Appunti di Principi-BiolMol CTF - Capitolo7 - Omero

Regolazionedell’espressione genica

I promotori batterici hanno due sequenza consensodistinte

Trascrizione neiprocarioti

Regolazione dell’espressione genica neiprocarioti• Il modello dell’operone di Jacob-Monod per la regolazionedei geni:• Proposto nel 1959, questo modello introduceva il concettodi geni regolatori che codificano per prodotti (proteine) checontrollano altri geni.• L’operone lac è un esempio di controllo negativo deglienzimi coinvolti nel metabolismo del lattosio. Tuttavia,questo operone viene anche regolato da un controllopositivo.• Il modello dell’operone ha portato alla scoperta deglimRNA.

Modello del’operone di Jacob e Monod

Esperimento (1966)di Gilbert e Müller-Hill che dimostra cheil repressore lac, unaproteina, si lega alDNA dell’operatore

Regolazione dell’operone del lattosio (lac)• Nei batteri i geni sono organizzati in operoni, chesono unità di espressione e di regolazione dei genibatterici, che comprendono geni strutturali edelementi di controllo nel DNA che vengonoriconosciuti dai prodotti dei geni regolatori.• I geni di un operone sono sotto il controllo di un solopromotore e si produce un singolo trascritto dimRNA o “mRNA policistronico”.• Le caratteristiche dell’operone lac illustrano iprincipi fondamentali universali della regolazionedei geni.

Regolazionedell’operone lacda parte delglucosio e dellattosio

Uso in biologia molecolare del promotore lace del gene lac Z• Gene lac Z -galattosidasi X-gal prodottocolorato (blu): strategie di screening di coloniebatteriche trasformate con DNA ricombinante(clonaggio); usato come gene reporter per lo studiodella regolazione genica in animali transgenici ocellule in coltura.• Il meccanismo trascrizionale del promotore lac èusato in indurre l’espressione di proteineetererologhe in E. coli (uso di IPTG per indurrel’espressione della proteina ricombinate).

Meccanismi d’azione dei regolatoritrascrizionali• Legame cooperativo delle proteine al DNA: importantesia nei procarioti che negli eucarioti; es. della proteina CAP cheha un dominio di legame al DNA ed un dominio detto “regione diattivazione” che entra in contatto con la RNA polimerasi che silega al promotore.• Modificazioni allosteriche e legame al DNA: ci sono dueesempi, 1) il legame del cAMP alla proteine CAP che induce uncambiamento allosterico in quest’ultima per cui si lega piùsaldamente al DNA; 2) il legame dell’allolattosio o dell’IPTG allaproteina repressore dell’operone lac che induce un cambiamentoallosterico nel repressore che fa diminuire la sua capacità dilegarsi al DNA.• Formazione di anse da parte del DNA: la formazione dianse di DNA permette a proteine, anche distanti, legate sul DNAdi interagire con la DNA polimerasi legata al promotore.

ComplessoCAP-DNA

L’operone del Triptofano (trp)• La regolazione dell’operone del trp nei batteri è unclassico esempio di attenuazione trascrizionale.• Due meccanismi di attenuazione:• Controllo post-trascrizionale mediante ripiegamentodifferenziale dell’mRNA.• Controllo dell’inizio della trascrizione dell’operone trpmediante il legame di un repressore, attivato dallegame con il triptofano, a siti operatori, conconseguente blocco dell’accesso della RNA polimerasial promotore trp.

Attenuazionetrascrizionaledell’operonetrp di E. coli

Regolazione della trascrizione neglieucarioti• Concetto di elementi cis-agenti and trans-agenti delDNA e fattori trans-agenti.• Fattori che intervengono nella regolazione dellatrascrizione negli eucarioti:• Interazioni DNA-proteina;• Interazioni proteina-proteina;• Struttura della cromatina;• Architettura del nucleo;• Compartimentazione cellulare.

Il controllo dell’espressione genica negli eucariotipuò essereesercitato a molti livelli oltre che a livellotrascrizionale.

Regolazione della trascrizione neglieucarioti• La RNA polimerasi II è responsabile della trascrizionedella grande maggioranza dei geni eucariotici:• Geni codificanti per mRNA;• Geni codificanti per snoRNA;• Geni codificanti per alcuni snRNA;• Geni codificanti per microRNA.• Negli eucarioti esistono altre due RNA polimerasi: RNApolimerasi I localizzata nel nucleolo responsabile dellasintesi dell’rRNA grande; RNA polimerasi III si trova nelnucleoplasma ed è responsabile della sintesi dell’tRNA,dell’rRNA 5S e di alcuni snRNA.

Elementi regolatori dei geni codificantiproteine• Fattori di trascrizione (attivatori o repressori) CREB, CTCF, FOG-1, GATA-1, NF-E2, NF-B, Sp1.• Macchinario generale della trascrizione RNApol II, TFIIB, TFIID (TBP + TAF), TFIIE, TFIIF, TFIIH,Mediatore.• Coattivatori e corepressori complessi dimodificazione della cromatina (HAT, HDAC, CBP, HMT,LSD1), complessi di rimodellamento della cromatina(SWI/SNF, ISWI, SWR1).• Fattori di allungamento FACT, allungatore, TFIIS.

Le unità trascrizionali (RNA pol II)degli eucarioti10 kb 2 – 3 kb

Le unità trascrizionali (RNA pol II)degli eucarioti• Elementi regolatori cis-agenti degli eucariotimulticellulari:• Elementi promotori (vicini al punto di inizio dellatrascrizione) nucleo del promotore + elementiprossimali del promotore (elementi a monte delpromotore od elementi regolatori a monte);• Elementi regolatori a lungo raggio.

Il nucleo del promotore• Sequenza di 60 bp di DNA sovrapposta al sito +1;• E’ il sito di riconoscimento per la RNA pol II e per ifattori generali di trascrizione (TFII).

Motivi del nucleo del promotore della RNA pol II

Promotore Posizione Fattore di trascrizione Sequenza consensoElementi a monte del nucleo del promotoreBRETATA BoxIniziatore-37 a -32-31 a -26-2 a +4TFIIBTBPTAF1 e TAF2Elementi a valle del nucleo del promotoreMTEDPE+18 a + 27+28 a + 32TFIIDElementi prossimali del promotoreTAF9 e TAF6(G/C)(G/C)(G/A)CGCCTATA(A/T)AA(G/A)PyPyA +1 N(T/A)PyPyC(G/A)A(A/G)C(G/C)(C/A/G)AACG(G/C)(A/G)G(A/T)(C/T)(G/A/C)CAAT boxGC box-200 a -70-200 a -70CBF, NF1, C/EBPSp1CCAATGGGCGGCBF: fattore che lega CAAT;C/EBP: proteina che lega CAAT/enhancer

Elementi regolatori a lungo raggio Questi elementi degli eucarioti multicellulari comprendo:• Enhancer;• Silenziatori;• Isolatori;• Regioni di controllo del locus (LCR);• Regioni di attacco alla matrice (MAR).Alcuni enhancer che sono negli introni contribuisconoall’espressione tessuto-specifica enhancer nel secondointrone del gene dell’apolipoproteina B (apoB delle LDL).

Enhancer e silenziatori• Questi elementi sono di solito a 700 – 1000 o più bpdi distanza dal sito di inizio della trascrizione.• Gli enhancer si possono trovare sia a monte che avalle del gene, o dentro un introne, e possonofunzionare in entrambi gli orientamenti rispetto alpromotore.• Un enhancer è lungo 500 bp e contiene 10 siti dilegame per fattori di trascrizione diversi.• I silenziatori sono elementi simili agli enhancer, mareprimono l’espressione del gene.•

EnhancereSilenziatori

IsolatoriUn isolatore è una sequenza di DNA, di solito lunga300 – 2000 bp, che ha la funzione di:• Marcatore di un confine di cromatina, tra regioni dieucromatina ed eterocromatina;• Attività di blocco di un enhancer o di un silenziatore. Contiene un gruppo di siti di legame per proteineche legano sequenze specifiche di DNA.

IsolatoriGli elementi isolatori sono riconosciuti da almeno 3 proteine diverse chelegano il DNA: fattore che lega CCCTC (CTCF) ed i fattori stimolatori a monte(USF) 1 e 2. CTCF media l’attività di blocco dell’enhancer mentre USFsreclutano enzimi che modificano la cromatina.

Regioni di controllo del locus (LCR)• Le LCR sono sequenze di DNA che organizzano emantengono un dominio funzionale di cromatina attiva efanno aumentare la trascrizione dei geni a valle.• Siti ipersensibili (HS) alla DNasi a monte del gruppo deigeni della -globina.• Le LCR sono presenti in altri loci genici fra cui: i gruppi digeni che codificano le -globine, i pigmenti visivi, leproteine del complesso maggiore di istocompatibilità, gliormoni della crescita umani, le serpine, le citochine dellecellule T helper di tipo 2.

Regioni di controllo del locus (LCR)L’intero locus dei geni della -globina occupa 200kb.La LCR è necessaria per la trascrizione ad alto livellodi tutti i geni della famiglia della -globina.La regolazione della formazione di “anse” dicromatina è il meccanismo che controllal’espressione durante lo sviluppo dei geni della -globina.La LCR interagisce con un solo promotore genicoalla volta, così da garantire l’espressione differenzialedei diversi geni durante lo sviluppo.

Regioni di attacco alla matrice (MAR) L’organizzazione tridimensionale della cromatina ha ancheun ruolo centrale nel controllo della trascrizione neglieucarioti. Organizzazione in anse indipendenti della cromatina. Laformazione di queste anse dipende da elementi specifici disequenza del DNA che sono sparsi in tutto il genoma adintervalli di 5 – 200 kb. Queste sequenze di DNA sono chiamate regioni di attaccoalla matrice (MAR). Le MAR organizzano il genoma in 60000 anse dicromatina con una dimensione media di 70 kb.

Regioni di attacco alla matrice (MAR) I geni attivi tendono a far parte di domini ad ansa piccoli,mentre quelli inattivi sono associati a domini più grandi. Più del 70% delle MAR sono ricche di sequenze AT Le MAR si trovano vicino agli enhancers. Conferisconospecificità tissutale e controllo durante lo sviluppodell’espressione genica reclutando fattori di trascrizione erichiamando gli enzimi di rimodellamento della cromatina. MAR strutturali servono come ancore; MAR funzionalisono dinamiche e aiutano a portare i geni sulla matricenucleare.

Modello della regolazione trascrizionale da parte delle MAR

Macchinario generale (basale) della trascrizioneComponenti: RNA polimerasi II (12 subunità) sintetizzaRNA in 5’ 3’ ed esegue correzione delle bozze deltrascritto nascente;Fattori generali di trascrizione 5 fattori,TFIIB, TFIID, TFIIE, TFIIF e TFIIH, sonoresponsabili del riconoscimento del promotore edell’apertura della doppia elica del DNA;Mediatore complesso di 20 subunità; trasduceinformazioni regolatrici da attivatori e repressori allaRNA pol II.

I fattori di trascrizioneLa regolazione dell’attività trascrizionale dei geniavviene mediante cambiamenti della quantità odell’attività dei fattori di trascrizione.Questi fattori influenzano la velocità di trascrizionedei geni “target” positivamente o negativamentetramite interazioni specifiche con gli elementiregolatori del DNA e tramite interazioni con altreproteine.

Meccanismi di regolazione della quantità e dell’attività deifattori di trascrizione

Meccanismi con cui agiscono fattori di trascrizioneattivatori per aumentare l’attività trascrizionale‣ 1) Stimolazione del reclutamento e del legame deifattori generali di trascrizione e della RNA pol II sulnucleo del promotore per formare un complesso dipreinizio.‣ 2) Induzione di un cambiamento conformazionale oddi una modificazione post-traduzionale che stimolal’attività enzimatica del macchinario generale ditrascrizione.‣ 3)Interazione con i complessi di rimodellamento e dimodificazione della cromatina per permettere unamigliore accessibilità dei fattori generali di trascrizioneo di attivatori specifici al DNA.

Domini modulari deifattori di trascrizione

Fattori di trascrizione: motivi del dominioche lega il DNA‣ Motivo elica-giro-elica (HTH) (es. repressore del trp,proteina CAP, repressore lac, ecc.) l’omeodominio (60amminoacidi) è una variante del motivo HTH classico che èpresente in molti fattori di trascrizione che regolano losviluppo (anche nei mammiferi).

Fattori di trascrizione: motivi del dominio chelega il DNA• L’omeodominio: un -elica contatta il solco maggiore del DNAriconoscendo una sequenza di 6 pb (come nel HTH), mentre un braccioflessibile interagisce specificamente con il solco minore del DNA.

Fattori di trascrizione: motivi deldominio che lega il DNA‣ Motivo a dita di zinco: deriva il nome dallo schema dellasua struttura un atomo di Zn coordina dei residui dicisteine e di istidine, formando un ansa che ricorda laforma di un dito. Struttura diffusa in molte famiglie diattivatori trascrizionali (es. fattore Sp1, recettori degliormoni steroidei).

Dominio a dito di Zn del recettoredei glucocorticoidi (GR)Motivo a dita di Zn

Fattori di trascrizione: motivi deldominio che lega il DNA‣ Domini a cerniera lampo (leucine zipper): due lunghe strutture ad-elica che contengono, contemporaneamente, il dominio didimerizzazione ed il dominio di legame al DNA. Queste strutturepossono formare sia omodimeri che eterodimeri.

Domini a cerniera di leucina‣ Questo motivo è stato descritto per la prima volta nellaproteina C/EBP che lega CAAT box presente in moltienhancer.‣ Appartiene a questo gruppo di attivatori la proteina AP-1,un eterodimero formato dall’unione di due protooncogenic-Jun e c-Fos, che regola l’espressione genica in risposta avari stimoli, quali, stress, infezioni virali e batteriche, el’attivazione da parte delle citochine.

Domini elica-ansa-elica basico (BHLH)‣ E’ una struttura caratterizzata da due -eliche connesse da un ansa. Ifattori con questo motivo sono in genere eterodimeri, formati daun’elica più lunga che lega il DNA attraverso amminoacidi basici.‣ Appartengono a questa famiglia molti attivatori che hanno un ruolonello sviluppo, come Myo-D che svolge una funzione fondamentale neldifferenziamento delle cellule muscolari. Un altro esempio è laproteina c-Myc, che è coinvolta nella trasformazione tumorale (linfomadi Burkitt).

Controllo combinatoriale della trascrizione‣ Gli attivatori e gli inibitori sono coinvolti nella regolazionedi numerosi geni.‣ E’ la combinazione tra diversi attivatori ed inibitori cherende molto specifico il meccanismo di regolazione.

Sequenze di importazione ed esportazionenucleare‣ Il traffico fra nucleo e citoplasma avviene attraverso i complessidei posi nucleari (NPC).‣ I fattori di trascrizione, sintetizzati nel citoplasma, devonoattraversare questi pori per giungere nel nucleo.‣ Le proteine sono indirizzate al nucleo da una sequenzaamminoacidica specifica chiamata sequenza di localizzazionenucleare (NLS); ne esistono diverse, ma le più studiate sono lesequenze ricche di a.a basici (Arg e Lys).‣ Per l’uscita dal nucleo, le proteine devono anche avere unasequenza di esportazione nucleare (NES); le megliocaratterizzate sono le piccole sequenze idrofobiche ricche di Leu.‣ Per il passaggio attraverso i pori le proteine con sequenze dilocalizzazione e/o esportazione, si avvalgono di una famiglia direcettori solubili, importine od esportine (carioferine).

Importazionenucleare regolata‣ I recettori degli ormonisteroidei

Importazione nucleare regolata di NF-B

Risposta all’cAMP e fattore CREBP-CREB si lega a siti sul DNA chiamatiCRE (cAMP Response Element).CREB è strettamente correlato, sia perstruttura che per funzione, a CREM(cAMP Response Element Modulator)ed a ATF-1 (Activating TranscriptionFactor-1).