universita - Clinica pediatrica - Università degli Studi di Trieste

3° Giorno
1. Raccogliere il 1° output in 1 ml di 2xYT. Aggiungere glicerolo sterile fino alla
concentrazione max 20%. Conservare a -80°C.
2. Ripetere i passaggi del 1° Giorno partendo da un inoculo del 1° output.
COATING: saturare un immunotubo con l’antigene (htTG) 10 µg/ml diluito in 500 μl - 1
ml di PBS 1X e lasciare O/N a 4°C.
4° Giorno
Procedere come il 2° Giorno ma aumentando la stringenza:
1. Incubare in rotazione per 30' e fermo 1h 30' a T ambiente.
2. Svuotare l’immunotubo e fare 10 lavaggi con PBS 1X - Tween 0.1% e 10 con PBS
1X.
3. Aggiungere 2 ml di PBS 1X - Tween 0.1% e lasciare in rotazione per 30' a T
ambiente.
4. Svuotare l’immunotubo e fare 5 lavaggi con PBS 1X - Tween 0.1% e 5 con PBS
1X.
5. Svuotare l’immunotubo e mettere 500 µl - 1 ml di DH5αF' a DO600 = 0.5.
6. Lasciare infettare per 45' a 37°C.
7. Piastrare su piastre 2xYT + Amp 1% + glucosio 1%: 200 μl di DH5αF' per
controllare l’assenza di contaminazioni; 500 µl - 1 ml delle cellule DH5αF'
infettate coi fagi (2° output); una diluizione per calcolare la titolazione della 2°
selezione.
8. Far crescere le piastre O/N a 37°C.
5° Giorno
1. Preparare una master plate in una piastra da microtitolazione da 96 pozzetti
mettendo in ciascuno 120 µl di 2xYT + Amp 1% + glucosio 1% + 1 colonia
piccata dalla piastra della 2° selezione.
2. Far crescere in agitazione a 37°C.
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