universita - Clinica pediatrica - Università degli Studi di Trieste

6.2 LA CULTURA DELLE CELLULE HEP-2b
1. Coltivare le cellule Hep-2b in flask da 25 ml, incubate a 37°C, al 5% di CO2, in
liquido di cultura DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium) addizionato con
glucosio (4500 mg/l), 1% di glutammina, 1% di antibiotici (penicillina e
streptomicina) e 10% di FBS (Fetal Bovine Serum).
2. Al raggiungimento di una confluenza di circa 80%, staccare le cellule dalla flask
mediante incubazione breve con 1ml di Tripsina allo 0,25%.
3. Lavare le cellule per 2 volte in PBS ( Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline), per
rimuovere proteine eventualmente presente provenienti dal terreno
4. Portare le cellule ad una concentrazione di 10 6 /ml.
5. Distribuire 40 μl di questa soluzione madre negli otto pozzetti, forniti di pareti di
separazione (Lab-Tek chamber slide 177402 Nalge Nunc International).
6. Incubare i vetrini a 37°C, al 5% di CO2 per 48 ore fino al raggiungimento della
confluenza di circa il 50% - 80% in ogni pozzetto.
6.2.1 IMMUNOFLUORESCENZA SU CELLULE HEP 2b IN CULTURA
1. Aggiungere ad ogni pozzetto Colchicina 0,1 mM in soluzione fisiologica per poter
rendere più evidenti i filamenti di Actina e incubare per due ore a temperatura
ambiente.
2. Lavare le cellule per due volte con PBS
3. Fissare le cellule con Paraformaldeide al 4% incubare per 15 minuti RT
4. Lavare 2 volte con PBS e
5. Permeabilizzare le cellule incubando per 15 minuti con Triton X 100 0,5%-PBS a
RT.
6. .Eseguire tre lavaggi con PBS
7. Addizionare 120 μl di siero (diluito e trattato con le tre diverse metodiche) ad ogni
pozzetto e incubare per 35 minuti a RT.
8. Effettuare altri tre lavaggi con di PBS -Tween 0,05% in agitazione per circa 5
minuti.
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