Contaminazione da muffe tossigene e fusariosi ... - ARTA Abruzzo

Istituto di Scienze delle Produzioni AlimentariConsiglio Nazionale delle Ricerche – Bari, ItaliaContaminazione da muffe tossigene efusariosi nella filiera cerealicolaAntonio MorettiChieti, 17 Marzo 2005, III Conferenza Regionale Ambientale

Generi di funghi micotossigeni nellafiliera dei cerealiAspergillusPenicilliumFusariumClavicepsAlternariaAltri funghi

Micotossine nella filiera dei cerealiAflatossineOcratossineFumonisineDeossinivalenoloTossina T-2ZearalenoniErgotossine

Raggruppamento di alcune micotossine sulla base dell’attivitàcancerogena per l’uomo secondo lo IARC .Gruppo Attività Micotossine- Gruppo 1… Cancerogeni per l’uomo. - Aflatossine B 1 , B 2 , G 1 , G 2.- Gruppo 2… Cancerogeni per gli animali epossibili cancerogeni per l’uomo.- Gruppo 3 … Non classificabili per lacancerogenicità sull’uomo.- Aflatossina M 1- Ocratossina A- Fumonisine B 1 e B 2- Deossinivalenolo, Zearalenone Tossina T2,Nivalenolo, Fusarenone-X

SPECIE FUNGINE TOSSIGENE –MICOTOSSINE

Aspergillus flavus

OOOOOOOAflatossineOOOCH 3OOOCH 3OOAflatossina B 1 Aflatossina G 1OHOOOOCH 3OOOOAflatossina M 1OOOOOOCH 3OOOCH 3Aflatossina B 2Aflatossina G 2

Livelli di HCC / Livelli di Aflatossine ingeriteLivelli di HCC / Livelli di Aflatossine ingeriteNazione Area Consumo Livelli ding/Kg di peso HCC /peso/giorno 100000 /perannoTHAILANDIA SONGKHLA 5.0 2.0SWAZILAND HIGH ALTITUDE 5.1 2.2SWAZILAND MEAN ALTITUDE 8.9 3.8SWAZILAND LOW ALTITUDINE 43.1 9.2SWAZILAND LEBOMBO 15.4 4.3KENIA MURANG (HIGH ALTITUDE) 3.5 1.2KENIA MURANG (MEAN ALTITUDE ) 5.9 2.5KENIA MURANG (LOW ALTITUDINE ) 10.0 4.0UGANDA KARAMAJO 400.0 15.0MONZAMBICO IMHAMBONE 221.1 13.0THAILANDIA RARBURI 45.0 6.0A basse altitudini, il clima è caratterizzatoda più alta umidità: maggiore frequenza di HCC

Valori massimi ammissibili di aflatossine in prodottialimentari, nell’Unione Europea.Prodotto alimentareContenuto massimo ammessoµg/kg = ppbB 1 B 1 +B 2 +G 1+G 2M 1Arachidi, frutta a guscio e frutta secca e prodottiderivati destinati al consumo umanodiretto…………..…………………………………………..…. 2 4 -- arachidi destinate ad essere sottoposte acernita o ad altri trattamenti fisici…….………….. 8 15 -- frutta a guscio e frutta secca destinate adessere sottoposte a cernita o ad altritrattamenti fisici……………….....……………………. 5 10 -Cereali (compreso il grano saraceno, Fagopyrumspp.) e prodotti derivati, destinati al consumoumano diretto.…………………………………………… 2 4 -Latte (latte crudo, latte alimentare trattatotermicamente, latte destinato allafabbricazione di prodotti a base di latte………… - - 0,05Circolare Ministeriale del 9 giugno 1999, n. 10 (G.U. n. 135 del 11.6.1999).

AFLATOSSINA B 1 : 2003Indagini in Emilia Romagna e Lombardia condotte dal dr. Petri:temperature costantemente molto alte (da Maggio a Settembre)e stress idriciSolitamente i valori per la contaminazione delle cariossidisono di circa 5 ppt in 6-12% of samples analyzed2003Cariossidi di mais. Elevatissimepercentuali di campioni analizzatierano oltre>> 50ppbCampioni di latte: 50-60% deicampioni oltre i limiti (50 ppt)

Penicillium verrucosum cresce a basse temperature (0-31 °C ) e bassi valori di umidità. Diffuso in regionitemperato-fredde, lo si ritrova principalmente su cereali eprodotti derivati.Aspergillus ochraceus cresce a temperature tra 8 e37 °C. Diffuso in regioni temperato-calde, lo si ritrova suun’ampia gamma di alimenti e principalmente su fruttasecca e in alimenti conservati.

Fusariosi della spiga del frumento eDeossinivalenolo

La Fusariosi della Spiga di Grano (FSG) haricevuto un’attenzione particolare in Europain anni recenti per l’impatto che l’infezionepuò avere su:• Raccolto,• Qualità delle cariossidi• Contaminazione da micotossine.• Assenza di di fungicidi di pre-raccoltoadeguati al controllo della malattia.

Principali micotossine prodotte da FusariumTricoteceniFumonisineFusarina CMoniliforminaZearalenoneAcid FusaricoCiclodepsipeptidiFusaproliferinaoltre 150 composti differentipotenti inibitori della sintesi proteicaComposti cancerogeniAgente altamente mutagenoDanni al miocardiodisordini estrogenipatologia del sistemo nervosoattività antibiotica ed insetticidaeffetti teratogenici

TRICOTECENIPOTENTI INIBITORI DELLA SINTESI PROTEICAATTIVITA’ CITOTOSSICAATTIVITA’ MUTAGENAIRRITAZIONE DELLA PELLELESIONI EMORRAGICHEPATOLOGIE EMOPOIETICHEDEFICIENZA DEL SISTEMAIMMUNITARIOTARGETUNITA’ 60S RIBOSOMIALE

DEOSSINIVALENOLO / NIVALENOLOPRODOTTIFrumento, mais, orzo,avena, segale, birraEFFETTI TOSSICI SU ANIMALIVomito, rifiuto del ciboattività immuno-soppressivaDON e NIV sono i più importanti tricoteceni trovati neicereali.NIV è considerato più tossico per gli animaliDON è considerato fornire al fungo più aggressività verso lapianta.DON è più comune in Europa e Nord America.Ceppi fungini che producono NIV sono stati ritrovati in Europa,Africa, Asia, e Sud America ma non in Nord America.

ZearalenoniFunghi produttoriFusarium graminearum, F. culmorum, F. cerealis, F.equiseti, F. semitectum.MicotossineZearalenone (ZEN), Zearalenoli (isomeri α-ZOH e ß-ZOH).FormazioneNelle piante infette: agenti di “mal del piede” e di“marciume della spiga”.In magazzino: umidità (>18-20%); temperatura (12-15;22-27).DiffusioneMais. Altri cereali (frumento, orzo, avena, sorgo). Alimenti.Mangimi. Insilati. Birra.

Tossina T-21) Tricotecene di tipo A; Sesquiterpenoide epossidico.2) F. sporotrichioides, , F. poae, F. equiseti, F. acuminatum.3) Potente inibitore della sintesi proteica, in vivo e in vitro.4) Immuno-tossicatossica.5) Veleno acuto potenzialmente letalenausea, vomito, irritazione faringea, pena addominale , diarrea,vertigini.

Principali specie fungineassociate alla FSG in tutto il mondo• F. graminearum• F. avenaceum• F. culmorum• F. poae• Microdochium nivale• var. majus• var. nivaleDON* NIV* 3- 15 AcDON, ZEA*, ZOHs, Fusarenon XMON* BEA* Enn* (B, B1and A1), Fusarin CDON* NIV* ZEA*, ZOHs, Fusarenon XDAS* NIV* BEA* Enn* B, T-2, Fusarenon X,* Trovate come contaminanti naturali

Specie di Fusarium meno frequentiassociate alla FSG in tutto il mondo•F. cerealis (ex F. crookwellense)•F. sporotrichioides (T-2, HT-2, NEO)•F. tricinctum (MON, BEA, ENs)•F. acuminatum (T-2, NEO or MON, ENs)•F. subglutinans (MON, BEA, FUP)•F. oxysporum (MON, BEA, ENs)•F. equiseti (DAS, ZEN, ZOH)

F. avenaceumF. poaeF. sporotrichioides zF. culmorumF. culmorumF. graminearumF. avenaceumF. poaeF. graminearumF. culmorumF. avenaceumF. cerealisNivalenoloT-2 + derivativiDiacetosscirpenoloMoniliforminaBeauvericinaEnniatineDeossinivalenolo (DON)3-AcDON15-AcDONNivalenoloZearalenoneZearalenoli

OCCURRENCE OF DON IN CULTIVARS OF WHEATKERNELS FROM VARIOUS ITALIAN LOCATIONS (2000)DON mean concentration (ng/g)140012001000800600400200ERIDANOCENTAURO350030002500200015001000500SIMETOZENIT00North Central SouthNorth Central SouthSOFT WHEATDURUM WHEATERIDANO3,010 ng/gSIMETO6,465 ng/g

ObiettiviStudio delle relazioni fra clima e sviluppomalattia/micotossine in un range di condizioniambientali controllate e monitorando lamalattia in campi di 4 nazioni con condizoniambientali variabili in EU.‣Esaminare l’impatto di varietà di granosullo svilupo della malattia e sull’accumulodelle micotossine.‣Modelli per la valutazione del rischioquantitativo sullo sviluppo della malattia esull’accumulo delle micotossine.

Campi indagati nel 2001-2002-2003-2004Solo nel 2001Grano teneroGrano duroCampi 2003 e 2004

50454035302520AntesiIncidenza delle speciefungine 2001-2004 perfase fenologicaF.poaeF.avenaceumF.graminearumF.culmorumM.nivale m.1510M.nivale n.502001 20025045Lattea10090Maturazione40803570306025502040153010502001 2002 2003 2004201002001 2002 2003 2004

Contaminazione micotossine 2001-2003DONNIVZEAHT-2Nopos/totRange(ppb)Nopos./tot.Range(ppb)Nopos/tot.Range(ppb)Nopos/tot.Range(ppb)20019/1935-2854/193912/193-12n.a.n.a.20029/19181-155303/19213-10332/1922-318/1925-11020031/101620/10-0/10-4/1018-71Beauvericina ed Enniatina mai presenti sopra i limiti di rilevabilità

Presenza di micotossine nelconfronto con le altre nazioniNumero totale di sitiNumero di siti con presenza di micotossineTotaleItaliaZeaHT-2DONNIV2001741913 2 n.a.33 919 42002741910 2 41 822 98 3200340109 0 21 416 15 0

Campionamento campi:risultati principali• Le frequenze delle specie è stata variabile nel tempo e fra leregioni• Il livello di micotossine è molto basso, a parte alcuni campioniin un anno (2002).• Le più comuni micotossine isolate sono state DON e NIV.• C’è relazione qualitativa nella presenza di specie collegate allaFSG, ma non c’è relazione di tipo quantitativo.• Vi sono indicazioni di associazioni fra alcune specie in unsingolo sito.• F. culmorum non sembra essere un problema in Italia per laFSG

CONCLUSIONII campioni di grano duro erano piùcontaminati che i campioni digrano teneroUna netta diminuzione nel livello dicontaminazione di DON è statoosservato da Nord a SudI livelli di contaminazionefungina e da micotossine a voltevariavano in maniera puntiformeDONI livelli di contaminazione funginae da micotossine non hannomostrato differenze significativefra campi biologici e tradizionali

Fusariosi della spiga del maise principali micotossine relative

Main Fusarium species associatedwith maize ear rot:F. verticillioidesF. proliferatumF. subglutinansF. graminearum

Principali micotossine da Fusaria della sezioneLiseola coinvolte nel marciume della spiga di mais :• F. verticillioides: Fumonisine (FB 1 , FB 2 , FB 3 )• F. proliferatum: Fumonisine (FB 1 , FB 2 )MoniliforminaBeavericinaFusaproliferina• F. subglutinans:MoniliforminaBeavericinaFusaproliferina

Microconidial production in chainsand on monophialides inF.verticillioidesFusarium proliferatum microconidialsporification on polyphialides

F. subglutinansF. poaeF. graminearumF. verticillioidesF. verticilliodesF. proliferatumMoniliforminBeauvericinFusaproliferinDeoxynivalenolNivalenolZearalenoneFumonisinsFusaproliferinMoniliforminBeauvericin

FumonisineBackgroundButler, in 1902, ha descritto un malattia dei cavallichiamata Leucoencephalomalacia equina(ELEM)Questa malattia è stata descitta anche con altri nomi:•encefalite•leucoencefalite•malattia del culmo di mais•barcollamento•malattia del foraggioAgente causale dell’ELEM fu messo in relazione aspecie di Fusarium contaminanti il mais.L’eziologia dell’ELEM è stata elucidata dal gruppo di Marasas, Sud Africanel 1988 con la fumonisina B1 scoperta da colture di mais di Fusariummoniliforme (syn. F. verticillioides) e successivamente di F. proliferatum.

Due diverse fumonisine furono purificate e chiamate FB 1 and FB 2 .Prove di alimentazione con due cavalli usando FB 1 and FB 2 indussero itipici sintomi dell’ELEMA F. verticillioides produttore di FBs sono state associate altre malattiequali:•nefrosi ed epatiti nelle pecore•Trombosi cardiache e cirrosi epatiche nei ratti•Edema polmonari nei maiali• Apoptosi (frammentazione del DNA) su cellule mammifere.•ASSOCIATA AL CANCRO ALL’ESOFAGO NELL’UOMO•Sud Africa, Cina, Italia (Friuli)

Esadepsipeptidiprodotti da specie di FusariumONR 2R 1NO O OO OOONOR 3Enniatina AEnniatina A 1Enniatina BEnniatina B 1BeauvericinaR 1= R 2= R 3= -CH(CH3)CH 2CH 3R 1= R 2= -CH(CH3)CH 2CH 3; R 3= -CH(CH3) 2R 1= R 2= R 3= -CH(CH3) 2R 1= R 2= -CH(CH3) 2; R 3= -CH(CH3)CH 2CH 3R 1= R 2= R 3= -CH2C 6H 5

Fusaproliferina e suoi effetti tossiciEffetti Teratogenisu embrioni di polloCH 3CH 3CH 3 OR 3OR 2H 3CApoptosi sulinfociti di cellulemammifereOR 1CH 3OR 1 = R 2 = R 3 =HDeacetilfusaproliferinaR 1 = R 2 =H R 3 =CH 3 CO FusaproliferinaR 1 = R 2 = R 3 =CH 3 COAcetilfusaproliferina

Dicotomia cefalicaBecco e collo anomali

PRESENZA DI FUMONISINA B 1 (FB 1 ) IN MAIS EALIMENTI A BASE DI MAISDerrataCampioni analizzati > 1 µg/g FB 1Mais macinato(farina di mais, polenta, semolina,mais macinato grosso)Cariossidi di mais(genotipi, mais commerciale, maisimportato)Alimenti a base di mais(mais in scatola, mais estruso, pane, biscotti,cereali, cornflakes, , amido, mais dolce, alimentiper l’infanzia, ltortillas, , pop-corn etc.)108103818130%37%10%

PRESENZA DI FUMONISINE (FB 1+FB 2) IN ALIMENTI A BASEDI MAIS IN GENOTIPI DI MAIS IN ITALIACAMPIONI POSITIVI /ANALIZZATIRANGE FB 1 + FB 2(ng/g)MEDIA DEIPOSITIVI (ng/g)MAIS COMMERCIALE7/7130 - 67903500GENOTIPI DI MAIS26/2610 - 2850450POLENTA13/13210 - 46702230POLENTA PRECOTTA4/4200 - 1200870POLENTA BIOLOGICA3/3200 - 1300810MAIS ESTRUSO6/6900 - 66203540MAIS DOLCE5/560 - 790300ALTRI ALIMENTI6/1010 - 8040Dati ripresi da DOKO e VISCONTI (1994) e da PASCALE M. et al. (1995)

Presenza di micotossine da specie di Fusarium neicereali nel mondo (W) e nell’Unione Europea (EU).ToxinsSamples positive /total Ratio RangeWEU(µg/kg = ppb)No. % No. % EU/W W EUDON...... 3781/7889 48 3415/5690 60 1,25 1-67000 4-67000DAS....... 126/2103 6 49/1535 3 0,50 1-31500 20-31500FB 1 ........ 365/497 73 154/179 86 1,18 1-117520 50-4670MON...... 102/288 35 37/148 25 0,70 50-11570 50-750NIV........ 967/4181 40 545/3608 16 0,40 2-37900 3-7800T2.......... 490/5856 8 449/3883 12 1,50 1-38890 1-14000ZEN....... 2297/18018 13 845/5745 15 1,15 2-275800 1-175000(a) - DON = Deossinivalenolo (Vomitossina); DAS = Diacetossiscirpenolo; FB1 =Fumonisina B1; MON = Moniliformin; NIV = Nivalenolo; T2 = Tossina T-2;ZEN = Zearalenone.

Una corretta identificazione e una caratterizzazionetossicologica dei patogeni e dei colonizzatori fungini deicereali e dei prodotti a base di cereali è determinanteper valutare il loro potenziale tossigeno e stabilire i rischipotenziali per prevenire malattie a piante, animali e uomo.Obiettivo importanteSviluppare un rapido, robusto e praticokit diagnostico molecolare sia qualitativosia quantitativoValutazioneValutazionedeldelrischiorischioeeprevenzioneprevenzione

cluster di geni che codificano per le subunita’ ribosomialiITS 1ITS 418S ITS 1 5.8SITS 2 28 S IGS 18Scluster di geni coinvolti nella biosintesi di fumonisinaFUM5FUM6FUM7FUM8 FUM9cluster di geni coinvolti nella biosintesi di tricoteceniTri8Tri3Tri6Tri10Tri11Tri13Tri7Tri4Tri5Tri9Tri12

Sistemi di monitoraggio per via molecolareReal Time PCRDNA ChipDiversi sistemi per il monitoraggio della contaminazione funginaattraverso l’identificazione del DNA:PCR Qualitativa, PCR quantitativa e micro/macro sistemi (array)

FATTORI CHE INFLUENZANO LAFORMAZIONE DI MICOTOSSINE IN CAMPO PRESENZA E PATOGENICITÀ DEI I CEPPI TOSSIGENI SUSCETTIBILITÀ DELLE COLTURE STRESS BIOTICI E ABIOTICI ANDAMENTI CLIMATICI POCO FAVOREVOLI TECNICHE AGROCOLTURALI NON IDONEE- semine in periodi non adatti e/o semine molto fitte- mancanza di rotazioni colturali- successioni irrazionali- fertilizzazioni squilibrate- inadeguato impiego di fitofarmaci- irrigazione insufficiente o discontinua INFESTAZIONE DA INSETTI

MISURE DI CONTROLLO IN PRE-RACCOLTA RE-RACCOLTA DINOTA EFFICACIA‣ PREVENIRE CONDIZIONI DI “STRESS” PER LE COLTURE- irrigazioni adeguate ⇒ evitare il verificarsi di condizioni di siccità o di eccessivaumidità; ; seminare in modo da trarre vantaggio dai periodi dell’anno più piovosi ed evitarecondizioni di stress idrico- fertilizzazioni equilibrate- riduzione degli attacchi di insetti‣ RIDURRE I RESIDUI DI CAMPO E LE SORGENTI DI INOCULO- preparazione dei terreni alla semina ⇒ la quantità di spore di Fusarium ècorrelata alla quantità di residui di campo (mais) e aumenta se la decomposizione è lenta;i trattamenti di aratura e dissodamento riducono significativamente nte l’incidenza ldi attacchidi fusariosi del frumento‣ REINTRODURRE LE ROTAZIONI COLTURALI- patata, orzo, soia, barbabietola/frumento ⇒ bassa incidenza di attacchi difusariosi del frumento e di contaminazione da DON-mais/frumento⇒ ⇒ elevata incidenza

MISURE DI CONTROLLO IN PRE-RACCOLTARE-RACCOLTA“POTENZIALMENTEEFFICACI”1. SELEZIONE DI VARIETA’ NATURALMENTERESISTENTIibridi di mais a basso accumulo di fumonisine ⇒scarso adattamento a condizioni ambientali diverse da quelledelle aree di produzioneGT-MAS:gk, “Illinois-resistant lines” ⇒ibridi di mais con cariossidi resistenti all’accumulo accumulo di aflatossinedopo infezione da A. flavus“TropicalHybrids” ⇒ ibridi di mais più tolleranti a condizionidi temperatura e umidità ambientale elevate e più resistentiall’accumulo accumulo di aflatossine

MISURE DI CONTROLLO IN PRE-RACCOLTARE-RACCOLTA“POTENZIALMENTEEFFICACI”2. USO DI SOSTANZE CON ATTIVITA’ ANTIFUNGINAFUSARIOSI DELLA SPIGA DI GRANO ⇒- i risultati sul controllo della malattia mediante fungicidi sono ancoraCONTRADDITORI- in alcuni casi, il trattamento con fitofarmaci riduce i sintomi della malattia el’accumulo di DON, in altri ha portato ad un maggiore accumulo di tossina- i prodotti disponibili hanno uno spettro di azione limitato per cui è importanteconoscere la natura dell’infezione per scegliere il prodotto specifico o unamiscela di prodotti diversiTEMPO DI APPLICAZIONE ⇒PUNTO CRITICOFREQUENZA DEI TRATTAMENTI ⇒frequenze sbagliate possono compromettere l’efficacia ldei trattamenti

FASI DI RACCOLTA EIMMAGAZZINAMENTODELLE GRANAGLIEDurata, rapidità e modalità di essiccamentoUmidità relativa delle derrateTemperatura e umidità ambientaleTensione di vapore di CO 2 e O 2Natura e consistenza del substratoPresenza di danni meccanici o da insettiQuantità e vitalità dell’inoculo funginoInterazioni con altri microrganismiPresenza di conservanti

Antonio MorettiGruppo Funghi TossigeniAntonio BottalicoAntonio LogriecoGiuseppina MulèGiancarlo PerroneAntonella SuscaGiuseppe CozziFilomena EpifaniEnzo RicciGaetano SteaGiusi Tocco