Descrizione delle esercitazioni - Itisfocaccia.it

CALENDARIO ATTIVITA’ DI LABORATORIOGRUPPO 1Le seguenti scuole:Focaccia (15 studenti), Fermi (15 studenti), Alfano I (5studenti), Genoino (5 studenti), Mangino (5 studenti) nelleore 9.00-13.00,- mercoledì 1 febbraio seguiranno l’esercitazione n. 1 di sintesi del rossopara;Responsabile esercitazione: Carmine GaetaResponsabile laboratorio: Patrizia OlivaTutors laboratorio: Carmen Talotta, Roberta Ciao, Marco MauroTutors: I. Izzo, G. Monaco, C. Tedesco- giovedì 2 febbraio seguiranno l’esercitazione n. 2 relativa alla sintesi inemulsione acquosa dello stirene;Responsabile esercitazione: Lucia CaporasoResponsabile laboratorio: Ivano ImmediataTutors laboratorio: Simona Longo, Antonio De NicolaTutors: C. Capacchione, M. Lamberti, M. Mazzeo- mercoledì 8 febbraio seguiranno l’esercitazione n. 3 relativa allasintesi dello stilbene;Responsabile esercitazione: Antonio MassaResponsabile laboratorio: Mariagrazia NapoliTutors laboratorio: Graziella Ianniello, Maurizio CelentanoTutors: L. Palombi, M. De Rosa, G. Della Sala- giovedì 9 febbraio gli studenti si divideranno in tre gruppi eseguiranno l’esercitazione denominata “dalle cellule agli ecosistemi”.Responsabili esercitazioni: Ivana Caputo, Daniela Baldantoni, Gianni VigliottaResponsabile laboratorio: Patrizia IanneceTutors laboratorio: Maria Rosaria Acocella, Brunello NardoneResponsabile laboratorio: Francesco De MartinoTutors laboratorio: Alessandra Perfetto, Laura FaliveneTutors: Giovanni Saviello (Baldantoni), Raffaella Morelli (Baldantoni), Simona Matrella(Vigliotta), Flaminia Gay (Caputo), Marilena Lepretti (Caputo), Gaetana Paolella(Caputo)

Direzioni per raggiungerel’AULA P 1. Stampare la mappa.NON NONPARCHEGGIOSTAZIONE BUSSecondo ingresso lato NORD(cancello aperto color rossomattone): ENTRARE…AULAP 1DIREZIONE DI PROVENIENZA...Ingresso principale lato NORD(quello con spartitraffico alcentro): DA EVITARE.Per problemi chiamare al cell. diDe Riccardis: 320 423 00 66Per coloro che vengono da Salerno IN AUTO: NON prendete l’uscita UNIVERSITA’ sul raccordo Salerno-Avellino ma proseguito dritto. Dopo 100 metrispostatevi a destra e prendete la direzione AVELLINO. Uscite subito a a FISCIANO e girate a destra.Evitate il primo ingresso (ossia il più grande, con lo spartitraffico al centro) e proseguite di 50 m. Ci sarà un secondo ingresso più piccolo (CARATTERIZZATODA UN CANCELLO ROSSO MATTONE APERTO). Entrate e, più avanti, parcheggiate. Una volta parcheggiato, tornate indietro verso il cancello: l’ingressodell’aula P 1 è al lato destro dell’entrata (come mostrato dalla freccia). Basta entrare nell’edificio segnalato dalla cartina e scendere di un piano.Per coloro che vengono da Avellino IN AUTO: prendere l’uscita Fisciano e girare a sinistra. Evitate il primo ingresso (ossia il più grande) e proseguite di 50 m.Ci sarà un secondo ingresso più piccolo (CARATTERIZZATO DA UN CANCELLO ROSSO MATTONE APERTO). Entrate e, più avanti, parcheggiate.L’ingresso dell’aula P 1 è al lato destro dell’entrata (come mostrato dalla freccia). Basta entrare nell’edificio segnalato dalla cartina e scendere di un piano.IN BUS: UNA VOLTA ARRIVATI ALLA STAZIONE AUTOBUS (in alto nella cartina), seguite la mappa per arrivare all’aula P 1.Appuntamento per ogni giorno delle attività: h. 9.00, aula P 1 della facoltà di Scienze MM. FF. e NN.

ESERCITAZIONI PLS CHIMICAGRUPPO 1Esercitazione 1: Sintesi del rosso para- Mercoledì 1 febbraio 2012 gli studenti delle scuole: Focaccia(15 studenti), Fermi (15 studenti), Alfano I (5 studenti),Genoino (5 studenti), Mangino (5 studenti) seguirannol’esercitazione;Responsabile esercitazione: GaetaResponsabile laboratorio: OlivaTutors laboratorio: Carmen Talotta, Roberta Ciao, Marco MauroTutors: I. Izzo, Monaco, TedescoPremessaSebbene la tintura tessile sia un processo che l’uomo effettua findall’antichità, solamente da una quarantina di anni sono stati introdotti icosiddetti coloranti reattivi, i quali sono in grado di reagire chimicamente con lafibra tessile formando un legame covalente. Tutti gli altri numerosissimicoloranti, naturali e sintetici, si fissano alla fibra per la concomitanza di duefattori:1) un fenomeno fisico di imprigionamento della molecola di colorante tra leanse della macromolecola fibrosa;2) un insieme di interazioni attrattive che si instaurano tra la molecola dicolorante e la fibra (pur senza tradursi in un legame covalente) e che siconfigurano come: attrazioni elettrostatiche, legami di idrogeno, forze divan der Waals.Poiché i coloranti reattivi sono relativamente costosi e funzionano solo per ilcotone, i coloranti tessili tradizionali sono tuttora ampiamente usati. In molti casi,per favorire la fissazione del colorante sulla fibra e per rendere la tintura piùresistente, è necessario ricorrere a qualche accorgimento nel modo di operare.Uno di questi è quello di effettuare la sintesi del colorante impregnando il tessutoda colorare con uno dei reagenti.3

La procedura che sarà effettuata nella seguente attività di laboratoriosfrutterà proprio questa metodica.IntroduzioneI coloranti azoici, che costituiscono la più numerosa classe di colorantisintetici, sono caratterizzati dal fatto che la loro molecola contiene come gruppocromoforo il gruppo funzionale N=N inserito tra due anelli benzenici. Molti diessi sono idrosolubili, ma molti altri non lo sono (ed esempio il tradizionalecolorante rosso para, quello che sarà sintetizzato in questa esperienza). In talcaso, per conseguire una tintura tessile resistente, occorre operare con lacosiddetta procedura “a sviluppo”. Essa consiste nel fatto di sintetizzare ilcolorante direttamente nel bagno di tintura a partire da un precursore idrosolubilecon la cui soluzione acquosa è già stata impregnata la fibra da tingere.Lo Schema 1 e la Figura 1 visualizzano la struttura del rosso para, la reazioneper la sua sintesi ed un modello molto semplificato della fissazione sulla fibra.Schema 1. Meccanismo di sintesi del colorante rosso para a partire dalla 4-nitroanailina (1), ilnitrito di sodio (2), il sale di diazonio (3) e il 2-naftolo (4).4

Figura 1. Esempio di procedura “a sviluppo”.Procedura:Si prepara anzitutto quanto segue:a) in un becker da 250 mL: 1.4 g di 4-nitroanilina (1) in 30 ml di unasoluzione 0.35 M di acido solforico;b) in un becker da 50 mL: 0.7 g di sodio nitrito in 10 mL di acqua;c) in un becker da 250 mL: 0.5 g di 2-naftolo in 100 mL di acqua;d) in un cristallizatore da 1 litro: una miscela refrigerante di ghiacciotritato;inoltre occorre:e) una soluzione di NaOH al 30% (da cui prelevare 0.5 mL),f) una matassina di cotoneg) carta da filtro5

h) 100 ml di acqua ghiacciataLa miscela (a) viene riscaldata fino ad incipiente ebollizione (per permetterela dissoluzione della 4-nitroanilina, composto 1, Schema 1), quindi raffreddata atemperatura ambiente. A questo punto, il becker che la contiene viene immersonel bagno refrigerante e la miscela viene raffreddata a 0 °C tenendola inagitazione con una bacchetta di vetro. Si mette qualche pezzettino di ghiacciodentro la miscela e, continuando ad agitarla vigorosamente, vi si aggiunge gocciaa goccia (utilizzando una pipetta di Pasteur) la soluzione di sodio nitrito (b) in untempo di circa 5 minuti (sodio nitrito, composto 2, Schema 1). In questo modo siformarà il sale di diazonio 3, Schema 1.Terminata l’aggiunta, si continua ad agitare per 2 minuti, quindi si lascia ilbecker con la miscela di reazione nel bagno refrigerante.La miscela (c) viene trattata con 0.5 mL di NaOH al 30% e riscaldata adincipiente ebollizione (per permettere la dissoluzione del sale sodico del 2-naftolo, composto 4, Schema 1). A questo punto, vi si immerge la matassina dicotone da tingere (del peso di 3-4 grammi) e la si lascia a macero per 3 minuti. Sitoglie la matassina con una pinza e la si asciuga bene tra due fogli di carta dafiltro.Alla soluzione fredda risultante dal mescolamento di (a) + (b) si aggiungono100 mL di acqua ghiacciata, quindi vi si immerge la matassina di cotoneimpregnata di 2-naftolo. In questo modo avviene la reazione tra il sale di diazonio(composto 3) e il 2-naftolo (composto 4), come rappresentato in Figura 1, e vieneformato, tra le fibre della matassina, il colorante rosso para.Il becker viene tolto dal bagno refrigerante e lasciato a temperatura ambiente,agitando saltuariamente con la bacchetta di vetro. Dopo 5 minuti, la matassinaviene estratta e lavata abbondantemente sotto l’acqua del rubinetto. Il cotone tintoviene poi lasciato asciugare.6

Esercitazione 2: Sintesi in emulsione acquosa dello stirene- Giovedì 2 febbraio gli studenti delle scuole: Focaccia (15studenti), Fermi (15 studenti), Alfano I (5 studenti), Genoino(5 studenti), Mangino (5 studenti) seguiranno l’esercitazionen. 2;Responsabile esercitazione: CaporasoResponsabile laboratorio: ImmediataTutors laboratorio: Simona Longo, Antonio De NicolaTutors: Capacchione, Lamberti, MazzeoObiettivo dell’esercitazione:Sintetizzare il polistirene atattico in emulsione acquosa allo scopo dimostrare un esempio di procedura di polimerizzazione industriale in cui sonoapplicati i principi della Green Chemistry.Introduzione all’esperienza:Cosa si intende per Green ChemistryLa Chimica Verde (in inglese Green Chemistry) è un approccio etico fatto dicriteri, di priorità e di obiettivi, quindi una filosofia, che attinge dalla conoscenzascientifica della chimica per guidare le applicazioni di questa disciplina, adiniziare da quelle industriali, verso modalità sostenibili dal punto di vistaambientale ed economico. E’ quindi un nuovo modo di pensare la chimicaimpostata su una prevenzione dell'inquinamento che comporta la messa a puntodi sintesi che utilizzino e producano sostanze che siano di minor rischio per lasalute umana e a basso impatto ambientale.Il polistirene atattico (aPS):7

Si ottiene per polimerizzazione dello stirene monomero.Si tratta di una polimerizzazione radicalica perché la reazione è iniziata damolecole (dette iniziatori) capaci di produrre radicali, come ad esempio iperossidi:Formazione del radicale:calore o luceX O O X 2XO.Lo stirene monomero reagisce con il radicale formando un nuovo radicale:Reazione di iniziazione+ . XO.OXIl polimero si forma per reazioni successive delle molecole di stirene con lacatena radicalica:Reazione di propagazione. +CH 2.CH 2CH 2. n CH 2n+1OX OX OXOXCH 2.La reazione può terminare quando tutto il monomero ha reagito oppure quandol’estremità attiva della catena si “spegne”, come ad esempio:Reazione di terminazione (un esempio):8

CH 2CH 2.CH 2CH 2.+ CH 2CH 2nmOX OX OXn+mOXE’ evidente che per ottenere il polistirene occorre :1) lo stirene (monomero),2) l’iniziatore radicalicoTecniche di polimerizzazioneLa polimerizzazione in massa:Il sistema di reazione è formato solo dal monomero e dall’iniziatore. L’iniziatoreè solubile nel monomero. Questa tecnica richiede il numero minimo di reagentinecessari per l’ottenimento del polimero, infatti non si usano solventi o mezzidisperdenti. Questo è sicuramente un vantaggio. Tuttavia questa tecnica presentadiverse “controindicazioni”. Tra queste: durante la crescita di catena il monomeroviene inglobato fisicamente nel polimero e non può più reagire (bassa resa);quindi, prima della lavorazione, il polimero ottenuto deve essere ulteriormenteprocessato per allontanare il monomero che non ha reagito (purificazione). Tuttoquesto risulta svantaggioso da un punto di vista economico; dannoso da un puntodi vista dell’impatto ambientale.La polimerizzazione in emulsione:Polimerizzazione in massa9

Si definisce emulsione una sospensione colloidale stabile formata da un liquidoimmiscibile, disperso e trattenuto in un altro liquido grazie ad emulsionanti otensioattivi (un sapone).Solubile in acquaTesta polareCoda non polareO - Na +SO OSolubile nel monomeroIl sistema di reazione è formato dal monomero (stirene), da un mezzo disperdentepolare (acqua), da un iniziatore che è solubile in acqua e insolubile nel monomero(come il potassio persolfato) e dal tensioattivo (come il dodecilbenzensolfonatodi sodio ).OOSO - K + + K - OOOSOOPotassio persolfatoIn questa tecnica il sapone, o tensioattivo, viene aggiunto all’acqua, fino araggiungere il valore della concentrazione micellare critica (CMC), cioè quelvalore della concentrazione al di sopra della quale le molecole di sapone siaggregano formando micelle della dimensione di circa 10-100Å. In questiaggregati, che possono avere forme diverse (sferica, cilindrica, lamellare ediscoidale…), le molecole di sapone espongono la testa polare verso l’acqua e lacoda apolare verso il centro della micella.10

Successivamente, si aggiunge il monomero, insolubile nel solvente di reazione,che andrà a sistemarsi all’interno delle micelle. In tal modo “gocce” dimonomero di dimensioni nanometriche si troveranno stabilmente disperse inacqua.L’iniziatore radicalico può così essere aggiunto al sistema di reazione.L'iniziatore, come i perossidi ed i persolfati, è insolubile nel monomero e quindiha una bassissima probabilità di entrare nella micella. Questa probabilità è bassama non nulla. La reazione di iniziazione, e quindi la reazione dipolimerizzazione, parte nel momento in cui una molecola di iniziatore migraall'interno di una micella e reagisce con una molecola di monomero. In media siha un radicale polimerico per micella (una catena in crescita per ogni micella) eproprio per questo motivo la reazione di terminazione per accoppiamento tracatene radicaliche è sfavorita. In altre parole, il monomero nel nano-reattore nonha “concorrenti”, la reazione terminerà in ogni micella quando tutto il monomerocontenuto avrà reagito (resa prossima al 100%!). Data la dimensione dellemicelle e la presenza, in media, di un’unica catena polimerica per micella, ilpolimero ottenuto risulta molto omogeneo e può essere processato (stampato,colorato…) senza ulteriori purificazioni o trattamenti.Polimerizzazione in emulsionePerché la polimerizzazione dello stirene in emulsione rientra nei “principi” dellaGreen Chemistry? Perché è una polimerizzazione in acqua, il reagente piùinquinante, lo stirene, viene completamente trasformato in polimero e non èquindi presente nei prodotti di scarto, perché il polimero, così come ottenuto, nondeve essere ulteriormente processato ma può essere trasformato direttamente nelprodotto finale (piatti, contenitori, oggetti vari…).Materiale:- pallone da 100 ml ad un collo- Ancoretta magnetica- Refrigerante a bolle- Piastra riscaldante con annessa pinza di supporto- Bagno ad acqua- Termometro digitale11

- 3 Beute da 100 ml- 2 Bacchette di vetro- Cilindro graduato da 10 ml- Imbuto separatore da 100 ml- Pipetta graduata con stantuffo da 10 ml- 2 Pipette graduate con stantuffo da 5 ml- 2 Navicelle per pesare i reagenti- BilanciaProcedura:Indossare i dispositivi di protezione (camice occhiali, guanti).1) Lavare lo stirene.Lo stirene viene conservato nei flaconi in cui è venduto aggiungendo almonomero degli inibitori radicalici, come il 4-ter-butilcatecolo. Queste molecolehanno la funzione di catturare radicali che possono generarsi spontaneamente dalmonomero per effetto del calore. Essi sono solubili in acqua e devono essereallontanati prima di effettuare l’esperienza.Preparare 10 ml di una soluzione acquosa di NaOH al 5% in peso saturata conNaCl. (Pesare 0.5 g di NaOH e scioglierli in 10 ml di H 2 O, aggiungere NaCl finoa quando, pure effettuando una vigorosa agitazione, non sarà più possibilescioglierlo nella soluzione). Aggiungere nell’imbuto separatore 2 ml di questasoluzione e 10 ml di stirene monomero. Agitare vigorosamente chiudendol’imbuto separatore con l’apposito tappo. Sollevare il tappo e lasciare separare ledue fasi. Poiché la densità dello stirene (0.897 g/cm 3 ) è minore di quelladell’acqua (1 g/cm 3 ) il monomero si troverà nella fase superiore. Dalla partebassa del separatore, allontanare tutta la fase acquosa e conservare nell’imbuto ilmonomero lavato.2) Preparare una soluzione acquosa allo 0.7% in peso di potassio persolfato(iniziatore)Pesare 0.14 g di iniziatore e scioglierli in una beuta contenente 20 ml di acqua.3) Preparare una soluzione acquosa di dodecilbenzensolfonato di sodio al3.6% in peso (tensioattivo)Pesare 0.75 g di tensioattivo e scioglierli in 20 ml di acqua.4) In un pallone da 100 ml ad 1 collo provvisto di ancoretta magneticaintrodurre, nell’ordine:- 8 ml di acqua distillata- 6 ml di una soluzione acquosa di dodecilbenzenesolfonato al 3.6% in peso(soluzione di tensioattivo)- 4 ml di monomero lavato12

Agitare il sistema per una decina di minuti in modo da assicurarsi che tutto ilmonomero sia riuscito ad entrare nelle micelle.- Aggiungere nel pallone 2 cm 3 di una soluzione acquosa di potassio persolfato allo 0.7% in peso (soluzione di iniziatore radicalico) e agitare ilsistema.Collegare il refrigerante a bolle sul collo del pallone e immergere il pallone in unbagno ad acqua termostatato a 80°C (temperatura di attivazione dell’iniziatoreradicalico) per circa 30 minuti; dopodiché il pallone ben chiuso dovrebbe essereconservato per 3 giorni in freezer (le basse temperature servono per spaccare lemicelle). In seguito dovrebbe effettuarsi una filtrazione, seccare il polimero instufa da vuoto e pesare.Poiché l’esercitazione si conclude in una giornata, verrà mostrato il polimerocome si presenta alla fine della sintesi.13

Esercitazione 3: Sintesi dello stilbene mediantereazione di Wittig- mercoledì 8 febbraio gli studenti delle scuole: Focaccia (15studenti), Fermi (15 studenti), Alfano I (5 studenti), Genoino(5 studenti), Mangino (5 studenti) seguiranno l’esercitazionen. 3;Responsabile esercitazione: MassaResponsabile laboratorio: NapoliTutors laboratorio: Graziella Ianniello, Maurizio CelentanoTutors: Palombi, De Rosa, Della SalaProcedura:O+ Cl -PPh 3+HNaOH, CH 2 Cl 2 /H 2 Oriflussocis-stilbene+trans-stilbeneCloruro di benziltrifenilfosfonio(solido)0.778 g (peso molecolare: 388.9; 2 mmol)Benzaldeide (liquido) (peso molecolare: 106.1, densità: 1.04, 1.0equivalente)Sodio idrossido (solido caustico)(peso molecolare: 40.0, 60 equivalenti)CH 2 Cl 2Suggerimenti: calcolare le quantità dei reagenti.Procedura:8 mL14

In un pallone da 100 mL, provvisto di ancoretta magnetica, sospendere il clorurodi benziltrifenilfosfonio (0.778 g, 2 mmol) in 8 mL di diclorometano edaggiungere la benzaldeide. Lasciare la sospensione sotto agitazione. A parte, inuna beuta da 250 mL, disciogliere NaOH in 30 mL di acqua (soluzioneestremamente pericolosa in quanto corrosiva: MASSIMA ATTENZIONE!!).Lasciare raffreddare la soluzione a temperatura ambiente ed aggiungerla, in duetempi, alla sospensione nel pallone da 100 mL.Tappare il pallone di reazione e lasciare la miscela sotto energicaagitazione per 30 minuti (si osserverà la formazione dell’ilide gialla ed, inseguito, la sua scomparsa). L’andamento è monitorato mediante unacromatografia su strato sottile (TLC, eluente: etere di petrolio/Et 2 O=9/1;rivelante: UV).Reaz. = Contenuto del pallonedi reazioneMix = miscela tra Reaz. e Rif.X X XReaz. Mix Rif.Almeno1 cmRif. = Prodotto di partenza(pochi mg sciolti in qualche goccia di MeOH)Una volta che la reazione è andata a completezza, estrarre l’ancorettamagnetica con la barra magnetica, versare il tutto in un imbuto separatore(controllare che la valvola inferiore risulti chiusa), lavare il pallone con Et 2 O (2 x40 mL) ed acqua (40 mL) e agitare avendo cura di tappare l’imbuto separatore.Delle due fasi formate, eliminare quella basica acquosa e poi dibattere quellaorganica con H 2 O (30 mL) per due volte. Anidrificare con solfato di sodio la faseeterea e portarla a secco.PURIFICAZIONE: Il grezzo di reazione contiene sia lo stilbene che iltrifenilfosfinossido. Per estrarre selettivamente lo stilbene aggiungere nel pallone40 mL di una miscela etere di petrolio : etere etilico (8 : 2), tappare il pallone elasciare in agitazione per cinque minuti. Il solvente, contenente lo stilbene, dovràessere portato a secco in un pallone tarato da 100 mL e pesato.In alternativa la fase di purificazione dello stilbene potrà essere effettuatapresso la scuola di appartenenza (trattandosi di istituti chimici).Scheda reagenti e materiali per l’esperienza15

Reagenti:Cloruro di benziltrifenilfosfonio 0.778 g (peso molecolare: 388.9; 2 mmol)Benzaldeide (peso molecolare: 106.1, densità: 1.04, 1.0equivalenti)Sodio idrossido(peso molecolare: 40.0, 60 equivalenti)Na 2 SO 4Solventi MaterialeCH 2 Cl 2Acqua distillataEtere di petrolioEtere etilico2 Palloni da 100 mLPallone da 250 mLImbuto estrattore2 Beute da 250 mLPipette PasteurCromatografia su stratosottile (TLC)Carta da filtroNavicelle per pesata16

Esercitazione 4: Dalle cellule agli ecosistemiDATE: martedì 9 febbraio, h. 9.00-13.00 per gli studenti dellescuole:Focaccia (15 studenti), Fermi (15 studenti), Alfano I (5 studenti),Genoino (5 studenti), Mangino (5 studenti);Responsabili esercitazione: I. Caputo, D. Baldantoni, G. VigliottaResponsabile laboratorio: Patrizia IanneceTutors laboratorio (Iannece): Maria Rosaria Acocella, BrunelloNardoneResponsabile laboratorio: Francesco De MartinoTutors laboratorio (De Martino): Alessandra Perfetto, Laura FaliveneTutors: Giovanni Saviello (Baldantoni), Raffaella Morelli (Baldantoni),Simona Matrella (Vigliotta), Flaminia Gay (Caputo), Marilena Lepretti(Caputo), Gaetana Paolella (Caputo)NOTA. Gli studenti e gli insegnanti verranno divisi in tre gruppi da 20-25unità. Un gruppo seguirà l’esercitazione A (un semplice metodo per purificare ilDNA da cellule batteriche, I. Caputo), un altro gruppo seguirà l’esercitazione B(relazioni trofiche delle comunità dei sistemi fluviali: dai produttori aidecompositori), un terzo gruppo seguirà l’esercitazione C (viaggio nel mondo deimicrorganismi: impariamo a studiarli).17

ESERCITAZIONE A:UN SEMPLICE METODO PER LA PURIFICAZIONE DI DNA DACELLULE BATTERICHEResponsabile: dott. Ivana CaputoPremessaI batteri vengono spesso impiegati nei laboratori di ricerca biologici poiché, per loro natura,possono contenere, in più copie, i PLASMIDI, ossia piccole molecole di DNA circolare diqualche migliaio di coppie di basi (bp) facilmente purificabili a partire da colture battericheliquide. In natura, i plasmidi contengono geni che conferiscono, alle cellule che li contengono,la proprietà di resistere a specifici antibiotici e quindi rappresentano un vantaggio per la cellulache li contiene. Ma perché i plasmidi sono così utili nella pratica di laboratorio? Uno dei motiviè che i plasmidi possono essere modificati introducendo, in essi, dei geni di nostro interesse,mediante tecniche che, nel loro complesso, sono note come tecniche di ingegneria genetica. Ilrisultato è quello di avere una cellula batterica contenente un plasmide da noi modificato,cellula che, duplicandosi esponenzialmente, dà luogo a milioni di cellule uguali, e quindi amilioni di copie del plasmide con il gene “estraneo”. Purificando il plasmide dalla colturabatterica possiamo ottenere dunque milioni di copie del gene di nostro interesse, che potremousare per un’infinità di analisi e scopi diversi. In certe condizioni, tale gene estraneo puòprodurre una proteina di interesse come un ormone o un vaccino, che potremo successivamenteisolare dalla coltura batterica. Insomma, il batterio lavora per noi, producendo a nostropiacimento geni e proteine che intendiamo studiare o utilizzare per scopi medici o industriali,ecc.!!Obiettivo dell’esercitazioneL’obiettivo dell’ esercitazione proposta è quello di ripercorrere i passaggi di un protocollosperimentale, utilizzato di routine nei laboratori di biologia molecolare, per ottenere DNAplasmidico da una coltura di cellule batteriche. Per valutare il risultato della purificazione vieneproposta una tecnica, l’elettroforesi in gel di agarosio, che consente di “vedere” ossia divisualizzare il DNA ottenuto. L’obiettivo è anche quello di mostrare agli studenti il correttomodo di lavorare con le macromolecole (nello specifico con il DNA), imparando a rispettare lecondizioni di sterilità e a manipolare microvolumi.18

Descrizione dell’esperienzaIl giorno precedente all’esercitazione verranno eseguiti gli inoculi dei batteri nell’opportunomezzo di coltura; fare un inoculo significa prelevare un certo numero di cellule batteriche dauna coltura congelata o cresciuta in mezzo semisolido e porle in un mezzo nutritivo liquidoadeguato. Nello specifico si utilizzeranno cellule di Escherichia coli, impiegate di routinecome “contenitori” di plasmidi. Dopo una notte a 37°C in agitazione, le cellule verrannoraccolte mediante centrifugazione e si inizierà la procedura di purificazione del DNAplasmidico. La tecnica impiegata prevede la lisi delle cellule in ambiente alcalino, la rimozionedei detriti cellulari mediante centrifugazione, il lavaggio del DNA con alcool e la risospensionedel DNA ottenuto in acqua sterile. Gli acidi nucleici (DNA e RNA) sono carichinegativamente, quindi, se sono posti in un campo elettrico migrano verso il polo positivo.Quindi, un’aliquota di campione di DNA ottenuto potrà essere analizzata mediante una tecnicadenominata elettroforesi che consente di far muovere il DNA in una matrice polimerica (il“GEL di AGAROSIO”) e di visualizzarlo successivametne sotto forma di bande discrete.Norme relative alla la sicurezzaE’ necessario l’utilizzo di camice e guanti monouso. Alcuni dei reagenti utilizzati possonocausare irritazione se vengono a contatto con la pelle e le mucose. Quando indicato dallespecifiche tecniche, le polveri devono essere pesate sotto cappa o utilizzando una mascherina.Lo stesso vale per i reagenti liquidi. In presenza di raggi UV, occorre utilizzare opportunischermi di protezione. E’ infine necessario smaltire adeguatamente i rifiuti.Materiale occorrente-Microtubi (vol 1.5 ml), tubi da 50 ml sterili-Puntali per micropipette automatiche sterili-stand portatubi-beuta da 250 ml-cilindro da 100 ml-cilindro da 1 l-capsule Petri per batteriologiaReagenti occorrenti:-acqua distillata sterile-etanolo 100%; etanolo 70%; acido acetico glaciale-glucosio, Tris, EDTA, NaOH, sodio dodecil solfato, potassio acetato, NaCl, agarosio-bacto-triptone, estratto di lievito, agar, loading buffer 6XStrumentazione necessaria-incubatore per batteri-microcentrifuga refrigerata-micropipette automatiche (p200, p1000)-camera elettroforetica orizzontale con alimentatore-bilancia tecnica-transilluminatore UV-vortex-fornetto a microonde19

-autoclaveNB: Per questa esercitazione occorre la disponibilità di cellule batteriche contenenti plasmidi.CameraelettroforeticamicrocentrifugaMicropipette automaticheTransilluminatore UVmicrotuboPuntali perIncubatore perbatteriProtocollo sperimentaleNota: il protocollo è diviso in 3 parti; le parti 1 e 3 verranno solo mostrat, mentre la parte 2verrà eseguita dagli studenti ospiti; preliminarmente, verrà spiegato il corretto utilizzo dellemicropipette.Parte 1- Crescita dei batteri in coltura liquida (effettuata dalresponsabile dell’esercitazione)1. Inoculo in mezzo liquido20

Utilizzando un puntale sterile, prelevare una singola colonia dal disco petri e immergere ilpuntale in 5 ml di mezzo di coltura liquido Luria Bertani (LB) presenti in un tubo sterile da 50ml; agitare leggermente il puntale nella soluzione e gettare via il puntale.2. Incubazione della coltura a 37°C per 18 oreApporre al tubo il coperchio e posizionare il tubo nell’incubatore per batteri; settare latemperatura a 37°C, l’ agitazione a 200 rotazioni per minuto per un tempo di 18 ore.Soluzioni occorrenti-Terreno di coltura LB liquido (1 litro) pH 7.2bacto triptone 10gestratto di lievito 5gNaCl10gper terreno semisolido aggiungere 15g/l di Agar, autoclavare 20minNOTE:Il mezzo o “brodo” di coltura contiene sali ed estratti proteici necessari per la sopravvivenza ela crescita delle cellule batteriche. I batteri crescono a 37°C con agitazione continua affinchéci sia sufficiente aerazione della soluzione e i batteri non sedimentino sul fondo del tubo. Iltubo è sufficientemente grande da contenere tutta l’aria di cui i batteri hanno bisogno per ungiorno. La coltura semisolida si ottiene aggiungendo l’agar, una sostanza di naturapolisaccaridica che si scioglie ad alta temperatura e gelifica raffreddandosi.Parte 2 – Purificazione del DNA plasmidico (effettuata dallostudente)1. Prelevare 1.0 ml di coltura batterica cresciuta per 18 ore a 37°CUtilizzare una PIPETTA P1000, mettere la coltura batterica in un MICROTUBO, chiudere ilcoperchio.2. Centrifugare per 2 min. a 12000 r.p.m. (rotazioni per minuto)L’operazione può essere effettuata a 4°C o a temperatura ambiente indipendentemente. Iltempo e la velocità della centrifugazione devono essere tali da consentire la formazione di unpellet (sedimento o precipitato) compatto.3. Rimuovere la coltura batterica dal MICROTUBOPer eliminare il mezzo di coltura batterica sovrastante il pellet (ossia il “ supernatante”) èsufficiente versare il contenuto del MICROTUBO, capovolgendolo, e picchiettare leggermenteil MICROTUBO, con tappo aperto, su carta, cercando di allontanare le eventuali goccioline diterreno residuo: tale operazione consente di non modificare le concentrazioni delle tresoluzioni in seguito utilizzate.3. Risospendere il pellet batterico in 100 µl di Soluzione I.Per la risospensione si può utilizzare il vortex, in quanto le cellule sono ancora integre ed ilDNA è protetto.4. Aggiungere 200 µl di Soluzione II.Mescolare capovolgendo il tubo 4 o 5 volte. In questa fase la soluzione alcalina provoca la lisidelle cellule e la denaturazione e precipitazione delle molecole di DNA genomico e plasmidico(NB: per “denaturazione del DNA” si intende l’apertura della doppia elica con rottura deiponti ad idrogeno che tengono unite le due catene del DNA). Quindi, le molecole di DNA21

diventano estremamente fragili, per questo si deve mescolare adeguatamente ma evitandoazioni troppo energiche per non rompere meccanicamente il DNA stesso. Si ottiene un lisatocellulare viscoso e biancastro.5. Aggiungere 150 µl di soluzione III e mescolare capovolgendo delicatamente il tubo 4 o 5volte.Con l’aggiunta della soluzione III (entro pochi minuti dall’aggiunta della soluzione II) siriporta il lisato cellulare al pH che consente la “rinaturazione” (ossia la riassociazione delledue eliche ) del DNA plasmidico. Il DNA genomico e le proteine rimangono inveceintrappolate irreversibilmente nel complesso formato da potassio e SDS.6. Centrifugare a 12000 r.p.m. per 5 min.Questa centrifugazione permette la sedimentazione dei residui cellulari.7. Recuperare il supernatante in un nuovo MICROTUBO.Al termine della centrifugazione nel tubo è presente un volume di circa 450 µl. Per noncorrere il rischio di far risospendere il pellet mentre si recupera il supernatante, si consiglia diprelevare un volume di 350 µl.8. Precipitare il DNA con due vol. di etanolo (100% v/v).L'etanolo è aggiunto al 100% per ottenere una soluzione finale al 70%. Per esempio: a 100 µldi DNA si aggiungono 200 µl di etanolo assoluto. In questa fase è necessario capovolgere iltubo delicatamente: il DNA deve venire a contatto con l’alcool per precipitare.9. Centrifugare a 12000 r.p.m per 5 min.Al termine della centrifugazione, se il DNA è “sporco”, ossia contaminato da detriti cellulari eproteine, è possibile vedere il pellet bianco sul fondo del tubo. Il DNA è comunque presente maad un basso grado di purezza.10. Rimuovere il supernatante.Per rimuovere il supernatante è sufficiente capovolgere il MICROTUBO. Con l’etanoloandranno via la maggior parte dei sali derivanti dai passaggi precedenti.11. Lavare con etanolo 70% v/v e ricentrifugare, quindi rimuovere il supernatante.Versare nel MICROTUBO 500µl di Etanolo 70%. Agitare. Centrifugare come sopra alla finedella centrifugazione allontanare l’etanolo capovolgendo la provetta aperta e scuotendolaleggermente su un pezzo di carta. Il lavaggio con Etanolo 70% serve ad eliminare i saliresidui.12. Lasciare asciugare il pellet all’aria per 10 minuti.E’ importante che il pellet sia completamente asciutto perché la presenza di tracce di etanolodetermina una scarsa risospensione del DNA.13. Risospendere il DNA plasmidico in 50 µl di dH 2 O sterile.Il DNA risospeso in dH 2 O si conserva a –20°C (la bassa temperatura blocca le endonucleasi,ossia gli enzimi che degradano il DNA).Soluzioni utilizzate:- Soluzione I:• 50 mM glucosio• 25 mM Tris-HCl (pH 8.0)• 10 mM EDTA (pH 8.0)- Soluzione II• 0.2 N NaOH• 1% SDS- Soluzione III• 5M potassio acetato 60 ml• acido acetico glaciale 11.5 ml• acqua 28.5 mlNOTE:Si possono distinguere due fasi operative nel presente protocollo:22

1. Lisi alcalina: lisi delle cellule batteriche mediante l’uso di una soluzione alcalina cheprovoca la denaturazione e la precipitazione di tutte le componenti cellulari, ad eccezione delDNA plasmidico che rimane in soluzione.2. Precipitazione e risospensione del DNA: operazione che prevede la precipitazione ed illavaggio del DNA, seguito da risospensione in dH2O.Secondo la procedura della lisi alcalina, il DNA plasmidico è preparato da piccole quantità diuna coltura di batteri contenenti plasmidi. I batteri sono lisati da un trattamento con unasoluzione contenente sodio dodecil solfato SDS (che denatura le proteine batteriche) e NaOH(che denatura il DNA plasmidico e cromosomale). La miscela è neutralizzata con potassioacetato che permette la rinaturazione del DNA plasmidico a differenza di quello genomico.La maggior parte del DNA cromosomale e le proteine batteriche precipitano (così come l'SDS,che forma un complesso con il potassio), e sono rimosse mediante una centrifugazione. Il DNAplasmidico rinaturato, che rimane nel supernatante, viene concentrato per precipitazione inetanolo.La Soluzione I è necessaria per risospendere le cellule e porle nelle condizioni adatte allasuccessiva lisi. Il glucosio: rende la soluzione isoosmotica; la sua presenza impone lasterilizzazione in autoclave della soluzione per evitare lo sviluppo di muffe. Il tampone Tris-Cl(pH 8.0) : fornisce potere tamponante, viene equilibrato con HCl a valori prossimi ad 8.0 , cheè il pH ideale per mantenere in soluzione il DNA nella sua forma a doppio filamento. L’ EDTA(pH 8.0): è necessario per sequestrare (chelare) gli ioni bivalenti, in particolare impedisceagli ioni Mg2+ di agire da coenzimi per le endonucleasi, rendendole inattive. Questogarantisce l’estrazione e la conservazione di DNA integro in qualsiasi condizione di lavoro.L’EDTA, inoltre, chela gli ioni Ca2+ indebolendo la parete cellulare, evitando l’utilizzo dilisozima (un enzima che attacca la parete batterica).La Soluzione II provoca la lisi alcalina delle cellule. L’NaOH permette la lisi alcalina con laquale il DNA genomico e plasmidico denaturano e precipitano. L’SDS è un detergente cheha ilpotere di solubilizzare le membrane e denaturare le proteine. L’etanolo e l’etanolo 70%devono essere usati freddi.Parte 3 – Analisi del DNA ottenuto mediante elettroforesi in gel diagarosio (mostrata agli studenti)1. Preparazione del gel all’1% di agarosio• Pesare 1 g di agarosio• Mettere l’agarosio in una beuta, aggiungere 50 ml di tampone TAE (TRIS-Acetato-EDTA) e porre la beuta nel forno a microonde a media potenza; di tanto in tantoestrarre la beuta e agitarla fino ad ottenere una soluzione limpida• Fare raffreddare la soluzione aggiungendo altri 50 ml di TAE e aggiungere, quando latemperatura è tale da non scottare, il bromuro di etidio (10 µl di una soluzione10mg/ml).• Versare la soluzione nel lettino opportunamente allestito con i pettini e lasciaresolidificare.• Dopo la solidificazione, il gel viene posto nell’apposita vaschetta elettroforeticariempita con il tampone di corsa. Tale tampone è lo stesso e alla stessa concentrazionedi quello usato per polimerizzare l’agarosio.•NOTE:23

Il Tris contenuto nel tampone è un sale molto usato nei laboratori. Tampona tra pH 7 e pH 8,un range in cui il DNA si mantiene molto bene. L’Acido acetico fornisce gli ioni chepermettono il passaggio della corrente elettrica. L’EDTA, invece, è un chelante che sequestraioni Mg2+ presenti in soluzione e che vengono utilizzati da enzimi che degradano il DNA(DNAsi). Il suo potere tamponante è nullo rispetto a quello del Tris.Per visualizzare le bande elettroforetiche durante e dopo la corsa, viene aggiunto al gel ilBromuro di etidio, un intercalante del DNA che, se esposto a luce UV, emette fluorescenza. Inquesto modo sono rese visibili le bande di DNA che hanno migrato sul gel. Il limite dirivelabilità è in genere attorno ai 15-20 ng di DNA. Attenzione: il bromuro di etidio è unamolecola potenzialmente cancerogena, come TUTTE le molecole che si intercalano fra leeliche del DNA, ed è dunque necessario maneggiarla con prudenza; in caso entrasse incontatto con la pelle, lavare abbondantemente con acqua, ma non insaponare, per evitare disolubilizzare la molecola e farla penetrare negli strati inferiori dell’epitelio. Gli strati piùsuperficiali sono infatti formati da cellule morte che non possono quindi essere danneggiate daparte di questa molecola. Il tampone per l’elettroforesi viene utilizzato sia per preparare il geld’agarosio sia per la corsa elettroforetica.2. Preparazione dei campioni da analizzare in gel• Miscelare 10 µl di campione con 3 µl di “loading buffer” (tampone di caricamento) e 5µl di acqua (volume finale 18 µl).NOTE:Questo passaggio ha lo scopo di rendere il campione visibile, durante il caricamento nel gel,grazie alla presenza di coloranti; consente anche di seguire istante per istante l’andamentodell’elettroforesi. Spesso sul gel, durante il caricamento dei campioni, si riserva un pozzetto incui verrà messo il marker. Questo è composto da una miscela di frammenti lineari di DNA iquali migrano nel gel in maniera nota.3. Caricamento e corsa• Caricare evitando di avere bolle nel puntale: queste uscendo spingerebbero il campionefuori dal pozzetto.• Applicare una differenza di potenziale proporzionale alla distanza tra gli elettrodi, inparticolare si applica un voltaggio di 3-5 V/cm (calcolato come distanza fra i dueelettrodi), quindi 80 V.24

• La corsa termina quando il primo colorante (blu di bromofenolo) ha percorso i ¾ dellalunghezza del gel (45-60 min.)4. Visualizzazione delle bande• Al termine della corsa elettroforetica, il gel viene prelevato ed appoggiato sul piano diuno strumento denominato TRANSILLUMINATORE a UV; le lampade UV deltransilluminatore consentiranno di visualizzare le bande di DNA sul gel.NOTE:Dopo l’estrazione il DNA plasmidico può presentarsi in tre forme (superavvolto, circolareaperto e lineare) a seconda di come è avvenuta l’estrazione. Generalmente si osservano solodue bande: superavvolto e circolare aperto; la forma superavvolta è quella che migra piùvelocemente.Se è più evidente la banda della forma superavvolta significa che il protocollo diestrazione del plasmide è delicato e non danneggia il DNA.Soluzioni utilizzate:- Tampone Tris-Acetato-EDTA• 0.04 M Tris acetato;• M EDTA pH 8.0.- Loading buffer (6x)• 0.15% Blu di bromofenolo°• 0.15% Xilene di cianolo^• 24% (w/v) glicerolo in acqua°migrazione simile a quella di un frammento di 300 bp^ migrazione simile a quella di un frammento di 4000 bp25

ESERCITAZIONE BRELAZIONI TROFICHE DELLE COMUNITÀ DEI SISTEMI FLUVIALI:DAI PRODUTTORI AI DECOMPOSITORIResponsabile: dott. Daniela BaldantoniLa maggior parte delle comunità ecologiche è costituita da centinaia di specie cheinteragiscono le une con le altre e con l’ambiente fisico in molti modi; quindi,tentare di comprendere come funzionino le comunità può sembrare un compitoimpossibile. Fortunatamente non dobbiamo conoscere tutti i dettagli per ottenereimportanti informazioni. Possiamo comprendere molte cose semplicementecapendo “chi mangia chi”. Gli organismi in una comunità possono esseresuddivisi in livelli trofici in base alla loro fonte di energia. I produttori ottengonola loro energia quasi sempre dalla luce solare. Gli erbivori, che ricavano la loroenergia cibandosi dei produttori, sono consumatori primari. Gli organismi cheottengono la loro energia mangiando gli erbivori, sono consumatori secondari, ecosì via. Gli organismi che vivono a spese della materia organica morta (carognedi animali, escrementi, rami secchi e foglie cadute, frutti…) si chiamanodecompositori e svolgono un ruolo centrale nel ciclo della materia.Obiettivo dell’esercitazioneL’esercitazione mira all’osservazione di alcune macrofite e macroinvertebrati chenei sistemi fluviali occupano livelli trofici chiave nel ciclo della materia.Materiale- Alghe unicellulari e pluricellulari- Piante acquatiche- Macroinvertebrati- Microscopio ottico a luce trasmessa- Stereomicroscopio- Lente d’ingrandimento- Pinzetta- Vetrino porta-oggetto- Vetrino copri-oggetto- Pipetta Pasteur- Capsula Petri- Spruzzetta- Olio a immersione26

Microscopio ottico a luce trasmessa: nell’immagine sono indicate le principalicomponenti.Stereomicroscopio27

ReagentiEtanolo al 75%ProceduraAllestimento di vetrini per l’osservazione al microscopio ottico a luce trasmessadi alghe unicellulari e pluricellulari e di piante acquatiche; osservazione allostereomicroscopio di macroinvertebrati.Presupposti teoriciSi richiede che i docenti trasmettano agli studenti conoscenze relative ai principidi funzionamento e dell’utilizzo del microscopio ottico.Sono utili conoscenze di base della comunità di organismi dei fiumi.SicurezzaComuni principi di sicurezza in laboratorio, non sono richieste prescrizioniparticolari.29

ESERCITAZIONE CVIAGGIO NEL MONDO DEI MICRORGANISMI:IMPARIAMO A STUDIARLIResponsabile: Dott. Giovanni VigliottaArgomenti trattatiDefinizione di microrganismo.Procedure fenotipiche per l’identificazione microbica: colorazione di Gram edella spora, analisi microscopica, test della ossidasi e della catalasi per ilriconoscimento di Escherichia coli, Pseudomonas spp. e dei cocchi Gram positivi(streptococchi e stafilococchi).Obiettivo dell’esercitazioneFornire alcuni dei principi fondamentali per manipolare i microrganismi ericonoscerli attraverso l’analisi fenotipica e biochimica.Note relative alla sicurezzaNel corso delle esercitazioni quasi tutti i microrganismi utilizzati saranno nonpatogeni e quindi potranno essere manipolati con le opportune precauzioni daglistudenti. Nel caso sia necessario il confronto con quelli patogeni, questi ultimiverranno manipolati esclusivamente dal responsabile di laboratorio. E’fondamentale l’uso del camice e, all’occorrenza, dei guanti monouso.Tutti i materiali (fazzoletti, coloranti, vetrini, ecc.) che sono stati in contatto con imicrorganismi dovranno essere gettati negli appositi contenitori etichettati inmodo appropriato al fine di garantirne il corretto smaltimento.Materiali:Vetrini portaoggettiSpruzzetteGuanti e camici monousoAnse calibrate steriliPipette graduate in plasticaPipette monousoOlio minerale per microscopiaBecco bunsen30

Reagenti:Kit per colorazione di Gram:soluzioni di cristal violetto, safranina,decolorante (acetone o etanolo), reattivo di Lugol (Iodio).Soluzione verde malachite (5% in acqua) per colorazione della spora.Reattivi per i saggi della catalasi e ossidasiStrumentazione:Microscopio ottico con obiettivi 20X e 40X e 100X e oculare 10X; attrezzaturaper la conta cellulare.Presupposti teorici.I microrganismi sono definiti come organismi viventi talmente piccoli darichiedere l’uso del microscopio per essere osservati. Nonostante le dimensioni, ilmondo microbico è molto vario e affascinante: entrando nell’infinitamentepiccolo lo scenario che si aprirebbe sarebbe quello di un mondo parallelosconosciuto, infinitamente grande, fatto di organismi dalle forme più disparate(sferici, ellittici, cilindrici, filamentosi, quadrati, ecc.), colorati, fissi, fluttuanti,traslanti e dalle capacità di colonizzare ambienti estremi e impossibili perqualunque altro essere vivente. La nostra vita e quella di ogni organismo ètotalmente dipendente da essi, dal punto di vista medico (patogeni: Candida,Micobacterium tuberculosis, Virus HIV, ecc.), ambientale (cicli biogeochimici),ma anche biotecnologico (alimenti, risanamento ambientale, farmaciricombinanti, antibiotici). Saper manipolarli e studiarli riveste, quindi, un’enormeimportanza, soprattutto se si pensa che è stato stimato che quelli cheeffettivamente sono a noi noti rappresentano una percentuale trascurabile rispettoa quelli effettivamente presenti in natura.Lo studio dei microrganismi richiede metodi per la crescita e propagazione inlaboratorio (terreni di crescita) e per la identificazione. Le dimensioni ridotte chenon ci permettono di carpire i particolari, come si potrebbe fare semplicementeosservando un organismo superiore (una pianta, un cane, un uomo ecc.), rendononecessari dei metodi per l’identificazione che vanno oltre la sola definizione dellaforma, spesso ripetuta tra gruppi differenti. L’identificazione corretta si avvale didiverse procedure e difficilmente una sola di queste può portare ad un risultatoattendibile. Oggi si utilizza quello che si definisce approccio polifasico, ovverol‘impiego simultaneo di tecniche molecolari, basate sullo studio del DNA e deigeni, e tecniche fenotipiche, mirate alla caratterizzazione della forma, fisiologia,metabolismo. Queste ultime consistono nell’osservazione microscopica, nellacrescita in vari tipi di terreni e in condizioni diverse di pH, temperatura, salinità,31

nell’uso di metodi biochimici (ricerca di attività enzimatiche quali la catalasi el’ossidasi, ureasi ecc.) e sierologici (mediante anticorpi per individuare specifichemolecole dette marcatori presenti sulla superficie del microrganismo).La nostra esercitazione affronterà il tema del riconoscimento microbicoutilizzando tecniche esclusivamente fenotipiche.• Il primo passo per identificare un microrganismo è quello di osservarloattentamente al microscopio, ma questo richiede che lo si contrasti rispettoall’ambiente circostante. Per lo scopo sono comunemente utilizzatesostanze coloranti che funzionano legandosi ad alcune strutture dellacellula (membrana, parete DNA e altro), conferendo loro caratteristicicolori. Alcune colorazione, dette semplici, hanno come unico scopo quellodi contrastare la cellula, tuttavia, sono state messe a punto una serie diprocedure che permettono di differenziare tra diversi gruppi microbici(colorazioni differenziali) o di riconoscere particolari strutture quali spore,capsule, flagelli, nucleo (colorazioni strutturali). Saranno applicate duetecniche di colorazione che ci permetteranno di osservare un insiemedi microrganismi diversi.• Si passerà poi all’uso di tecniche biochimiche: il saggio dell’ossidasi edella catalasi.Il test dell’ossidasi permette di evidenziare la presenza nella cellula diattività ossidante il citocromo c (citocromo c ossidasi), tipica solo di certigruppi batterici ma che manca in altri. Questo saggio ci permetterà didistinguere tra coliformi, il cui rappresentante più noto è Escherichiacoli (habitat: apparato digerente scarichi fognari, liquami) ePseudomonas (habitat: pesce, pollame, uova, frigoriferi di casa,ospedali). Entrambi i batteri, molto diffusi in natura, risultanopraticamente identici all’analisi microscopica.Il test della catalasi evidenzia la presenza dell’enzima catalasi, un enzimadetossificante che converte il perossido di idrogeno prodotto dalmetabolismo dell’ossigeno e tossico per la cellula, in ossigeno e acqua,innocui. Sarà utilizzato il test per distinguere gli stafilococchi (catalasipositivi) dagli streptococchi (catalasi negativi), entrambi Gram positivie caratterizzati da una forma sfericaEsercitazione pratica.A. Visualizzazione delle colonie microbiche cresciute su capsule di Petricontenenti terreno di coltura solido (15% agar): valutazione della forma,grandezza, colore, consistenza e contorno delle colonie.32

B. Analisi del gruppo di appartenenza, forma, dimensione e struttura dei singolimicrorganismi, mediante tecniche di colorazione e microscopia.B.1. Colorazione di Gram (differenziazione tra gruppi Gram positivi e Gramnegativi).Preparazione del campione.Prelevare con un’ansa calibrata sterile una data quantità di acqua distillata (circa 5 microlitri) e appoggiarla sul vetrino portaoggetti;Con una seconda ansa sterile prelevare una piccola quantità di coloniamicrobica e stemperarla nell’acqua posta sul vetrino portaoggetti;Fare asciugare bene il vetrino;Fissare il campione passandolo 3 volte con movimento deciso tra la fiammadi un becco bunsen.Colorazione.Con una pipetta monouso pulita prelevare poche gocce di cristal violetto,stratificarlo sul materiale fissato e incubare 3 minuti;Rimuovere con acqua di fonte, mediante spruzzetta, l’eccesso di colorantedal vetrino;Con una pipetta monouso pulita prelevare poche gocce di mordenzante,(reattivo di Lugol) stratificare sul materiale precedentemente colorato eincubare 1 minuto;Rimuovere con acqua di fonte l’eccesso di mordenzante;Applicare con una pipetta monouso pulita poche gocce di decolorante sulcampione per 10 secondi;Rimuovere immediatamente con acqua di fonte;Con una pipetta monouso pulita prelevare poche gocce di colorante safraninaper il contrasto, stratificare sul materiale fissato e incubare 1 minuto;Rimuovere con acqua di fonte e lasciare asciugare prima dell’osservazione almicroscopio.B.2. Colorazione dell’endospora secondo Schaeffer e Fulton (analisi distrutturale).Preparazione del campione.Operare come al punto B.1.33

Colorazione.Far bollire in un becker dell’acqua mediante l’uso di una piastra riscaldante;Poggiare il vetrino con il campione sopra all’acqua bollente utilizzandoappositi sostegni;Coprire gli strisci con pezzi di carta assorbente e saturarli con la soluzione diverde malachite;Lasciare agire per 5 minuti aggiungendo nuovo colorate per evitare eccessivaperdita per evaporazione;Rimuovere il vetrino e lavare delicatamente con acqua di fonte;Con una pipetta monouso pulita prelevare poche gocce di colorante safraninaper il contrasto, stratificare sul materiale fissato e incubare 1 minuto;Rimuovere con acqua di fonte e lasciare asciugare prima dell’osservazionemicroscopioB.3. Osservazione al microscopio ottico.Porre il vetrino precedentemente colorato con il colorante di Gram o verdemalachite sul tavolino porta vetrini del microscopio in dotazione e mettere afuoco con ingrandimenti minori (20X);Porre una goccia di olio minerale sulla zona da osservare e posizionarvi sopral’obbiettivo 100X per l’osservazione in immersione.B.4. Risultati.Le forme possibili varieranno in funzione dei microrganismi utilizzati(l’allievo sarà chiamato a descriverle, possibilmente disegnandole).I batteri Gram negativi appariranno di colore rosa pallido mentre quelli Grampositivi saranno colorati in viola scuro con un’intensità dipendente dal gruppomicrobico.I batteri endosporigeni presenteranno una colorazione rosa e al loro internouna struttura di forma variabile (circolare, ovoidale o cilindrica) di coloreverde.I lieviti appariranno di colore viola (postitivi al Gram) con una forma sferica,ellittica o cilindrica e con eventuali gemme sporgenti sulla superficie.C. Saggio della catalasi.Porre una goccia di reattivo su di un vetrino portaoggetti;Con un’ansa monouso sterile prelevare una colonia microbica cresciuta supiastra Petri e stemperarla nella goccia di reattivo.34

Risultato.Test positivo: sviluppo quasi immediato di ossigeno, evidenziato dallaformazione di schiuma bianca sul vetrino.Test negativo: assenza di schiuma.D. Saggio dell’ossidasi.Porre una goccia di reattivo su di un disco di carta assorbente di 0,6-0,8 cm didiametro;Con un’ansa monouso sterile prelevare una colonia microbica cresciuta supiastra passarla sulla carta umida.RisultatoTest positivo: sviluppo di colore viola in pochi secondi in corrispondenza deimicrorganismi.Test negativo: assenza di sviluppo di colore.ABCA. Colonie batteriche di attinomiceti cresciute in capsule di Petri con terrenoagarizzato. B. Analisi microscopica della colonia: notare la forma filamentosa deisingoli batteri simile al micelio fungino C. Differenziamento microbico nel tempo:produzione di antibiotico (indicato dal colore rosso) e spore (alone bianco sullasuperficie batterica35

ABCA,B,C. Esempi di batteri bastoncellari. D. Lievito. A. E.coli, Gram negativo. B. Bacillus tetani. C. Bacillus cereusevidenziato con colorazione di Gram e chiaramente Grampositivo. Notare in B la presenza della endospora subDterminale rifrangente. D. Saccaromyces cerevisiae ilcomune lievito di birra; notare le gemme sulle cellulemadri36