ESTRAZIONE DI ACIDI NUCLEICI - Sezione di Microbiologia
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<strong>Microbiologia</strong> UpdateOE Varnier<strong>ESTRAZIONE</strong> <strong>DI</strong> ACI<strong>DI</strong> <strong>NUCLEICI</strong>by Jennifer L. McDermott• L’amplificazione genica me<strong>di</strong>ante reazionea catena (PCR) è una delle tecnicheutilizzate piú frequentemente per laricerca <strong>di</strong> sequenze genomiche specifiche<strong>di</strong>rettamente nel campione clinico.• I campioni clinici inviati al laboratoriodevono essere preparati in modo dapermettere l’amplificazione delle sequenzespecifiche, <strong>di</strong> conseguenza a seconda deltipo <strong>di</strong> campione inviato e del bersaglioricercato, vengono utilizzati <strong>di</strong>fferentiprotocolli per l’estrazione degli aci<strong>di</strong>nucleici.• L’estrazione <strong>di</strong> aci<strong>di</strong> nucleici puo essereeffettuato <strong>di</strong>rettamente sulla maggiorparte dei campioni clinici senza unaprocedura <strong>di</strong> pre-trattamento (sangueintero, urine, liquor, plasma, siero). Laprocedura <strong>di</strong> pre-trattamento (separazionedelle cellule me<strong>di</strong>ante un gra<strong>di</strong>ente <strong>di</strong>densità) va effettuata in caso <strong>di</strong> estrazione<strong>di</strong> aci<strong>di</strong> nucleici da cellule mononucleate.SEPARAZIONE <strong>DI</strong> LEUCOCITI DA SANGUEPERIFERICO (CON ANTICOAGULANTE)A. La provetta <strong>di</strong> sangue viene agitatalentamente per inversione, stappata e<strong>di</strong>ncubata per 30 minuti a 37°C inpresenza <strong>di</strong> CO 2 al 5%.B. Questo permette la separarazione deiglobuli bianchi da quelli rossi per se<strong>di</strong>mentazione.C. lL fase superiore, contenente plasma eleucociti, viene trasferita con una pipettaPasteur sterile monouso in una provettasterile monouso.D. Dopo aver centrifugato la provetta per 10min. a a 20°C (220 g.) il sopranatante(plasma) viene eliminato e se sonopresenti globuli rossi nel pellet vengonolisati me<strong>di</strong>ante incubazione per 2-3 mincon una soluzione contenente 0.1% bicarbonato<strong>di</strong> potassio e 0.82% <strong>di</strong> cloruro <strong>di</strong>ammonio NH 4 Cl.E. I leucociti vengono lavati, successivamente<strong>di</strong>luiti con una soluzione salinatamponata con fosfato (PBS) per ridurre ladensitá e permettere la conta delle celluleB. Il sangue viene <strong>di</strong>spensato dentro unaprovetta sterile. Il Lympholyte-H vieneaggiunto <strong>di</strong>rettamente sul fondo tramiteuna pipetta PasteurC. Avendo il Lympholyte-H una densitá maggiorerispetto alla sospensione <strong>di</strong> cellule,la sospensione <strong>di</strong> cellule formerà uno stratosopra il Lympholyte-H con una <strong>di</strong>stintainterfaccia.D. Dopo aver centrifugato la provetta per 30min. a T.A. (800 g.) si evidenzia il plasmanella fase superiore, l’anello <strong>di</strong> linfociti sitrova all’interfaccia, il lympholyte-H nellafase inferiore ed i globuli rossi e le cellulemorte formano un pellet sul fondo dellaprovetta.E. I linfociti vengono trasferiti in una nuovaprovetta, lavati due volte, successivamente<strong>di</strong>luiti con PBS per ridurre ladensitá e permettere la conta delle cellule.CONTA DELLE CELLULE• Vengono contate al microscopio (obiettivo40X) le cellule presenti in 2 campiqualsiasi della camera Newbauer.SEPARAZIONE <strong>DI</strong> LINFOCITI DA SANGUEPERIFERICO (CON ANTICOAGULANTE)ME<strong>DI</strong>ANTE LYMPHOLYTE-HA. Il Lympholyte-H viene <strong>di</strong>spensato dentrouna provetta sterile, successivamenteviene aggiunto lentamente un volumedoppio <strong>di</strong> sangue periferico avendo cura <strong>di</strong>non miscelare le parti.1
<strong>Microbiologia</strong> UpdateOE Varnier• Il numero <strong>di</strong> cellule per ml <strong>di</strong> soluzioneviene ottenuto me<strong>di</strong>ante i seguenti calcoli:Numero <strong>di</strong> cellule= (N°1+N°2)/2Numero <strong>di</strong> cellule per ml = N° x 10 4Volume contenente 10 6 cellule = 10 6 /N° x 10 4• Il volume della sospensione cellulare checontiene il numero <strong>di</strong> cellule desideratoviene trasferito in una nuova provetta ecentrifugato ad alta velocita.• Dopo aver eliminato il sopranatante ilpellet viene conservato a -80°C.REAGENTI UTILIZZATI PER LA LISICELLULARENonidet-P40, Detergente anionici che pro-Tween 20 o muovono la rottura delle me-So<strong>di</strong>um Dodecyl mbrane cellulari e <strong>di</strong>ssociareSulfate (SDS) le proteine dagli aci<strong>di</strong> nucleiciProteinase K Degrada le proteine (equin<strong>di</strong> anche le nucleasi)• Le cellule vengono lisate me<strong>di</strong>ante incubazione(60 minuti a 56°C) con una soluzionetamponata contenente detergenteanionici e proteinase K• La proteinase K deve essere innattivatame<strong>di</strong>ante incubazione a 95°C per 15minuti altrimenti potrebbe inibire la Taqpolimerasi nella reazione <strong>di</strong> amplificazione.• I lisati inattivati possono essere conservatia -20°C.• È importante lisare un numero noto <strong>di</strong>cellule per poter risalire al numero <strong>di</strong>PBMC contenuto nel volume <strong>di</strong> lisatoutilizzato per la reazione <strong>di</strong> PCR.REAGENTI UTILIZZATI PERLA PURIFICAZIONE DEL DNAFenolorimuove le proteine presentinel lisato cellulareCloroformio migliora l’efficienza dell’estrazione<strong>di</strong> proteine ed eliminaretracce <strong>di</strong> fenolo da soluzioni <strong>di</strong>DNA <strong>di</strong>luito in acquaIsoamilicoAcetato <strong>di</strong> so<strong>di</strong>oEtanolo assolutocrea un’interfase tra la faseacquosa contenente DNA ed ilfenoloprecipita il DNAprecipita il DNAPURIFICAZIONE DEL DNA1. Portare il campione a volume finale 500µl con l'aggiunta <strong>di</strong> H 2 O <strong>di</strong>-stillata;2. Aggiungere 500µl <strong>di</strong> Fenolo:Isoami-lico(49:1);3. Mescolare, centrifugare a 2,000 rpm per15 min a T. ambiente e trasferire la fasesuperiore in una nuova provetta;4. Aggiungere 500µl <strong>di</strong> fenolo:Cloroformio:Isoamilico (49:49 :2);5. Ripetere punto 3;6. Aggiungere 500µl <strong>di</strong> Cloroformio:Isoamilico(49:1);7. Ripetere punto 38. Aggiungere 25µl <strong>di</strong> NaOAc 3M pH 5.39. Mescolare e aggiungere 1000µl <strong>di</strong> EtOH100% ghiacciato;10. Mescolare e incubare a -80°C per 40min;11. Centrifugare a 10,000 rpm per 15 min a4°C, eliminare il sopranatante, prendendonota della orientazione della provetta.Rimuovere con cura il liquido;12. Aggiungere 1000µl <strong>di</strong> etanolo al 70%ghiacciato;13. Centrifugare a 10,000 rpm per 15 min a4°C, eliminare il sopranatante, e rimuoverel’etanolo con una pipetta (conattenzione <strong>di</strong> non aspirare il DNA);14. Asciugare il DNA all’aria e risospendereil DNA in 50µl <strong>di</strong> H2O <strong>di</strong>stillata lasciandoloa 4°C;Il tempo per completare la purificazione<strong>di</strong> DNA è <strong>di</strong> circa 120 minuti.REAGENTI UTILIZZATI PERL’<strong>ESTRAZIONE</strong> E PURIFICAZIONE DELRNADietilpirocarbonato Trattamento chimico(DEPC)per <strong>di</strong>struggere le RNAsiTiocianatoForte denaturante<strong>di</strong> guani<strong>di</strong>na delle proteineB-Mercaptoetanolo Riduce i legami <strong>di</strong>sulfi<strong>di</strong>cidelle proteinetRNA Utilizzato come coa<strong>di</strong>uvantela precipitazione(precipitando e-gli stesso)Isopropanolo Precipita l’RNAEtanolo al 70% Precipita l’RNA<strong>ESTRAZIONE</strong> E PURIFICAZIONE <strong>DI</strong>RNA DAL PLASMA1. Agitare con vortex la soluzione <strong>di</strong>estrazione e <strong>di</strong>spensare una aliquota (400µl) in ciascuna provetta contenente 200µl <strong>di</strong> plasma.2. Agitare con vortex per 30 sec.3. Incubare per 10 min. a 60°C, quin<strong>di</strong>agitare con vortex.4. Aggiungere 500 µl <strong>di</strong> isopropanolo adogni provetta ed agitare con vortex.5. Incubare per 2 min. a temperaturaambiente.2
<strong>Microbiologia</strong> UpdateOE Varnier6. Centrifugare per 15 min. a 5’000 g(10’000 rpm) a temperatura ambiente.Fare un segno sulla provetta eposizionarle nella centrifuga con il segnorivolto verso l’interno. (Il se<strong>di</strong>mento sidepositerá sul lato opposto a tale segno).7. Eliminare il sopranatante da ogniprovetta senza toccare il se<strong>di</strong>mento.8. Aggiungere 1 ml <strong>di</strong> etanolo al 70% eagitare con vortex.9. Centrifugare per 5 min (ve<strong>di</strong> punto 6).10. Eliminare con attenzione il sopranatante.11. Aggiungere 100 µl <strong>di</strong> H 2 O DEPC senzaspipettare. Vortexare il se<strong>di</strong>mentocontenente l’RNA per staccarlo dallaparete della provettaIl tempo per completare l’estrazione e lapurificazione dell’RNA è <strong>di</strong> circa 40 minuti.<strong>ESTRAZIONE</strong> E PURIFICAZIONE DEIACI<strong>DI</strong> NUCEICI UTILIZZANDO KITCOMMERCIALI (CELLULE, TESSUTI ELIQUI<strong>DI</strong> BIOLOGICI)• Esistono kit che permettono l’estrazione ela purificazione del DNA, RNA o entrambi(aci<strong>di</strong> nucleici totali) utilizzando colonnine.• L’assorbimento selettivo degli aci<strong>di</strong>nucleici avviene su una membrana <strong>di</strong>silice in presenza <strong>di</strong> un’alta concentrazione<strong>di</strong> sali caotropici i quali tolgonol’acqua da molecole idratate in soluzione.• Polisaccari<strong>di</strong> e proteine non sono assorbitie vengono rimossi durante i lavaggi.• Gli aci<strong>di</strong> nucleici vengono eluiti con unasoluzione contenente una bassa concentrazione<strong>di</strong> sali (TE) oppure in acquasterile Dnase e/o Rnase freeAggiungere soluzione <strong>di</strong> cattura e Proteinase K(10 min. a 70°C)↓Isopropanolo↓Caricare la colonna↓Centrifugare a 6000 g (1 min.)↓Aggiungere soluzione <strong>di</strong> lavaggio (etanolo)↓Centrifugare a 6000 g (1 min.)↓Eluire con tampone T.E. o H 2 O <strong>di</strong>stillataprescaldata a 70°C↓Aci<strong>di</strong> nucleiciIl tempo per completare l’estrazione e lapurificazione degli aci<strong>di</strong> nucleici è <strong>di</strong> circa20 minuti.Vantaggi• Estrazioni ottenute in tempi ridotti• Non richiede alta esperienza <strong>di</strong> laboratorio• DNA altamente purificato• Non prevede l’utilizzo <strong>di</strong> solventi organici• Gli inibitori della PCR sono completamenterimossiSvantaggi• Costi alti per campione rispetto alleprocedure tra<strong>di</strong>zionaliCALCOLO DELLA CONCENTRAZIONE DEIACI<strong>DI</strong> <strong>NUCLEICI</strong>Se si utilizza un campione <strong>di</strong> DNA o RNApurificato si puo verificare la purezza e laconcentrazione del campione me<strong>di</strong>ante letturespettrofotometriche (260 nm e 280 nm).Per una soluzione con un A 260 = 1,0 si avrárispettivamente:50 µg/ml per Dna a doppio filamento;37 µg/ml per Dna a singolo filamento;40 µg/ml per Rna a singolo filamento.Il rapporto tra le OD misurate a 260nm e280nm da un in<strong>di</strong>cazione della purezza dell’acidonucleico esaminato. Una soluzione <strong>di</strong>DNA o RNA puro dovrebbe avere un rapportoA 260 /A 280 <strong>di</strong> 1,8 e 2,0 rispettivamente.VERIFICA DELL’IDONEITÀ DEL DNA PERL’AMPLIFICAZIONEPer <strong>di</strong>mostrare l’idoneitá del campione <strong>di</strong>DNA all’amplificazione puó essere amplificatauna sequenza genomica cellulare (β-globina,citocromo B, HLA…)• Dopo la PCR, vengono aggiunti:♦ un colorante (blu <strong>di</strong> bromofenolo) chepermette <strong>di</strong> evidenziare il campione♦una volta caricato nel gelglicerolo che conferisce maggiore densitáal DNA, facilitando la precipitazionesul fondo del pozzetto del gel• L’amplificato cosí preparato viene rilevatome<strong>di</strong>ante elettroforesi su gel <strong>di</strong> agarosio(2%) contenente bromuro <strong>di</strong> eti<strong>di</strong>o, questosi intercala all’ elica <strong>di</strong> DNA e vieneevidenziato alla fine del processo grazieall’esposizione a raggi UV.• Il DNA ha una carica negativa quin<strong>di</strong> migradal polo negativo al positivo mentre ilbromuro <strong>di</strong> eti<strong>di</strong>o ha una carica positiva.• La presenza <strong>di</strong> fattori inibitori (eparina,emoglobina ecc) che non vengono sufficientementerimossi durante la procedura<strong>di</strong> purificazione, possono rendere ilcampione <strong>di</strong> DNA falsamente negativo, inquanto inibiscono l’attività della taqpolimerasi. In questi casi è opportunorichiedere un nuovo campione e/ocontrollare le meto<strong>di</strong>che <strong>di</strong> raccolta e <strong>di</strong>preparazione utilizzate nel laboratorio.3