VIROLOGIA: MORFOLOGIA - Sezione di Microbiologia

Microbiology UpdateOE VarnierVIROLOGIA: MORFOLOGIANel 1955, Conrat e Williams hanno fatto una sorprendentescoperta dimostrando che il virus del mosaico deltabacco (TMV) si formava spontaneamente a partire dauna miscela di RNA genomico e proteine dirivestimento purificate. Infatti la struttura del TMV èautoregolata e corrisponde ad un minimo di energialibera. Nonostante la grande variabilità che caratterizzale proprietà dei virus, a livello strutturale ci si basa supochi ed essenziali disegni.Metodi di AnalisiIl microscopio elettronico è stato utilizzato per ottenereinformazioni a bassa risoluzione sulla struttura deivirus. Il termine "risoluzione" usato in questo contesto,sta ad indicare la dimensione di una unità strutturaleche può essere vista chiaramente. Con il microscopioelettronico il livello di risoluzione è 5 nm (1 nm=10 -9metri). Ad esempio: un atomo ha un diametro di circa 0.2-0.3 nm un ripiegamento ad alfa-elica di una proteina ha undiametro di circa 1 nm il DNA ha un diametro di circa 2 nmIl microscopio elettronico può dare informazioniriguardanti la forma complessiva di un virus. Per larisoluzione di strutture atomiche dettagliate, la solatecnica idonea è la cristallografia a raggi X, che richiedeche il virus sia stato cristallizzato. Nella maggior partedei casi ciò è possibile; la prima cristallizzazione di unvirus è stata eseguita nel 1930. In quel periodo non siera capito che questo significava che i virus avevanouna strut-tura definita (geometrica) e neppure che lastrut-tura potesse essere identificata dal tipo didiffrazione. Fred Sanger ha determinato la primasequenza amino-acidica di una proteina, l’insulina, nel1950, e John Kendrew ha descritto la prima strutturacristallizzata di una proteina, la mioglobina, agli inizi del1960. La prima risoluzione della struttura atomica di unvirus è stata fatta solo nel 1978. Da allora sono statedeterminate molte strutture virali e nuove risoluzionisono frequen-temente descritte nelle riviste scientifiche.In alcuni casi le strutture sono determinate studiandovirus cristal-lizzati, in altri questo approccio diretto nonè possibile. In questi casi, l’analisi biochimica puòessere usata per determinare la presenza e la quantitàdei componenti virali, che sono quindi cristallizzati peridentificare le loro strutture. Il clonaggio genico e letecniche di sequenziamento facilitano l’isolamento di ungran numero di proteine e acidi nucleici. La strutturaglobale è dedotta dalla "costruzione" del virus conqueste subunità strutturali, prendendo in considerazionel’informazione ottenute con la microscopiaelettronica.Tipi di Strutture ViraliIl microscopio elettronico suggerisce che molti virussono sferici. Un virus piccolo (parvovirus) ha undiametro di circa 25 nm; un virus grande (poxvirus) haun diametro superiore ai 300 nm. Molti virus sonorivestiti, alcuni sono approssimativamente sferici ehanno una simmetria icosaedrica (HIV-1) ed altri sonofilamentosi (virus della rabbia).Il virus HIV contiene 2 copie identiche di un singolofilamento di RNA di senso positivo (come un RNAmessaggero) lungo circa 9500 nucleotidi. Questo RNAgenomico è associato con una proteina basica delnucleocapside. Le proteine del nucleocapside sono1solitamente proteine basiche (caricate positivamente)che possono diventare neutre e facilitarel’impaccamento dell’acido nucleico acido negativo(Figura 1). Questo filamento di nucleoproteina potrebbeessere avvolto ad elica. Il filamento di nucleoproteina èavvolto da uno strato di capside costituito da copiemultiple della proteina del capside. Lo strato delcapside potrebbe avere una struttura icosaedrica; essoè rivestito da uno strato di proteine della matrice (anchequesto potrebbe mostrare una simmetria icosaedrica).Queste proteine della matrice sono asso-ciate con undoppio strato o rivestimento lipidico. Il pericapsidedell’HIV deriva dalla membrana plasmatica della cellulae si origina quando il virus gemma attraverso lamembrana cellulare. Esso contiene i costituenti lipidici eproteici della membrana plasmatica della cellula dallaquale deriva. Inoltre esso contiene anche proteine viraliche formano i peplomeri. Le proteine maggiori dell’HIVassociate con il rivesti-mento sono gp120 e gp41. Laloro funzione è quella di antirecettore virale o proteinadi attacco. gp 41 attraversa il rivestimento, gp 120 èpresente sul lato esterno ed è legata a gp 41.Figura 1. HIV: un tipico virus con pericapsidePrecisazioniIl pericapside è una struttura comune nei virus animali,ma insolita nei virus delle piante. In altri virus ilpericapside deriva dalla membrana nucleare o dallamembrana dell’apparato di Golgi. Una dettagliataanalisi dei virus sferici mostra che spesso essi hannouna simmetria icosaedrica o basata sull’icosaedro. Ivirus icosaedrici sono molto comuni tra i virus dellepiante e degli animali. Alcuni virus icosaedrici (quelli deiPico-rnaviridae) non sono rivestiti e non hanno unostrato di proteine della matrice. Il pericapside èall’esterno dello strato proteico del virus.Le subunità del capside sono collocate intorno ai verticio facce dell’icosaedro. Un icosaedro ha 20 triangoliequilateri sistemati intorno alle facce della sfera. Sonostate definite così, tre possibili assi di simmetria: assedi simmetria 2, ossia con due possibili posizioni simmetricheintorno ad esso, è quello che passa per ilcentro degli spigoli; asse di simmetria 3, passanteattraverso il centro delle facce; asse di simmetria 5,passante attraverso i vertici. In tal modo la simmetriadell'icosaedro è stata chiamata di tipo 3; 5; 2 osimmetria "cubica". Sembra che non esistano virus con20 subunità (FX174). In generale, la maggior parte deivirus adatta 60xN subunità nel loro capside. N è a voltechiamato "numero di triangolazione" ed è stato valutato

Microbiology Updatecome 1,3,4,7,9,12 e più. Un virus icosaedrico checontiene 60 subunità ha una simmetria perfetta.Tuttavia, geometricamente non è possibile sistemarepiù di 60 subunità in maniera equivalente intorno all’icosaedro;le subunità invece possono essere sistemate inmaniera quasi equivalente. Per illustrare ciò, consideriamoun frammento con 180 subunità. Le subunitàproteiche non sono separate indipendente-mente maper gruppo, perchè questo rende massime le interazionimolecolari che stabilizzano il frammento. Sono possibili3 tipi di raggruppamento (Figura 3).Figura 2. Il capside icosaedrico in maggior dettaglioOE Varnierconseguenza di questo raggrup-pamento è che i legamitra le subunità in un capsomero sono più forti che ilegami tra i capsomeri e ciò significa che possonoessere isolati per studi funzionali e strutturali.Il virus del bacello chiazzato del fagiolo (BMPV) ha 60copie di due proteine di rivestimento. La subunità S conpeso molecolare 22 Kda e la subunità L con pesomolecolare 42 Kda. Le subunità S e L sono dellepoliproteine, C-B-A. A è tagliata via per dare origine allasubunità S e ha un dominio b-barrel. Rimane quindi C-B, la subunità L, che ha 2 domini b-barrel. In totalequindi, ci sono 120 subunità ma 180 domini barrel. Ognidominio è lungo 180-190 aminoacidi. La struttura dellesub-unità è stata determi-nata mediante cristal-lografia.B e C sono legate covalentemente e la loro inter-facciaè stabilizzata da interazioni idrofobiche. L’elica dellasubunità S e del dominio A interagisce con un’elicadella subunità larga del dominio B. L’insieme dellesubunità S e L formano un cuneo lungo 5 nm: 1.7 nmnella estremità stretta e 3 nm nella estremità larga. Neldiagramma la subunità larga è colorata in duesfumature di verde, la subunità piccola è blu. Lastruttura quaternaria è quasi sferica con simmetriaicosaedrica.Virus filamentosiL’esame in microscopia elettronica ha dimostratol’esistenza di molti virus dalla forma a bastoncino, comead esempio i virus filamentosi larghi circa 80 nm elunghi circa 14000 nm. Anche molti virus delle piantesono filamentosi.Figura 4. Struttura molecolare di un capsideicosaedrico-struttura del virus del bacello chiazzato difagiolo (BPMV).Figura 3. Tipi di capside virale.Nel poliovirus si raggruppano al centro del triangolodando origine a 60 strutture morfologiche o capsomericomposti di trimeri. Nel Virus Turnip Crinkle, siraggruppano al centro dei margini dando origine a 90capsomeri composti di dimeri. Nel virus del mosaicogiallo Turnip si raggruppano al vertice dei triangoli chedanno 20 esomeri e 12 pentameri e 32 capsomeri. UnaLa loro esatta lunghezza dipende spesso dallalunghezza del genoma, comunque generalmente è dicirca 300-500 nm; il loro diametro è usualmente di 15-20 nm. Il virus del mosaico del tabacco (TMV)rappresenta l’esempio meglio conosciuto di questo tipodi virus (Figura 5).Le subunità della proteina possono essere situateattorno alla circonferenza di un cerchio per formare undisco. All'interno del disco è possibile rilevare lapresenza di una cavità tubulare al cui centro vi è l'acidonucleico. Un esame più accurato di queste strutturevirali dimostra che le proteine di rivestimento non sono2

Microbiology Updatedisposte in maniera cilindrica ma elicoidale; questoperchè l’acido nucleico ha la tendenza ad assumereuna struttura elicoidale. Dopo che le subunità elicoidalidella proteina sono sistemate, si possono formare deilegami equivalenti tra le proteine e l’acido nucleico -eccezion fatta per le due subunità terminali-.Figura 5. Virus del mosaico del tabacco (TMV)Tutti i virus filamentosi conosciuti sono elicoidali. Lastruttura del TMV può essere descritta in termini dinumero di subunità per giro di elica (m=16.3). Il passo ol’altezza per giro di elica (P) è 2.28 nm e l’altezzaassiale per subunità (p) è 0.14 nm. È possibile che ilfilamento della nucleoproteina dell’HIV abbia unastruttura simile.Anche i Rabdovirus (ad es. il virus della rabbia) hannoun nucleofilamento simile a quello descritto qui, ma essisono rivestiti ed hanno uno strato di matrice come ilvirus HIV.OE Varniere Williams avevano dimostrato che il TMV siformava spontaneamente incubando insiememiscele della proteina del capside e dell'RNAgenomico. Questo significa che la struttura, che ilTMV assume, è autoregolata e corrisponde ad unminimo di energia libera. Un modo semplice perrealizzare ciò, consiste nell’incorporare copiemultiple di una o più subunità.3. Per la fedeltà: il DNA, l’RNA e la sintesi delleproteine sono soggetti ad errori casuali. Usandouna proteina più piccola e quindi un gene piùpiccolo, esiste una minore probabilità di incorrerein errori casuali.4. Per l’economia: la struttura corretta può essereformata con il minimo spreco in quanto, quandouna subunità è sintetizzata in maniera non corretta,viene scartata solo una piccola unità.5. Per la complessità: ci sono dei limiti fisici cheostacolano l'assemblaggio di una struttura ottaedricao tetraedrica. Assemblate in maniera grossolana,gli spazi tra le subunità risulterebberotroppo grandi e quindi la particella diventerebbeinstabile. Infatti, un piccolo numero di contatti potrebbeessere insufficiente per la stabilità. Il virusdiventa più stabile quando è maggiore il numerodelle subunità e il suo genoma può essere piùgrande e più complesso quando è più grande ilframmento virale.Aggiornato 9 ottobre 2007Complessitá delle strutture viraliMolti virus hanno una struttura molto più complicata diquella che è stata descritta, sebbene essi sianocostituiti da unità che possono avere altre simmetrieicosaedriche o elicoidali. Un esempio ben conosciuto èquello dei batteriofagi (es. T4). La testa di questo virusè icosae-drica con 7 facce triangolari. ed è attaccatamediante un colletto all’estremità contrattile consimmetria elicoidale.Commenti finaliPerchè il virus ha incapsidato il genoma?1) per un ambiente fisico ostile2) per la fragilità dell’acido nucleico3) per il taglio del genoma4) per difendersi dagli UV, dall’azione degli enzimi edal pH5) per il fatto che le proteine di rivestimento facilitanol’entrata del virusPerchè la costruzione delle subunità è comune a tutti ivirus?1. Per necessità: il codone a tripletta ha un pesomolecolare approssimativamente di 1000 e codificaper un aminoacido con un peso molecolare medio di150. Così, al meglio, un acido nucleico puòcodificare solo per il 15% del suo peso, comeproteina. Poichè i virus sono composti per il 50-90%dal peso della proteina, deve esistere più di unaproteina e la costruzione a subunità è essenziale.2. Per l’autoassemblaggio: nel 1955 Fraenkel Conrat3

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