bibliografia - Università degli Studi di Ferrara
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Nei capitoli precedenti è stata messa in luce l’importanza di acetilacetoino sintasi(AAS) da Bacillus licheniformis per la formazione di legami carbonio-carbonio.Un requisito fondamentale, affinché una metodologia biocatalitica possa avereun’ampia diffusione, è rappresentato dalla facile disponibilità del biocatalizzatore.In quest’ottica, parte dell’attività sperimentale dell’ultimo anno di dottorato si èconcentrata sulla purificazione dell’enzima al fine di porre le basi per un lavoro dibiologia molecolare volto al clonaggio del gene di AAS e alla sua overespressionein cellule ospite ricombinanti. Le tecniche di biologia molecolare,infatti, sono oggi imprescindibili per poter disporre facilmente e in tempi rapidi diquantità considerevoli dell’enzima desiderato, preservandone l’efficienzacatalitica e semplificando enormemente le procedure di purificazione. Partendodalla sequenza putativa del gene codificante l’enzima, ottenuto dall’analisicomparata delle informazioni contenute nelle banche genomiche deimicrorganismi, si procede al clonaggio in vettori plasmidici, e poi allatrasformazione di cellule ospiti per l’espressione. Il clonaggio del gene target inuna cellula ospite è un passaggio cruciale che deve tener conto di alcuni aspettifondamentali:i) riproducibilità ed affidabilità dell’espressione proteica;ii) stabilità della proteina così che risulti biologicamente attiva (mantenendostruttura e conformazione);iii) facilità di recupero in fase di purificazione.Di solito vengono scelti ceppi di E. coli ricombinanti come cellule ospite dalmomento che offrono i requisiti migliori in termini di ottenimento di grandiquantità di biomassa (crescita cellulare) e facilità di recupero/purificazione dellaproteina. Il genoma di B. licheniformis DSM 13 è stato completamentesequenziato ed esistono molte sequenze codificanti geni di cui ancora non siconosce la funzione (ORF s ) (Cap. 2). Dall’analisi comparata dei genomi di altrimicrorganismi produttori di 2,3-butandiolo, appartenenti al medesimo alberofilogenetico di B. licheniformis, è stato possibile identificare tra le ORF s alcune184
sequenze putative codificanti geni del metabolismo dell’acetoino e, con buonaprobabilità, tra queste si dovrebbe trovare quella codificante per AAS (Cap. 2).A tutt’oggi in letteratura non esiste un microrganismo per il quale sia statadescritta una sequenza codificante una acetilacetoino sintasi, nonostante sia notoche diversi batteri oltre a B. licheniformis possiedano questo enzima [36,38,39].Questo dato di partenza, di conseguenza, rende più complicato il progetto diclonaggio ed espressione; per questo motivo che si è pensato di risalire allasequenza del gene di AAS da B. licheniformis partendo dalla purificazionedell’enzima. Una volta ottenuta la proteina pura, infatti, esistono diverse tecnicheche permettono dalla sequenza amminoacidica primaria di risalire alla sequenzagenica codificante.Il lavoro che viene descritto in questo capitolo riguarda la purificazione di AAS.In futuro, a seguito della purificazione, si procederà con l’analisi della proteinapura per stabilire la sequenza amminoacidica (analisi in massa o sequenziamentoN-terminale) e, quindi, si tenterà poi di risalire almeno ad una parte dellasequenza genica codificante AAS. Su questa sequenza poi si potrebbero disegnarei primers da utilizzare in reazioni di PCR per amplificare e clonare il gene di AASdel cromosoma batterico di B. licheniformis.La purificazione dell’enzima AAS da B. licheniformis DSM 13 è stata condottaispirandosi ad una procedura descritta in letteratura per una AAS da Bacillussp.YUF-4 [39]. Il protocollo seguito per la AAS da B. licheniformis, ha permessodi raggiungere un buon grado di purezza della proteina, attraverso un ridottonumero di passaggi.Il lisato cellulare, ottenuto trattando ad alta pressione (French-press) unasospensione di cellule di B. licheniformis in tampone fosfato a pH 6.5, rappresentail punto di partenza della procedura di purificazione. Tale lisato è stato sottopostoad una precipitazione frazionata con solfato d’ammonio. L’enzima, che precipitatra il 40 ed il 60% della concentrazione saturante, attraverso questo passaggioviene purificato circa 6 volte con un recupero del 93%. Nel passaggio successivoil precipitato proteico è stato sciolto sempre in tampone fosfato a pH 6.5, lasoluzione è stata desalata per ultrafiltrazione e caricata su una colonna di185
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sequenze putative co<strong>di</strong>ficanti geni del metabolismo dell’acetoino e, con buonaprobabilità, tra queste si dovrebbe trovare quella co<strong>di</strong>ficante per AAS (Cap. 2).A tutt’oggi in letteratura non esiste un microrganismo per il quale sia statadescritta una sequenza co<strong>di</strong>ficante una acetilacetoino sintasi, nonostante sia notoche <strong>di</strong>versi batteri oltre a B. licheniformis possiedano questo enzima [36,38,39].Questo dato <strong>di</strong> partenza, <strong>di</strong> conseguenza, rende più complicato il progetto <strong>di</strong>clonaggio ed espressione; per questo motivo che si è pensato <strong>di</strong> risalire allasequenza del gene <strong>di</strong> AAS da B. licheniformis partendo dalla purificazionedell’enzima. Una volta ottenuta la proteina pura, infatti, esistono <strong>di</strong>verse tecnicheche permettono dalla sequenza amminoaci<strong>di</strong>ca primaria <strong>di</strong> risalire alla sequenzagenica co<strong>di</strong>ficante.Il lavoro che viene descritto in questo capitolo riguarda la purificazione <strong>di</strong> AAS.In futuro, a seguito della purificazione, si procederà con l’analisi della proteinapura per stabilire la sequenza amminoaci<strong>di</strong>ca (analisi in massa o sequenziamentoN-terminale) e, quin<strong>di</strong>, si tenterà poi <strong>di</strong> risalire almeno ad una parte dellasequenza genica co<strong>di</strong>ficante AAS. Su questa sequenza poi si potrebbero <strong>di</strong>segnarei primers da utilizzare in reazioni <strong>di</strong> PCR per amplificare e clonare il gene <strong>di</strong> AASdel cromosoma batterico <strong>di</strong> B. licheniformis.La purificazione dell’enzima AAS da B. licheniformis DSM 13 è stata condottaispirandosi ad una procedura descritta in letteratura per una AAS da Bacillussp.YUF-4 [39]. Il protocollo seguito per la AAS da B. licheniformis, ha permesso<strong>di</strong> raggiungere un buon grado <strong>di</strong> purezza della proteina, attraverso un ridottonumero <strong>di</strong> passaggi.Il lisato cellulare, ottenuto trattando ad alta pressione (French-press) unasospensione <strong>di</strong> cellule <strong>di</strong> B. licheniformis in tampone fosfato a pH 6.5, rappresentail punto <strong>di</strong> partenza della procedura <strong>di</strong> purificazione. Tale lisato è stato sottopostoad una precipitazione frazionata con solfato d’ammonio. L’enzima, che precipitatra il 40 ed il 60% della concentrazione saturante, attraverso questo passaggioviene purificato circa 6 volte con un recupero del 93%. Nel passaggio successivoil precipitato proteico è stato sciolto sempre in tampone fosfato a pH 6.5, lasoluzione è stata desalata per ultrafiltrazione e caricata su una colonna <strong>di</strong>185
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