1. CITOCHIMICA ENZIMATICA - CusMiBio
1. CITOCHIMICA ENZIMATICA - CusMiBio
1. CITOCHIMICA ENZIMATICA - CusMiBio
- No tags were found...
Create successful ePaper yourself
Turn your PDF publications into a flip-book with our unique Google optimized e-Paper software.
<strong>CITOCHIMICA</strong> <strong>ENZIMATICA</strong>Queste reazioni prevedono l’incubazione di cellule o tessuti in una soluzione contenente:<strong>1.</strong> il substrato specifico per il sistema enzimatico oggetto di studio;2. un tampone in grado di mantenere il pH ottimale per il sistema enzimatico;3. qualsiasi cofattore necessario all’enzima;4. una molecola in grado di rendere il complesso enzima-substrato insolubile e colorato(“catturante o cromogeno”) in modo che sia visibile, al microscopio, nella sede specifica in cuisi trova in natura.
XSECELLULAIEPRXE+XCROMOGENOEECONTROLLI<strong>1.</strong> omissione2. inibitorePRODOTTO DIREAZIONE- COLORATO(=visibile)- INSOLUBILE- “in situ”
Istochimica enzimatica per localizzarel’ enzima Fosfatasi alcalina (FA)Sono fosfomonoesterasi che catalizzano l’idrolisi di esteridell’acido ortofosforico con attività ottimale a pH basicoOFAOR-O-P-O-H+ HOHR.OH +HO-P-O-HOHOHSi trovano in membrane cellulari implicate in processi attivi di trasporto
Nell’intestino tenue la Fosfatasi alcalina è nella membranaapicale delle cellule epiteliali, a livello dei microvilli
REAGENTI reazione istochimica per FOSFATASI ALCALINACampioni = sezioni in paraffinaSOLUZIONE TAMPONE = Tris-HCl 0,1 M pH 9,2-9,4MEZZO DI INCUBAZIONEANaftil fosfato di sodio = substratoFast Blue B = catturanteBNaftolo AS MX fosfato = substratoFast Red = catturanteN-N dimetilformamide = solvente del naftoloMEZZO DI MONTAGGIO = PBS/Glicerolo 1:3PREPARATO NON PERMANENTE
Protocollo reazione istochimica per FOSFATASI ALCALINA1 Delimitare sezioni con matita vetrografica2Sparaffinare le sezioni e portarle all’acqua distillata con lascala discendente degli alcoli34Lavaggio in tampone Tris-HCl 0,1 M pH 9,2-9,4 per 5 minutiIncubazione nel mezzo di incubazione A o B,preparato immediatamente prima dell’uso, per3-15 minuti al buio e a temperatura ambiente,in camera umida5Lavaggio in acqua distillata emontaggio delle sezioni in PBS/glicerolo 1:3
MEZZO DI INCUBAZIONE A(-> PRODOTTO DI REAZIONE NERO)• Naftil fosfato di sodio: 1mg/ml in Tris-HCl 0,1 M, pH 9,2-9,4• Fast Blue B : 1 mg/ml in Tris-HCl 0,1 M, pH 9,2-9,4MEZZO DI INCUBAZIONE B(-> PRODOTTO DI REAZIONE ROSSO e fluorescente)• Naftolo AS MX fosfato: 0,5 mg/ml in Tris-HCl 0,1 M, pH 9,2-9,4• Fast Red : 1 mg/ml in Tris-HCl 0,1 M, pH 9,2-9,4• N-N dimetilformamide 0,05 ml
CONTROLLISono possibili due tipi di controlli:<strong>1.</strong> omettere il substrato nel mezzo di incubazione(es. incubazione in solo Fast Blue B)2. inibire preventivamente l’attività enzimatica mediantepreincubazione della sezione di controllo in un INIBITORESPECIFICO (L-fenilalanina 0,05M in tampone Tris-HCl 0,1M, pH 9,2-9,4 per 10 minuti)
RISULTATI ATTESICromogeno = FAST BLU
RISULTATI ATTESICromogeno = FAST RED
APPLICAZIONI DELLA<strong>CITOCHIMICA</strong><strong>ENZIMATICA</strong>
MuscoloagoBIOPSIA MUSCOLARE
GHIANDOLA MAMMARIAENDOMETRIOTONSILLAPROSTATACOLONLINFONODO