Vol. 79, supplement to no. 2, March-April 1994 - Supplements

DISCUTIAMONE INSIEMEmizzare il legame della sonda all’RNA e di migliorare la accessibilità della sonda stessa al DNAcromosomico e nucleare;2) preparazione della sondaPer la visualizzazione del legame col DNA bersaglio, la sonda viene modificata mediante lanick translation che consiste in una reazione catalizzata che consente la incorporazione nellasonda di nucleotidi marcati (biotinati o digoxigenati). La sonda di DNA deve avere una lunghezzadi 50-400 bp per una buona accessibilità alle sequenze complementari del DNA bersaglio;3) denaturazione del DNA cellulare e della sondaPer permettere l’allineamento ed il legame della sonda alle sequenze complementari delDNA bersaglio entrambi i tipi di DNA devono trovarsi come singola catena. Allo scopo si eseguela denaturazione sfruttando il calore e la formamide in soluzione salina;4) ibridazioneIl vetrino viene incubato con la miscela contenente la sonda biotinata lungo una nottata. Lasonda si legherà specificamente al DNA bersaglio e, con legame meno forte, ad altre sequenzegenomiche che presentano un certo grado di omologia col DNA bersaglio (legame aspecifico).Successivamente a questa incubazione si procede alla rimozione della sonda legata aspecificamentemediante ripetuti lavaggi.Entrambi questi passaggi, cruciali per ottenere un buon rapporto tra segnale specifico esegnale aspecifico, vengono condotti in condizioni sperimentali di “stringenza” (stringency)adeguate per ciascun tipo di sonda e di preparato impiegato.La “stringenza” dipende da diversi fattori, tra cui i più importanti sono rappresentati dallaconcentrazione di formamide e salina e dal calore. Variando questi fattori durante il passaggiodi ibridazione e durante i lavaggi post-ibridazione si determinano condizioni di bassa o elevatastringenza ottenendo cosi, rispettivamente, un segnale più intenso con un maggiore gradodi aspecificità o un segnale più debole, ma più “pulito”;5) rilevazione del segnaleQuesto passaggio sfrutta la capacità dell’avidina fluoresceinata di legarsi alla sonda biotinata.Si procede in genere ad una o più amplificazioni sfruttando un monoclonale anti-avidina biotinatoed un secondo strato di avidina fluorescente.Sono oggi in commercio alcune sonde direttamente fluoresceinate che consentono di risparmiarei passaggi di amplificazione.Sono anche disponibili tecniche di rilevazione immunoenzimatiche.ApplicazioniLa possibilità di visualizzare con metodiche non-radioattive la presenza di determinatesequenze di DNA o di RNA su preparazioni cromosomiche, su nuclei in interfase, su preparaticitologici ed istologici si presta ovviamente ad un numero di applicazioni che vanno dallamappatura del genoma umano, allo studio dell’espressione genica, alla microbiologia e virologia,alla diagnostica prenatale ed alla citogenetica delle neoplasie.16