di selezione. In particolare è stato dimostrato che esisteassociazione fra il numero di spermatozoi “funzionali” e la fertilità, fino alraggiungimento di un valore soglia, oltre al quale la fertilità non aumenta.La fertilità associata a tale valore soglia varia fra toro e toro, rappresentandoil livello di fertilità del riproduttore. L’ottimizzazione della produzione didosi di seme congelato presso un Centro di Produzione Seme si raggiunge nel6

La valutazione del livello di fertilità dei torimomento che vengono prodotte dosi contenenti il numero di spermatozoiadeguato al raggiungimento del massimo della fertilità di quel toro, consentendonel frattempo la produzione del maggior numero di dosi.Ma come si calcola la fertilità ?Il metodo maggiormente utilizzato è quello che utilizza la percentuale dinon ritorni, che richiede, per essere corretto, un numero elevato di inseminazioni,possibilmente distribuite in più aziende, e un modello statistico ingrado di aggiustare il dato per i maggiori fattori di variabilità. Tuttavia anchecosì facendo la variabilità fra i differenti tori rimane bassa e può risultaredifficile evidenziare delle differenze fra tori che tendono ad “appiattirsi”intorno alla media. Un sistema efficace per massimizzare la variabilità fratori è quello di calcolare la graduatoria di fertilità utilizzando un indice difertilità competitivo, ottenuto tramite IA con dosi eterospermiche, contenentile popolazioni di due dei tori che si vogliono mettere a confronto.I confronti da eseguire sono elevati ed implicano disegni sperimentalicomplessi e costosi.Il presente progetto è partito con l’obiettivo di rendere semplice e pococostoso il confronto eterospermico fra tori utilizzando un test in vitro,basato su procedure di laboratorio ormai codificate e standardizzate inriproduzione assistita.7

ObiettivoIl progetto vuole dare un sostanziale contributo al miglioramento dell’efficienzariproduttiva negli allevamenti bovini, tramite lo sviluppo di un testin vitro predittivo del livello di fertilità dei tori.Sarà così possibile, presso i Centri di Produzione Seme, massimizzare laproduzione di dosi di seme congelato con il massimo potere fecondante.8

La valutazione del livello di fertilità dei toriIl ProgettoIl progetto si sviluppa nei seguenti momenti principali:• calcolo della fertilità in campo dei tori tramite ERCR e selezione di toriminus e plus varianti;• studio dell'associazione fra caratteristiche seminali e fertilità (ERCR);• sviluppo di un test di valutazione in vitro della fertilità tramiteFecondazione in Vitro Eterospermica;• valutazione in vitro della fertilità e confronto dei risultati con quelliottenuti in campo.9

Calcolo della fertilitàdi riferimento in campoLa fertilità è stata calcolata come ERCR (Estimated Relative Conception Rates)utilizzando i dati derivanti dai Controlli Funzionali a disposizione dell’ANAFI.Il tratto misurato era la percentuale di non ritorni a 56 giorni, aggiustato peruna serie di fattori di variabilità.Il modello utilizzato dall’ANAFI prevedeva i seguenti aggiustamenti:• AZIENDA - ANNO - MESE di inseminazione;• ENERGIA spesa nella produzione di latte al 3,5 % di grasso e al 3,2 %di proteine;• ordine di PARTO della vacca;• Day-Open della vacca (in classi) alla prima inseminazione;• TORO;• ORIGINE del TORO (Estero, Progenie, Provato);• Centro di Produzione Seme (14 Centri);• VACCA.In sintesi l’ERCR rappresenta l’effetto del toro sulla percentuale di non ritornidelle vacche inseminate in azienda, espresso come differenza rispetto allamedia della percentuale di non ritorni ottenuti con il seme degli altri tori.10

La valutazione del livello di fertilità dei toriIl data-set degli ERCR è stato analizzato e sono stati individuati due gruppi ditori ad alta e bassa fertilità, con una attendibilità media della stima di ERCRpari al 96,7% (con minimo 92% e massimo 99%).I tori sono stati codificati con degli ID di laboratorio da 1 a 10.ToroERCRToroERCR1+ 3.956- 2.302+ 2.627- 3.113+ 2.398- 3.524+ 2.269- 3.935+ 2.2010- 4.74Con i due gruppi di tori si disponeva di un data-set di ERCR di riferimento ingrado di massimizzare la variabilità fra riproduttori, al fine di facilitare lamessa a punto del test in vitro.L’elevata attendibilità degli ERCR dei tori selezionati era tale da garantirne lastabilità nel tempo: gli ERCR potevano pertanto essere considerati quale stimadel livello di fertilità del riproduttore.11

Studio dell'associazionefra caratteristiche seminali e fertilitàDi ogni toro sono stati utilizzati due lotti di seme congelato, ognuno deiquali è stato preventivamente scongelato ed analizzato per quanto concerne:• concentrazione, tramite contatore elettronico di particelle;• motilità, tramite analizzatore automatico d’immagine (sistema CASA).In particolare sono state misurate le seguenti variabili: motilità totale,motilità progressiva, velocità media;• integrità spermatica, tramite microscopia a contrasto interferenziale;• integrità di membrana, tramite colorazione vitale fluorescente emicroscopia a fluorescenza.12

La valutazione del livello di fertilità dei toriIn una indagine preliminare è statastudiata l’associazione fra i parametriseminali e l’ERCR, non evidenziandoassociazioni degne di nota. Non erapertanto possibile prevedere il livellodi fertilità dei tori, misurato conERCR, tramite un approccio seminologico“classico”, pur utilizzando metodioggettivi con protocolli che nerendevano massima l’accuratezza e laripetibilità.13

Sviluppo del test in vitroL’approccio metodologico prevedeval’utilizzo di una tecnica di laboratorioben consolidata: la fecondazione invitro (FIV), eseguita utilizzando un disegnosperimentale eterospermico (E).La fecondazione in vitro eterospermica(FIVE) consisteva nel mettere a “confronto”contemporaneamente il semedi due tori con oociti maturati in vitro,raccolti da un grande numero di ovaieprovenienti da vacche macellate.Per rendere la valutazione semplice erapida sono state utilizzate le particolaritàcitochimiche di alcuni colorantifluorescenti che consentono la discriminazionedegli spermatozoi di ciascuntoro, senza inibirne la vitalità.14

La valutazione del livello di fertilità dei toriDopo la colorazione, il seme dei duetori da testare veniva unito e posto inincubazione con gli ovociti privati dellecellule della granulosa, così da poteressere immediatamente accessibili aglispermatozoi.La fecondazione eterospermica permettevadi valutare la capacità di legametra gli spermatozoi dei due diversitori con la zona pellucida, eliminandocompletamente la variabilità legataalla qualità degli ovociti.Dopo l’incubazione con gli spermatozoi,gli ovociti venivano preparatisu un vetrino e gli spermatozoi deidue diversi tori venivano contati utilizzandoun microscopio a fluorescenza.15

Con l’approccio FIVE sono state testate tutte le possibili coppie di tori delgruppo in analisi, utilizzando il seguente schema.1-21-32-31-42-43-41-52-53-54-51-62-63-64-65-61-72-73-74-75-76-71-82-83-84-85-86-87-81-92-93-94-95-96-97-98-91-102-103-104-105-106-107-108-10 9-1016

La valutazione del livello di fertilità dei toriCalcolo dell’Indice di Legame CompetitivoUtilizzando come misura il numero di spermatozoi legati ad ogni ovocitaè stato calcolato l’Indice di Legame Competitivo (ILC) tramite il computodelle frequenze relative per ogni singolo toro rispetto a tutti i confrontieseguiti.Il modello utilizzato è stato il seguente:NILCi = ∑ pij / ( ∑ pij + ∑ pji)j=1Nj=1Nj=1dove:ILCi = ILC dell’i-mo toropijpji= frequenza degli spermatozoi dell’i-mo toro nel confronto conil j-mo toro per gli N confronti= frequenza degli spermatozoi del j-mo toro nel confronto conil i-mo toro per gli N confronti17

Confronto fra stima della fertilitàin vitro e fertilità in vivoFertilità in vitroFertilità in vivoID-ToroILCID-ToroERCR9 0,3610 0,397 0,403 0,436 0,461 0,534 0,545 0,558 0,602 0,6610 - 4,749 - 3,938 - 3,527 - 3,116 - 2,305 + 2,204 + 2,263 + 2,392 + 2,621 + 3,95Dal confronto fra ILC ed ERCR si evidenzia che solamente due tori presentanouna diversa classificazione nelle due categorie ad alta e bassa fertilità: il toro3 con bassa fertilità in ILC ed alta con ERCR ed il toro 8 con alta fertilità inILC e bassa in ERCR.18

La valutazione del livello di fertilità dei toriConclusioniDal confronto delle graduatorie di fertilità dei tori per ERCR e ILC sono apparsenotevoli congruenze, che permettono di considerare come particolarmentepromettente l’utilizzo di ILC quale metodo di stima della fertilitàdei giovani tori.ERCR rappresenta il valore di riferimento della fertilità misurata in campo.Tale stima deriva dalla elaborazione di dati acquisibili solo “a posteriori”.ILC, quale test in vitro basato su tecniche consolidate, rappresenta una stima“a priori”, ovvero prima dell'effettivo utilizzo del toro.ILC rappresenta una misura che si candida quale precoce supporto all’ottimizzazioneproduttiva presso i Centri di Produzione Seme, fermorestando che, prima di poter utilizzare in forma estesa questo approccio,sarà necessario validare il protocollo utilizzando un data set più esteso.19