universita - Clinica pediatrica - Università degli Studi di Trieste

9. Incubare con l’ anticorpo secondario anti-IgA Human (Jakson Immunoresearch)
diluito 1:100 in PBS Tween 0,05% per 40 minuti a temperatura ambiente e al buio.
10. Lavare nuovamente di PBS Tween 0,05% in agitazione al fine di
11. Asciugare e ricoprire il vetrino con glicerolo (50% in PBS) e proteggerlo con
coprioggetto.
12. Osservare al microscopio ad immunofluorescenza ad un ingrandimento pari a 40x.
6.2.2 ALLESTIMENTO DI VETRINI ATTIVATI CON CELLULE HEP-2b
1. Aggiungere ad ogni pozzetto Colchicina 0,1 mM in soluzione fisiologica per poter
rendere più evidenti i filamenti di Actina e incubare per due ore a temperatura
ambiente.
2. Lavare le cellule per due volte con PBS
3. Aggiungerei Paraformaldeide al 4% incubare per 15 minuti a temperatura
ambiente. al fine di fissare le cellule al vetrino.
4. Effettuare due lavaggi PBS e incubare con Triton X 100, 0,5% a temperatura
ambiente. Tramite questa procedura, la membrana plasmatica diviene permeabile
agli eventuali anticorpi presenti nel siero.
5. Eseguire tre lavaggi con PBS e quindi addizionare 120 μl di siero (diluito e trattato
con le tre diverse metodiche) ad ogni pozzetto e incubare per 35 minuti a
temperatura ambiente.
6. Effettuare altri tre lavaggi con di PBS -Tween 0,05% in agitazione per circa 5
minuti.
7. Incubare con l’ anticorpo secondario anti-IgA Human (Jakson Immunoresearch)
diluito 1:100 in PBS Tween 0,05% per 40 minuti a temperatura ambiente e al buio.
8. Lavare nuovamente di PBS Tween 0,05% in agitazione al fine di eliminare
l’anticorpo secondario in eccesso .
9. Ricoprire il vetrino con glicerolo (50% in PBS) e proteggerlo con vetrino
coprioggetto.
10. Osservare al microscopio ad immunofluorescenza ad un ingrandimento pari a 40x.
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