Rabbia Virus della - Sezione di Microbiologia

Microbiologia UpdateOE VarnierGENERALITÀRhabdo= bastoncino (greco). I rhabdovirus hannoun genoma ad RNA con polarità negativa nonsegmentatosimile a quello dei Paramyxo-virus. Cisono più di 200 rhabdovirus noti, che infettanol’uomo (il virus della rabbia è il più importante), iRHABDOVIRUSFamiglia: Rhabdoviridaemammiferi (cani, gatti volpi, lupi, scoiattoli, neiquali provoca una infezione letale), i pesci, gliinsetti e le piante (elevata versatilità).La famiglia Rhabdoviridae è stata divisa in duegeneri: Lyssavirus e Vesciculovirus:Generi Lyssavirus VesiculovirusSpecie Virus della Rabbia Virus della Stomatite VescicolareSpecie menocomuniVirus di Lagos bat, Mokola, Obodhang,Kotonkan e Duvenhagevirus degli insettiLa rabbia è una malattia antica, la prima dellaquale è stata identificata l’origine infettiva nel1808, dimostrata da Pasteur essere un’eziologiavirale nel 1880 (anche se il concetto di virus èstato definito nel 1898). Per un decennio Pasteurha passato il virus della rabbia serialmente neiconigli ottenendo una preparazione attenuata, cheè stata usata per trattare pazienti morsi da canirabbiosi.CARATTERISTICHE DEL VIRIONEMorfologia. I virioni del virus della rabbia hannodimensioni di circa 180x70 nm con una unacaratteristica forma a bastoncino o a proiettile.Il pericapside ha delle lunghe spine (10 nm) sullasuperficie esterna, costituite dalla proteina G, cheagglutina i globuli rossi e racchiude il nucleocapsideelicoidale, composto da RNA e proteinaM. Due proteine non strutturali, L e NS, sonoassociate al nucleocapside e funzionano in modocomplementare come RNA-polimerasi RNA-dipendenti.Come la maggior parte dei virus conpericapside, i virioni sono relativamente labili.Figura I-1. Immagini schematiche del virus dellarabbia.1

Microbiologia UpdateFigura I-2. Microfotografia (100.000 x) di untipico virione a proiettile dei rabdovirus.Genoma. Il genoma è costituito da un singolofilamento di circa 11kb con una regione leader dicirca 50 nt all’estremità 3’ e una regione "nontradotta"di circa 60 all’estremità 5’ dell’RNAv, cheè a polarità negativa, quindi non è infettivo e nonfunziona da messagero. Come nei Paramyxovirus,c’è un segnale conservato di poliadenilazione allafine di ciascun gene and una breve regioneintergenica tra ciascuno dei 5 geni.Il genoma del virus della rabbia codifica per 5diverse proteine (ciascuna naturalmente innumero di copie diverse) rappresentate rispettivamenteda:• glicoproteina G, che costituisce l’unità basedei peplomeri ed è in grado di agglutinare iglobuli rossi,• proteina N, costituente del capside,• proteine M1 e M2, proteine della matrice,• polimerasi L, (RNA-polimerasi RNA-dipendente)associata al virione,• fosfoproteina NS, associata al nucleocapside.La maggior parte delle conoscenze sono stateottenute da studi fatti sul Virus della StomatiteVescicolare (Vesicular Stomatitis Virus = VSV), cheè molto simile al virus della Rabbia.REPLICAZIONE.La trasmissione varia a seconda del virus/ospite,ma nella maggior parte dei casi avviene percontatto diretto (es. un morso di animale). C’è unlungo periodo di incubazione in vivo, ma questonon correla con la cinetica della replicazione incolture cellulari. Le spine di proteina G si leganoal recettore presente sulla superficie della cellulaospite ed il virus entra nella cellula per endocitosie fusione con le membrane della vescicola (inmodo simile ai Paramyxovirus), mediata dallaproteina G.Il recettore per i Rhabdovirus non è noto, ma siritiene che sia un fosfolipide. La replicazioneavviene nel citoplasma ed entrambe la proteine Le NS, che non sono attive singolarmente, sononecessarie per la trascrizione. Sono trascritti 5OE VarnierRNAm monocistronici, con il capping all’estremità5’ e la poliadenilazione al 3’; ognuno dei qualicontiene la sequenza leader del 3’ dell’RNAvall’estremità 5’. Questi RNAm sono prodottimediante trascrizione sequenziale della ORF delgenoma virale, ma non è noto se sono prodottiindividualmente oppure se sono processati da ununico trascritto. L’RNAv progenie viene prodottoda un intermedio a polarità positiva (+) con unameccanismo non ancora noto. Il genoma vienereplicato dal complesso L+NS con attività polimerasica(come nella trascrizione), con l’interventodi fattori cellulari sconosciuti.È una caratteristica dei Rhabdovirus che questieventi abbiano luogo in aree delimitate delcitoplasma ("fattorie virali"), che sono individuabiliquali corpi d’inclusione citoplasmatici:corpi perinucleari di Negri. I virioni sono assemblatiattorno al core nucleoproteico strettamenteavvolto e gemmano sia dalle membrane citoplasmatichee sia dalla membrana esterna cellulareacquisendo le proteine M e G.Antigeni. Tutte le proteine virali sono dotate dipotere antigene, ma solo gli anticorpi antiglicoproteina G sono in grado di neutralizzarel’infettività dei virioni.Sensibilità agli agenti fisici e chimici. Il virione,come la maggior parte dei virus con pericapside, èrelativamente labile; sopravvive a +4º C persettimane, ma viene inattivato dalla CO2 erapidamente ucciso dalle radiazione ultraviolette,luce del sole, calore, solventi dei lipidi e tripsina.PATOGENESI E PATOLOGIAClinica. La trasmissione del virus dall’animaleinfetto all’uomo è mediata dalla saliva che passaattraverso ferite e abrasioni della cute in seguito amorsi per mezzo dei quali entra direttamente nelcircolo sanguigno. Si sono registrati casi diinfezione dopo trapianto di cornea e di infezioneper via aerea, ad esempio in grotte abitate dapipistrelli, nelle quali sono presenti micro gocce disaliva di questi animali.L’estrema variabilità del periodo di incubazione(da un minimo di 10 giorni ad un massimodi 1 anno con valori medi di 3-8 settimane) èda porre in relazione al sito ed alla dimensionedell’inoculo (es. testa/collo vs mano/piede). Nelleprime tre-quattro settimane dopo l’ingresso delvirus, il soggetto infettato presenta esclusivamentei sintomi correlati alla morsicatura. In questoperiodo il rabdovirus compie la prima replicazionenel tessuto muscolare o connettivo e migra lungole guaine dei nervi periferici verso il SNC. Giuntoin queste regioni il virus si replica e producelesioni gravissime tipiche dell’encefalite rabica,una forma acuta di tale patologia. Il decorso dellamalattia è suddivisibile in quattro fasi:1. fase prodomica;2. fase sensoriale;3. periodo di eccitabilità;4. fase di paralisi.2

Microbiologia UpdateLa prima fase, di durata piuttosto breve (2-4giorni), presenta sintomi quale malessere, anoressia,cefalea, nausea, vomito, faringite e febbre.La seconda fase comporta un’iperestesia sensorialeintorno al sito dell’inoculo.Nella terza fase il paziente può mostrare unprogressivo stato di ansia, nervosismo e apprensione.Contemporaneamente si ha iperattività delsistema ortosimpatico che causa lacrimazione,OE Varniermidriasi pupillare e aumento della salivazione. Ilsoggetto è inoltre affetto da allucinazioni econtratture muscolari spesso provocate da correntid’aria o dalla vista dell’acqua (rispettivamenteaereo e idrofobia). Se il processo è localizzato allalaringe provoca un senso di soffocamento.La quarta fase è caratterizzata da paralisi bulbare:il paziente entra in coma e generalmente muoreper paralisi dei muscoli respiratori.DIAGNOSI DI LABORATORIOLa diagnosi clinica è facilitata dal dato anamnesticodel morso di un animale. La diagnosi puòessere confermata, post mortem, mediante laricerca di antigeni virali nei neuroni dell’ippocampocon reazioni di immunofluorescenza e laricerca dei corpi di Negri.Microscopio. Microscopicamente ci sono 3caratteristiche immagini nella encefalite rabbica,che sono rappresentate nella figura succcessiva:La prima caratteristica (alto a sx) si ritrova intutti i casi di encefalite: infiltrati linfocitari concentratinelle meningi e nel parenchima prossimoai vasi. La seconda caratteristica (alto a dx) é iltipico nodulo gliale, immagine non specificapresente nella maggior parte delle encefaliti. Laterza immagine (basso a sx), che ha significatodiagnostico, é il corpo di Negri, che é unainclusione citoplasmtica eosinofila con un core basofilo.I virioni della rabbia formano degli aggregatidi materiale elettrondenso ai due lati del nucleo diuna cellula di Purkinje (basso a sx).Isolamento. Il virus può essere isolato dalnevrasse o dalla saliva prelevata dal paziente invita. Gli isolati freschi sono chiamati "virusselvaggi (street virus)", hanno periodi variabili diincubazione (da 21 a 60 giorni) e regolarmenteproducono corpi di inclusioni intracitopla-smatici.Il passaggio seriale da cervello a cervello neiconigli seleziona un virus fisso privo di capacitàreplicativa nei tessuti extraneuronali. Questovirus si replica rapidamente in 4-6 giorni. Il viruspuò essere propagato in uova embrionate di polloo di anatra e in numerosi tipi di colture cellulari(cellule diploidi umane: WI38, BHK21, HeLa). Inqueste colture, la sintesi degli antigeni virali puòessere dimostrata mediante immunofluorescenza,mentre non sempre le colture cellulari infettepresentano evidenti lesioni degenerative.Antigeni. Tutte le proteine sono dotate di potereantigene. Le spine purificate inducono anticorpineutralizzanti negli animali. Un antisiero prepa-3

Microbiologia Updaterato contro il nucleocapside purificato vieneimpiegato nelle prove diagnostiche di immunofluorescenza.Sierologia. Anticorpi diretti contro il virus dellarabbia possono essere identificati medianteimmunofluorescenza, fissazione del complementoe prove di neutralizzazione.Osservazione dell’animale. Frequentemente ilproblema diagnostico si pone nei confronti dianimali (cani) che abbiano morso un individuo. Sel’animale sospetto è catturato vivo e non presentasegni morbosi, esso viene tenuto in osservazioneper due settimane. In assenza di sintomi, il2OE Varniersoggetto morsicato non corre alcun rischio, inquanto solo negli ultimi 8-10 giorni del periodo diincubazione il virus viene eliminato con la saliva.Nel caso si manifestino i segni di malattia,l’animale viene sacrificato e si procede alla ricercadegli antigeni virali mediante immunofluorescenzae alla ricerca delle inclusioni specifiche neineuroni dell’ippocampo.EPIDEMIOLOGIAL’uomo è l’ultima fase dell’infezione, mentre gliospiti naturali sono alcuni mammiferi domestici eselvatici, ad esempio cani, gatti, volpi, lupi,scoiattoli, pipistrelli, ecc. Dopo il periodo diincubazione, il virus si ritrova nella saliva, urina,latte, sangue e sistema nervoso. I pipistrelliematofagi (vampiri), che sono assenti nel nostropaese, mentre sono presenti diffusamente in SudAmerica, possono trasmettere il virus per mesisenza sviluppare malattia e probabilmente ancheguarire spontaneamente rimanendo portatoriinfettivi. In questi animali il virus si èpeculiarmente adattato nelle ghiandole salivariLa rabbia ha un andamento endemico che, inrelazione con la densità degli animali portatori, sipresenta con due aspetti epidemiologici:• rabbia urbana: associata al randagismocanino. In Italia è stata eradicata mediante lavaccinazione obbligatoria dei cani introdottanel 1969;• rabbia silvestre: associata agli animaliselvaggi, in particolare alle volpi, è comparsain Italia nel 1977 e sono stati diagnosticati piùdi 2000 casi, ma nessuno nell’uomo.IMMUNITA’La glicoproteina del virus della rabbia induce laproduzione di anticorpi neutralizzanti, che dannoun’immunità protettiva contro l'infezione letale delvirus della rabbia; in ogni modo si è visto cheanche la ribonucleoproteina del virus, compostada RNA genomico e dalle proteine N, NS e L, puòcontribuire ad un’immunità protettiva.Il virus della rabbia durante il periodo diincubazione, è catturato dal sistema immunitariocon meccanismi ancora sconosciuti. Se l’infezio-neè naturale e la malattia è in uno stadio avanzato, ilivelli di anticorpi neutralizzanti nel siero sonobassi ed è per questo motivo che fare una diagnosidi rabbia è difficile. Se un animale sopravviveall’infezione, il titolo anticorpale rimane elevatoper mesi o per anni.Nell’uomo, immunizzato con un vaccino antirabbicotra il settimo e il quattordicesimo giorno,si ha il passaggio dalla risposta IgM a quella IgG,ma siccome il virus diffonde neurologicamente inassenza di viremia, le IgM hanno un valorelimitato. In vivo gli anticorpi neutralizzanti giocanoun ruolo importante per varie ragioni: garantisconoall’ospite protezione immunitaria in caso direinfezioni da parte del virus e favorisconol'eliminazione del virus dal SNC. Questi anticorpisono in grado di ancorarsi al virus espresso sullasuperficie della cellula infetta e dare inizio a una

Microbiologia UpdateOE Varnierlisi mediata dal complemento. La distruzioneprecoce del complesso virus-cellula-infettatadurante la infezione è un meccanismo immunitarioche risulta d’ostacolo alla manifestazioneclinica della rabbia. Se però il numero delle celluleinfettate è elevato, la risposta immunitaria puòaccelerare il decorso della malattia verso un esitonefasto.Profilassi. La rabbia umana è la direttaconseguenza della rabbia animale, per cui ilmiglior modo di prevenirla consiste nel controllodei focolai di rabbia animale, (sia nella sua formaurbana che silvestre). Per quanto riguarda larabbia umana si procede alla vaccinazione obbligatoriadei cani e alla riduzione del randagismo.Prima degli anni ‘20 le uniche contromisureproposte erano guinzaglio e museruola per i canidomestici, che si dimostrarono inapplicabili einadeguate, successivamente si passò ai primitentativi di immunizzazione canina (35 anni dopoil primo vaccino per l’uomo scoperto da Pasteur).La vaccinazione deve essere massiva, ovverointeressare il maggior numero di animali possibile,e continuata nel tempo senza interruzioni generazionali.Per quanto riguarda la rabbia silvestre, i controllisono stati più tardivi e di ardua attuazione.Segnali di disordine, che comportano ad esempiouna crescita della popolazione volpina, sonospesso correlati all’insorgenza di epidemie. Ci sonostati tentativi di riduzione della popolazioneanimale nelle zone endemiche tramite massicciavvelena-menti. L’inefficacia e la difficile attuazionedi questi metodi portarono a studi sullapossibilità di vaccinazione. Le volpi risultaronovaccina-bili per via orale, tramite ad esempioesche contenenti il vaccino.La vaccinazione è obbligatoria per le personeesposte a rischio di contagio, ad esempioveterinari, guardie forestali, ricercatori che lavoranocon il virus. Per il resto della popolazione siprocede in caso di possibile contagio a immunizzazionepassiva.TERAPIANon esiste una efficace terapia farmacologica, cheè solo sintomatica, mentre è utile l’immunizzazionepassiva (post-esposizione), che viene effettuataallo scopo di limitare la gravità della malattiae non ovviamente di prevenire l’infezione. Èpertanto importante che i soggetti a rischio diesposizione ricevano una immunizzazione profilattica,che la natura ed il rischio di qualsiasiesposizione siano attentamente valutate e che gliindividui ricevano una profilassi postesposizionese l’esposizione viene ritenuta a rischio diinfezione. È noto che il virus della rabbia rimanelatente nei tessuti per un certo periodo dopol’introduzione del virus. La rapida somministrazionedi vaccino e antisiero può pertanto impedireal virus di raggiungere il sistema nervoso centrale.L’immunità passiva fornita dall'antisieroprotegge il soggetto per il periodo necessario alvaccino per indurre la produzione di anticorpi.Antisieri:• Imunoglobiline umane anti-rabbia (Rabiesimmune globulin, human - RIG): Preparazione digamma globuline ottenute mediante frazionamentoa freddo con etanolo di plasma di soggettiumani iperimmunizzati. Il titolo di anticorpineutralizzanti è standardizzato a 150 IU/ml. Ladose è di 20 IU/kg, mezza dose viene inocula-taattorno alla ferita da morso e mezza per viaintramuscolare.• Siero anti-rabbico di cavallo (Antirabiesserum, equine - ARS): È un siero concentratoottenuto da cavalli iperimmunizzati. Ha un titolodi anticorpi neutralizzanti di 1.000 IU/ml e ladose è di 40 IU/Kg.Antisiero Preparazione TitoloAnticorpaleSomministrazioneRIGImmunoglobuline umaneanti-rabbiaARSSiero di cavallo antirabbiaGamma globulinepreparate mediantefrazionamento a freddocon etanolo ottenute dasoggetti iperimmunizzatiSiero concentratoottenuto da cavalliiperimmunizzati150 IU/ml 20 IU/ml1000 IU/ml 40 IU/mlsi inietta mezza dose intornoalla ferita e mezza dose per viaintramuscolareVACCINISono disponibili diversi vaccini preparati condiverse modalità di produzione. (Vedi schema)• Human Diploid Cell Vaccine (HDCV): Il virusdella rabbia è stato propagato nella lineacellulare di fibroblasti umana WI38 perottenere una preparazione virale priva dicomponenti del sistema nervoso. La preparazionevirale viene concentrata per ultracentrifugazioneed inattivata con beta propiolattoneed N-butil-fosfato. Induce lievi reazioni locali(eritema, prurito, ecc.) e blande reazioni3

Microbiologia UpdateOE Varniersistemiche (nausea, mialgie, ecc.). Questovaccino viene utilizzato negli USA dal 1979.• Duck embryo vaccine (DEV): Questo vaccinoè stato sviluppato per minimizzare il problemadell’encefalite postvaccinica. Il virus dellarabbia viene propagato in uova embrionate dianatra dopo rimozione della testa per evitarereazione allergiche per la presenza di tessutonervoso. Era scarsamente antigenico ed èstato utilizzato negli Usa nel passato.• Nerve tissue vaccine: Questo vaccino è statoottenuto dal cervello di pecore, montoni o topiinfettati con il virus della rabbia ed è statoutilizzato in Asia, Africa e sud America. Causaencefalite post vaccinica nello 0.05% deivaccinati.• Inattivato: inventato da Pasteur nel 1884 edutilizzato fino al 1950. Il vaccino proposto daSemple, ottenuto da conigli uccisi da virusrabbico "fisso", conteneva fino al 5% di tessutonervoso, inat-tivato con fenolo e al calore, eprovocava gravi reazioni immunitarie neiriceventi, ma salvava le loro vite. Questo tipodi vaccino è stato successivamente prodottofacendo crescere il virus in uova embrionate dianatra. La preparazione era migliore, ma•Vaccino Modalità di produzione Effetticollateralicausava ancora gravi encefaliti in alcunisoggetti. Il vaccino inattivato viene attualmenteprodotto facendo crescere il virus incellule umane diploidi: efficace, sicuro, macostoso, quindi la preparazione ottenuta dauova di anatra viene ancora utilizzata neipaesi in via di sviluppo.• Vivo attenuato. Tale vaccino viene allestinocon varianti attenuate di virus rabbico (ceppoFlury) selezionate mediante passaggi seriali inembrione di pollo. La variante Flury-LEP (LowEgg Passage) è ancora neurotropa e vieneutilizzata per vaccinare gli animali domestici.Viene considerato efficace, ma non sufficientementesicuro per essere utilizzatonell’uomo. La variante Flury-HEP (High EggPassage), priva di neuropatogenicità, puòessere usata nell’uomo senza rischi collaterali.• Ricombinante. Un vaccino ricombinante,recentemente preparato, composto da virusvaccinico/proteina G viene impiegato nellaeradicazione della rabbia nelle volpi inEuropa.ImpiegoNerve TissueVaccineCervello di scimmia, montone otopo, infettati con il virus.Encefalite nello0.05% deivaccinatiAsia, Africa e SudAmericaHDCVHuman diploid cellvaccineIl virus viene propagato infibroblasti umani WI38ottenendo una preparazionepriva di componenti delsistema nervoso. Lapreparazione vieneultracentrifugata ed inattivatacon beta propiolattone e N-butilfosfato.Induce lievireazioni localicome eritemi eprurito e blandereazionisistemiche comenausea omialgie.U.S.A. dal 1979DEVDuck embryovaccineUova embrionate di anitraprivate della testa per evitareallergie al di tessuto nervoso---- Non più usato per lascarsa antigenicità.InattivatoConigli infettati con il virus.Contiene fino al 5% di tessutonervoso. Inattivato con il caloreed il fenolo.Uova di anatraGravi reazioniimmunitarieEncefaliti----Usato dal 1884 al 1950Usato in paesi in via disviluppoPoco usato per l'elevatocostoCellule umane diploidiAttenuato Flury-LEPPassaggi seriali in embrione dipolloNeurotropoAnimali domestici2

Microbiologia UpdateOE Varnier(low egg passage)Flury-HEP(high egg passage)RicombinanteRVARabbid vaccineadsorbedPassaggi seriali in embrione dipolloVirus vaccinico contenente ilgene per la proteina GCellule embrionali diploidi dipolmone di scimmia, inattivatocon betapropiolattone econcentrato con assorbimentoal fosforo di alluminio---- uomo--- volpi---- Usato negli USA dal1988Scelta. Il vaccino HDCV ha la maggiorefficacia e la minore frequenza dicomplicazioni. L’antisiero RIG presenta minoricomplicazioni ed ha una emivita maggiore.Profilassi pre-esposizione. È indicata per lepersone ad alto rischio di contatto con animalirabbiosi. L’obiettivo è di indurre un livelloanticorpale protettivo.Profilassi post-esposizione. Dal 1960 negliUSA sono state trattate circa 20-30.000persone e sono stati riportati 1-5 casi peranno. (tabella).Aggiornato il 14 novembre 20022