DISCUTIAMONE INSIEMEIDENTIFICAZIONE DI PROGENITORI EMOPOIETICI PHILADELPHIA-NEGATIVI IN PAZIENTI CON LEUCEMIA MIELOIDE CRONICA MEDIAN-TE IBRIDIZZAZIONE IN SITU IN FLUORESCENZACARMELO CARLO STELLA, GIOVANNA PIOVANI, DANIELA GARAU, VITTORIO RIZZOLICattedra di Ema<strong>to</strong>logia, Centro Trapianti di Midollo Osseo, ParmaLa leucemia mieloide cronica (LMC) è una malattia della cellula staminale caratterizzatadalla coesistenza di progeni<strong>to</strong>ri Philadelphia-positivi (Ph-pos) e Ph-negativi (Ph-neg). Scopodel presente lavoro è sta<strong>to</strong> di valutare, mediante ci<strong>to</strong>genetica convenzionale e ibridizzazione insitu in fluorescenza (FISH), la presenza del cromosoma Ph in colonie CD34+ di pazienti(n=7) con LMC.Per la FISH è sta<strong>to</strong> utilizza<strong>to</strong> un probe biotilina<strong>to</strong> (Oncor, Gaithersburg, Md, USA) che ibridizzal’oncogene abl. Per verificare la localizzazione cromosomica di abl, il probe è <strong>supplement</strong>a<strong>to</strong>di DNA biotilina<strong>to</strong> che ibridizza le sequenze ripetitive AATGG della regione pericentricadel cromosoma 9.Dopo trattamen<strong>to</strong> con colchicina, singole colonie veniva<strong>no</strong> aspirate, trasferite in multipiastreda 96 pozzetti, incubate (25 min, 37°C) in KCl (0.075 M) e fissate in meta<strong>no</strong>lo/acido acetico(4:1). Ciascuna colonia, risospesa in PBS veniva trasferita su vetri<strong>no</strong> e lasciata aderire.Dopo trattamen<strong>to</strong> con eta<strong>no</strong>lo (100%, 60 min), i vetrini veniva<strong>no</strong> immersi (10 min) in HCl(0.1 M)/Tri<strong>to</strong>n X-100 (0.5%) e quindi in SSC 2X. La denaturazione del DNA (70°C) e SSC 2X,era seguita da deidratazione in eta<strong>no</strong>lo freddo (80, 90, 100%). I vetrini veniva<strong>no</strong> quindi incubati(16 h, 37°C) con 10 µl di miscela di ibridizzazione (50% formamide, 10% destra<strong>no</strong> solfa<strong>to</strong>,2x SSC), 10 µl di DNA di sperma di salmone (500 mg/ml) o 10 µl di DNA di placentaumana (500 mg/ml) e 10 µl di probe anti-abl (10 µg/ml) biotilina<strong>to</strong>. Dopo l’ibridizzazioneveniva esegui<strong>to</strong> un lavaggio in formamide (50%) e SSC 2x (43°C, 20 min) e due lavaggi in SSC2x (4 min, 37°C).L’ibridizzazione veniva rivelata mediante avidina-FITC. Il segnale di fluorescenza era amplifica<strong>to</strong>mediante incubazione con anticorpo anti-avidina biotilina<strong>to</strong> segui<strong>to</strong> da avidina/FITC. Ivetrini, controcolorati con ioduro di propidio, era<strong>no</strong> esaminati mediante microscopio a fluorescenza(Zeiss Axiophot).L’arricchimen<strong>to</strong> di cellule CD34+ mediante immu<strong>no</strong>aderenza permetteva di ottenere frazionicellulari altamente purificate (cellule CD34+ = 74%). Il numero medio (±ESM) di coloniegenerate da 10.000 cellule CD34+, stroma-aderenti era di 888±188 (controllo) e 570±258(mafosfamide). Iil risulta<strong>to</strong> dell’analisi di colonie mediante ci<strong>to</strong>genetica convenzionale e FISH<strong>no</strong>n ha evidenzia<strong>to</strong> discrepanze, fornendo uguali percentuali di progeni<strong>to</strong>ri Ph-neg. Peraltro,l’analisi mediante FISH ha permesso di analizzare i progeni<strong>to</strong>ri emopoietici di un caso diLMC Ph-neg, ma porta<strong>to</strong>re del riarrangiamen<strong>to</strong> bcr-abl all’esame del DNA.La frazione stroma-aderente CD34+ conteneva 38±14% (controllo) e 56±18% (mafosfamide)(p≤ .025) progeni<strong>to</strong>ri Ph-neg. In tre su sette casi, nella frazione stroma-aderente, CD34+,trattata con mafosfamide è stata dimostrata esclusivamente la presenza di progeni<strong>to</strong>ri Ph-neg.In conclusione, i <strong>no</strong>stri dati dimostra<strong>no</strong> che: 1) è possibile svelare mediante FISH il riarrangiamen<strong>to</strong>dell’oncogene abl in progeni<strong>to</strong>ri emopoietici di pazienti con LMC Ph-pos e Ph-neg;2) tale approccio può essere efficacemente utilizza<strong>to</strong> sia dopo manipolazioni cellulari in vitro28
DISCUTIAMONE INSIEMEche dopo trapian<strong>to</strong> di midollo; 3) la FISH eseguita su cellule clonate in vitro consente di quantificarel’emopoiesi <strong>no</strong>rmale e quella leucemica a diversi livelli on<strong>to</strong>genetici e di identificare lafiliera differenziativa di appartenenza delle cellule analizzate.29
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