bibliografia - Università degli Studi di Ferrara

Il giorno seguente il gel viene decolorato con un paio di lavaggi in H 2 O bidist.rendendo così visibili le bande proteiche presenti nel campione (Figura 3).Purificazione di acetilacetoino sintasi (AAS) da B. licheniformisa) Coltivazione cellule di B. licheniformis.In una beuta da 50 ml contente 10 ml di terreno liquido composto da estratto dilievito (10 g/L), peptone (10 g/L), NaCl (5 g/L), tappata con cotone idrofobo esterilizzata in autoclave viene inoculato B. licheniformis DSM 13, prelevato conansa sterile e sotto cappa a flusso laminare dalle colture di conservazione suterreno solido (slants). La coltura viene agitata per 24 h (110 rpm) allatemperatura di 28°C, quindi, sempre in condizioni di sterilità, viene versata in unabeuta da 250 ml contenente 100 ml del medesimo terreno addizionato di 3-idrossi-2-butanone (5 g/L), al fine di ottenere l’induzione dell’espressione di AAS [36].Dopo 24 h in agitazione a 28°C le cellule vengono separate per centrifugazione(7000 rpm, 15 minuti) sospese in 5 ml di soluzione fisiologica e la sospensione èstata nuovamente centrifugata (7000 rpm, 15 minuti). Il supernatante vieneallontanato e le cellule così ottenute (0.3 g) vengono conservate in congelatore (-20°C) e rappresentano lo stock di riferimento per la preparazione del lisatocellulare per la purificazione di AAS.b) Preparazione del lisato cellulareLe cellule (1.0 g) sono scongelate e sospese in tampone fosfato 50 mM a pH 6.5(10 ml) contenente EDTA 0.1 mM e -mercaptoetanolo 1 mM. La sospensioneviene omogeneizzata (vortex) e trattata per estrusione ad alta pressione per mezzodi una French-press (1380 bar) per ottenere un omogenato grezzo che vienecentrifugato (10.000 rpm, 20 minuti, 10°C) per dare il lisato cellulare (10 ml) utilealla purificazione.192