universita - Clinica pediatrica - Università degli Studi di Trieste

6.7 TEST D’INIBIZIONE PER LA VERIFICA DEL RUOLO DELLA
GELSOLINA SIERICA
La verifica del ruolo dei fattori sierici leganti l’Actina (Actin Binding Protein), che la
sequestrano il legame con anticorpi specifici, inducendo risultati falsamente negativi è
stata condotta con due diversi approcci secondo i seguenti protocolli:
Prima prova: Ipotizzando che i fattori depolimerizzanti l’Actina, contenuti in un pool di
sieri di controlli sani, mascherino il sito di legame degli AAA utilizzando gli stessi epitopi
di questi anticorpi lungo il microfilamento di Actina, ci si attende che, preincubando le
cellule con un pool di sieri negativi, la positività dei campioni che contengono gli AAA
venga meno al test ad immunofluerescenza indiretta.Per testare questa ipotesi, il protocollo
seguito è stato:
1. Incubare 500 µl di un pool di 8 sieri di donatori sani, negativi agli AAA, e
contenente un’uniforme concentrazione di Gelsolina con un’ anticorpo monclonale
anti-Gelsolina (Sigma G4896) a concentrazioni crescenti (1:40, 1:20, 1:10, 1:5) a
RT per 60 minuti in agitazione
2. Testare il pool su una linea cellulare di Hep 2b attivata (vedi primo protocollo)
3. Lavare 3 volte con PBS e 3 con PBST
4. Incubare per altri 60 minuti con sieri di pazienti celiaci francamente positivi agli
AAA
5. Lavare 3 volte con PBS e 3 con PBST
6. Incubare con un anticorpo secondario anti-Human IgA FITC .(Jakson
immunoresearch) diluito 1:100
7. . Lavare 3 volte con PBS e 3 con PBST
8. Osservare al microscopio ad immunofluorescenza ad un ingrandimento pari a 40x.
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