Vol. 79, supplement to no. 2, March-April 1994 - Supplements

More documents

Recommendations

Info

DISCUTIAMONE INSIEMEmizzare il legame della sonda all’RNA e di migliorare la accessibilità della sonda stessa al DNAcromosomico e nucleare;2) preparazione della sondaPer la visualizzazione del legame col DNA bersaglio, la sonda viene modificata mediante lanick translation che consiste in una reazione catalizzata che consente la incorporazione nellasonda di nucleotidi marcati (biotinati o digoxigenati). La sonda di DNA deve avere una lunghezzadi 50-400 bp per una buona accessibilità alle sequenze complementari del DNA bersaglio;3) denaturazione del DNA cellulare e della sondaPer permettere l’allineamento ed il legame della sonda alle sequenze complementari delDNA bersaglio entrambi i tipi di DNA devono trovarsi come singola catena. Allo scopo si eseguela denaturazione sfruttando il calore e la formamide in soluzione salina;4) ibridazioneIl vetrino viene incubato con la miscela contenente la sonda biotinata lungo una nottata. Lasonda si legherà specificamente al DNA bersaglio e, con legame meno forte, ad altre sequenzegenomiche che presentano un certo grado di omologia col DNA bersaglio (legame aspecifico).Successivamente a questa incubazione si procede alla rimozione della sonda legata aspecificamentemediante ripetuti lavaggi.Entrambi questi passaggi, cruciali per ottenere un buon rapporto tra segnale specifico esegnale aspecifico, vengono condotti in condizioni sperimentali di “stringenza” (stringency)adeguate per ciascun tipo di sonda e di preparato impiegato.La “stringenza” dipende da diversi fattori, tra cui i più importanti sono rappresentati dallaconcentrazione di formamide e salina e dal calore. Variando questi fattori durante il passaggiodi ibridazione e durante i lavaggi post-ibridazione si determinano condizioni di bassa o elevatastringenza ottenendo cosi, rispettivamente, un segnale più intenso con un maggiore gradodi aspecificità o un segnale più debole, ma più “pulito”;5) rilevazione del segnaleQuesto passaggio sfrutta la capacità dell’avidina fluoresceinata di legarsi alla sonda biotinata.Si procede in genere ad una o più amplificazioni sfruttando un monoclonale anti-avidina biotinatoed un secondo strato di avidina fluorescente.Sono oggi in commercio alcune sonde direttamente fluoresceinate che consentono di risparmiarei passaggi di amplificazione.Sono anche disponibili tecniche di rilevazione immunoenzimatiche.ApplicazioniLa possibilità di visualizzare con metodiche non-radioattive la presenza di determinatesequenze di DNA o di RNA su preparazioni cromosomiche, su nuclei in interfase, su preparaticitologici ed istologici si presta ovviamente ad un numero di applicazioni che vanno dallamappatura del genoma umano, allo studio dell’espressione genica, alla microbiologia e virologia,alla diagnostica prenatale ed alla citogenetica delle neoplasie.16
DISCUTIAMONE INSIEMELimitatamente alla citogenetica ematologica i principali impieghi della FISH sono:Studio delle trisomie e monosomie nelle cellule in metafase e nei nuclei in interfaseValutando con una sonda riconoscente sequenze ripetitive paracentromeriche di un cromosoma,il soggetto normale presenta due spot fluorescenti nel nucleo in interfase in oltre il 95%delle cellule. Cellule con un solo segnale (falsa monosomia) sono in genere rinvenute in percentualeinferiore al 4%, mentre cellule con tre segnali (falsa trisomia) sono rinvenute inferioreall’1%.Studio delle traslocazioniViene visualizzata la giustapposizione di sequenze normalmente disposte su cromosomidiversi. Ad esempio nella traslocazione t(9;22) il gene bcr ed il gene abl possono essere riconosciutida due sonde rispettivamente biotinate e digoxigenate. Impiegando come sistemi di rilevazionefluorocromi diversi (ad esempio rodamina e fluoresceina) si dimostra la giustapposizionedei due segnali di colore diverso lungo il cromosoma 22 e la presenza dei due segnaliaccoppiati nel nucleo in interfase.Studio dei riarrangiamenti cromosomici complessiVengono sfruttati diversi tipi di sonda scelti sulla base delle indicazioni dell’analisi citogeneticaconvenzionale.Di largo impiego in questo tipo di analisi sono le sonde riconoscenti regioni disposte insequenza lungo un intero cromosoma (chromosome painting) o lungo una intera banda checonsentono di dimostrare la partecipazione di un determinato cromosoma o di parte di essonella composizione di un marcatore complesso.Studio della malattia minima residuaQuesto tipo di approccio si fonda sulla possibilità di analizzare rapidamente un grandenumero di cellule in interfase in pazienti in remissione qualora questi abbiano dimostrato lapresenza alla diagnosi di aneuploidia o traslocazioni per le quali siano disponibili sonde adeguate.Gli studi sono stati eseguiti in prevalenza in pazienti affetti da trisomia in quanto la tecnicaè in questi casi molto sensibile.Un ulteriore affinamento deriva dalla possibilità di identificare la cellula in esame mediantecolorazione immunologica del fenotipo di membrana o mediante preventiva localizzazionedella cellula a morfologia sospetta su vetrino colorato con miscela panottica e successiva rilocalizzazionedella stessa cellula dopo l’esperimento di ibridizzazione.È ovviamente possibile monitorare mediante FISH i pazienti trapiantati con donatori disesso diverso.Rilevazione della amplificazione genicaImpiegando sonde riconoscenti sequenze di geni possibilmente amplificati in determinateforme tumorali (ad esempio l’oncogene ERBB2 nel carcinoma mammario) si può dimostrarnela effettiva amplificazione qualora l’esperimento di FISH metta in evidenza segnali multipli.17
Page 1 and 2: Vol. 79, supplement to no. 2, March
Page 3 and 4: Vol. 79, supplement to no. 2, March
Page 5 and 6: MECCANISMI DI CRESCITA DELLE LEUCEM
Page 7 and 8: DISCUTIAMONE INSIEMEtransmembrana (
Page 9 and 10: DISCUTIAMONE INSIEMETRASDUZIONE RET
Page 11 and 12: DISCUTIAMONE INSIEMETHE ACUTE PROMY
Page 13 and 14: DISCUTIAMONE INSIEMEPRODUZIONE DI G
Page 15 and 16: L’ibridazione in situnel paziente
Page 17: DISCUTIAMONE INSIEMEIBRIDAZIONE IN
Page 21 and 22: DISCUTIAMONE INSIEMESTUDIO DELLE AB
Page 23 and 24: DISCUTIAMONE INSIEMEANALISI DELLA t
Page 25 and 26: DISCUTIAMONE INSIEMELA TRISOMIA 7 C
Page 27 and 28: DISCUTIAMONE INSIEMEPresso il nostr
Page 29 and 30: DISCUTIAMONE INSIEMEduta per GvHD a
Page 31 and 32: DISCUTIAMONE INSIEMEche dopo trapia
Page 33 and 34: DISCUTIAMONE INSIEMERIARRANGIAMENTO
Page 35 and 36: DISCUTIAMONE INSIEMEIMPIEGO DELL’
Page 37: Direttore responsabile: Prof. Edoar

Vol. 79, supplement to no. 2, March-April 1994 - Supplements

You also want an ePaper? Increase the reach of your titles

Delete template?

Save as template?