Diagnosi diretta - Sezione di Microbiologia
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METODI DIAGNOSTICI IN VIROLOGIA1. <strong>Diagnosi</strong> <strong><strong>di</strong>retta</strong>2. <strong>Diagnosi</strong> in<strong><strong>di</strong>retta</strong>La <strong>di</strong>agnosi <strong><strong>di</strong>retta</strong> è rivolta alla ricerca dell’agente infettante o <strong>di</strong> suoicomponenti chiaramente identificati;la <strong>di</strong>agnosi in<strong><strong>di</strong>retta</strong> o sierologica sfrutta a fini <strong>di</strong>agnostici la rispostaimmunitaria dell’organismo infettato; entrambe possono esserequalitative e quantitative.2 <strong>di</strong> 00
DIAGNOSI DIRETTA E DIAGNOSI INDIRETTAla <strong>di</strong>agnosi <strong><strong>di</strong>retta</strong> è da preferire, come quella che può consentire lostu<strong>di</strong>o analitico <strong>di</strong> un determinato agente eziologico, soprattutto per quantoriguarda i determinanti genetici della virulenza e, importantissimo, dellaresistenza a farmaci chemioterapici.La <strong>di</strong>agnosi in<strong><strong>di</strong>retta</strong> trova in<strong>di</strong>cazione nelle infezioni acute e nella faseacuta (infezione primaria) delle infezioni persistenti (’eccezioni importantispno le malformazioni congenite, da virus o altri microrganismi, che, purderivando da infezioni persistenti, possono essere <strong>di</strong>agnosticateefficientemente con tecniche sierologiche).3 <strong>di</strong> 00
CRITERI PER L’ACCETTABILITÀ E L’IMPIEGO ROUTINARIO DI UN TESTDI DIAGNOSTICA MICROBIOLOGICASpecificitàSensibilitàPraticità e rapi<strong>di</strong>tà <strong>di</strong> esecuzioneCosto contenuto4 <strong>di</strong> 00
DIAGNOSI DIRETTA1. Ricerca del Virus Esame colturale Colture cellulari effetto citopatico, ecc.Esame microscopico Microscopia elettronica morfologia2. Ricerca dell’Antigene Esame immunologico immunofluorescenza, ELISA, ecc.3. Ricerca del Genoma Ibri<strong>di</strong>zzazione con sonde - amplificazione genica (PCR) eReal Time PCR5 <strong>di</strong> 00
ISOLAMENTO VIRALE1. Colture Cellulari effetto citopatico (CPE)emoadsorbimentoimmunofluorescenza2. Uova effetto citopaticoemoagglutinazionecorpi inclusi3. Animali malattia o morte6 <strong>di</strong> 00
ISOLAMENTO VIRALELe colture cellulari sono usate per l’isolamento virale: ci sono tretipi <strong>di</strong> colture cellulari:1) Colture primarie rene <strong>di</strong> scimmia2) Colture secondarie fibroblasti <strong>di</strong> cutecellule <strong>di</strong> rene embrionale umano3) Linee continue HeLa, Vero, Hep2, LLC-MK2, MDCKLe colture primarie sono il miglior sistema <strong>di</strong>sponibile che supporta lareplicazione del maggior numero <strong>di</strong> virus. Comunque, sono molto costose,e spesso è <strong>di</strong>fficile avere una fornitura affidabile e continua. Le lineecontinue sono le più facili da gestire, ma hanno uno spettro d’ospitelimitato.7 <strong>di</strong> 00
COLTURE CELLULARILa replicazione virale causa:Effetto Citopatico (CPE) – simile al rigonfiamento delle cellule oalla formazione <strong>di</strong> sincizi – può essere specifico oppure nonspecifico.Emoadsorbimento – le cellule acquisiscono la capacità <strong>di</strong> legarsi aiglobuli rossi <strong>di</strong> mammiferi.La conferma dell’identificazione del virus può essere eseguitame<strong>di</strong>ante prove <strong>di</strong> neutralizzazione, inibizione dell’emoadsorbimento,prove <strong>di</strong> immunofluorescenza o prove <strong>di</strong> ibri<strong>di</strong>zzazionecon sonde specifiche8 <strong>di</strong> 00
EFFETTO CITOPATICO (1)Effetto citopatico dell’enterovirus 71 e <strong>di</strong> HSV incellule in coltura: osservare il rigonfiamentodelle cellule.9 <strong>di</strong> 00
EFFETTO CITOPATICO (2)Formazione <strong>di</strong> sincizi in colture cellulariindotta da (alto) e da virus del morbillo(in basso).10 <strong>di</strong> 00
EFFETTO CITOPATICO (3): RHINOVIRUS11 <strong>di</strong> 00
EMOADSORBIMENTOLa formazione <strong>di</strong> sincizi causati dal virus del morbillo e l’emoadsorbimento <strong>di</strong> eritrociti12 <strong>di</strong>sulla superficie del monostrato.00
CELLULE EPITELIALI: ADENOVIRUSNon-infettate Infezione precoce Infezione tar<strong>di</strong>vaslides from CDC13 <strong>di</strong> 00
CELLULE EPITELIALI: VIRUS RESPIRATORIO SINCIZIALE (RSV)non infettateEffetto citopatico da RSVslides from CDC14 <strong>di</strong> 00
CELLULE FIBROBLASTICHE: VIRUS HERPES SIMPLEXslides from CDCNon infettate Infezione precoce Infezione tar<strong>di</strong>va15 <strong>di</strong> 00
CELLULE FIBROBLASTICHE: POLIOVIRUSslides from CDCNon infettate Infezione precoce Infezione tra<strong>di</strong>va16 <strong>di</strong> 00
SINCIZI: HIV17 <strong>di</strong> 00
IMMUNOFLUORESCENZA18 <strong>di</strong> 00
CORPI INCLUSI DA CMV19 <strong>di</strong> 00
CORPI INCLUSI DA CMV20 <strong>di</strong> 00
PROBLEMI CON LE COLTURE CELLULARITempi lunghi (fino a 4 settimane) per il referto.Spesso hanno una scarsa sensibilità, che <strong>di</strong>pende dalle con<strong>di</strong>zionidel campioneSuscettibili <strong>di</strong> contaminazione batterica.Sensibili a sostanze tossiche, che possono essere presenti nelcampione.Molti virus non crescono in colture cellulari: virus dell`epatite B,parvovirus, papillomavirus, rotavirus, ecc..21 <strong>di</strong> 00
ESAMI COLTURALI RAPIDISono <strong>di</strong>sponibili esami colturali rapi<strong>di</strong>, nei quali si identificanoantigeni virali in 2-4 giorni. Il miglior esempio è il test per l`antigenepp72 del CMV.Un monostrato cellulare è fatto crescere su singoli vetrini in unafiaschetta <strong>di</strong> plastica sterileDopo l`inoculazione del campione, la fiaschetta viene centrifugata abassa velocità per 1 ora (per accelerare l`adsorbimento del virus) equin<strong>di</strong> incubata per 2 – 4 giorni.Il vetrino viene rimosso e analizzato per la presenza dell`antigeneprecoce virale pp72 utilizzando un anticorpo monoclonale anti pp72coniugato con fluoresceina (immunofluorescenza).22 <strong>di</strong> 00
TEST COLTURALE RAPIDO PER L`ANTIGENE pp72 DI CMV23 <strong>di</strong> 00
VIRUS ISOLABILI IN COLTURE CELLULARIVIRUS FACILMENTE ISOLABILIHerpes simplexCitomegalovirusAdenovirusCoxsackie Virus BEchovirusVirus parainfluenzaliParotiteVirus Respiratorio SincizialeVIRUS DIFFICILMENTE ISOLABILIVaricella ZosterMorbilloRosoliaRhinovirusCoxsackieVirus A24 <strong>di</strong> 00
MICROSCOPIA ELETTRONICA10 6 virioni per ml sono richiesti per la visualizzazione, ingran<strong>di</strong>menti <strong>di</strong>50,000 - 60,000 volte sono normalmente impiegati. I virus possonoessere identificati nei seguenti campioni.FeciRotavirus, Adenovirus, Norwalk like virusesAstrovirus, CalicivirusLiqui<strong>di</strong> <strong>di</strong> vescicoleHSVVZVPrelievi <strong>di</strong> cutepapillomavirus, mollusco contagioso25 <strong>di</strong> 00
ELETTROMICROGRAFIEAdenovirusRotavirus26 <strong>di</strong> 00
MICROSCOPIA ELETTRONICA: HIV27 <strong>di</strong> 00
IMMUNO-ELETTRO MICROSCOPIALa sensibilità e specificità della microscopia elettronica può essere miglioratacon la immuno-elettro microscopia. Ci sono due varianti:La Immuno Elettro Microscopia Classica: il campione è trattato conantisieri specifici prima <strong>di</strong> essere posizionato sul microscopio. Leparticelle virali presenti saranno agglutinate insieme dall’anticorpo.La Immuno Elettro Microscopia su Fase Solida: La griglia ècoattata con antisieri specifici. Le particelle virali presenti nelcampione saranno adsorbite sulla griglia dall’anticorpo.28 <strong>di</strong> 00
IMMUNO ELETTRO MICROSCOPIA29 <strong>di</strong> 00
PROBLEMI CON LA MICROSCOPIA ELETTRONICAStrumentazione costosaManutenzione costosaElevata competenza tecnicaBassa sensibilità30 <strong>di</strong> 00
IMMUNOFLUORESCENZAVirology Laboratory, Yale-NewHaven HospitalPositive immunofluorescence test forrabies virus antigen. (Source: CDC)31 <strong>di</strong> 00
CMV pp65 ANTIGENAEMIA TESTAntigeni pp65 <strong>di</strong> CMV identificati nei nuclei<strong>di</strong> neutrofili del sangue periferico. VirologyLaboratory, Yale-New Haven Hospital.32 <strong>di</strong> 00
IMMUNOFLUORESCENZA per CMV nelle URINE33 <strong>di</strong> 00
IMMUNOFLUORESCENZA per CMV nei : PBL34 <strong>di</strong> 00
IMMUNOFLUORESCENZA35 <strong>di</strong> 00
IBRIDIZZAZIONE HIV36 <strong>di</strong> 00