Diagnosi diretta - Sezione di Microbiologia

METODI DIAGNOSTICI IN VIROLOGIA1. Diagnosi diretta2. Diagnosi indirettaLa diagnosi diretta è rivolta alla ricerca dell’agente infettante o di suoicomponenti chiaramente identificati;la diagnosi indiretta o sierologica sfrutta a fini diagnostici la rispostaimmunitaria dell’organismo infettato; entrambe possono esserequalitative e quantitative.2 di 00

DIAGNOSI DIRETTA E DIAGNOSI INDIRETTAla diagnosi diretta è da preferire, come quella che può consentire lostudio analitico di un determinato agente eziologico, soprattutto per quantoriguarda i determinanti genetici della virulenza e, importantissimo, dellaresistenza a farmaci chemioterapici.La diagnosi indiretta trova indicazione nelle infezioni acute e nella faseacuta (infezione primaria) delle infezioni persistenti (’eccezioni importantispno le malformazioni congenite, da virus o altri microrganismi, che, purderivando da infezioni persistenti, possono essere diagnosticateefficientemente con tecniche sierologiche).3 di 00

CRITERI PER L’ACCETTABILITÀ E L’IMPIEGO ROUTINARIO DI UN TESTDI DIAGNOSTICA MICROBIOLOGICASpecificitàSensibilitàPraticità e rapidità di esecuzioneCosto contenuto4 di 00

DIAGNOSI DIRETTA1. Ricerca del Virus Esame colturale Colture cellulari effetto citopatico, ecc.Esame microscopico Microscopia elettronica morfologia2. Ricerca dell’Antigene Esame immunologico immunofluorescenza, ELISA, ecc.3. Ricerca del Genoma Ibridizzazione con sonde - amplificazione genica (PCR) eReal Time PCR5 di 00

ISOLAMENTO VIRALE1. Colture Cellulari effetto citopatico (CPE)emoadsorbimentoimmunofluorescenza2. Uova effetto citopaticoemoagglutinazionecorpi inclusi3. Animali malattia o morte6 di 00

ISOLAMENTO VIRALELe colture cellulari sono usate per l’isolamento virale: ci sono tretipi di colture cellulari:1) Colture primarie rene di scimmia2) Colture secondarie fibroblasti di cutecellule di rene embrionale umano3) Linee continue HeLa, Vero, Hep2, LLC-MK2, MDCKLe colture primarie sono il miglior sistema disponibile che supporta lareplicazione del maggior numero di virus. Comunque, sono molto costose,e spesso è difficile avere una fornitura affidabile e continua. Le lineecontinue sono le più facili da gestire, ma hanno uno spettro d’ospitelimitato.7 di 00

COLTURE CELLULARILa replicazione virale causa:Effetto Citopatico (CPE) – simile al rigonfiamento delle cellule oalla formazione di sincizi – può essere specifico oppure nonspecifico.Emoadsorbimento – le cellule acquisiscono la capacità di legarsi aiglobuli rossi di mammiferi.La conferma dell’identificazione del virus può essere eseguitamediante prove di neutralizzazione, inibizione dell’emoadsorbimento,prove di immunofluorescenza o prove di ibridizzazionecon sonde specifiche8 di 00

EFFETTO CITOPATICO (1)Effetto citopatico dell’enterovirus 71 e di HSV incellule in coltura: osservare il rigonfiamentodelle cellule.9 di 00

EFFETTO CITOPATICO (2)Formazione di sincizi in colture cellulariindotta da (alto) e da virus del morbillo(in basso).10 di 00

EFFETTO CITOPATICO (3): RHINOVIRUS11 di 00

EMOADSORBIMENTOLa formazione di sincizi causati dal virus del morbillo e l’emoadsorbimento di eritrociti12 disulla superficie del monostrato.00

CELLULE EPITELIALI: ADENOVIRUSNon-infettate Infezione precoce Infezione tardivaslides from CDC13 di 00

CELLULE EPITELIALI: VIRUS RESPIRATORIO SINCIZIALE (RSV)non infettateEffetto citopatico da RSVslides from CDC14 di 00

CELLULE FIBROBLASTICHE: VIRUS HERPES SIMPLEXslides from CDCNon infettate Infezione precoce Infezione tardiva15 di 00

CELLULE FIBROBLASTICHE: POLIOVIRUSslides from CDCNon infettate Infezione precoce Infezione tradiva16 di 00

SINCIZI: HIV17 di 00

IMMUNOFLUORESCENZA18 di 00

CORPI INCLUSI DA CMV19 di 00

CORPI INCLUSI DA CMV20 di 00

PROBLEMI CON LE COLTURE CELLULARITempi lunghi (fino a 4 settimane) per il referto.Spesso hanno una scarsa sensibilità, che dipende dalle condizionidel campioneSuscettibili di contaminazione batterica.Sensibili a sostanze tossiche, che possono essere presenti nelcampione.Molti virus non crescono in colture cellulari: virus dell`epatite B,parvovirus, papillomavirus, rotavirus, ecc..21 di 00

ESAMI COLTURALI RAPIDISono disponibili esami colturali rapidi, nei quali si identificanoantigeni virali in 2-4 giorni. Il miglior esempio è il test per l`antigenepp72 del CMV.Un monostrato cellulare è fatto crescere su singoli vetrini in unafiaschetta di plastica sterileDopo l`inoculazione del campione, la fiaschetta viene centrifugata abassa velocità per 1 ora (per accelerare l`adsorbimento del virus) equindi incubata per 2 – 4 giorni.Il vetrino viene rimosso e analizzato per la presenza dell`antigeneprecoce virale pp72 utilizzando un anticorpo monoclonale anti pp72coniugato con fluoresceina (immunofluorescenza).22 di 00

TEST COLTURALE RAPIDO PER L`ANTIGENE pp72 DI CMV23 di 00

VIRUS ISOLABILI IN COLTURE CELLULARIVIRUS FACILMENTE ISOLABILIHerpes simplexCitomegalovirusAdenovirusCoxsackie Virus BEchovirusVirus parainfluenzaliParotiteVirus Respiratorio SincizialeVIRUS DIFFICILMENTE ISOLABILIVaricella ZosterMorbilloRosoliaRhinovirusCoxsackieVirus A24 di 00

MICROSCOPIA ELETTRONICA10 6 virioni per ml sono richiesti per la visualizzazione, ingrandimenti di50,000 - 60,000 volte sono normalmente impiegati. I virus possonoessere identificati nei seguenti campioni.FeciRotavirus, Adenovirus, Norwalk like virusesAstrovirus, CalicivirusLiquidi di vescicoleHSVVZVPrelievi di cutepapillomavirus, mollusco contagioso25 di 00

ELETTROMICROGRAFIEAdenovirusRotavirus26 di 00

MICROSCOPIA ELETTRONICA: HIV27 di 00

IMMUNO-ELETTRO MICROSCOPIALa sensibilità e specificità della microscopia elettronica può essere miglioratacon la immuno-elettro microscopia. Ci sono due varianti:La Immuno Elettro Microscopia Classica: il campione è trattato conantisieri specifici prima di essere posizionato sul microscopio. Leparticelle virali presenti saranno agglutinate insieme dall’anticorpo.La Immuno Elettro Microscopia su Fase Solida: La griglia ècoattata con antisieri specifici. Le particelle virali presenti nelcampione saranno adsorbite sulla griglia dall’anticorpo.28 di 00

IMMUNO ELETTRO MICROSCOPIA29 di 00

PROBLEMI CON LA MICROSCOPIA ELETTRONICAStrumentazione costosaManutenzione costosaElevata competenza tecnicaBassa sensibilità30 di 00

IMMUNOFLUORESCENZAVirology Laboratory, Yale-NewHaven HospitalPositive immunofluorescence test forrabies virus antigen. (Source: CDC)31 di 00

CMV pp65 ANTIGENAEMIA TESTAntigeni pp65 di CMV identificati nei nucleidi neutrofili del sangue periferico. VirologyLaboratory, Yale-New Haven Hospital.32 di 00

IMMUNOFLUORESCENZA per CMV nelle URINE33 di 00

IMMUNOFLUORESCENZA per CMV nei : PBL34 di 00

IMMUNOFLUORESCENZA35 di 00

IBRIDIZZAZIONE HIV36 di 00