fattori di crescita

Fattori di crescitaFATTORI DI CRESCITARecettori

FATTORI DI CRESCITAProliferazioneDifferenziamento

FATTORI DI CRESCITAChi produce?Chi risponde?Fattore Sorgente principale Attività primariaPDGF piastrine, cellule endoteliali, promuove la proliferazione del tessutoplacentaconnettivo, della glia e delle cellulemuscolari liscieEGF ghiandola sottomandibolare promuove la proliferazione delmesenchima, di cellule gliali edi cellule epitelialiTGF-α cellule trasformate, macrofagi fibroblasti, osteoclastiFGF endotelio attivato e molti altri fibroblasti, cellule endoteliali, glia,tipi cellularicheratinociti, neuroniNGF astrociti promuove la crescita e la sopravvivenzaneuronaleEritropoietina cellule del rene promuove la proliferazione e ildifferenziamento degli eritrocitiIGF-I cellule del fegato promuove la proliferazione di moltitipi cellulari. Si chiama ancheSomatomedina C

FATTORI DI CRESCITA?Come fa una interazionetra due molecole sullasuperficie cellulare araggiungere il nucleo perattivare la trascrizione dimRNA e la traduzioneproteica?

STUDIO INTERAZIONE RECETTORE-LIGANDO1. Analisi dell’equilibrio di legame a saturazione2. Cross-linking+ 125 I + iodogenbolton-hunterlactoperoxidase125I125I125I125I

Protein + Na 125 I +Protein + Na 125 I +

Analisi dell’equilibrio di legame a saturazione(Scatchard plot)•Cellule GM7373 – 180.000 cells/pozzetto in piastra da 48 pozzetti•Aggiunti 100 microlitri di terreno/pozzetto contenente• 125 I-FGF2 4 ng/ml, 8 ng/ml, 16 ng/ml, 40 ng/ml, 80 ng/ml, 100 ng/ml• +/- FGF2 300x•Campioni in quintuplicato125 I-FGF2: attività specifica 358 CPM/fmoleI VALORI SONO OTTENUTI DA HOT medio – COLD medio[ 125 I-FGF2] CPM caricate Lavaggio F pH4 BB/F4 ng/ml9936863224.112450.680.0288 ng/ml143061297536.243020.840.02316 ng/ml289952644173.854111.150.015640 ng/ml7838572462202.405631.570.007880 ng/ml154666143609401.1410632.970.0074

Analisi dell’equilibrio di legame a saturazione(Scatchard plot)125I-GF125 I-GF125 I-GF125 I-GF 125 I-GF125 I-GF125 I-GFY Y Y Y Y Y YY Y Y Y Y YT = binding totaleNSB = binding non specifico (non saturabile)SB = binding specificohttp://www.pdg.cnb.uam.es/cursos/Barcelona2002/pages/Farmac/Comput_Lab/Guia_Glaxo/chap3b.html

FBB/FB/F0,03024.110.680.0280,0250,02536.240.840.0230,0200,02073.85202.401.151.570.01560.00780,0150,0150,010?401.142.970.00740,0100,0050,005 0,0000,6 0,5 0,8 1,0 1,0 1,5 1,2 2,0 1,42,5 1,6 3,0Bound Bound (fmole) (fmole)B rappresenta il coefficiente angolareQuando Y=0 X=1,89 fmoliN° rec/cell = 1.89 x 6.023 x 10 23 x 10 -15 =1,8 x 10 5 6.3 x 10 3Ka= 1/B = 44.68 fmoli in 100 microlitri,Che equivale a 446 pM

Cross-linking125I-GF125 I-GF125 I-GF125 I-GF 125 I-GF125 I-GF125 I-GFY Y Y Y Y Y YY Y Y Y Y YX125 I-GF125 I-GF125 I-GF 125 I-GF125 I-GF125 I-GFY Y Y Y Y Y YY Y Y Y Y YBis(Sulfosuccinimidyl)suberate (BS 3 ) is a homobifunctional, water-soluble, non-cleavable and membraneimpermeable cross-linker. It contains an amine-reactive N-hydroxysulfosuccinimide (NHS) ester at eachend of an 8-carbon spacer arm. NHS esters react with primary amines at pH 7-9 to form stable amidebonds, along with release of the N-hydroxysulfosuccinimide leaving group. Proteins, including antibodies,generally have several primary amines in the side chain of lysine (K) residues and the N-terminus of eachpolypeptide that are available as targets for NHS-ester cross-linking reagents.http://www.piercenet.com/Products/Browse.cfm?fldID=02030212

Cross-linking125 I-GF125 I-GF125 I-GF 125 I-GF125 I-GF125 I-GFY Y Y Y Y Y YY Y Y Y Y Y+ sample bufferFGF/FGFRSDS-PAGEDry gelAUTORADIOGRAFIA

ATTIVAZIONE DEL SEGNALEOUTTKIN

La trasduzione del segnale si perpetra attraversoeventi di fosforilazione

*+ fattore di crescitaSDS-PAGE****Western blot

La trasduzione del segnale si protrae perintegrazione dell’informazione

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PROTEINE CHE LEGANO PDGFR ATTIVATO

Come identificare proteine legate alrecettore?ImmunoprecipitazioneLisi in tampone adeguato

ImmunoprecipitazioneGli anticorpi sileganospecificamentealle proteine A o Gdi staffilococcotramite laporzione FcLisato+anticorpoLavaggioTamponeEluizione

Immunoprecipitazione

FGFR1 signal transductionShcFRS2PPPPY766Y463FGF2FGF2PY730Y653Y654PPY653Y654Y730PPY583Y585PY463PPY583Y585PPY766PLC- γPLC-γCrkCrkSrc80K-HShp-2RafRasNucleusJun-DOUTINMAP kinasepathwayCytoplasm

Specifiche tirosine fosforilate legano specifiche molecole

I trasduttori intracellulari posseggono dominimodulari

Dominio SH2Il nome deriva da una regione omologa nell’oncogene src (srchomology 2). I domini SH2 sono moduli di circa 100aminoacidi che legano residui di tirosina fosforilata. Laspecificità di legame dipende dagli aminoacidi fiancheggiantila tirosina fosforilata.

Proteine con domini SH2

Dominio PTBI domini leganti tirosine fosforilate sono moduli di 100-150 aa chelegano motivi Asn-Pro-X-Tyr. In alcuni casi (Shc) la tirosina deveessere fosforilata.Dominio PTB di Shclegato al peptideHIIENPQpYFS

Dominio SH3Il nome deriva da una regione omologanell’oncogene src (src homology 3). Idomini SH3 generalmente legano peptidiricchi in prolina (Pro-X-X-Pro)Dominio SH3dell’omologo di Grb2legato al peptidePPPVPPRRR di Sos.

DAL RECETTORE A RASShcGrb2PTBSH2SH3 SH2 SH3SosProline-richCatalytic activity (GNRP)

LA PROTEINA RAS

LA PROTEINA RASLe GTPasi monomeriche Sono tutte proteine che subisconomodificazioni lipidiche (farnesilazione e/o palmitoilazione) che neconsentono l’ancoraggio alle membrane. Nel caso di Ras,l’ancoraggio è sulla faccia citoplasmatica della membrana cellulareCristallo di Raslegato a GTP

LA PROTEINA RASGAPStatoinattivoRasGDPGDPP iGTPRasGTPStatoattivoRafGNRPLa proteina Ras è attiva quando è legata a GTP, mentre è inattiva se legata a GDP.La sua attività viene regolata da altre due classi di proteine:1. GTPase activating protein (GAP) che incrementano l’idrolisi di GTP legato a Ras a GDP,favorendo l’inattivazione della proteina2. Guanine nucleotide releasing protein (GNRP) che stimolano Ras a perdere GDP. Laconcentrazione di GTP nel citosol è 10 volte più alta di quella di GDP, quindi Ras tenderà alegare GTP una volta lasciato GDP.

Gli “hotspot” maggiori che, se mutati, portano all’attivazionedella proteina Ras si ritrovano in prossimità del legame a GTP.Le diverse mutazioni aminoacidiche decrementano l’idrolisi delGTP da parte della proteine GAP. La molecola Ras mutatarimane prevalentemente legata a GTP e quindicostitutivamente attiva, nonostante l’assenza di un segnale distimolazione extracellulare.

DA RAS ALLA CASCATA DELLE MAP CHINASILa fosforilazione in tirosina e l’attivazione di Ras sono eventitransitori e a vita breve. Pressochè immediata è l’azione dellefosfatasi sui residui fosforilati e altrettanto veloce è l’idrolisi delGTP a GDP.Per stimolare la proliferazione cellulare questi segnali devonoessere tramutati in altri che durando più a lungo possonotrasportare l’informazione fino al nucleo.La cellula interviene con cascate di eventi di fosforilazione chehanno come bersaglio residui di serina e di treonina.CASCATA DELLE MAP (Mitogen-activated protein) CHINASIchiamate anche ERK (extracellular-signal-regulated) chinasi

CASCATA DELLE MAP CHINASIL’attivazione delle MAP chinasi necessita della fosforilazione contemporanea di unresiduo di treonina e di un residuo di tirosina. La proteina che può da solacatalizzare queste reazioni viene chiamata MAP chinasi-chinasi (MAPKK). A suavolta, questa proteina viene attivata, tramite fosforilazione in serina e treonina,dalla MAP chinasi chinasi chinasi (MAPKKK), che è il target di Ras.

CASCATA DELLE MAP CHINASINucleoLa MAPK attivata trasloca dal citosol al nucleo, dove può fosforilarediversi substrati. Tra di essi i più importanti sono i fattori ditrascrizione che consentono la produzione di nuovi mRNA checodificano per proteine coinvolte nella replicazione cellulare.

ATTIVAZIONE DELLE MAP CHINASI

FGFR1 signal transduction

Saggi di attività chinasica

Inibitori di attività chinasica

Come utilizzare un inibitoredi attività chinasica?+/- stimolo+/- inibitoreAttivita’ biologicaMa a che dose?

Perché sono importantigli inibitori di attività chinasica?

Selection of antitumor and antivascular drugs under investigation for cancer therapy

http://www.kinasenet.org/pkr/Welcome.dohttp://www.biocarta.com/