universita - Clinica pediatrica - Università degli Studi di Trieste

• allungamento finale - 72°C per 10'
Controllare l’amplificato su gel di agarosio 2% in tampone TBE 1X.
b) PURIFICAZIONE DELLA PRE-PCR DI SEQUENZA
• pre-PCR di sequenza (80-100 ng di DNA)
• mix di purificazione 2,5 µl
• H2O bidistillata sterile a 5 µl
Mix di purificazione:
• 0,05 μl di ExoI (20 U/μl)
• 0,2 μl SAP (1 U/μl)
• 0,4 μl Buffer PCR 10X (con MgCl2)
• 1 μl MgCl2 25 mM
Programma:
• 1h a 37°C
• 20' a 80°C (inattivazione enzima)
c) PCR DI SEQUENZA
• BIG DYE TERMINATOR Buffer 1X
• primer 0,32 µM
• BIG DYE TERMINATOR RR PREMIX
• pre-PCR di sequenza purificata
• Taq DNA polimerasi 0,025 U/µl
• H2O bidistillata sterile a 10 µl
Condizioni di amplificazione:
denaturazione lunga - 96°C per 1'
25 cicli:
• denaturazione breve - 96°C per 30''
• appaiamento - 50°C per 15''
• allungamento - 60°C per 4’
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