Estrazione del DNA II A

L’estrazione delDNAChe cos’èIl DNAProcedimentoChe cos’èL’estrazione

Questa operazione ha lo scopo di demolire le membrane cellulari (in questo casoquelle del kiwi) e quelle del loro nucleo per liberare il DNA. Per effettuarel’estrazione si ha bisogno di queste attrezzature e materiali:-10 ml di detersivo liquido da cucina,-3 g di sale fino da cucina,-100 ml di acqua distillata,-mezzo kiwi,-20 ml di etanolo freddo al 95% (alcol per preparare liquori),-imbuto, frullatore ad immersione o pestello ,- carta da filtro,-2 becher ,-1 cilindro graduato da 100 ml,-3 provette grandi ,- ansa (un filo metallico con una estremità ad occhiello),-coltello.

NomeesperimentoProtocolloFrullato del DNA (estrazione del DNA da kiwi)1) spezzettare mezzo kiwi2) unire nel becher sale, detersivo, ed acqua distillata emescolare bene3) unire il frutto a pezzi4) attendere 10 minuti5) frullare bene per 5 secondi6) filtrare il frullato7) versare 20 ml del filtrato in una provetta8) unire molto lentamente l’alcool etilico facendolo colarelungo la parete del becher finché non appaia il precipitatobianco e filamentoso del DNA9) raccogliere i fili di DNA con un’ansa roteando in un unicosenso

L'acido desossiribonucleico è un acido nucleico che contiene le informazioni genetiche necessariealla biosintesi di RNA e proteine. il DNA è un polimero organico costituito da monomeri chiamatinucleotidi. Tutti i nucleotidi sono costituiti da un gruppo fosfato, il deossiribosio, zucchero pentoso euna base azotata. Le basi azotate sono quattro: adenina, guanina, citosina e timina. Negli eucarioti, ilDNA si trova all'interno del nucleo in strutture chiamate cromosomi. Ogni tipo di base presente su unfilamento forma un legame con la base posta sul filamento opposto. Tale evento è noto comeappaiamento complementare. Le basi puriniche formano legami idrogeno con le basi pirimidiniche: Apuò legare solo T e G può legare solo C. L'associazione di due basi viene comunemente chiamatapaio di basi. Negli eucarioti, il DNA è solitamente presente all'interno di cromosomi lineari. La sommadi tutti i cromosomi di una cellula ne costituisce il genoma; La disposizione finale a cromosomi segueprecise regole gerarchiche di impacchettamento. Nelle cellule, infatti, il doppio filamento di DNA nonpuò essere disposto a casaccio, ma deve seguire precise regole di ordinamento Nella maggior partedelle cellule batteriche il DNA è disposto su un unico cromosoma circolare, come previsto danumerosi esperimenti di linkage ed infine evidenziato in cellule cresciute con timina marcata contritio. Negli eucarioti l'impacchettamento è ottenuto attraverso diversi accorgimenti. Il DNA èassociato ad un gran numero di proteine: l'associazione complessiva DNA-proteine è definitacromatina, la cui struttura è ampiamente conservata tra tutti gli organismi eucarioti.

L'acido ribonucleico (RNA o ARN) è un polimero organico, risultante dallapolimerizzazione di ribonucleotidi.Chimicamente l'RNA è molto simile al DNA. Anch'esso è una catenapolinucleotidica contenente quattro nucleotidi diversi. Le molecole di RNAdifferiscono da quelle di DNA perché:contengono lo zucchero ribosioBasi Azotate sono:Uracile,Guanina,Adenina,CitosinaL’RNA possiede una struttura semplice a elica singola.Vi sono tre tipi di RNA comuni a tutti gli organismi cellulari:mRNA (messaggero) che contiene l'informazione per la sintesi delle proteine;rRNA (RNA ribosomiale), che entra nella struttura dei ribosomi;tRNA (RNA transfer) necessario per la traduzione nei ribosomi.Negli eucarioti abbiamo anche:hnRNA (RNA eterogeneo nucleare) tipo di molecole di cui fa parte il pre-mRNA;snRNA (piccolo RNA nucleare) necessario per la maturazione dell'HnRna.Sull' mRNA viene trascritta l'informazione genetica che poi verra utilizzata persvariati usi.

TiminaLa timina è una delle due basi azotate pirimidiniche che formano inucleotidi dell'acido nucleico DNA. Tramite due legami a idrogeno, nel DNAsi lega all'adenina (A).Legata al desossiribosio, forma la timidina. La timidina può legare a sé finoa tre gruppi fosfato per dare la timidina mono-, di- o trifosfato.

GuaninaLa guanina è una delle due basi azotate puriniche che formano inucleotidi degli acidi nucleici DNA e RNA. Tramite tre legami aidrogeno, nel DNA e nell'RNA si lega alla citosina (C).Legata al ribosio forma la guanosinaL'etimo del termine (e la fonte da cui originariamente veniva estratta) èil guano.

CitosinaLa citosina è una delle tre basi azotate pirimidiniche che formano i nucleotidi degli acidinucleici DNA e RNA. Tramite tre legami a idrogeno, nel DNA e nell'RNA si lega allaguanina.Legata al ribosio forma la citidina.La citosina fu scoperta nel 1894, quando venne isolata dai tessuti del timo dei vitelli. Lasua struttura fu ipotizzata nel 1903 e confermata per sintesi lo stesso anno.Oltre al suo ruolo negli acidi nucleici, la citidin trifosfato (CTP) è un co-fattore di alcunienzimi e può trasferire un'unità fosfato per trasformare l'ADP (adenosin difosfato) in ATP.Non è una molecola indefinitamente stabile. Può subire una spontanea perdita del gruppoamminico e trasformarsi in uracile.Nei batteriofaghi T2 e T4 la citosina è sostituita dalla idrossimetilcitosina (HMC).La deaminazione della citosina, forma uracile: questa mutazione, che avvienespontaneamente, può essere facilmente riconosciuta e riparata dal miss match repaircomplex. Questo fatto è uno dei motivi principali per cui nel DNA al posto dell' uracile c'èla timina.

UracileL'uracile è una delle due basi azotate pirimidiniche che formano i nucleotidi dell'acidonucleico RNA. Tramite due legami a idrogeno, nell'RNA si lega all'adenina (A). Legata auna molecola di ribosio, forma l'Uridina. Come tale, l'uridina non ha quasi nessuncoinvolgimento metabolico. Deve essere prima convertita nella sua forma fosforilatacompleta (UTP) e da qui prendere diverse vie metaboliche:incorporazione nella struttura nell'RNA per azione della RNA polimerasi II;essere convertita a derivati glucidici come l'UDP-glucosio e l'UDP-galattosio, cheintervengono nei fenomeni di costruzione delle strutture polisaccaridiche cellulari(zuccheri complessi con funzione strutturale)ritornare a derivato monofosfato (UMP), che per azione della timidilato sintetasi vieneconvertita a timidina monofosfato (TMP) e così passare alla forma desossi-trifosfata,pronta per entrare nella struttura del DNA.Quest'ultimo passaggio è stato sfruttato ampiamente nella chemioterapia antitumoralecol farmaco 5-fluoro-uracile (5FU), inibitore suicida ed irreversibile della timidilatosintetasi. Ha trovato infatti ampio uso nella terapia del carcinoma mammario, di quello delcolon, nel tumore epatico ed altri tipi. Oggi si preferiscono dei suoi derivati più efficaci(Fluoro-desossiuridina e Tegafur), che hanno un profilo di farmacocinetica e tossicitàmigliori.

AdeninaL'adenina è una delle due basi azotate puriniche che formano i nucleotididegli acidi nucleici DNA e RNA. Tramite due legami a idrogeno moltofragili, nel DNA si lega alla timina (T) e nell'RNA si lega all'uracile (U).Legata al ribosio forma l'adenosina la quale, per addizione di tre gruppifosfato forma l'adenosin-trifosfato, più noto come ATP, composto base peril trasferimento di energia chimica tra le reazioni che compongono ilmetabolismo della cellula.Nella letteratura meno recente, l'adenina è anche chiamata vitamina B 4.Oggi non viene più considerata una vitamina.

La cellula eucariote è più grande e complessa rispetto a quella procariote, si trovanei protisti,negli animali,nelle piante e nei funghi. La membrana ha la funzione diregolare lo scambio dei materiali tra i due ambienti ed è costituita da un doppiostrato di fosfolipidi nel quale sono inseriti diversi tipi di proteine. La parete dellecellule vegetali svolge il ruolo di protezione e di sostegno. Nella cellula eucariote,sotto alla membrana si trova il citoplasma, una massa gelatinosa composta daacqua nella quale sono disciolte molte sostanze. Esso è percorso da un sistema dimembrane simili a quell’esterna: il reticolo endoplasmatico. Esso delimita spazi alcui interno avvengono reazioni tra sostanze e vengono depositati materialinecessari all’attività della cellula. Si riconoscono due tipi di reticolo:il reticoloendoplasmatico ruvido e il reticolo endoplasmatico liscio; il primo è punteggiato daribosomi, il secondo ne è privo. Nella cellula eucariote, come in quella procariote, iribosomi sono la sede della sintesi proteica.La cellula eucariote contiene altrestrutture, gli organuli , i mitocondri grazie ai quali la cellula respira, I cloroplasti,che si trovano solo ed esclusivamente nelle parti verdi delle piante e sono la sededella fotosintesi. In essi oltre alla doppia membrana che li riveste esternamente, c’èuna membrana interna ripiegata in modo da costituire degli strati impilati gli unisugli altri. I cloroplasti sono il luogo in cui viene prodotto glucosio nel quale vieneaccumulata l’energia catturata dal sole. Mentre nei mitocondri con la respirazionecellulare l’ossigeno viene consumato, nei cloroplasti con la fotosintesi l’ossigenoviene liberato.

Le cellule procariote (pro:prima e kàryon:nucleo) sono cellule prive diun nucleo ben definito e delimitate dalla membrana cellulare, le cellule procarioterispetto a quelle eucariote non possiedono organuli e hanno una struttura internamolto semplice. Non avendo il nucleo il loro DNA è sparso nel citoplasma, in unaparticolare zona detta nucleoide. Le loro dimensioni sono dell'ordine dipochi micron, ma possono variare dai circa 0,2 µm dei micoplasmi ai 30 µm dialcunespirochete e oltre.l genoma cellulare è più semplice di quello delle cellule eucarioteed è costituitoda una sola molecola circolare di DNA, a cui si aggiungono eventuali repliconiautonomi. È assente la membrana nucleare.Il citoplasma delle cellule procariote contiene:il DNAi ribosomi 70 S, che sintetizzano le proteinePuò essere composta da una sostanza caratteristicadenominatapeptidoglicano. Esternamente alla parete cellulare ci può essereuno strato più spesso e meno rigido, detto capsula.Esempi di organismi formati da cellule procariote (tutti unicellulari) sono:i batteri, le alghe azzurre (chiamate anche cianoficee o alghe verdi-azzurreo cianobatteri) e gli archeobatteri.

Oggigiorno le carte da filtro di alta qualità sono essenziali per il lavoroquotidiano in laboratorio e nell’industria. Le carte da filtro sono deicosiddetti filtri di profondità. La loro efficacia è influenzata da un complessodi parametri: ritenzione meccanica delle particelle, caratteristiche diadsorbimento, valore di pH, qualità della superficie, spessore e resistenzadella carta da filtro, nonché forma, densità e quantità delle particelle chedevono essere trattenute . Ci sono diverse carte da filtro tra cui:– Carte da filtro quantitative, qualitative e tecnico-qualitative– Carta da filtro e cartoni tecnici– Ditali da estrazione– Carte per blotting e cromatografia– Filtri in microfibra di vetro e quarzo– E molti altri gradi di carta per applicazionispecifiche.

La cromatina rappresenta la forma in cui gli acidi nucleici si trovanonel nucleo di una cellula eucariote. Tramite un microscopio ottico, le fibredi cromatina sono distinguibili grazie alla loro condensazione durante ladivisione cellulare. Durante l'interfase, la cromatina è più espansa: questaconfigurazione è necessaria perché l'informazione genetica possaesprimersi.Si distinguono due tipi di cromatina:eucromatina: meno condensata e corrisponde a zone in cui vi èun'intensa attività di trascrizione per la sintesi proteica ;eterocromatina è la componente più condensata, costituisce circa il 10%del genoma e non sembra presentare attività di trascrizione. Sidistinguono due tipi di eterocromatina: l'eterocromatina costitutiva, cherimane tale durante tutto lo sviluppo, ed è presente in posizione identicasu entrambi i cromosomi omologhi di un paio, e l'eterocromatinafacoltativa, che varia di condizione (rilassata ed espressa/condensata einattiva) a seconda dei diversi tipi cellulari (es: inattivazione cromosomaX per la formazione del corpo di Barr) e delle diverse fasi dello sviluppo.

Il nucleo è un grosso corpuscolo, il più delle volte sferico, circondato da unamembrana nucleare costituita a sua volta da due membrane nucleari fuseinsieme in diversi punti in modo da creare pori nucleari, attraverso i quali puòavvenire il passaggio di sostanze tra citoplasma e nucleo. All’interno diquest’ultimo si può individuare una regione, detta nucleolo in cui vengonoassemblati i ribosomi. Il nucleo ,inoltre,ha varie funzioni : la prima ,secondoHertwig, è quella di trasmettere informazioni ereditarie. L’altra,secondoHammerling, è quella di controllare le attività che si svolgono nel citoplasma.

Il citoplasmaIl citoplasma è una matrice acquosa colloidale (detta più propriamente citosol)che contiene gli organuli e alcuni sistemi di membrane; è presente sia nellecellule eucariote sia in quelle procariote. Il citoplasma occupa circa la metà delvolume totale della cellula e vi si trovano disperse tutte le sostanze chimichevitali tra cui sali, ioni, zuccheri, una grande quantità di enzimi e proteine e lamaggior parte dell'RNA. Il liquido costituisce circa il 75-85 per cento dellesostanze contenute nel citoplasma, ed è formato inoltre da sali minerali,sostanze organiche e inorganiche. La matrice citoplasmatica può esseredefinita plasmagel o plasmasol a seconda dello stato di aggregazione delleproteine. Nelle cellule eucariote, il citoplasma contiene un'intelaiatura formatada una complessa rete di filamenti costituiti da proteine fibrose e/o globulariche costituiscono il citoscheletro. Il citoscheletro conferisce alla cellula la suaforma caratteristica, rende possibili gli spostamenti degli organuli cellulari ecoordina funzioni biologiche fondamentali.

Gli acidi nucleici sono acidi presenti nel nucleo della cellula. Sono deputatialla conservazione e trasmissione dell'informazione biologica negli esseriviventi. Gli acidi nucleici sono costituiti da lunghe catene di nucleotidi. Questia loro volta sono formati da tre parti: un gruppo fosfato ,un pentoso e unabase azotata. Il gruppo fosfato è la parte del nucleotide che possiedeproprietà acide , da qui il termine “acido nucleico”. Negli organismi viventi cisono due tipi di acidi nucleici: RNA e DNA , di cui abbiamo già parlato.

Realizzato dagli alunni della II AScientifico• Moggio Luca• Gennarelli Caterina• Ponticelli Giovanna