bibliografia - Università degli Studi di Ferrara

Nei capitoli precedenti è stata messa in luce l’importanza di acetilacetoino sintasi(AAS) da Bacillus licheniformis per la formazione di legami carbonio-carbonio.Un requisito fondamentale, affinché una metodologia biocatalitica possa avereun’ampia diffusione, è rappresentato dalla facile disponibilità del biocatalizzatore.In quest’ottica, parte dell’attività sperimentale dell’ultimo anno di dottorato si èconcentrata sulla purificazione dell’enzima al fine di porre le basi per un lavoro dibiologia molecolare volto al clonaggio del gene di AAS e alla sua overespressionein cellule ospite ricombinanti. Le tecniche di biologia molecolare,infatti, sono oggi imprescindibili per poter disporre facilmente e in tempi rapidi diquantità considerevoli dell’enzima desiderato, preservandone l’efficienzacatalitica e semplificando enormemente le procedure di purificazione. Partendodalla sequenza putativa del gene codificante l’enzima, ottenuto dall’analisicomparata delle informazioni contenute nelle banche genomiche deimicrorganismi, si procede al clonaggio in vettori plasmidici, e poi allatrasformazione di cellule ospiti per l’espressione. Il clonaggio del gene target inuna cellula ospite è un passaggio cruciale che deve tener conto di alcuni aspettifondamentali:i) riproducibilità ed affidabilità dell’espressione proteica;ii) stabilità della proteina così che risulti biologicamente attiva (mantenendostruttura e conformazione);iii) facilità di recupero in fase di purificazione.Di solito vengono scelti ceppi di E. coli ricombinanti come cellule ospite dalmomento che offrono i requisiti migliori in termini di ottenimento di grandiquantità di biomassa (crescita cellulare) e facilità di recupero/purificazione dellaproteina. Il genoma di B. licheniformis DSM 13 è stato completamentesequenziato ed esistono molte sequenze codificanti geni di cui ancora non siconosce la funzione (ORF s ) (Cap. 2). Dall’analisi comparata dei genomi di altrimicrorganismi produttori di 2,3-butandiolo, appartenenti al medesimo alberofilogenetico di B. licheniformis, è stato possibile identificare tra le ORF s alcune184