Il sistema immunitario dei teleostei - G. Scapigliati - SIPI

Il sistema immunitarioi Dicentrarchus labrax…. e non solo

Lymphoid Organs of Teleoststrunk kidneyTeleosts have innate and acquireddefences

DIFESE INNATE:- Peptidi antibatterici- Complemento- Lisozima, Transferrina- Produzione di ROS- Fagocitosi- IFNαRapide (1 s-10 min), aspecifiche, senza memoriaAttivate da stimolanti (es. glucani)Inibite da stress

- AnticorpiDIFESEACQUISITE:- Opsonine/Complemento- Linfociti killer e helper antigene-specifici- Produzione di citochine e fattorisolubiliRitardate (da ore a giorni), specifiche, con memoriAttivate da stimolanti (adiuvanti, probiotici)Inibite da stress

Cosa sappiamo delle difese immunitarie dei teleostei in acquacoltura?1- Il sistema immunitario risponde, in quanto stimolando con un antigene tigene o vaccingenetica si possono misurare, dopo un certo tempo, anticorpi circolanti colanti specifici(casi a parte: Cod, Haddok, Icefish).2- Il sistema immunitario può essere modulato positivamente da immunostimolanimmunoadiuvanti, probiotici; ; negativamente da condizioni di stress ambientale.3- Si può effettuare vaccinazione propedeutica massiva e preventiva in età giovan4- La vaccinazione terapeutica ha poco effetto nel rallentare gli outbreaks5- Alcuni patogeni sono ormai ubiquitari e, quindi, opportunisti.6- Nonostante le somiglianze, e’ difficile applicare le conoscenze immunologichemammiferi ai Teleostei, , e fra questi puo’ essere difficile da specie a specie.Futuro: vaccini polivalenti, modulazione positiva, parchi riproduttori geneticamenselezionati.

Metodi con i quali si studia ilsistema immunitarioCellulariMolecolariProliferazioni “in vitro” inrisposta a stimoli “allo” e“xeno”Misurazione di anticorpi prodotti “invivo” e “in vitro”Attività antibatterica e antiviraleCitotossicità e “killing“killing”Determinazioni delle concentrazionileucocitarie

Metodi con i quali si studia ilsistema immunitarioCellulariMolecolariClonaggio di geni di interessePresenza di espressionegenica (RT-PCR e qRT-PCR)Determinazione dell’antigene(i)riconosciuto(i)Espressione dei geni diinteresseTrasfezione di geni diinteresseEspressione di proteinericombinantiAnalisi extra- ed intracellulari delle interazioni ligando-

Lab of Animal Biotechnology:Cellular and molecular markers available for sea bassMab anti- thymocytes andperipheralT cellsMab anti- immunoglobulins and B-cellsMab anti- complement (C3)Molecular probes for:IL-1β, , IL-10, CD8a, T-cellreceptor(Vb,, Va), Immunoglobulin (IgLC),MHCI, MHCII, IFN, Ciclooxygenase-2, MxContinuous embryonic cell line(DLEC)Riboprobes for “in situ”hybridisationProtocols for:Sea bass is, , at present, , the only marine teleoLeucocyte purification, leucocytestaining, cell proliferation, secondmessengers detection, transfection,markers areimmunoenzymatic analysis, fishvaccination…..species for which all these markersIn progress:EST libraries from fish challengedwith various pathogens,Microarray chip(s)are avail

IMMUNITA’ UMORALEProduzione di anticorpi specifici “invivo”Produzione di anticorpi specifici “invitro”

Test the efficiency of a stimulant(e.g. a vaccine) through B-cellactivitiesBcRAgB-cellactivitiesB-cellThe binding of an antigen isenough to activate B lymphocytesfor somatic ricombination of BcRand for antibody secretionRationale: B-cells from immunised fish shouldproduce antigen-specific antibodies andmaintaina memory for the antigen.Methods: ELISA and “In vitro” production of specific antibody by HKleucocytes.

IMMUNITA’ UMORALE “in vivo”Antigene sintetico: aptene (DNP) e molecola carrier (KLH)30,25Abs. 492 nm2,521,510,502 2,3 2,6 2,9 3,2 3,5 3,8 4,1Log reciprocal serum dilutionAbs. 492 nm0,20,150,10,0502 2,3 2,6 2,9 3,2 3,5 3,8 4,1Log reciprocal serum dilutionDNP-KLHKLHELISA di Anticorpi specifici anti-DNPDNP-KLH e KLH nelsiero di pesci immunizzati per via intraperitoneale (30giorni).

Risposta antibatterica “in vivo”0,450,40,35Pre-immuneImmune0,3A492 nm0,250,20,150,10,0502 2,3 2,6 2,9 3,2 3,5 3,8 4,1 4,4 4,7 5 5,3Log reciprocal serum dilutionELISA di Anticorpi specifici anti-Vibrio nel siero di pescidopo 20 giorni di immunizzazione i.p., senza richiamo

Risposta antibatterica “in vivo”1,41,210,8ImmunePre-immunePesci di 2 gAbs 492 nm0,60,40,202 2,3 2,6 2,9 3,2 3,5 3,8 4,1 4,4 4,7 5 5,3log reciprocal serum dilutionELISA di Anticorpi specifici anti-Vibrio nel siero di pesciimmunizzati un anno prima con vaccino commerciale perIlimmersionesiero di questo gruppo di animali è capace di agglutinare “invitro” Vibrio anguillarum vitale

RISPOSTA ANTIBATTERICA “in vivo”La vaccinazione per immersione contro Photobacterium damselaerichiede un richiamo dopo 20 giorniAbs. 492 nm0,60,50,40,30,2P. damselae, 64 days (30 days after boosting)preimmuneimmunePesci di 100 g0,102 2,3 2,6 2,9 3,2 3,5 3,8 4,1Log reciprocal serum dilutionELISA di Anticorpi specifici anti-P.damselae nel siero di pesciimmunizzati.

RISPOSTA ANTIBATTERICA “in vivo”, effetto diimmunoadiuvante: E.coli LTK63 ricombinante0,25a0,2b21 49 (28*)0,50,4c0,80,70,670 (49*)0,150,30,50,40,10,20,30,050,10,20,102 2,3 2,6 2,9 3,2 3,5 3,8 4,102 2,3 2,6 2,9 3,2 3,5 3,8 4,102 2,3 2,6 2,9 3,2 3,5 3,8 4,1ELISA assay.control PhdaPhda + LTK63Pesci di 1,5 gELISA assay on pooled sera of young sea bass (1.5 G) vaccinated against Photobacterium damselae batested at day 21 (a), 49 (b), and 70 (c) after vaccination. Control rol fish= black bars, vaccinated fish = emptyLTK63-treated fish = grey bars. X-axis Xis the log of reciprocal serum dilution.

RISPOSTA “in vivo”, effetto diimmunoadiuvante: : (IL-1β ricombinante)Abs 492 nm0,60,50,40,30,20,10PBSPBS+VibrioPBS+Vibrio+IL-1beta2 2,3 2,6 2,9 3,2 3,5 3,8 4,1Log rec. serum dilutionImmunizzazione intraperitonealeELISA dopo 30 giorniPesci di 150 gAbs 492 nm10,80,60,4PBSPBS+VibrioPBS+Vibrio+IL-1-betaELISA dopo 60 giorni0,202 2,3 2,6 2,9 3,2 3,5 3,8 4,1Log rec. serum dilution

RISPOSTA “in vivo”, effetto di probiotici2COX-2, espressione relativa1,81,61,41,210,80,60,40,2Espressione COX-2/actinaRT-PCR su RNA estrattoda cellule di intestinoPesci di 50 g0control pro-car1 pro-car2Cellule a 51 dph(cellule/mm 2 )Controllo Pro-carrier 1 ∆%EGC 19 ± 6 19 ± 3 0Linfociti T 1158 ± 149 1252 ± 274 + 8Cellule a 74 dph(cellule/mm 2 )Controllo Pro-carrier 1 ∆% Pro-carrier 2* p

RISPOSTA “in vivo”, effetto di CpG-nucleotidi

RISPOSTA “in vivo”, effetto di immunostimolanti15 giorni di trattamentoPesci di 50 gcomplementoHSP 70lisozimaHSP 70

RISPOSTA “in vivo”, effetto di immunostimolanti45 giorni di trattamentocomplementoPesci di 50 glisozimaProteina totale sierica

RISPOSTA “in vivo”, effetto di immunostimolantiConta dei linfociti B e linfocitiT tramite analisi citofluorimetricaPesci di 50 gPBL T-cellsPBL B-cellsIntestino T-cellsIntestino B-cells

Effetto “in vivo”: concentrazione di ossigenodisciolto876543213530252015102150normossiaiperossia0normossiaiperossiaQuantità di immunoglobuline totali sierichein spigola (1) e sarago pizzuto (2) determinate tramite ELISA

Effetto “in vivo”: concentrazione di ossigenodisciolto sulla conta linfocitariaLinfociti T (%) Linfociti B (%)normossiaiperossianormossia iperossia---------------------------------------------------------------------------timo 264 726 aaa 78*** 54.5**rene 98 84 86 367*** ,aaamilza 138 92 212* 308*** ,aintestino 119 552 aaa 109 22*** ,abranchie 2514 7013 aaa 76** 61***sangue 85 32 1010 109--------------------------------------------------------------------------L’analisi statistica del T di Student per dati non appaiati (a due code) risulta: significativamentedifferente da cellule positive per DLT15 (***) P

RISPOSTA ANTICORPALE“in vitro”vitro

RISPOSTA ANTIBATTERICA “in vitro”Immersion-vaccinationagainst Photobacterium damselaeand immunoadjuvanticity of E. coli rLTK63a0,70,6HK0,6b0,5Gills0,50,40,40,30,30,20,20,10,1021 40 70021 40 70control PhdaPhda + LTK63“In vitro” production of anti-Phda immunoglobulins.Head kidney and gill leucocytes at indicated days incubated with the immunisation antigen(Photobacteriumdamselae bacterin) ) adsorbed onto plastic for 48 hours at 18 °C. Cells were thenremoved and specific antibody detected by ELISA.

IMMUNITA’ UMORALE “in vitro”Produzione di anticorpi specifici anti: P.damselae daleucociti di branchie e rene cefalico0,30,25"In vitro" Ig, P. damselaeAbs. 492 nm0,20,150,10,050Gills pre Gills post HK pre HK post64 days after boosting

IMMUNITA’ CELLULARE

TcRAgMHCT-cellactivitiesCD4-8T-cellAPCActivation of T-cell populations triggersomatic ricombination of TcR, T-cells proliferationand cytokine production

Profilo linfocitarioDLT15= T-cellsLinfociti T (%) Linfociti B (%)DLIg3= B-cellsnormossiaiperossianormossia iperossia---------------------------------------------------------------------------timo 264 726aaa 78*** 54.5**rene 98 84 86 367****** ,aaamilza 138 92 212* 308***,aintestino 119 552 aaa 109 22*** ,abranchie 2514 7013 aaa 76** 61***sangue 85 32 1010 109--------------------------------------------------------------------------Questa distribuzione è correlabile allo “uptake” dell’antigene?

Abundance of T-cellsin the intestineT-cellsB-cellsrelative cell numberT-lymphocytes in the gut12010080604020T-cellsEpithelial cells0anterior middle posteriorMay this be important for oral vaccination?

Relative density of T-immunoreactive cells in seabass lymphoid organs (quantitative immunocytochemistry)number of cells/10000 micron210009008007006005004003002001000thymus28 35 41 49 56 70 86days post-hatchingnum ber of cells/10000 m icron2876543210kidney28 35 41 49 56 70 86days post-hatchingnumber of cells/10000 micron23530252015105028 35 41 49 56 70 86intestinedays post-hatchingnumber of cells/10000 micron26543210spleen28 35 41 49 56 70days post-hatching

Relative density of B-immunoreactive cells in seabass lymphoid organs during developmentnumber of cells/10000 micron210,90,80,70,60,50,40,30,20,10thymusnumber of cells/10000 micron21,210,80,60,40,20number of cells/10000 micron21,51CON QUESTI DATI POSSIAMO AFFERMARE0,50CHE DICENTRARCHUS LABRAX E’28 35 41 49 56 70 8628 35 41 49 56 70 86days post-hatchingdays post-hatchingIMMUNOLOGICAMENTE COMPETENTEintestine28 35 41 49 56 70 86days post-hatchingnumber of cells/10000 micron24,543,532,52,521,510,502kidneyA 3 MESI DI ETA’spleen28 35 41 49 56 70 86days post-hatching

Interleukin-10:an important regulator of immune responsT-cellMHC IMHC IICytotoxicity Helper activityCD8 CD4Th1Th2IFNγIL-10activation deactivation

B-cellsand T-cellscan be immunopurified with mAbPurified B-cellshave anenhanced proliferativecapability6Proliferation index (arbitrary units)543210leucocytesDLIg3-purifiedHK leucocytes from Vibrio-immunised fishincubated “in vitro” with antigen.ATP- luminescence assay

A typical T-cellactivityThe one-waymixed leucocyte reaction (MLR)BloodStimulator PBL(inactivated byirradiation ormitomycin)EffectorPBL 1PBLEffector PBL …n°25Effector / Stimulator ratio = 5:1Effector PBL 2

“in vitro” MLRMetodo di indagine: Alloreazione di PBL controPBL irradiati (MLR). Conta linfocitaria tramite FACSa3025B cells= Empty barsT cells = solid barsb3025B cells= Empty barsT cells = solid bars2020Percent of positive cells151050*0 2 4WeeksPercent of positive cells1510500 2 4WeeksControl PBLMLR

Flow cytometric analysis of MLRDMEMPBLMLR

2 weeks MLR: effects of cyclosporin-A (5 µg/ml)cyclosporin A is known in mammals to inhibit T-cell activities through the depression of T-cells growth factors production, by preventing activation of transcription factors involvedin cytokine expression.14121086420Control MLR MLR + Cs A

Cytotoxicity assay of MLRculturesPBL andMLRE4 daysE+TTSAF-1 fibroblasts(fromsea bream)ATP-basedluminometricassayRationale: : target (damaged(damaged) cells should have lessintracellular ATPAdvantage: effector cells may be removed easily% cell viability = (E+T) – E / T x 100

Xenogeneic reaction (PBL on mitomycin-treatedtreated SAF-1cells)Assay: IIF and flow cytometry with mAb DLIg3 andDLT15Xenoreaction B-cells: 4 daysXenoreaction T-cells, 4 daysPercent positive cells in PBL302520151050ANOVA test, p=0.016controlxenoPercent positive cells in PBL109876543210ANOVA test, p=0.013controlxeno

Cytotoxicity in xenoreaction at 4 days200E = PBLT = SAF-1 cellspercent target survival15010050Assay: luminometric determinationof intracellular ATP020;1 10;1 5;1 1;1E:T ratio

FishimmunopharmacologyOncorhynchus mykiss IL-1N-endC-endb-bulgebulge loopDicentrarchus labrax IL-1N-endC-endb-bulgebulge loop

N-endDominio IC-endTrout IL-1 receptor (Il-1R I )Dominio IIITrout IL-1 bound to Il-1R IDominio IIA synthetic peptide derivedfrom the bulge loop has goodimmunoadjuvant activityIL-1OO EXPENSIVE, AT PRESENT,FOR APPLICATIONIN FISH FARMINGIL-1R

WP2.2-2.3NewvaccinestrategiesWP2.4Immuno-StimulantsWP3.2AntibodyResponseassaysSIXTH FRAMEWORK PROGRAMMEPRIORITY 5FOOD QUALITY AND SAFETYImproved immunity of aquacultured animalsWP10.1Differential displaySubtractive hybridisationMicroarrayWPs1-2Disease modelsVaccinationImmunostimulationChallengeStressWP3.1+3.3Immune response analysesHistological studies(IMAQUANIM)Homology cloningNew genes relatedto immune defensemechanismsGenomics of immunity- Qualitative and quantitativeassays for gene expression- Functional analysisWP4.1-12.1Previouslycharacteriseddefense geneelementsWP3.2+ WP13.1Platform for better disease protection- Gene array assays for quantitative and qualitative determination ofimmuno competance and vaccine efficacy.- Assays for determination of pathogen-related immunological statusAntibodies toKey molecules

Contributo alla divulgazione in acquacoltura:LA RICERCA SCIENTIFICA INNOVATIVA IN ACQUACOLTURA:LA GENOMICA PER IL MANTENIMENTO DELLA SALUTE DELLE SPECIE ALLEVAElisa Randelli, Daniela Casani, Francesco Buonocore, Giuseppe ScapigliatiBollettino API, in stampa, 2006

RINGRAZIAMENTILab di Biotecnologie AnimalUniv. . Della Tuscia, , VTScottish Fish ImmunologyResearch Centre, , AberdeenUniversity, UKICRAM, RomaM.I.P.A, , 4C, 5CEU 5FP FISHAIDEU 6 FP IMAQUANIMNuova Azzurro, Civitavecchia