ESTRAZIONE DI ACIDI NUCLEICI - Sezione di Microbiologia

Microbiologia UpdateOE VarnierESTRAZIONE DI ACIDI NUCLEICIby Jennifer L. McDermott• L’amplificazione genica mediante reazionea catena (PCR) è una delle tecnicheutilizzate piú frequentemente per laricerca di sequenze genomiche specifichedirettamente nel campione clinico.• I campioni clinici inviati al laboratoriodevono essere preparati in modo dapermettere l’amplificazione delle sequenzespecifiche, di conseguenza a seconda deltipo di campione inviato e del bersaglioricercato, vengono utilizzati differentiprotocolli per l’estrazione degli acidinucleici.• L’estrazione di acidi nucleici puo essereeffettuato direttamente sulla maggiorparte dei campioni clinici senza unaprocedura di pre-trattamento (sangueintero, urine, liquor, plasma, siero). Laprocedura di pre-trattamento (separazionedelle cellule mediante un gradiente didensità) va effettuata in caso di estrazionedi acidi nucleici da cellule mononucleate.SEPARAZIONE DI LEUCOCITI DA SANGUEPERIFERICO (CON ANTICOAGULANTE)A. La provetta di sangue viene agitatalentamente per inversione, stappata edincubata per 30 minuti a 37°C inpresenza di CO 2 al 5%.B. Questo permette la separarazione deiglobuli bianchi da quelli rossi per sedimentazione.C. lL fase superiore, contenente plasma eleucociti, viene trasferita con una pipettaPasteur sterile monouso in una provettasterile monouso.D. Dopo aver centrifugato la provetta per 10min. a a 20°C (220 g.) il sopranatante(plasma) viene eliminato e se sonopresenti globuli rossi nel pellet vengonolisati mediante incubazione per 2-3 mincon una soluzione contenente 0.1% bicarbonatodi potassio e 0.82% di cloruro diammonio NH 4 Cl.E. I leucociti vengono lavati, successivamentediluiti con una soluzione salinatamponata con fosfato (PBS) per ridurre ladensitá e permettere la conta delle celluleB. Il sangue viene dispensato dentro unaprovetta sterile. Il Lympholyte-H vieneaggiunto direttamente sul fondo tramiteuna pipetta PasteurC. Avendo il Lympholyte-H una densitá maggiorerispetto alla sospensione di cellule,la sospensione di cellule formerà uno stratosopra il Lympholyte-H con una distintainterfaccia.D. Dopo aver centrifugato la provetta per 30min. a T.A. (800 g.) si evidenzia il plasmanella fase superiore, l’anello di linfociti sitrova all’interfaccia, il lympholyte-H nellafase inferiore ed i globuli rossi e le cellulemorte formano un pellet sul fondo dellaprovetta.E. I linfociti vengono trasferiti in una nuovaprovetta, lavati due volte, successivamentediluiti con PBS per ridurre ladensitá e permettere la conta delle cellule.CONTA DELLE CELLULE• Vengono contate al microscopio (obiettivo40X) le cellule presenti in 2 campiqualsiasi della camera Newbauer.SEPARAZIONE DI LINFOCITI DA SANGUEPERIFERICO (CON ANTICOAGULANTE)MEDIANTE LYMPHOLYTE-HA. Il Lympholyte-H viene dispensato dentrouna provetta sterile, successivamenteviene aggiunto lentamente un volumedoppio di sangue periferico avendo cura dinon miscelare le parti.1

Microbiologia UpdateOE Varnier• Il numero di cellule per ml di soluzioneviene ottenuto mediante i seguenti calcoli:Numero di cellule= (N°1+N°2)/2Numero di cellule per ml = N° x 10 4Volume contenente 10 6 cellule = 10 6 /N° x 10 4• Il volume della sospensione cellulare checontiene il numero di cellule desideratoviene trasferito in una nuova provetta ecentrifugato ad alta velocita.• Dopo aver eliminato il sopranatante ilpellet viene conservato a -80°C.REAGENTI UTILIZZATI PER LA LISICELLULARENonidet-P40, Detergente anionici che pro-Tween 20 o muovono la rottura delle me-Sodium Dodecyl mbrane cellulari e dissociareSulfate (SDS) le proteine dagli acidi nucleiciProteinase K Degrada le proteine (equindi anche le nucleasi)• Le cellule vengono lisate mediante incubazione(60 minuti a 56°C) con una soluzionetamponata contenente detergenteanionici e proteinase K• La proteinase K deve essere innattivatamediante incubazione a 95°C per 15minuti altrimenti potrebbe inibire la Taqpolimerasi nella reazione di amplificazione.• I lisati inattivati possono essere conservatia -20°C.• È importante lisare un numero noto dicellule per poter risalire al numero diPBMC contenuto nel volume di lisatoutilizzato per la reazione di PCR.REAGENTI UTILIZZATI PERLA PURIFICAZIONE DEL DNAFenolorimuove le proteine presentinel lisato cellulareCloroformio migliora l’efficienza dell’estrazionedi proteine ed eliminaretracce di fenolo da soluzioni diDNA diluito in acquaIsoamilicoAcetato di sodioEtanolo assolutocrea un’interfase tra la faseacquosa contenente DNA ed ilfenoloprecipita il DNAprecipita il DNAPURIFICAZIONE DEL DNA1. Portare il campione a volume finale 500µl con l'aggiunta di H 2 O di-stillata;2. Aggiungere 500µl di Fenolo:Isoami-lico(49:1);3. Mescolare, centrifugare a 2,000 rpm per15 min a T. ambiente e trasferire la fasesuperiore in una nuova provetta;4. Aggiungere 500µl di fenolo:Cloroformio:Isoamilico (49:49 :2);5. Ripetere punto 3;6. Aggiungere 500µl di Cloroformio:Isoamilico(49:1);7. Ripetere punto 38. Aggiungere 25µl di NaOAc 3M pH 5.39. Mescolare e aggiungere 1000µl di EtOH100% ghiacciato;10. Mescolare e incubare a -80°C per 40min;11. Centrifugare a 10,000 rpm per 15 min a4°C, eliminare il sopranatante, prendendonota della orientazione della provetta.Rimuovere con cura il liquido;12. Aggiungere 1000µl di etanolo al 70%ghiacciato;13. Centrifugare a 10,000 rpm per 15 min a4°C, eliminare il sopranatante, e rimuoverel’etanolo con una pipetta (conattenzione di non aspirare il DNA);14. Asciugare il DNA all’aria e risospendereil DNA in 50µl di H2O distillata lasciandoloa 4°C;Il tempo per completare la purificazionedi DNA è di circa 120 minuti.REAGENTI UTILIZZATI PERL’ESTRAZIONE E PURIFICAZIONE DELRNADietilpirocarbonato Trattamento chimico(DEPC)per distruggere le RNAsiTiocianatoForte denaturantedi guanidina delle proteineB-Mercaptoetanolo Riduce i legami disulfidicidelle proteinetRNA Utilizzato come coadiuvantela precipitazione(precipitando e-gli stesso)Isopropanolo Precipita l’RNAEtanolo al 70% Precipita l’RNAESTRAZIONE E PURIFICAZIONE DIRNA DAL PLASMA1. Agitare con vortex la soluzione diestrazione e dispensare una aliquota (400µl) in ciascuna provetta contenente 200µl di plasma.2. Agitare con vortex per 30 sec.3. Incubare per 10 min. a 60°C, quindiagitare con vortex.4. Aggiungere 500 µl di isopropanolo adogni provetta ed agitare con vortex.5. Incubare per 2 min. a temperaturaambiente.2

Microbiologia UpdateOE Varnier6. Centrifugare per 15 min. a 5’000 g(10’000 rpm) a temperatura ambiente.Fare un segno sulla provetta eposizionarle nella centrifuga con il segnorivolto verso l’interno. (Il sedimento sidepositerá sul lato opposto a tale segno).7. Eliminare il sopranatante da ogniprovetta senza toccare il sedimento.8. Aggiungere 1 ml di etanolo al 70% eagitare con vortex.9. Centrifugare per 5 min (vedi punto 6).10. Eliminare con attenzione il sopranatante.11. Aggiungere 100 µl di H 2 O DEPC senzaspipettare. Vortexare il sedimentocontenente l’RNA per staccarlo dallaparete della provettaIl tempo per completare l’estrazione e lapurificazione dell’RNA è di circa 40 minuti.ESTRAZIONE E PURIFICAZIONE DEIACIDI NUCEICI UTILIZZANDO KITCOMMERCIALI (CELLULE, TESSUTI ELIQUIDI BIOLOGICI)• Esistono kit che permettono l’estrazione ela purificazione del DNA, RNA o entrambi(acidi nucleici totali) utilizzando colonnine.• L’assorbimento selettivo degli acidinucleici avviene su una membrana disilice in presenza di un’alta concentrazionedi sali caotropici i quali tolgonol’acqua da molecole idratate in soluzione.• Polisaccaridi e proteine non sono assorbitie vengono rimossi durante i lavaggi.• Gli acidi nucleici vengono eluiti con unasoluzione contenente una bassa concentrazionedi sali (TE) oppure in acquasterile Dnase e/o Rnase freeAggiungere soluzione di cattura e Proteinase K(10 min. a 70°C)↓Isopropanolo↓Caricare la colonna↓Centrifugare a 6000 g (1 min.)↓Aggiungere soluzione di lavaggio (etanolo)↓Centrifugare a 6000 g (1 min.)↓Eluire con tampone T.E. o H 2 O distillataprescaldata a 70°C↓Acidi nucleiciIl tempo per completare l’estrazione e lapurificazione degli acidi nucleici è di circa20 minuti.Vantaggi• Estrazioni ottenute in tempi ridotti• Non richiede alta esperienza di laboratorio• DNA altamente purificato• Non prevede l’utilizzo di solventi organici• Gli inibitori della PCR sono completamenterimossiSvantaggi• Costi alti per campione rispetto alleprocedure tradizionaliCALCOLO DELLA CONCENTRAZIONE DEIACIDI NUCLEICISe si utilizza un campione di DNA o RNApurificato si puo verificare la purezza e laconcentrazione del campione mediante letturespettrofotometriche (260 nm e 280 nm).Per una soluzione con un A 260 = 1,0 si avrárispettivamente:50 µg/ml per Dna a doppio filamento;37 µg/ml per Dna a singolo filamento;40 µg/ml per Rna a singolo filamento.Il rapporto tra le OD misurate a 260nm e280nm da un indicazione della purezza dell’acidonucleico esaminato. Una soluzione diDNA o RNA puro dovrebbe avere un rapportoA 260 /A 280 di 1,8 e 2,0 rispettivamente.VERIFICA DELL’IDONEITÀ DEL DNA PERL’AMPLIFICAZIONEPer dimostrare l’idoneitá del campione diDNA all’amplificazione puó essere amplificatauna sequenza genomica cellulare (β-globina,citocromo B, HLA…)• Dopo la PCR, vengono aggiunti:♦ un colorante (blu di bromofenolo) chepermette di evidenziare il campione♦una volta caricato nel gelglicerolo che conferisce maggiore densitáal DNA, facilitando la precipitazionesul fondo del pozzetto del gel• L’amplificato cosí preparato viene rilevatomediante elettroforesi su gel di agarosio(2%) contenente bromuro di etidio, questosi intercala all’ elica di DNA e vieneevidenziato alla fine del processo grazieall’esposizione a raggi UV.• Il DNA ha una carica negativa quindi migradal polo negativo al positivo mentre ilbromuro di etidio ha una carica positiva.• La presenza di fattori inibitori (eparina,emoglobina ecc) che non vengono sufficientementerimossi durante la proceduradi purificazione, possono rendere ilcampione di DNA falsamente negativo, inquanto inibiscono l’attività della taqpolimerasi. In questi casi è opportunorichiedere un nuovo campione e/ocontrollare le metodiche di raccolta e dipreparazione utilizzate nel laboratorio.3