fattori di crescita
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Fattori <strong>di</strong> <strong>crescita</strong>FATTORI DI CRESCITARecettori
FATTORI DI CRESCITAProliferazioneDifferenziamento
FATTORI DI CRESCITAChi produce?Chi risponde?Fattore Sorgente principale Attività primariaPDGF piastrine, cellule endoteliali, promuove la proliferazione del tessutoplacentaconnettivo, della glia e delle cellulemuscolari liscieEGF ghiandola sottoman<strong>di</strong>bolare promuove la proliferazione delmesenchima, <strong>di</strong> cellule gliali e<strong>di</strong> cellule epitelialiTGF-α cellule trasformate, macrofagi fibroblasti, osteoclastiFGF endotelio attivato e molti altri fibroblasti, cellule endoteliali, glia,tipi cellularicheratinociti, neuroniNGF astrociti promuove la <strong>crescita</strong> e la sopravvivenzaneuronaleEritropoietina cellule del rene promuove la proliferazione e il<strong>di</strong>fferenziamento degli eritrocitiIGF-I cellule del fegato promuove la proliferazione <strong>di</strong> moltitipi cellulari. Si chiama ancheSomatome<strong>di</strong>na C
FATTORI DI CRESCITA?Come fa una interazionetra due molecole sullasuperficie cellulare araggiungere il nucleo perattivare la trascrizione <strong>di</strong>mRNA e la traduzioneproteica?
STUDIO INTERAZIONE RECETTORE-LIGANDO1. Analisi dell’equilibrio <strong>di</strong> legame a saturazione2. Cross-linking+ 125 I + iodogenbolton-hunterlactoperoxidase125I125I125I125I
Protein + Na 125 I +Protein + Na 125 I +
Analisi dell’equilibrio <strong>di</strong> legame a saturazione(Scatchard plot)•Cellule GM7373 – 180.000 cells/pozzetto in piastra da 48 pozzetti•Aggiunti 100 microlitri <strong>di</strong> terreno/pozzetto contenente• 125 I-FGF2 4 ng/ml, 8 ng/ml, 16 ng/ml, 40 ng/ml, 80 ng/ml, 100 ng/ml• +/- FGF2 300x•Campioni in quintuplicato125 I-FGF2: attività specifica 358 CPM/fmoleI VALORI SONO OTTENUTI DA HOT me<strong>di</strong>o – COLD me<strong>di</strong>o[ 125 I-FGF2] CPM caricate Lavaggio F pH4 BB/F4 ng/ml9936863224.112450.680.0288 ng/ml143061297536.243020.840.02316 ng/ml289952644173.854111.150.015640 ng/ml7838572462202.405631.570.007880 ng/ml154666143609401.1410632.970.0074
Analisi dell’equilibrio <strong>di</strong> legame a saturazione(Scatchard plot)125I-GF125 I-GF125 I-GF125 I-GF 125 I-GF125 I-GF125 I-GFY Y Y Y Y Y YY Y Y Y Y YT = bin<strong>di</strong>ng totaleNSB = bin<strong>di</strong>ng non specifico (non saturabile)SB = bin<strong>di</strong>ng specificohttp://www.pdg.cnb.uam.es/cursos/Barcelona2002/pages/Farmac/Comput_Lab/Guia_Glaxo/chap3b.html
FBB/FB/F0,03024.110.680.0280,0250,02536.240.840.0230,0200,02073.85202.401.151.570.01560.00780,0150,0150,010?401.142.970.00740,0100,0050,005 0,0000,6 0,5 0,8 1,0 1,0 1,5 1,2 2,0 1,42,5 1,6 3,0Bound Bound (fmole) (fmole)B rappresenta il coefficiente angolareQuando Y=0 X=1,89 fmoliN° rec/cell = 1.89 x 6.023 x 10 23 x 10 -15 =1,8 x 10 5 6.3 x 10 3Ka= 1/B = 44.68 fmoli in 100 microlitri,Che equivale a 446 pM
Cross-linking125I-GF125 I-GF125 I-GF125 I-GF 125 I-GF125 I-GF125 I-GFY Y Y Y Y Y YY Y Y Y Y YX125 I-GF125 I-GF125 I-GF 125 I-GF125 I-GF125 I-GFY Y Y Y Y Y YY Y Y Y Y YBis(Sulfosuccinimidyl)suberate (BS 3 ) is a homobifunctional, water-soluble, non-cleavable and membraneimpermeable cross-linker. It contains an amine-reactive N-hydroxysulfosuccinimide (NHS) ester at eachend of an 8-carbon spacer arm. NHS esters react with primary amines at pH 7-9 to form stable amidebonds, along with release of the N-hydroxysulfosuccinimide leaving group. Proteins, inclu<strong>di</strong>ng antibo<strong>di</strong>es,generally have several primary amines in the side chain of lysine (K) residues and the N-terminus of eachpolypeptide that are available as targets for NHS-ester cross-linking reagents.http://www.piercenet.com/Products/Browse.cfm?fldID=02030212
Cross-linking125 I-GF125 I-GF125 I-GF 125 I-GF125 I-GF125 I-GFY Y Y Y Y Y YY Y Y Y Y Y+ sample bufferFGF/FGFRSDS-PAGEDry gelAUTORADIOGRAFIA
ATTIVAZIONE DEL SEGNALEOUTTKIN
La trasduzione del segnale si perpetra attraversoeventi <strong>di</strong> fosforilazione
*+ fattore <strong>di</strong> <strong>crescita</strong>SDS-PAGE****Western blot
La trasduzione del segnale si protrae perintegrazione dell’informazione
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PROTEINE CHE LEGANO PDGFR ATTIVATO
Come identificare proteine legate alrecettore?ImmunoprecipitazioneLisi in tampone adeguato
ImmunoprecipitazioneGli anticorpi sileganospecificamentealle proteine A o G<strong>di</strong> staffilococcotramite laporzione FcLisato+anticorpoLavaggioTamponeEluizione
Immunoprecipitazione
FGFR1 signal transductionShcFRS2PPPPY766Y463FGF2FGF2PY730Y653Y654PPY653Y654Y730PPY583Y585PY463PPY583Y585PPY766PLC- γPLC-γCrkCrkSrc80K-HShp-2RafRasNucleusJun-DOUTINMAP kinasepathwayCytoplasm
Specifiche tirosine fosforilate legano specifiche molecole
I trasduttori intracellulari posseggono dominimodulari
Dominio SH2Il nome deriva da una regione omologa nell’oncogene src (srchomology 2). I domini SH2 sono moduli <strong>di</strong> circa 100aminoaci<strong>di</strong> che legano residui <strong>di</strong> tirosina fosforilata. Laspecificità <strong>di</strong> legame <strong>di</strong>pende dagli aminoaci<strong>di</strong> fiancheggiantila tirosina fosforilata.
Proteine con domini SH2
Dominio PTBI domini leganti tirosine fosforilate sono moduli <strong>di</strong> 100-150 aa chelegano motivi Asn-Pro-X-Tyr. In alcuni casi (Shc) la tirosina deveessere fosforilata.Dominio PTB <strong>di</strong> Shclegato al peptideHIIENPQpYFS
Dominio SH3Il nome deriva da una regione omologanell’oncogene src (src homology 3). Idomini SH3 generalmente legano pepti<strong>di</strong>ricchi in prolina (Pro-X-X-Pro)Dominio SH3dell’omologo <strong>di</strong> Grb2legato al peptidePPPVPPRRR <strong>di</strong> Sos.
DAL RECETTORE A RASShcGrb2PTBSH2SH3 SH2 SH3SosProline-richCatalytic activity (GNRP)
LA PROTEINA RAS
LA PROTEINA RASLe GTPasi monomeriche Sono tutte proteine che subisconomo<strong>di</strong>ficazioni lipi<strong>di</strong>che (farnesilazione e/o palmitoilazione) che neconsentono l’ancoraggio alle membrane. Nel caso <strong>di</strong> Ras,l’ancoraggio è sulla faccia citoplasmatica della membrana cellulareCristallo <strong>di</strong> Raslegato a GTP
LA PROTEINA RASGAPStatoinattivoRasGDPGDPP iGTPRasGTPStatoattivoRafGNRPLa proteina Ras è attiva quando è legata a GTP, mentre è inattiva se legata a GDP.La sua attività viene regolata da altre due classi <strong>di</strong> proteine:1. GTPase activating protein (GAP) che incrementano l’idrolisi <strong>di</strong> GTP legato a Ras a GDP,favorendo l’inattivazione della proteina2. Guanine nucleotide releasing protein (GNRP) che stimolano Ras a perdere GDP. Laconcentrazione <strong>di</strong> GTP nel citosol è 10 volte più alta <strong>di</strong> quella <strong>di</strong> GDP, quin<strong>di</strong> Ras tenderà alegare GTP una volta lasciato GDP.
Gli “hotspot” maggiori che, se mutati, portano all’attivazionedella proteina Ras si ritrovano in prossimità del legame a GTP.Le <strong>di</strong>verse mutazioni aminoaci<strong>di</strong>che decrementano l’idrolisi delGTP da parte della proteine GAP. La molecola Ras mutatarimane prevalentemente legata a GTP e quin<strong>di</strong>costitutivamente attiva, nonostante l’assenza <strong>di</strong> un segnale <strong>di</strong>stimolazione extracellulare.
DA RAS ALLA CASCATA DELLE MAP CHINASILa fosforilazione in tirosina e l’attivazione <strong>di</strong> Ras sono eventitransitori e a vita breve. Pressochè imme<strong>di</strong>ata è l’azione dellefosfatasi sui residui fosforilati e altrettanto veloce è l’idrolisi delGTP a GDP.Per stimolare la proliferazione cellulare questi segnali devonoessere tramutati in altri che durando più a lungo possonotrasportare l’informazione fino al nucleo.La cellula interviene con cascate <strong>di</strong> eventi <strong>di</strong> fosforilazione chehanno come bersaglio residui <strong>di</strong> serina e <strong>di</strong> treonina.CASCATA DELLE MAP (Mitogen-activated protein) CHINASIchiamate anche ERK (extracellular-signal-regulated) chinasi
CASCATA DELLE MAP CHINASIL’attivazione delle MAP chinasi necessita della fosforilazione contemporanea <strong>di</strong> unresiduo <strong>di</strong> treonina e <strong>di</strong> un residuo <strong>di</strong> tirosina. La proteina che può da solacatalizzare queste reazioni viene chiamata MAP chinasi-chinasi (MAPKK). A suavolta, questa proteina viene attivata, tramite fosforilazione in serina e treonina,dalla MAP chinasi chinasi chinasi (MAPKKK), che è il target <strong>di</strong> Ras.
CASCATA DELLE MAP CHINASINucleoLa MAPK attivata trasloca dal citosol al nucleo, dove può fosforilare<strong>di</strong>versi substrati. Tra <strong>di</strong> essi i più importanti sono i <strong>fattori</strong> <strong>di</strong>trascrizione che consentono la produzione <strong>di</strong> nuovi mRNA checo<strong>di</strong>ficano per proteine coinvolte nella replicazione cellulare.
ATTIVAZIONE DELLE MAP CHINASI
FGFR1 signal transduction
Saggi <strong>di</strong> attività chinasica
Inibitori <strong>di</strong> attività chinasica
Come utilizzare un inibitore<strong>di</strong> attività chinasica?+/- stimolo+/- inibitoreAttivita’ biologicaMa a che dose?
Perché sono importantigli inibitori <strong>di</strong> attività chinasica?
Selection of antitumor and antivascular drugs under investigation for cancer therapy
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