bibliografia - Università degli Studi di Ferrara

c) Precipitazione con (NH 4 ) 2 SO 4Da prove sperimentali preliminari condotte a diverse concentrazioni di ammoniosolfato, è risultato che l’enzima AAS precipita nel lisato cellulare in presenza di(NH 4 ) 2 SO 4 tra il 40 e il 60%. Si aggiunge pertanto ai 10 ml di lisato la quantità di(NH 4 ) 2 SO 4 necessaria a raggiungere la concentrazione suddetta attraverso piccoleaggiunte successive: il procedimento deve essere fatto mantenendo il campione inghiaccio sotto lenta e costante agitazione. Quando il (NH 4 ) 2 SO 4 risultacompletamente sciolto, il campione viene lasciato a 4°C per almeno 4 h così dapermettere la lenta precipitazione delle proteine. Si centrifuga (10.000 rpm, 20minuti, 10°C), il surnatante viene scartato mentre il precipitato viene conservato a4°C fino al momento dell’utilizzo per il successivo passaggio.d) Cromatografia a scambio ionico: DEAE-SepharoseIl precipitato ottenuto dal passaggio precedente viene risospeso in 5 ml ditampone fosfato 20 mM a pH 7 ed opportunamente desalato ripetendo 4 cicli dicentrifugazione (10000 rpm, 10 minuti, 10 °C) su membrane Amicon Ultra-4Millipore. L’estratto cellulare viene cromatografato su una colonna DEAEsepharose(3.0 x 1.5 cm) preventivamente equilibrata con tampone fosfato 20 mMa pH 7. La colonna viene eluita con concentrazioni crescenti di NaCl (0.1 M, 0.2M, 0.4 M, 0.6 M, 1 M). L’enzima viene eluito con la soluzione 0.4 M (Figura 1).Le frazioni contenenti l’AAS vengono riunite (4 ml) e concentrate perultrafiltrazione.e) Cromatografia di adsorbimento: IdrossiapatiteL’enzima parzialmente purificato ottenuto dalla cromatografia su DEAEsepharoseviene diluito in tampone fosfato 50 mM, fino ad un volume finale di 2.0mL, quindi caricato su una colonna di idrossiapatite (2.5 x 1.0 cm) equilibrata conlo stesso tampone. La colonna viene lavata con tampone a pH 7.0 conconcentrazioni crescenti di fosfato (50, 70, 90, 120 e 140 mM). L’enzima vieneeluito alla concentrazione di 120 mM (Figura 2).193