Current-Clamp - Università degli Studi di Bari

Farmaci e terapiaStudio preclinico dei farmacitecniche differenti (elettrofisiologiche ebiochimiche)Current Clamp, Voltage Clamp, mediantemicroelettrodi

Current ClampThe term "current clamp" is usually used to describerecordings from a very confined region (such as asingle cell) and often it is used to record the voltageof the inside of a single cell in comparison to theoutside (an intracellular recording) with fixed current

Le basi biofisiche

Galvani e la nascitadell'elettrofisiologiaLuigi Galvani (1737-1798) è ilpadre degli studi sull’attivitàelettrica nel sistema nervoso.Nel 1780 Galvani allestisce unlaboratorio per lo studio deifenomeni elettrici nell’animale,acquistando una macchina perla generazione di caricheelettrostatiche.Gli studi condotti dimostranol'esistenza di fenomeni elettricipropri nelle fibre nervose evengono illustrati nel De Viribuselectricitatis in motu muscularicommentarius, uscito nel 1791.

Composizione ionica e membrane cellulari• 1881‐1887, Sydney RINGER dimostra che per fare battere un cuoreisolato, la soluzione di perfusione deve contenere gli ioni Na + , K + , eCa 2+ in quantità definite.• 1888, NERNST lavora sui potenziali elettrici generati dalladiffusione degli ioni in soluzione attraverso le membrane. Si pensaallora che la cellula è carica negativamente all’interno rispettoall’esterno perché gli ioni H + diffondono più facilmente attraverso lamembrana che gli anioni organici più grossi.• 1902‐1912, BERNSTEIN propone la sua teoria della membrana.La membrana cellulare si comporta come una barriera che separadue compartimenti. A riposo, le cellule eccitabili (muscoli e nervi)hanno una membrana selettivamente permeabile agli ioni K + ,creando una differenza di potenziale di membrana (potenziale diriposo), mentre durante l’eccitazione, la permeabilità agli altri ioniaumenta, determinando una depolarizzazione.

Le prime registrazioni elettrofisiologiche1920‐1940, le tecniche di elettronica sono introdotte nei laboratori di fisiologia.L’elettrofisiologia si sviluppa con l’apparizione degli amplificatori, dei registratori(oscilloscopio), degli stimolatori ...1939, HODGKIN e HUXLEY (premio Nobel in 1963) introducono un elettrodonell’assone gigante di calamaro e registrano la differenza di potenziale attraverso lamembranaCIAmpOsCI : scambiatore d’impedenza / Amp : amplificatore / Os : oscilloscopioIn base alla legge di Ohm, V=RI, una variazione di potenziale è dovuta al passaggio dicorrente attraverso una resistenza:La membrana cellulare è quindi paragonata ad una resistenza attraversata da corrente.

L’inizio della biologia molecolare1973, il recettore canale dell’acetilcolina viene purificatodall’organo elettrico della razza Torpedo e il canale al sodioviene purificato dall’organo elettrico dell’anguillaElectrophorus electricus.L’isolamento viene fatto grazie al legame di questi canali atossine, l’α‐bungarotossina e la tetrodotossina (TTX).

Foto ottenuta al miscroscopio elettronicodi membrane dall’organo elettrico dellaTorpedo ricche di Recettori Nicotinicidell’acetilcolinaAnche il canale al cloro ClC-0 è statoscoperto in questo organo. Il canale hauna caratteristica struttura a doppietta(Miller, Phil. Trans. R. Soc. Lond. B 299: 401-411, 1982) con 2 pori identici edindipendenti, ciascuno regolato da fastgate e da uno slow gate in grado diabilitarne o meno l’apertura.La fast gate del ClC-0 si inattiva apotenziali iperpolarizzanti.Immagine del recettore dell’acetilcolina.Le 5 subunità si affiancano a cerchio inmodo da formare il poro per gli ioni.

Gli organi elettrici sono capaci di generare shock elettrico.Le scariche elettriche originano dagli elettrociti, cellule muscolarimodificate che hanno perso la capacità di contrarsi e hannoacquisito la capacità di generare un flusso di corrente ionica.L’attività elettrica (ELECTRIC ORGAN DISCHARGE) di Torpedo marmorataè stata osservata durante un attacco ad una preda.Serve a stordire la preda e ad allontanare i predatori.(Un adulto può produrre uno shock > di 200 volts, in grado di stordire un uomo).

Proprietà elettriche dellamembrana cellulare

La MEMBRANA CELLULARE si comporta come una barriera chesepara due compartimenti.A riposo le cellule eccitabili hanno una membrana selettivamentepermeabile agli ioni K + e creano una differenza di potenziale(potenziale di riposo).

differenza di carica elettrica fra interno ed esterno dellamembrana.dipende dal movimento di tutti gli ioni permeabili attraversola membrana. Il valore del potenziale di riposo è variabilefra cellula e cellula, ma approssima il potenziale di Nernstdello ione potassio.tanto più la membrana è permeabile ad una specie ionica,tanto maggiore sarà la forza che tale specie ionica eserciterànello spostare il valore del potenziale.

La membrana cellulare è formatada un doppio strato lipidico in cuisono inserite proteine che hanno lafunzione di trasportare materialeattraverso la membrana.

tra potenziale applicato e flusso di corrente esisteproporzionalitàche può essere espressa in due modi:Conduttanza (g) è un indice della facilità con cui le carichesi muovonoResistenza (R) è un indice della difficoltà con cui le carichesi muovonog=1/RLegge di Ohm (V=IR)g (Siemens) = 1/R (Ohms -1 ) = I (Ampers)/ΔV (Volts)g=1/RIΔV

Il gradiente di concentrazione del Na + è orientato in modo da mandarecariche positive all’interno della cellulaDa un punto di vista elettrico ciò equivale a dire che esiste unabatteria al Na + con un determinato orientamentoENa=58mV× Log10⎛ [Na]⎜⎝[Na]estint⎞⎟⎠EstNonostante esista un gradiente di concentrazione del Na + , cioè unabatteria al Na + , per il momento non c’è flusso di corrente perchèIntil canale del Na + è per ora chiuso!

In seguito all’apertura del canale selettivo per il Na + vi sarà un flusso di corrente (I Na)generato dal gradiente di concentrazione del Na + , cioè dalla batteria al sodio E NaL’intensità del flusso di corrente I Nadipenderà, oltre che dall’intensità della batteriaal Na + (E Na), anche dalla resistenza che il canale offrirà al passaggio degli ioni Na +E Na+ +-Est Intg NaLa permeabilità del canale nei confronti dello ione può essererappresentato da un punto di vista elettrico con un resistore R Naovvero con il suo inverso la conduttanza g Na

Il Na + si muove in base al suo gradiente di concentrazioneCarica netta = -1 0 Carica netta = 0+1E Na+EstInt

Pertanto, ogni canale e il gradiente di concentrazione dello ionepermeante che lo attraversa possono essere rappresentati comecostituiti rispettivamente da un resistore e da una batteria in serieSulla membrana esistono più canali ciascuno selettivo per un certoione, e il circuito elettrico equivalente sarà del tipo:esternoNa + K + Cl - E Nag Na g K g ClE KE Clinterno

se vengono incluse più maglie al circuito lacorrente netta circolante sarà la somma dellesingole correnti ionicheI Netta =ΣI i++E ClE KE Na+g Kg Clg NaΔV

In una membrana permeabile a più ioni ilpotenziale trans-membrana dipende da:•Carica elettrica di ciascuno ione•Permeabilità della membrana a ciascuno ione•Concentrazione interna ed esterna della specie ionica

Variazioni delle concentrazioni di cloro nonmodificano in maniera significativa il potenzialedi membranaInoltre, essendo la permeabilità al sodio moltoinferiore a quella del potassio (circa 1:100), ilpotenziale di riposo di un membrana cellulare èsimile al potenziale di equilibrio elettrochimicoper lo ione potassio

Tuttavia la membrana a riposo è permeabile in piccola percentuale ancheal Na + ,questo fa sì che il potenziale di riposo non sia esattamente il potenzialedi Nernst del potassio, ma un po’ meno negativo.dato che il Na + tende a spostare il potenziale verso il suo potenziale diequilibrio elettrochimicomV+61mVE Na +0mV-80mV-90mVV restingE K +

The membrane potential of a cellcan be measured in mV with theuse of a microelectrode and anoscilloscope.(a) When the recording andreference electrodes are outsideof the cell, and no electricalpotential (0 mV) is recorded.(b) The recording electrode isinside the cell, the referenceelectrode is outside, and anelectrical potentialdifference of about 85 mV isrecorded, with the inside ofthe membrane negative withrespect to the outside.

POTASSIUMCHANNELSligand andvoltage-gatedThis view of the KcsA potassium channel fromthe bacterium Streptomyces lividans shows thechannel's four identical subunits in differentcolors. The center of the channel holds apotassium ion (green). MacKinnon et al.

Canale per il sodioVoltaggio-dipendentesodium channel states:closed (1,2,5), open (3), inactivated (4)

I canali al cloro voltaggio-dipendentiDutzler et al., Nature 2002The ClC chloride channel from Salmonellatyphimurium contains two identical subunits,shown in blue and green, each forming its ownion pore. The extracellular surface of thechannel appears at the top. Red sphereshighlight the pathways for chloride ions.MacKinnon et al.

Canalopatie:patologie legate ad alterazioni molecolari dei canali ionici

Le cellule viventi sono caratterizzate da variazioni del potenziale diriposo se opportunamente stimolate.Esistono due tipi di risposta:Risposta elettrica passiva o potenziale elettrotonico:si produce TUTTE le volte che si fa passare corrente attraverso unamembrana cellulare. Questo accade perché la membrana cellulareè caratterizzata da proprietà elettriche:capacitàresistenzaRisposta attiva o potenziale d’azione: d

Il doppio strato lipidico, dal punto di vista elettrico sicomporta come un condensatore, cioè ha la capacità diseparare le cariche sui due lati della membrana. Le duepiastre conduttrici sono rappresentate dal mezzointracellulare e da quello extracellulare. Il dielettrico isolanteè rappresentato dal doppio strato lipidico.Le proteine canale sono responsabili della secondacaratteristica della membrana cellulare, cioè dellaconduttanza (1/R).

Una membrana con queste caratteristiche se stimolata inmodo opportuno (passaggio di corrente) risponde con unavariazione del potenziale in modo proporzionale al valore diresistenza e capacità.Questa variazione di potenziale prende il nome dipotenziale elettrotonico.00-20m-20-40m-40-60m-60-80m-80-100m0s 20ms 40ms 60ms 80ms 100ms-100

Le caratteristiche del potenziale elettrotonico sono:•È sempre presente, in tutti i tipi cellulari se intervieneuno stimolo sulla membrana cellulare•Dipende dalle caratteristiche passive della membranacellulare, cioè resistenza e capacità•È proporzionale all’intensità dello stimolo che logenera•Decade nel tempo e nello spazio con una costante dispazio che dipende dalle caratteristiche della fibra

Potenziale d’Azione Durante la 1° fase la membrana diviene piùpermeabile al sodio e il potenziale di membrana si porta verso ilvalore del potenziale di equilibrio per il sodio (E Na ).Prima che il potenziale di membrana raggiunga E Na , la permeabilitàal sodio inizia a diminuire e al tempo stesso aumenta la permeabilitàper il potassio. Questo cambiamento della conduttanza riporta ilpotenziale di membrana verso E K giustificando la ripolarizzazione.l’equilibrio ionico è mantenutoe/o ristabilito dallapompa Na/K-ATPasi

il valore del potenzialedi riposo è compresotra -40 e -90 mV, aseconda della cellulaPer misurare ilpotenziale di riposo siusa un ELETTRODOENDOCELLULARE conuna punta di 0.5μm eriempita di KCl 3M(Hodgkin, Huxley,Eccles, Keynes, Katz,1939)

Apparecchiatura utilizzata per le misureelettrofisiologiche in “current clamp”mediante due microelettrodi endocellulariper lo studio di parametri elettrici attivi epassivi di membrana dei tessuti eccitabilifibremuscolari scheletrichefibrecardiachefibrenervosepotenzialedi membrana a riposoparametridi cavoconduttanzeionichepotenzialed’azione

la corrente ionica che passa attraverso icanali è definita dalla legge di ohmV = RIla facilità con cui gli ioni attraversano lamembrana tramite i canali definisce la misuradella conduttanza di membrana, maggiore èla conduttanza maggiore è il flusso di ioni.La conduttanza è l’inverso della resistenza(R), misurata in ohm

Una proprietà elettrica della membranache influenza il movimento di ioni è lacapacità di membrana (Cm) cioèl’attitudine della membrana adimmagazzinare cariche elettriche.La capacità di membrana è misurata inunità di farad (F).Un fattore che determina la quantità dicarica che una membrana può accumulareè la sua superficie, più grande è lasuperficie, maggiore sarà la capacità diaccumulare la carica.

teoria del cavola membrana cellulare è paragonabile aduna resistenza attraversata da correnteNellaconduzionedeisegnalila fibrascheletricasicomportacome un cavoelettrico.Unsegnaleelettricopassivo(iperpolarizzante) applicatoad un capodellafibrascheletricasubisceundecremento e una distorsione la cui entitàdipende:• dalladistanza(rispettoal puntodiiniezione dell’impulsoimpulso) alla quale vengonoeffettuate le rilevazioni,• dallaresistenzainternalegataallacomposizione ionica intracellulare,• dalleresistenzetrasversedovuteacompartimentiisolanticostituentilamembrana• dalleelevatecomponenticapacitivepresenti nelle fibre scheletriche ma nonnei comuni cavi elettrici.Lo strato idrofobico della membranaplasmatica funge da isolante elettrico.La superficie della membrana plasmaticae le soluzioni elettrolitiche del citosol edel liquido extracellulare sono invecebuoni conduttori della corrente elettrica.

Misura delle proprietà passive dimembrana dei tessuti eccitabili:parametri di cavoUno stimolo iperpolarizzante (o sottosoglia)applicato alla fibra muscolare genera unpotenziale elettrotonicoLe correnti al cloro e al potassio che passanoattraverso la membrana attenuano l’effettoiperpolarizzante prodotto dal punto di applicazione delmicroelettrodo.Al contrario del potenziale d’azione, che segue lalegge del tutto o nulla,il potenziale elettrotonico si propaga con diminuzionelungo la fibra, scomparendo a distanza dallo stimolo,secondo la teoria del cavo.

Il decadimento del potenziale elettrotonico per unità dilunghezza della fibra è determinato dalla costante dispazio λλ = Vr m /r idove r m è al resistenza di membrana per unità di lunghezza (ohm xcm) e r i è la resistenza longitudinale del citoplasma per unità dilunghezza (ohm/cm) (cioè la resistenza che gli ioni incontranoquando scorrono all’interno del citoplasma).00-20m-40m-60m-80m-100m-20-40-60-80-1000s 20ms 40ms 60ms 80ms 100msλ rappresenta la distanza alla quale il potenziale di membranadecade fino al 37% del suo valore massimo.Più elevato è λ minore sarà il decadimento per unità di lunghezza.Quindi con l’aumentare della resistenza di membrana (Rm) lacostante di spazio aumenta.(maggiore per le fibre di ratto rispetto a quelle di topo)

La velocità con la quale lamembrana si ripolarizza dipendedalla resistenza di membrana perunità di area Rm (1/gm) e lacapacità per unità di area Cm.Il prodotto della resistenza dimembrana e della capacità definiscela costante di tempo τ dellamembranaτ = Rm x Cmdove τ rappresenta il tempoimpiegato dal potenziale dimembrana a decadere fino al 37% delsuo valore iniziale.La (τ) velocità di decadimento per laripolarizzazione è più lenta per valori altidella costante di tempo, perchél’aumento della resistenza di membranae/o della capacità fanno scaricare piùlentamente la membrana.

SET-UPCurrent clamp

Metodica di Current Clamppermette di fissare la corrente che saràutilizzata per stimolare la cellula e registrare levariazioni di voltaggio che ne derivanoun computer effettua la stimolazione,l’acquisizione dei dati e la misura dei parametrielettricistandardizzata per il muscolo scheletricoprelievo in anestesia generale avendo cura dinon arrecare danno né all’animale né almuscoloposizionamento su una bacchetta di vetro tiratomediante i tendini (per dare la giusta tensione)in una apposita vaschetta contenente soluzionefisiologica termostatata e opportunamentecarbossigenata

Vaschetta termostatata per registrazioniintracellulari con due microelettrodiPreparato muscolare (EDL). Sono visibili i duemicroelettodi utilizzati per l’impalamentodelle singole fibre

100mSegnale rilevato10080m8060m6040m40Risposta (mV)20m0-20m200-20Stimolo (nA)-40m-40-60m-60-80m-80-100m-1000s 20ms 40ms 60ms 80ms 100msI = corrente applicata alla distanza0 (in nA)t 84 = tempo necessario perraggiungere l’84% delplateau alla posizione V1

i parametri di cavo misurati con la metodicadei due microelettrodi endocellulari sono:λ costante di spazio (in mm) = (X-0.05)/ln (V1/V2)R inresistenza in ingresso (in MΩ) = 0.1 x (V1/I) x exp (0.05/ λ)τ costante di tempo (in ms) τ =t 84r iresistenza mioplasmica (in MΩ/cm) = 20 x R in/ λr mresistenza di membrana (in MΩ x cm) = 0.2 x R inx λc mcapacità di membrana (in μF/cm) = (λ /r m) x 0.001considerando la resistività specifica Ri che è stata calcolata per il ratto(dipendente dalle dimensioni della fibra muscolare) a 38°C = 125 Ω xcm si misurano:D = diametro della fibra (in μm) = (4 x R i/ π x r i) 1/2 x 10Rm = resistenza della membrana (in MΩ x cm 2 ) = r mx (π x D) x 10 2Cm = capacità di membrana (in μF x cm 2 ) = c m/ (π x D) x 10 4

la resistenza di membrana è legata alla permeabilità ariposo agli ioni K + e Cl -l’inverso della resistenza da la conduttanzain soluzione fisiologica normaleG m totale = 1/R m = G K + G Clin soluzione senza cloro si calcola G Kper avere la G Cl basta sottrarre G K a G m

Applicazioni della metodicavalutazione effetti di farmaci specifici peri canali al cloro e al potassio (modificazioneparametri di cavo in diverse soluzionifisiologiche)valutazione effetti di farmaci sui canali alsodio (modificazione del potenzialed’azione)valutazione proprietà attive e passive insituazioni patologiche spontanee o indotteda farmaci o in situazioni fisiologicheparticolari (sviluppo, invecchiamento,disuso)terapia farmacologica

GrelinariducegCl egKEffettoantagonizzato daspecificoinibitoredelrecettore

Misura delleproprietà attive dimembranadi tessuti eccitabilifibre scheletriche,cardiache, nervose,cellule β delpancreasPotenziale d’azionequando lo stimolodepolarizzanteraggiunge lasoglia, si aprono icanali al Na + nerisulta unadepolarizzazionedella membrana. Poii canali alNa + si chiudono(inattivazione tempoe voltaggiodipendente) e siaprono i canali alpotassio. Ilpotassio esce e lamembrana siripolarizza.

Potenziale d’azioneregistrato nel muscoloscheletrico di (A) topisani e (B) miotonici edeffetti della mexiletinae suoi derivati

MECHANICAL THRESHOLD(soglia meccanica di contrazione)nel muscolo scheletricoè una misura dell’e-c coupling e dipende dadiversi fattorilivelli di Ca 2+ basalesensibilità al Ca 2+ delle proteine contrattiliSR ATPaseDHP receptorsRy receptorsproteine sequestranti il Ca 2+calsequestrina (nel RS) e parvalbumina (nelcitosol)

La mechanical thresholddelle fibre muscolari viene misurata inpoint voltage clampcon 2 microelettrodi•holding potential -90 mV•impulsi di durata variabile 500-5 ms vengono imposti allafrequenza di 0.3 Hz•aggiunta TTX•a ciascuna durata il voltaggio viene aumentato finchè lacontrazione non diventa visibile•misura potenziale soglia (V) plottato in funzione di ciascunadurata•dal fit dei singoli punti si calcola la reobase

Valori di ReobaseSoleo controlloSoleo HU 1 settimanaSoleo HU 3 settimaneEDL controlloEDL HU 3 settimane-73 ± 0.4 mV-68 ± 0.8 mV*-69 ± 0.7 mV*-62 ± 0.2 mV-64 ± 0.3 mV

Action Potential recordingsSegnale rilevatoSegnale rilevato100m1k100m1k80m80080m80060m60060m60040m20m0400200040m20m04002000Control-20m-200-20m-200-40m-400-40m-400-60m-600-60m-600-80m-800-80m-800-100m-1k-100m-1k0s 20ms 40ms 60ms 80ms 100ms0s 20ms 40ms 60ms 80ms 100msFluvastatin5 mg/kg100m80m60m40m20mSegnale rilevato1k800600400200100m80m60m40m20mSegnale rilevato1k8006004002000000-20m-200-20m-200-40m-400-40m-400-60m-600-60m-600-80m-800-80m-800-100m0s 20ms 40ms 60ms 80ms 100ms-1k-100m0s 20ms 40ms 60ms 80ms 100ms-1k

Effetti dei farmaciipolipemizzanti sulla sogliameccanica di contrazione