Rapporto Istisan 95/1 - Istituto Superiore di SanitÃ

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}..ISTISAN 95/I(ISSN 1111-3117}ISTITUfO SUPERIORE DI SANITA'm Semlaario di agiornamento suU'epatile da HCV:dlaposl, epidemloloKbl, prevenzione e terapialstituiO Superiore di SaniiARoma, 23-24 gennaio 1995AUi a CID'Il di Maria RapiceuaLaboraJorio dj VirologUJRoma1995

Istituto Superiore di Sanità, Romam SeadbArio di aar&ornameuto 111lrepadte da HCV: diagnosi, epklemlolotia, preveazione e tenpla.lstiruto Superiore di Sanità. Roma, 23-24 gennaio 1995.Ani a cura di Maria Rapiceua1995, v, 227 p. Rapporti ISTISAN 95/1 (in italiano, inglese)Sono tranate le più reeenti acquisizioni disciplinari, per quanto concerne gli aspetti virologici e patogeneticidell'infezione da HCV, in particolare in relazione ~~gli studi sull'agente vitale, sulle IUe caratteristiche genomiche edespressione genica sui marcatori indotti nel corso dell'infezione, e in relazione agli studi su possibili vaccini. Sono, inoltre,trattati i progressi raggiunti nel campo dell'epidemiologia, p-ofi lassi e terapia dell'infezione. Tali dati hanno un notevoleimpatto in vari settori di interesse medico e saniwio quali quelli relativi alla lefapia e alla prevenzione dell'infezione.Ptuole chiave: Formazione, InJezioni, Virus epatite C.Istituto Superiore di Sanità, Rome (haly)ID Seminar OD developments ID HCV hepatltis: dlagnosis, epklemlology, pr.venUon and tberap)".Istiruto Superiore di Sanità. Rome. 23-24 January 1995.Proceedings edited by Maria a.p;ceua1995, v, 227 p. RapportilSTISAN 95/1 (in halian, English)The )alesi achievements from Ùle studies on HCV genome strucrure and expression, on vaccine development andsignificance of infection markers are reported, as well as, epidemiology, prophylaxis and lherapy perspectives. Such databave gready impacted on various areas of mediclne and heaiÙistructures as concems Ùle infection therapy and prevention.Key WOt"ds: Hepatitis C virus,lnfections, Training.Si ringrazia Cinzia Bisegna per la collaborazione tecnica prestata per la realizzazione del presente rapporto.C l.rtiluto S~riore di StuUuì 1995..(

; ..INDICEIntroduzione .................................................................................................... Pag.Maria RapicettaIASPETTI VIROLOGICI DELL'INFEZIONE DA HCVFerruccio Boniao, Maria RapicettaHCV structura/ proteins: expression in different anima/ ce/ls .......................... Pag. 3Tatsuo MiyamuraHCV detection in blood transjusion. ................................................................ Pag.Cee L. V an Der PoelI OTavola rotonda:ASPE177 DIAGNOS17CI DEU 'INFEZIONE DA HCVErica Villa, Alessandro ZanettiSaggi di screening e saggi addizionali ............................................................. Pag.Anna Rita Cicc::aglione, Maria RapicettaI8Importanza della quantizzazione ed analisi dinamica. ..................................... Pag. 27Ferruccio BoninoDeterminazione dei genotipi del/ 'HCV: aspetti diagnostici ed interesseclinico ............................................................................................................. Pag. 33Elisabetta Cariani, Antonella Ravaggi, Angelo Rossini

IlAspetti istologici dell'epatite da HCV ............................................................. Pag. 43Luisa Bercic:b, Mariafausta Bonetti, Giovanna Fabbreti, Laura Lucini,Francesco CalleaTavola rotonda:STORIA NATURALE E PATOGENESI DELL'INFEZIONE DA HCVAlfredo Alberti, Antonio CraxìStoria naturale dell'infezione da virus C ........................................................ Pag. 47RaffaeUa Romeo, Massimo ColomboMeccanismi virologici dell'infeziune .............................................................. Pag. 52Maurizia Rouana BrunettoAutoimmunità .................................................................................................. Pag. 56Francesco B. Bianchi, Laigi. Muratori, Marco LenziTavola rotonda:EPIDEMIOLOGIA DELL'INFEZIONE DA HCVNicola Caporaso, Evangelista SagnelliModalità di trasmissione delle epatiti Non A,Non'B parenterali ...................... Pag. 59Alfonso MeleHCV: trarmissione intrafamiliare e sessua/e .................................................... Pag. 66Maria ChiaramonteTrasmissione nei gruppi a rischio .................................................................... Pag. 7 4Piero Dentico, Rosalba BuoDgioro.o, Anna Volpe, Antonio.Migfietta,Gaetano Lonero, Rodolro S1cco.,f

..U1Trasmissione verticale!perinatale

IVValutazione clinica del paziente crtoglobulinemico e del pazienteautoimmune ..................................................................................................... Pag. 121Francesco B. Biancb~ Luigi Muratori, Marco LenziInfezione da virus del/ 'epaJite C (HCV): Problematiche connesseal trapianto di fegato ....................................................................................... Pag. /25Erica Villa, Antonolla Gnttola, Paola Buttalllco, Anuliu Merighi,Uva Ferretti, Federico ManentiB: ASPE177 TERAPEU11ClMaria Cbiaramnte, Giovanni Raimondo/nteljeron in clrronic hepaJitis C: an evaluation oj effectiveness andunresponsiveness. ............................................................................................ Pag. /30Anteaio Crul, Cristilla Linea, Silvio MagrinValutazione del trattamento a lungo termine con IFN. ..................................... Pag. 149Giuseppe Visco, Evangdo Boumis, Fabrizio Ferri, Maria AntonellaLongo, Puq1181e Note, Gianna Touin~ Mauro ZaccareUiFallori predittivi di risposta a/l'interjerone nel/ 'epatite cronica da HCV. ....... Pag. !60Alfredo Alberti, Liliana Cbemello, Patrizia PoatiaoTerapia con inteljerone nei "casi difficili " ...................................................... Pag. /68Evangelista Sap~ Fftlltesca Maria Fdaeo, Lucia Aprea, VilocenzoMeaina, Felice PieeiloiaoNuove prospettive di terapia ............................................................................ Pag. 172Antonio Aidone, Giovan Giuseppe Di Costanzo..( ,_...- ...

·'...vTavola rotonda:INFEZIONE DA HCVPROBLEMA11CHE COI{NESSE ALLA PRA11CA TRASFUSIONALEGIUHppe De Stuio, Emilio ManneiiLInfezione da HCV: implicazioni nella pratica trasfusiona/e ............................. Pag. I 77GiUHppe De StasioLa sorveglianza delle epatiti post-trasfusionall in I/JJ!ia e all'estero ................ Pag. I9 IEmilio Mannella, Micbelina Miceli, An11ela Di Loreozo, Assunta GaUoSllldiiJ sui riceventi unità di emocompanenti da donatori successivamentesieroconvertiti HCV. ........................................................................................ Pag. I98Osvaldo GlacbinoValutazione di un test anti-HCV di terza generazione applicato a doepopolazioni selezionate: epatiti acute NANB (indagine retrospettiva)e donatori di sangue indeterminati alla secondo generazione .......................... Pag. 204Marisa De PalmaEsperienza multicentrica con test di JA generazione nello screeningHCV dei donatori di sangue ............................................................................ Pag. 2I2Enrico Pauarelli Pula, Maurizio Lanteri, Sante Barbante, CesareFausto Bertorello, Paolo Cagetti, Giuseppe Cambié, Patrizia CoUinassi,W alter Cozzolino, Marisa De Palma, Osvaldo Giacbino, Paolo Gottardl,Ermanna Iiritano., Giovanni Landueci. Michela Macri, Mara Miazzucco,Carlo Omodei-Zorini, Gaetano Polignano, Paolo Rizzone-Faviccbio,Mario Ronl, Liliana Santarossa, Piera VaUauri, Leopolda ZampieriValutazione esterna di qualità di saggi di screening anti-HCV nei servizitrasfusiona/i (S. T.) italiani. RiS!tltati relativi al trtennio I992!94 ..................... Pag. 22IMaria Orlando, Alessandra Barca, F1avia Cbiarotti, Giuseppina Ruggia,Giuseppe Pizzocolo.

' ..lINTRODUZIONEMaria RapicettaLaboratorio di VirologiaIstituto Superiore di Sanità - RomaSono trascorsi più di cinque anni dalla identificazione del virus dell'epatite C(HCV) quale principale agente eziologico deUe epatiti post-trasfusionali e sporadicheprecedentemente classificate nell'ambito delle epatiti di tipo non-A, non-B.Negli ultimi 2-3 anni si è avuto un notevole progresso delle conoscenze sulla strutturagenomica virale. n significativo sviluppo che ne è derivato, per quanto concerne i metodisperimentali di rilevamento dei marcatori viraJi e lo studio dei prodotti di espressione invari sistemi procariotici ed eucariotici ha avuto, inoltre. una rapida applicazione nelcampo delle scienze mediche.In un considerevole numero di pazienti con epatite acuta e cronica di tipo non-A,non-8 e di tipo autoimmune e di pazienti con cirrosi ed epatocarcinoma è stato possibileeffettuare la correlazione della malattia con l'infezione da HCV. I valori di prevalenza deimarcatori virali nelle varie aree geografiche ed i meccanismi di trasmissione dell'infezionesono sufficientemente identificati, sebbene sia ancora oggetto di studio l'importanzaepidemiologica dei meccanismi di trasmissione verticale e sessuale e parenteraleinapparente.Lo screening di tutte le donazioni di sangue, applicato a partire dal 1990, haridotto in modo sostanziale l"incidenza dell'infezione correlata alla somministrazione disangue e suoi prodotti.Nel campo della ricerca virologica numerosi studi sono stati dedicati alladefinizione dei livelli di variabilità del genoma virale, nei differenti isolati, ed alle possibiliimplicazioni in campo biologico e patogenico. Sono in atto tentativi classificazioni cheincludono fino a 9 genotipi e vari subtipi. I dati di queste ricerche hanno un notevoleimpatto oltre che neUa definizione di appropriate strategie per un'accurata diagnosi e per

2un'appropriata selezione dei pazienti ai fini dell'efficacia dei trattamenti terapeutici,soprattutto nel campo della ricerca per lo sviluppo di vaccini per una profilassi specifica.Il Seminario di cui vengono riportati gli atti in questo volume, costituisce il IIIincontro, presso l'Istituto Superiore di Sanità, dopo quelli del 1990 e del 1992. Vienetrattata l'infezione da HCV, nei suoi principali aspetti virologici e patogenetici, perquanto concerne le più recenti acquisizioni disciplinari e sono discusse le relativeimplicazioni nella pratica diagnostica e clinica e nella profilassi.

-}..3HCV STRUCTURAL PROTEINS: EXPRESSION IN DIFFERENT ANIMALCELLSTatsuo MiyamuraDepartment ofVirology Il, National Institute ofHealth, Toyama 1-23-1, Shinjuku-ku,Tokyo 162, Japan.Hepatitis C virus (H CV) is the most important causative agent of post-transfusionand sporadic non-A, non-B hepatitis. HCV has a positive-senso RNA genome ofapproximately 9.4 kilobase which encodes a large polyprotein of about 3,000 antinoacids [l). Since effective replication system in tissue culture ceUs has been reported, it isnot yet known how the structural proteins of HCV are synthesized, processed and finallyforrn virus particles during the course of virai replication. The analyses of the structureof the HCV genome, the comparativo study of its antino acid sequence with those offtavi- and pestiviruses, in vi(ro tranSiation of HCV -RNA and gene expressionexperiments in Escherichia coli, yoast and animai cells hsve revealed thst the structuralproteina are procossed by a host cellular signalase and the remaining nonstructuralproteins, NS2-NSS, are cleaved by virus-coded proteinases (Fig. l) [2-9).We hsve cloned a typo lb HCV cDNA from a patient with hepatitis C andexpressed it using (i) recombinant baculoviruses [IO, Il], (ii) repUcation-deficientrecombinant adenoviruses [12), (iii) transient expression in COS cells under the contro!offoreign promoters derived from the SV40 early genome [4, 13) and (iv) constitutiveexpression in human hepatic cells by using promoter of tho human polypeptide chainelongation factor which is useful to obtain stable transfectants [ 14). Processing andimmunological properties of the HCV structural proteins will ho discussed .The HCV Core protein (p22) is unglycosylated protein of about 22 kilo-dalton(kD) encoded by the S' proximal portion ofthe large open reading frame (ORF) (16). ltis considered lo be composed of 191 amino acids (5). lt is rich in arginino and lysineparticularly at its N-tenninus (23.5%), as are those offlaviviruses, and it can bind to the

4RNA genome to form a nucleocapsid of an HCV virion.Although their hydropathyprofiles look similar, distinct amino acid homology among HCV, pestiviruses andflaviviruses is not detectable in this region of the genome. Because of the presence ofextremely hydrophobic domains at its carboxyl (C) terminus, the p22 protein i.s expressedin the cytoplasm ofanimal cells [4, IO]. When the C-terminai hydrophobic domains weredeleted, however, the truncated Core proteins were translocated into the nucleus [16]The truncated Core proteins were located in the nucleus even when they were expressedas a fusion protein with E.coli 13-galactosidase which is essentially localized in thecytoplasm. Plasmids containing HCV cDNAs with one of the regions encoding clustersofbasic amino acids deleted were expressed in COS cells and the localization ofthe Coreprotein was examined. The residues PRRGPR were suggested to play an important rolein nuclear localization. This phenomenon reminds us of the assembly of anchored Coreprotein of flaviviruses, during which it is converted t o mature Core protein by remo val ofthe C-terminai hydrophobic segments. In the case of W est Nile virus, the cleavage isdane by virai proteinase [16]. In the cells infected with recombinant vaccinia virus [8] orrecombinant adenovirus [12], transfected with expression plasmid and constitutivelyexpressing HCV Core protein [14], a truncated Core protein of 16 kD was also detected.The mechanisms of production, biological function and localization of the truncated Coreprotein are not known.The envelope protein (El and E2) regions are located downstream of the Coreregion. The El protein (gp35) is a glycosylated protein of about 35 kD. Afterdeglycosylation of the expressed product in animai cells, this protein band shifts to 22 kD[13]. It is composed of 192 amino acids. The amino acid sequence in this region is notconseiVed as much as that of the Core region among different HCV isolates. The E2region may encode the second envelope protein, gp60 [17]. The hydrophobic profile ofthe HCV polyprotein suggests that the HCV E2 protein corresponds to the flavivirusNSI glycoprotein and the major pestivirus . envelope protein . gp53/gp55 (E2) (gp53 inbovine virai diarrhea virus and gpSS in hog cholera virus).[18, 19]. Both flavivirus NSIprotein and pestivirus E2 protein bave been shown to induce protective immunity inimmunized animals [20-22]. There exist extremely hypeJVariahle sequences among(

..sdiJferent HCV isolates [23, 24). The heterogeneity ofthis region is also observed even insingle patients during the course of the disease. This raises a serious concem for thefuture development of'eftèctive vaccine for hepatitis C. Recently. immunoprecipitationexperiments with specific monoclonal antibodies ha ve suggested that the E l and E2proteins fonn a disulfide-linked heterodimer in pestiviruses [18] [25). Similarly,coprecipitation of E I and E2 proteins of HCV has also been detected in cells transientlyexpressing these two proteins [12). The molecular size of the HCV E2 produCI varies(from 58 to 72 kD) in different lahoratories and ditferent expression systetns [5, 6-8, 17,26-28].Amino acid sequences of Core protein are highly conserved among ditrerent HCV typesisolated and analyzed so far. The Core protein is sufficiently immunogenic to raisespecific antihody. Therefore, an antibody to HCV Core protein is found with highfrequency in the serum of patients with hepatitis C [ 10]. A recently developed antibodydetection assay using the p22 protein is effective for screening blood and for precisediagnosis of hepatitis C. On the other band, antihody to the E l protein is detectable inonly 10-20"/o of patients with hepatitis C at various stages of infection and in some rarehepatitis C cases who recovered naturally from the disease [13]. These observationsindicate that anti·El antibody might bave some neutralizatioo activity. The coexistenceof anti-El antibody with HCV in patient serum might reflect the appearance of escapemutants or mixed infèctions of serologically ditrerent types of HCV. In spite of thepresence of hypervariahle regions within the E2 region of the HCV genome, antibody t oE2 protein is found with very high frequency among hepatitis C patients, usingimmunofluorescence or ELISA assays. However. when the antigen is denatured by SDSfor Western blotting, the detection rate is lower [17, 26, 29]. These data, together withthe observation suggesting the formation of heterodimers of the E l and E2 proteins,indicate that the envelope proteins ofHCV constitute complex tertiary structures. As yetthere is no system for direct detection of antibody t o the natura! E I-E2 protein producedduring the course of HCV infection. Il is of extreme importance to analyze the native

6HCV proteins in detail. lt is also vital that nove! sensitive diagnostic tests as well as anetfective vaccine are deveJoped.Structural proteinsNonstructural proteinsNS2NS3NS4NSSb a b3'p22 gp35 gp60-70 p24p70 p8 p27 p58 p68References:l. Houghton M, Weiner A, Han J, Kuo G, Choo QL, (1991). Molecular biology ofthehepatitis C viruses: implications for diagnosis, development and contro! of viraidisease. Hepatology 14: 381-388.2. Kato N, Hijikata M, Ootsuyama Y, Nakagawa M, Ohkoshi S, Sugimura T,Shimotohno K, (1990). Molecular cloning of the human hepatitis C virus genomefrom Japanese patients with non-A, non-B hepatitis. Proc Nati Acad Sci USA B.Z:9524-9528.3. Takarnizawa A, Mori C, Fuke l, Manabe S, Murakarni S, Fujita J, Onishi E, AndohT, Yoshida l, Okayama H, (1991). Strutture and organization of the hepatitis Cvirus genome isolated from human carriers. J Viro! 65: 1105-1113.4. Harada S, Takeuchi K, Suzuki T, Katayarna T, Watanabe Y, Takebe Y, Saito I,Miyamura T, (1991 ). Expression of processed Core pr~ein of hepatitis C virus inmammalian cells. J Virol65: 3015-3021.(

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814. Harada T, Kim DW, Sagawa K, Suzuki T, Takahashi K, Saito I, Matsuura Y,Miyamura T, (submitted). Establishment aod characterization of a human hepatocyteclone constitutively expressing nonstructural proteins ofhepatitis C virus.15. Takeuchi K, Kubo Y, Boonmar S, Watanabe Y, Katayama T, Choo QL, Kuo G,Houghton M, Saito I, Miyamura T, (1990). The putative nucleocapsid aod envelopeprotein genes of hepatitis C virus determined by comparison of the nucleotidesequences of two isolates derived from an experimentally infected chìmpanzee andhealthy humao caniers. 1 Gen Virol1.!: 3027-303316. Suzuki R, Matsuura Y, Suzuki T, Ando A, Chiba J, Harada S, Saito l, Miyamura T,(1995). Nuclear localization ofthe truncated hepatitis C virus Core protein deletedin its hydrophobic C-terminus. 1 Gen Viro! 76: 53-6117. Harada S, Suzuki R, Ando A, Wataoabe Y, Yagi S, Miyamura T, Saito I,(submitted). Establishment of a cellline constitutively expressing E2 glycoprotein ofhepatitis C virus and humoral responce of hepatitis C patients to the expressedprotein.18. Rumenapf T, Unger G, Strauss JH, Thiel HJ, (I 993). Processing of the envelopeglycoproteins ofpestiviruses. 1 Virol67: 3288-329419. Miller RH, Purcell RH, (1990). Hepatitis C virus shares amino acid sequencesimilarity with pestiviruses and flaviviruses as well as members of two plant virussupergroups. Proc Nati Acad Sci USA 87:2057-206120. Hulst MM, Westra DF, Wensvoort G, Moomann RJM, (1993). Glycoprotein E2 ofhog cholera virus expressed in insect ceJis protects swine from hog cholera. J Viro!67: 5435-5442.21. Scltlesinger JJ, Brandriss MW, Walsh EE, (1985) Protection against I7D yellowfever encephaJitis in mice by passive transfer of monoclona1 antibodies to the nonstructuralglycoprotein gp 48 and by active immunization with gp 48. 1 lmmun 135:2805-2809.22. Zijl MV, Wensvoott G, Kluyver ED, Hulst M, Gulden HVd, Gielkens A, Bems A,Moonnann R. (1991). Live attenuated pseudorabies virus expressing envelope(

J9glycoprotein E2 of hog cholera virus protects swine against both pseudorabies andhog cholera. J Viro! Qi: 2761-2765.23. Weiner AJ, Geyseri·HM. Christopherson C, Hall JE, Mason TJ, Saracco G, BoninoF, Crawford K, Marion CD, Crawford KA, Barr PJ, Miyarnura T, McHutchinson J,Houghton M, (1992). Evidence far immune selection of HCV putative envelopeglycoprotein variants: potential role in chronic hepatitis C virus infection. Proc NatiAcad Sci USA 89: 3468-3472.24. Hijikata M, Kato N, Ootsuyama Y, Nakagawa M, Ohkoshi S, Shimotohno K,( 1991 ). Hypervariable regions in the putative glycoprotein of hepatitis C varus.Biochem Biophys Res Commun ili: 220-228.25. ThiellU, Stark R. Weiland E, RumenapfT, Meyers G, (1991). Hog cholera virus:molecuJar composition ofvirions from a pestivirus. J Viro! 65: 4705-4712.26. Lanford RE, Notvall L, Chavez D, White R. Frenzel G, Simonsen C, Kim J, ( 1993).Analysis of hepatitis C virus capsid, E l, and E2/NS t proteina expressed in insectcells. Viro1ogy 197: 225-236.27. Ralston R, Thudium K, Berger K, Kuo C, Gervaso B, Hall J, Selhy M, Kuo G,Houghton M, Choo QL, (1993). Characterization of hepatitis C virus envelopeglycoprotein complexes expressed by recombinant vaccinia viruses. J Viro! 67:6753-6761.28. Spaete RR, Alexander D, Rugroden ME, Choo QL, Berger K, Crawford K, Kuo C,Long S, Lee C, Ralston R. Thudium K, Tung JW, Kuo G, Houghton M, (1992).Characterization of the hepatitis C virus E2/NS 1 gene product expressed inmarnmalian cells. Virology 188: 819-830.29. Chien DY, Choo QL, Ralston R. Spaete R. Tong M, Houghton M. Kuo G, (1993).Persistance of HCV despite antibodies to both putative envelope glycoproteins.Lancet 342: 933.

IOHCV DETECTION IN BLOOD TRANSFUSIONCees L V an der PoelRed CrossBlood Bank Ulrecht, Rubenslaan 190,3582 JJ Utrechl, The NetherlandsSensitivity of anti-HCV blood donor trstingAfter the originally isolated hepatilis C virai (5-1-1) clone, lesting for antibodies lo thecausative agent of post-transfusion hepatitis non-A, non-B (PTH-NANB) became possible.At present third generation anti-HCV ELISA's (EUSA-3) include recornbinant or peptideantigens front lhe putative Core, NS3, NS4 and NS5 HCV regions (Figure). These BLISA-3systems are now widely used in blood donar screening, and are more sensitive and morespecific !han earlier generations (1, 2). The sensitivity ofELISA-3 blood donor screening, interms ofprevention ofHCV transmission and subsequenl post-transfusion hepatitis C (PTH­C) in recipients of blood is now practically l 00%. Situations may occur when antibody lestsdo not detect HCV infection. Immuno-suppressed palient~ such as renal transplant patients,may sometimes be anti-HCV antibody negative but remain HCV infected, but suchindividuals are noi likely to donate blood. More relevant to blood transfusion services is theperiod of early HCV infection in an asymptomatic donor. lt may take as long as 6 monthsalter primary infection for an anti-HCV response to develop, the mean period between HCVinfection and detectable antibody being 12 weeks (3). Although rare, a HCV infecteddonation nùght thus be missed by present anti-HCV screening. lgM anti-HCV antibody testsemploying Core proleins bave been evaluated, but were of no additional value in diagnosis ofacute HCV infection.Specificity and confinnation of anti-HCV blood donor testingEven with the high specificity (99. 7%) of anti-HCV BLISA-3, fàlse-positive testresults are relatively common arnong blood donors 2 . Tbe pOsitive predictive value ofthe testdepends on the prevalence in the population, which is very Jow. Therefore anti-HCV ELISAreactivity needs lo be coofirmed with supplernental assays.{

IlFor confinnation of positive anti-HCV ELISA test resq!ts, different fonnats such asrecombinant immunoblot assays (RIBA TM. Chiron) and synthetic peptide assays (lnno-LùoiM,Innogenetics) are developecf· Al present, the in Europe widely used third geoennion RIBAsystem (RIBA-3) employs synlhetic peptides from the Core, and NS4 regions, andrecombinant antigens from the NS3 and NSS regions. The preparation of HCV anrigens maydiffer among rnanulàcturers of supplemental assays, which in the case of NS3 is important,with regard to conformational epitopes. A modification of a (NS3 derived) C33 antigen wasshown to largely enhance the sensitivity of the RIBA-3 system as compared to the previousgenerati an l.3. RIBA-3 results are interpreted as confinned positive when antibodies t oantigens ofmore than one HCV region are detected. A high proportion, but not ali (75-80"/o)of such HCV RIBA-3 positive individuals are viraemic, as detected by HCV cDNA-PCR.RIBA-3 positive but HCV cDNA-PCR negative individuals may bave cleared the virus fromthe circulation after previous infection, they may be viraernic below the PCR detection leve!,or just represent false positive anti-HCV antibody reactivity. Negative HCV cDNA-PCR inserum of anti-HCV RIBA positive asymptomatic individuals was sbown to correlate withnorma! histological frndings in liver biopsy, probalbly indicsting clearance of the virus (4).However in hepatitis C patients treated with anti-viral drugs, HCV viraemia may re-occurafter a PCR negative period, indicating the possibility ofHCV RNA below the HCV cDNA­PCR detection level or presence oflNC in non-blood compartments. In tenns of notificati anof the deferred blood donor, RIBA-3 confrrrned positivity combined with negative cDNA­PCR represents a diagnost.ic problem. Most of these donors have a history of an overt riskfactor for parenteral exposure to HCV, suggesting that positivity of the RIBA-3 representstrue HCV infection, rather than non-specific reactivity (S).Indetenninate anti-HCV results in blood dononOflen anti-HCV antibody reactivity is found against orùy o ne of the HCV antigens ofthe supplemental assay. Such pattems are interpreted as indetenninate, and may representnon-specific IgG binding, resolved (PCR negative) HCV infection, or actual HCV viraemia.Among healthy blood donors, indetenninate RIBA results most often represent non-specificreactivity, but since RIBA-3 is more specific than RIBA-2, the numbers of such RIBA

12inderminate test results are now largely reduced (5). However, during the initial period of anacute HCV infection with increasing anti-HCV antibody response, one may occasionally findweak or indeterminate anti-HCV RIBA reactivity, and rarely individuals with "sero-reversion"after previous HCV infection, may show RIBA indetenninate test results aver prolongedperiods of time. It is therefore advisable to al so re-confinn RIBA indetenninate test results inblood donors with HCV cDNA-PCRConfinnation of HCV infection by PCRGiven the mentioned limitations of anti-HCV antibody testing. detection of HCVviraemia is often indicated. As a result ofthe low titers ofHCV RNA, amplification ofnucleicacid is needed. A most frequently followed protocol is performed by PCR after a reversetranscriptase (RT) step, transcribing the vira! RNA into cDNA (6, 7). HCV cDNA-PCR hasevolved from a research tool into a widely used diagnostic test, the most frequent applicationsbeing: confirmation ofHCV infection in individuals with RIBA positive or indeterminate anti­HCV antibody test resu1ts, early diagnosis in patients with acute hepatitis, monitoring ofHCVtransmission in epidemiological studies, and follow-up of anti-viral drug treatment. Childhooddiseases of upscaling this high-tech diagnostic bave been encountered, and a first Europeanproficiency pane! revealed only 16% ofthe laboratories to yield faultless HCV cDNA-PCRresults, a picture that was not dramatically changed by a more recently perfonned proficiencypane! (8). lt could be expected that commercia! availability ofHCV RNA amplification mightimprove the standardisation and reliability of such assays. In addition, estimation of the HCVWus load was shown to be of importance not only in monitoring anti-viral therapy, but alsobecause of the correlation of high virus loads with more severe histological abnonnalities inthe liver (9). An elegant method to quantitate HCV RNA under standardised conditions wasdeveloped by Chiron Corporation, where signa1 amplification in a hybridisation assay withbranched DNA (bONA) molecules was used to provide a linear correlation between testsignal and virus titre over a 3-4 logs range. However the bDNA assay is about 3 logs lesssensitive than cDNA-PCR, resulting in only 7rJ'/o of the HilV cDNA-PCR positive samplesbeing detected by HCV bDNA assay. Another commercially available HCV PCR assay,ernploying one single enzyme for reverse transcription and DNA polymerisation was recently(

13introduced, and yields reasonable results as compared to domestically developed HCV -cD NAPCR methods (IO).Transaminase testingAssessment of hepatitis C virus infection includes serum transaminase testing. Asalresdy observed in the previous decades, chronic NANB (C) hepatitis is chsracterised byfluctuating levels of alanine arninotransferase (AL T), or long term marginai AL T elevations atdose range to normal values. It was shown that 60"/o of the HCV infected individuals bavenormal ALT values in transversal studies, and that the ml\iority (80%) of asymptomstic HCVviraemic but AL T normal individuals bave chronic persistent or chronic active hepatitis(CPH/CAH) with or without cirrhosis (Il). A normal ALT value in HCV infection istherefore of limited diagnostic value. In addition, 70% of PCR/RIBA conlinned positiveblood dono111 bave a normal ALT leve! (12). The sensitivity far ALT screening of blooddono111 was calculated at 30%, 40%, and 60"/o in the USA, Japan, and Europe respectively( 13-15). It is doubtful whether continuation of AL T testing of blood dono111 in countrieswhere this test was introduced as a surrngate marker far PTH-NANB infection, would stiliadd to the safety of the blood supply, now tbat third generation anti-HCV testing isestablished.Importance of risk facton in blood do nonThe main mute ofHCV transmission is parenteral, and the majority ofHCV infectedindividuals are either recipients of blood products that had previously not been screened faranti-HCV, or intravenous drug use111 (IVDU), especially pe1110ns who in the past injecteddrugs only occasionafly, and do not percieve thernselves as a risk group of parenteral virusinfection (12). Incidental parenteral risk factors also include tattoo and needle stick accidentsamong health care workers. Proper assessment of such risk factors is of great irnportance fardonar selection procedures. in arder to reduce the chances that a donar with early HCVinfection escapes the blood screening with anubody tests. In addition, the presence of ahistoty of parenteral risk factors may help in diflicult diagnostic situations i. e.: conflictingRIBA l PCR results.

14Breaking the chainAs in low-prevalence countries 40-500/o of the HCV infected blood donors haveacquired the infection by recieving blood transfusions themselves, blood transfusion in thepast played a significant role in maintaining an epidemiologica1 vicious circle.The main consequences ofHCV infection are chronic, HCV being persistent in about 800/o ofthe cases, leading to chronic hepatitis, cirrhosis and probably to hepatocellular carcinoma(HCC) (Il, 16). Retrospective analy~s of followed-up transfusion recipients with HCVassociateci HCC in Japan, showed a progression of chronic hepatitis C, cirrhosis and HCCafter a mean interval of respectively l O, 19 and 29 years after transfu~on ( 17) Recent reponson the chronic sequelae of HCV infection thus leave a more pessimistic impression thanpreviously imagined from the earlier follow-up studies on chronic NANBH patients whenHCV testing was not available. Apart from the recent scientific achievements on HCVvirology, inununology and treatment, the ·screening ofblood donors for anti-HCV, resultingin practically the elimination ofpost-transfusion hepatitis Cis the major milestone.(

3'n tHCV eocoded antigeos upressed (or diagoostic anU..bcv antibody detection in recombinant immuooblots (RIDA).,.·-... .,HCV recombinant & peptide antigensstructural non-structural5'---- c I~;·~;~;1r;-I ~-~~~-.l~ _;~~ -_l_-~- -~-~--- NS6-PCR.. ~ ][E~][E2JNs!]~~~ NS3 ] ~S4j l N~5.-laa "'C1005-1-1-C22-- C33cC200C22 111 C33c NS55-1-1 l C100 1 •

l16References:l. Couroucé AM, Bouchardeau F, Girault A, et al., (1994). Significance ofNS3 andNS5 antigens in screening for HCV antibody. Lancet 343: 853-854.2. Busch MP, Tobler LH, Francis BS et al., (1994). Re-instatement ofdonors who testfalse·positive in second·generation hepatitis C virus enzyme immunoassay shouldawait availability oflicensed third-generation tests. Transfusion 34: 130-134.3. V an der Poel CL, Vrielink H, Reesink HW, et al., (1993). Detection of anti-HCVseroconversion with new third generation HCV ELISA (ELISA-3) and lmmunoblot(RIBA-3). Transfusion 33 (suppl.): S-121.4. Alberti A, Morsica G, Chemello L, et al., (1992). Hepatitis C viraemia and liverdisease in symptom-free individuals with anti-HCV. Lancet 340: 697-698.5. Zaaijer HL, Vrielink H, Van der Poel CL, et al., (1994). New inuounoblot resolvesindeterminate results for antibody to hepatitis C virus. Transfusion 34: 184.6. Weiner AJ, Brauer M, Bradley DW, et al., (1990). Detection of hepatitis C vira!sequences in non-A, non-B bepatitis. Lancet ill: 1-3.7. Bukh J, (1992). Importance of primers selection for the detection of hepatitis Cvirus RNA with the polymerase cbain reaction assay. Proc Nati Acad Sci 89: 187-191.8. Zaaijer HL, Cuypers HTM, Reesink HW, et al., (1993). Reliability of polymerasecbain reaction for detection ofhepatitis C virus. Lancet ili: 722-724.9. Lau JYN, Davis GL, Knifen J, et al., (1993). Significance ofhepatitis C virus RNAlevels in chronic hepatitis C. Lancet 341: 1501-1504.IO. Tilston P, Morris DJ, Klapper PE, et al., (1994). Commercia! assay for hepatitis Cvirus RNA. Lancet 344: 201-202Il. Esteban n, Lopez-Talavera JC, Genesca J, et al., (1991). High rate ofinfectivity andliver disease in blood donors with antibodies to hepatitis C virus. Ann Intero Medill: 111-112.12. Van der Poel CL, Cuypers HTM, Reesink HW, et ai., (1991). Risk factors in HCVinfected blood donors. Transfusion ll: 777-779.

' l1713. Zuck TF, Sherwood WC, Bove JR, (1987). A review of recent events related tosurrogate testing of blood to prevent non-A. non-8 posttransfusion hepatitis.Transfusion 27: 203-2

18SAGGI DI SCREENJNG E SAGGI ADDIZIONALIAnna Rita Ciccaglione, Maria RapicettaLaboratorio di Virologia. Istituto Superiore di Sanità, RomaI saggi di screening utilizzati per il rilevamento di infezione da virus dell'epatite ditipo C (HCV) sono basati su metodiche immunoenzimatiche di tipo indiretto cheevidenziano anticorpi specifici. Non sono al momento disponibili saggi in grado disvelare la presenza di antigeni virali da campioni sierici. I saggi per il rilevamento diHCV -RNA. diffusamente applicati in ambito diagnostico nei laboratori a più elevatolivello di specializzazione, sono in via di standardizzazione per un più ampio impiegoattraverso l'allestimento di kit commerciali.Le caratteristiche di sensibilità e specificità dei saggi immunoenzimatici sonoinfluenzate dal tipo di antigeni impiegati ed inunobilizzati alla fase solida oltre che dallecondizioni di standardizzazione delle concentrazioni dei singoli reagenti e dai tempi edalle temperature utilizzate nello sviluppo della reazione. La scelta del tipo di antigenecoinvolge il sistema di produzione (sintesi diretta o espressione in cellule procariotiche oeucariotiche) e fattori legati al virus. quali, la porzione genomica viraJe da cui l'antigene èdedotto, la funzione del suo prodotto di espressione durante il ciclo replicativo virate e lacapacità di indurre anticorpi circolanti_I progressi ottenuti con un ritmo molto rapido negli ultimi tre anni e che hannoportato al passaggio dai saggi di I generazione ai saggi di II e III generazione, con unnotevole miglioramento delle possibilità diagnostiche nell'infezione da HCV, sonopertanto avvenuti in stretta dipendenza dal progresso delle conoscenze sulla sequenza estruttura del genoma virale e delle proteine codificate, sul loro significato biologico esuUe caratteristiche immunogeniche oltre che sul tipo di anticorpi prodotti e sulla loropersistenza nelle principali fasi dell'infezione e nelle diverse categorie cliniche_I saggi di Il e III generaziooe liOilO risultati in grado di rilevare, nella maggior partedei casi di infezione da HCV la presenza di anticorpi Specifici. Permane tuttavia unapercentuale di casi non definiti, in alcuni studi valutata intorno al l 00/o con i saggi di IIgenerazione, ed un intervallo variabile di tempo successivo alla fase acuta dell'infezionein cui tali anticorpi non sono rilevabili. Non sono disponibili saggi in grado dì(

;19differenziare la fase acuta dalla fase cronica ed un considerevole numero di reazionifalsamente poflitive si verifica particolarmente nei sieri di popolazioni a bassa prevalenzadi infezione.Vari fattori possono influenzare la sensibilità dei saggi di screening. I recenti studisulla variabilità genetica deU'HCV hanno evidenziato le sue implicazioni non solo dalpunto di vista biologico e patogenico ma anche nel campo deUe diagnosi.L'eterogeneità genetica deii'HCV è stata messa in evidenza non appena sono statidisponibili i dati deUe sequenze ottenute da differenti isolati. anche proverùenti dallastessa area geografica. E' ormai noto che la popolazione virate è presente neJrospite conuna distribuzione di tipo "quasispecie", cioè di una popolazione di RNA correlati intornoad una sequenza dominante. L'analisi sulrintera sequenza del genoma di isolati diversi hapermesso la classificazione in due genotipi ciascuno suddiviso in due subtipi (l/la, Ulb,II/2a, II/2b) e l'analisi di sequenze parziali nelle porzioni genomiche 5'NC, Core, NS l edNSS di isolati da varie parti del mondo, ha permesso provvisorie classificazioni cheincludono fino a 9 genotipi e differenti subtipi (l).L'eterogeneità è variabile nelle differenti porzioni genomiche e le percentuali piùelevate di omologia sono state osservate neUa regione 5'NC (92%) Core (81%) ed NS3(70"/o) mentre per le altre regioni sono stati osservati valori dal 55% (El) al 65% (E2,NS4) e 66% (NS5) (2). Questi dati sono aUa base della scarsa sensibilità osservata con isaggi ELISA di I generazione in cui erano esclusivamente presenti antigenicorrispondenti alla regione NS4 del subtipo la. La percentuale di reattività per l'antigeneCl00-3 (corrispondente alla regione NS4) è risultata essere del90"/o nei sieri di donatoriinfetti con l'HCV tipo I e solo del 30% e 34% nei donatori infetti con HCV tipo II e tipolii (3). Anche la reattività per l'antigene C33, corrispondente alla regione NS3 e presentenei saggi ELISA di II generazione.. è risultata significativamente più bassa per l'HCV ditipo III rispetto al tipo L Valori di maggiore concordanza sono stati osservati. nell'ambitodi sieri ottenuti da individui infetti con i tre genotipi. per quanto riguarda la reattività neiconfronti di C22, corrispondente alla regione del Core. Questa regione presenta infatti lamaggiore percentuale di conservazione della sequenza aminoacidica (90%).Tuttavia i dati reali di quanto i saggi ELISA di II e lii generazione che includonoC 100-3, CJJ e C22 siano efficienti nel rilevamento delle positività di anti HCV,susseguentemente ad infezione da genotipi di HCV differenti dal tipo I e soprattutto danuovisubtipi. non sono attualmente definiti.

20Un altro fattore di fondamentale importanza per l'efficienza dei saggi di screening èdato dal tempo di comparsa. dopo l'infezione, di vari anticorpi attualmente rilevabili. ldati degli studi effettuati in scimpanzé hanno mostrato che tale periodo è dilazionato, conl'impiego di saggi di Il generazione, fino a 18 settimane dall'inoculazione, per glianticorpi anti CI00-3 e fino a 15 settimane per gli anticorpi anti C33 ed anti Core (4). Inogni caso in tempi di comparsa dei vari marcatori incluso I'HCV-RNA sono variabili neivari scimpanzè inoculati, anche se generalmente la comparsa dianti CI00-3 è più tardivaI dati sui campioni sierologici seriati, in casi di infezione acuta nell'uomo,confermano la presenza di una notevole variabilità, anche per quanto concerne lapersistenza nel tempo e l'entità della risposta anticorpale. Studi prospettici effettuati supazienti di epatite post-trasfusionale hanno indicato che gli anticorpi verso la proteina difusione CI00-3 compaiono dopo parecchie settimane (da 5 a 50 settimane), dall'iniziodella fase acuta (5) e persistono durante la fase cronica, riflettendo probabilmente lareplicazione virale.Studi effettuati con oligopeptidi sintetici hanno fatto rilevare l 1 esistenza di epitopiimmunodomina.nti presenti sia nel dominioC-tenninale che nella regione S-1-1, ilframmento di 42 aminoacidi, della CI00-3 (6) utilizzato nel saggio di l generazione. Talesaggio si è dimostrato utile nello stabilire il ruolo predominante dell'HCV all'interno delleepatiti non-A,non-B e la sua persistenza ad elevati livelli di OD è probabilmente disignificato prognostico, tuttavia studi successivi hanno messo in evidenza una sensibilitàe specificità insufficienti per la sua utilizzazjone, come antigene isolato, nei saggi discreening (7). l saggi di n generazione che includevano antigeni derivati dalla proteinacapsidica, espressa come proteina di fusione, e dalla regione non-strutturale NS3 sonorisultati più sensibili. La comparsa di anticorpi anti-NS3 (C33) e anti-Core avvienesignificativamente prima degli anticorpi anti-NS4 (CI00-3) (8). La presenza di talillll.igeni è pertanto indispensabile nel rilevamento delle infezioni acute. Inoltre glianticorpi verso il Core possono anche essere gli unici marlrers sierologici d 1 esposizioneali'HCV a persistere per parecchi anni dopo la guarigione.Differenze sono state dimostrate in relazione allo stato di immunooompetenza deipazienti. Infatti nei soggetti parzialmente imnwnodepressi (dializzati, ernofilici, neonati)lo spettro anticorpale risulta più frequentemente incomPleto particolarmente per quantoconcerne la presenza di anticorpi anti CI00-3 (9).Queste osservazioni trovano riscontro nel1 1 esame dei sieri di una popolazioneaperta per quanto concerne la presenza deUe singole reattività anti HCV. In un campione(

21di 500 sieri di popolazione a rischia con un valore globale di prevalenza del 25% lapresenza relativa degli anticorpi è stata osservata per quanto concerne anti Core nel 94%dei casi positivi, anti NS3 riel93%, anti NS4 nel 75%, anti El nel44%, anti E2/NSI nel38% ed anti NS5 nel 69% (l 0).In base a tutti questi dati risulta indispensabile ai fini della sensibilità delrilevamento la contemporanea presenza di differenti antigeni virati. Peptidi specificicorrispondenti ad epitopi variati potrebbero essere inclusi nei saggi per l'identificazionedelle reattività correlate a differenti genotipi virali. Fondamentale importanza rivestonoinoltre gli studi rivolti all'identificazione di antigeni contenenti epitopi significativi e disistemi di espressione adatti al mantenimento delle loro caratteristiche confonnazionalLStudi immunologici hanno dimostrato la presenza di due epitopi principali nellaporzione N-terminale della proteina del Core (porzioni 5-23 e 39-74) e probabilmente diun epitopo minore vicino alla sua porzione C-tenninale (Il). L'uso di peptidi sinteticicorrispondenti alle regioni immunodominanti N-terminali pennette il rilevamento dianticorpi e porta ad un miglioramento nella sierodiagnosi della infezione da HCV (12).Studi ulteriori sono necessari per stabilire il significato degli anticorpi prodotti contro leproteine dell'envelope E l ed E2. Infatti i risultati di immunoreattività dei sieri infetti neiconfronti delle proteine envelope prodotte in vari sistemi di espressione risultanovariabili. L'espressione della proteina E l in baculovirus ha permesso, in un primo lavorodi rilevare la presenza di anticorpi anti-El in una percentuale di pazienti cronici compresatra il 2% e il 17%. Tuttavia in uno studio successivo, anticorpi anti-E2, espressa inbaculovirus, sono stati rilevati nel 28% dei pazienti cronici. Analogamente la proteina E2espressa in baculovirus ha dato valori di positività per gli anticorpi anti-E2 compresi tra il13.4% e il 28% dei pazienti cronici, in un primo studio (13) e del 92% in uno studiosuccessivo (14). L'espressione delle proteine El ed E2 come proteine di fusione nellievito, ha pennesso di rilevare una immunoreattività nei sieri di pazienti cronici paririspettivamente al 61 o/o e 58%. L'espressione delle stesse proteine in "vaccini a virus",quindi in una fanna glicosilata più vicina alla forma nativa, ha consentito di ottenere unapositività maggiore, pari al 97% nei soggetti cronici (15). L'utilizzazione di due peptidisintetici PI e P2 corrispondenti alle regioni 210-223 e 315-327 della proteina El hamesso in evidenza la presenza di anticorpi anti-PI nel 44.7% nei pazienti e anti-P2 nel92.1% di una popolazione di donatori (16).

22I risultati ottenuti sembrano quindi indicare che la reattività immune nei confrontidelle proteine dell'envelope risulta variabile e dipendente dalla popolazione clinicatestata, dall'area geografica esaminata oltre che dal sistema di espressione utilizzato perprodurre l'antigene ricombinante.Tutte le considerazioni sopra esposte valgono anche per i saggi supplementariattualmente impiegati per conferma della positività, basati su metodologie diimmunohlolling in membrane di nitrocellulosa, che pennettono di evidenziare le singolereattività in forma isolata. Anche per questo tipo di metodiche sono stati allestiti saggi diHl generazione in cui oltre all'aggiunta dell'antigene relativo alla regione NS5 sono statrriformulate le composiziorll degli antigeni C22 e C33. Il saggio, poichè include gli stessiantigeni dei saggi di screening, prodotti con differenti metodologie, può essereconsiderato supplementare piuttosto che di conferma, costituisce tuttavia allo statoattuale un importante strumento dii\gnOstico.La Tab. l riporta i principali saggi attualmente in uso in Italia, la natura e posizionegenomica relativa degli antigeni presenti, il tipo di coniugato e substrato impiegati nellareazione.Una serie di studi sono stati effettuati per confrontare i risuJtati ottenuti nelloscreening di differenti popolazioni con l'impiego di saggi di l, Jl e Ill generazione anchein rapporto alla capacità risolutiva del saggio addizionale RIBA e del saggio dirilevamento, mediante PCR, dell'HCV -RNA. Quest'ultimo saggio sebbene sia basato sulrilevamento di un marcatore virale anziché anticorpale costituisce al momento l'unicoriferimento nei casi in cui si osservi un pattern anticorpale "indeterminato" grazie allecaratteristiche di elevata sensibilità ottenute con l'impiego di primers relativi alla regionealtamente conservata 5'NC. Può, pertanto, essere utilizzato in aggiunta ai saggi discreening anche in considerazione del fatto che )•infezione da HCV ha un elevatissimotasso di persistenza e che solo il 200/e degli individui mostra successivamente all'infezionescomparsa di HCV-RNA. Il rilevamento della viremia è necessario negli individui conrisultati positivi o con risultati indeterminati aJ RIBALa Tab. 2 riporta lo schema di utilizzazione di questo marcatore allo stato attuale,in cui il non completo livello di standardizzazione dei saggi di PCR ne limita l'uso alivello di laboratori con elevato livello di specializzazione.. ·'l

}23I dati di valutazione della III generazione dei saggi di rilevamento di anti-HCVanche in rapporto alla positività per HCV-RNA hanno messo in evidenza un'incrementodella sensibilità principalfllente legata alla migliore risposta nei confronti dell'antigeneC33 (rifonnulato) particolannente in relazione alla maggiore sensibilità a livello delrilevamento nella fase precoce dell'infezione e nelle popolazioni di soggetti conimmunodepressione. E' stato inoltre osservato un notevole miglioramento per ciò checoncerne le caratteristiche di specificità. legato al rilevamento della C22 (riformulata).L'inclusione dell'antigene relativo alla regione NS5 non sembra avere influenza nellemigliorate condizioni di sensibilità in considerazione della scarsa evenienza e dellaprobabile aspecificità della presenza di anti NS5 in fanna isolata.Si può sottolineare, in conclusione, che anche se l'inclusione di antigeni relativi allequattro regioni genomiche NSJ, NS4, NS5 e Core è una condizione essenziale per unamigliorata efficienza dei saggi, rimane tuttavia aperta la strada per la valutazione di saggidi IV generazione in cui vengono ulterionnente prese in considerazione la presentazionedi epitopi immunogenici degli antigeni utilizzati (e quindi il relativo sistema diproduzione) e la perdita di sensibilità legata all'infezione con i genotipi 3,4,5 e gli altrigenotipi di recente o futura identificazione.

Darata drlsagrlo (minuti),,... -~120IlO45-60120ISOValore di cut-tlffNCx +0.600NCx +0.300NCx + (0.25) PCx0.25 PC,;0.15 PCxNCx +0.600NCx +OJ"' ...Tabe-lla 1SAGGI ELISA. PER IL RILEVAMENTO DI ANTl HCV: 111 GENERAZIONE,,r'......•Dntominnlone Ditta prodnttrinOl1ho HCV 3.0 Ortho DiagnodicsELISA test sy!tem N.J. USAAbbon HCV EIA 3.0 Abbott l .L. USAMooolisa antiHCV OiagnostiC1 Pa!teurnewanti~es FranciaUBIHCVEIA UBIN.Y.USAMure,; antiHCV ·Mure~~:VK47/48 Gran BretagnaJnnotest lnnogeneticsHCV Ab 111 BelgioAntlpnl prrRnll Siero antiii:G. amane SnbstratoDenomiRazJone Shtema di produzione Retionr pnomka (canlupto)C22-3 riCQmbinante (lievito)monocll'llll.ie murino OPDClOO.NSl-NS4 (perossidasi)"""NSS. NSSHC34 rieombinante(E. col!) c~ polk:lbnale capra OPDHC43 .Core-NS3 (perossidasi)CI00-3 ricombinante (lievito) NS3·NS4NSl . NSlNC4l0 ricombinante (E. coli)policlonale capta OPDNSJ.I. NS3 (perossidasi)"""5.1.1.NS4C36. NSlJJO(Mh prpridilsintetioo NS4 polidonale capn OPDJK243t (pero!Sidasi)""" NSl494g.NS3'""BHC2Q ricombinante NSS+ monoc:lonalr murino TMB(baculovirus) NSJ+ (perossidui)CoWEJAC90 pq~tide sintetico NS4AC91 NS4A C'> l. NS4Core2-6·10 ptptide sintetieo Co~ policlonaJe capra TMB{perossidasi)NS4-1-5·7. NS4NSS-25-27·31. NSlHCCLI9B ricombiname (E. col1) NSl

or.--25Tabella 2. Utilizzazione diagnostica del rilevamento di HCV-RNA con metodo PCRDifferenziazione dei casi di risoluzione dell'infezione rispetto a quelli conevoluzione cronica ·diagnosi di infezione acuta nella fase precocerilevamento dell'infettività nei pazienti anti-HCV positivirisoluzione dei casi con risultato "indetenninato" al saggio RIBAdiagnosi dei casi di infezione verticalediagnosi di infezione nei pazienti con immunodepressionemonitoraggio dei trattamenti antivirali.Bibliografial. Tokita H, Okamoto H, Tsuda F, Song P, Nakata S, Chosa T, lizuka H, Mishiro S,Miyakawa Y, Mayumi M, (1994). Hepatitis C virus variants from Vietnam areclassifiable into the seventh, eighth. and ninth major genetic groups. Proc Nat1 AcadSci USA 91: l 1022-11026.2. RoggendorfM, Lu M, Fuchs K, Emst G, Hohne M, Schreier E, (1993). Variabilityof the envclope regions of HCV in European isolates and its significance fordiagnostic tools. Arch Virai Z: 27-39.3. McOmish F, Chan SW, Dow BC, Gillon J, Frame WD, Crawford RJ, Yap PL,Follett EAC, Simmonds P, (1993). Detection ofthree types ofhepatitis C virus inblood donors: investigation of type-specific differences in serologic reactivity andrate of alani ne aminotransferase abnormaJities. Transfusion 33: 7-13.4. Farci P, London WT, Wong DC, Dawson GJ, Vallari DS, Engle R, Purcell RH,(1992). The natura! history ofinfection with hepatitis C virus (HCV) in chimpanzees:comparison of serologic responses measured with first- and second- generationassays and relationship to HCV viremia. J Infect Dis 165: 1006-1011.5. Chien DY, Choo QL, Tabrizi A, Kuo C, McFarland J, Berger K, Lee C, Shuster JR,Nguyen T, Moyer DL, Tong M, Furuta S, Ornata M, Tegtmeier G, Alter H, SchiffE, Jeffers L, Houghton M, Kuo G, (1992). Diagnosis of hepatitis C virus (HCV)infection using an immunodeminant chimeric polyprotein to capture circulatingantibodies: reevaluation ofthe role ofHCV in liver disease. Proc Nati Acad Sci USA89: 10011-10015.6. Cerino A, Mondelli MU, (1991). Identification of an immunodominant B-cellepitope on the hepatitis C virus nonstructural region defined by human monoclonaJantibodies. J lmmunoll47: 2692-2696.

267. Miyamura T, Saito I, Katayama T, Kikuchi S, Tateda A, Houghton M, Choo QL,Kuo G, ( 1990). Detection of antibody against antigen expressed by molecularlycloned hepatitis C virus cDNA: application to diagnosis and blood screening forposttransfusion hepatitis. Proc Nati.Acad.SciUSA 87: 983-987.8 V an der Poel CL, Cuypers HTM, Reesink HW, Weiner AJ, Quan S, Di Nello R V anBoven IJP, Winkel l, Mulder-Forkerts D, Van Exei-Oehlers PI, Schaasberg W,Lentvaar-Kuypers A, Polito A, Houghton M, Leile PN, (1991). Confirmation ofhepatitis C virus infection by new four-antigen recombinant immunoblot assay.Lancet 337 317-319.9 Lok ASF, Chien D, Choo QL, Chan T-M, Chiu EKW, Cheng JKP, Houghton M,Kuo G, (1993). Antibody response to Core, envelope and nonstructural hepatitis Cvirus antigens: comparison of immunocompetent and immunosuppressed patients.Hepatology 18: 497-502.IO. Overby LR (1993). Hepatiti.s C: looking at a virus that hasn't been seen. Gut S6-S9.Il. Nasoff M, Zebedee SL, lnchauspé, Prince AM, (1991). ldentification of animmunodorninant epitope within the capsid protein of hepatitis C virus. Proc NatiAcad Sci USA 88·. 5462-5466.12. Sato A, Sho Y, Nakamura H, Kunitomo T, Arima T, (1994). Immune responses ofblood donors to peptides of various lengths and those with genotypic sequencevariations corresponding t the N-terminai portion ofthe Core protein of hepatitis Cvirus. I Med Viro)~: 88-91.13. lnoue Y,Suzuki R, Matsuura Y, Harada S, Chiba J, Watanabe Y, Saito I, MiyamuraT, (1992). Expression ofthe amino-terminai half ofthe NSI region ofthe hepatitis Cvirus genome and detection of an antibody to the expressed protein in patients withliver diseases. I Gen Virol73: 2151-2154.14. Ntshihara T, Nozaki C, Nakatake H, Hoshiko K, Esumi M, Hayashi N, Hino K,Hamada F, Mizuno K, Shikata T, (1993). Secretion and purification of hepatitis Cvirus NS l glycoprotein produced by recombinant baculovirus-infected insect cells.Gene 129: 207-214.15. Spaete RR Alexander D, Rugroden ME, et al. (1992). Characterization of thehepatitis C virus E2/NS l gene product ex.pressed in mammalian celi s. Virology 188:819-830.16. Ray R Khanna A, Lagging LM, Meyer K, Choo Q-L, Ralson R Houghton M,Becherer PR, (1994). Peptide immunogen mimicry'.of putative El glycoproteinspecificepitopes in hepatitis C virus. I ViroiQll 4420-4426.r

}27IMPORTANZA DELLA QUANTIZZAZIONE ED ANAUSI DINAMICA.Femaccio DoninoDipartimento Sperimentale di Gastroenterologia, Patologia Epatica, Ospedale Molinette,Corso Bramante 88, TorinoL'introduzione nella pratica clinica delle metodiche di biologia molecolare el'affinamento delle tecniche immunometriche ha drasticamente modificato la sensibilità especificità diagnostica. La possibilità di evidenziare quantità infinitesimali di acidonucleico virale con un limite di sensibilità compreso tra alcune e l 000 molecole hacambiato radicalmente il significato clinico delle detenninazioni dei parametri virologici(l, 2). Come in batteriologia la 'capsula di Petri" permette l'amplificazione in vitro deisingoli batteri in altrettante colonie, in virologia la metodica della PCR permette diamplificare pochi genomi in milioni di copie. Come conseguenza, la positività di unsemplice test qualitativo ha scarso valore diagnostico in quanto poche unita' di acidonucleico virale non implicano di fatto la presenza di un infezione attiva ne' di una malattiaindotta dal virus (3). In batteriologia si sono da tempo definiti per ciascun batterio i livellidi batteriuria e batteriernia che definiscono la sterilità, perciò la parola "sterile" nonsignifica assenza assoluta di batteri. ma la loro presenza in numero clinicamenteinsignificante. L'introduzione di tale concetto anche in virologia è oggi indispensabile.Tuttavia sarà molto difficile definire i livelli clinicamente significativi delle viremie peruna serie di ragioni biologiche impananti. D primo problema è dovuto alla mancanza diuna diretta corrispondenza tra numero di molecole di acido nucleico amplificato e ivirioni potenzialmente infettanti. La presenza di un acido nucleico non identificanecessariamente un virione completo. Infatti. possono esistere acidi nucleici liberi nonincapsulati nel virione. mutati o presenti in particelle virali difettive. Per i batteri invece.in quanto ad ogni batterio corrisponde nella "capsula di Petri" una colonia cherappresenta la sua progenie. Un altro problema è che la patologia virale è secondaria al

28critico equilibrio tra presenza e replicazione virale, da un lato, e tipo ed entità di rispostaimmune antivirale, dall'altro. Il virus dell'epatite B ad esempio può replicare indisturbatoper anni determinando livelli altissimi di viremia senza causare alcun danno epatico. Nellostesso soggetto la condizione di tolleranza immunologica può però interrompersibruscamente per una mutazione virale o della reattività del sistema immune e la reazioneimmunitaria può causare come conseguenza un'epatite acuta eliminando il virus oun'epatite cronica con persistenza del virus (in quantità molto ridotte) e del dannoepatico. L'equilibrio tra entità e tipo di replicazione virale e entità e tipo di rispostaimmune condizionano perciò fortemente lo stato e l'evoluzione del processo infettivo edella malattia virus indotta. Ne consegue che la misura di questo equilibrio possa avereuna grande importanza diagnostica e prognostica, molto superiori alla semplicedeterminazione qualitativa dei parametri virologici. In un soggetto con infezione da HCVidentificata mediante test sierologicì di screening la sola determinazione qualitativadeli'HCV-RNA e degli anticorpi antivirali con metodiche di immunoh/otting nonaggiunge informazioni diagnostiche rilevanti. Studi epidemiologici indicano, in indaginipopolazionistiche, che la presenza di acido nucleico virale nel siero è significativamentepiù frequente nei pazienti con danno epatico piuttosto che nei soggetti sieropo'sitivi coninfezione pregressa e fegato normale. Tuttavia, anche se in casi rari, la viremia può essereriscontrata in individui con fegato istologicamente sano (4) Inoltre i livelli di viremiapossono fluttuare ampiamente e risultare temporaneamente indeterminabili in moltipazienti con epatite cronica. Infine circa un terzo dei pazienti che guariscono dall'epatitecronica e mantengono il fegato istologicamente normale rimangono per anni viremiciL'analisi quantitativa dei livelli di viremia, delle transaminasi e degli anticorpi antivirali harivelato che anche nell'infezione da HCV le oscillazioni dei tre suddetti parametri sonosincrone. Ad un significativo aumento dei livelli di viremia fa seguito un incremento degliindici di citolisi e successivamente un innalzamento del titolo di alcuni anticorpi antivirali(5). I picchi sierici di ciascuna delle tre variazioni si susseguono sincronizzati conintervalli di circa 3-6 settimane. L'identificazione di questa sequenza di eventi è moltoutile per la specifica definizione eziologica di un episodio occasionale di citolisi epatica

~----;29soprattutto nei pazienti con danno epatico multifattoriale e con infezione virale multipla.Infatti la semplice associazione tra presenza di indici qualitativi di replicazione e di dannoepatico non definisce con sufficiente accuratezza diagnostica la relazione causale tra idue eventi. Quest'ultima è invece stabilita con precisione se si evidenzia un precisosincronismo tra le fluttuazioni di livelli di viremia e delle transaminasi. Qualora unpaziente arrivi all'osservazione durante un episodio di citolisi la misura della variazionesincrona della viremia non sarà più possibile perché questa precede l'evento citoliticoperò la stessa specificità diagnostica può essere raggiunta determinandoquantitativamente la variazione del livello sierico di un anticorpo antivirale che avvienesuccessivamente all'episodio di elevazione delle transaminasi (6, 7). L'uso di questiconcetti diagnostici quantitativi e dinamici ha utilissime implicazioni nel monitoraggio deipazienti soprattutto se sottoposti a terapia antivirale. La considerazione che lafluttuazione dei livelli sierici delle transaminasi è sincronizzata con quella della viremiadimostra l'inutilità della misura ripetuta della virernia e permette perciò una riduzionenotevole del costo del monitoraggio evitando testcostosi che non aggiungonoconoscenze cliniche utili alla semplice periodica misura del livello sierico delletransaminasi. La presenza di un valore normale delle transaminasi al termine della terapianon predice se il paziente manterrà la risposta o presenterà una recidiva. Solo ilmantenimento di valori normali delle transaminasi per oltre sei mesi dopo la sospensionedella terapia predice con sufficiente accuratezza la guarigione. Molti autori ritengono cheladeterminazione qualitativa della viremia permetta una migliore predizione,sfortunatamente ciò si rivela inutile nella pratica clinica in quanto valori indeterminabili diviremia al temùne della terapia non escludono una recidiva e come abbiamo detto sopracirca un terzo dei pazienti guarisce nonostante la persistenza di viremia (anche per anni)dopo la sospensione della terapia. Invece, la misura quantitativa della viremia nonaggiunge molto per le stesse ragioni. La misura dei livelli sierici degli anticorpi antivirali(anti-Core totale, anti-E2 ed anti-CIOO) presenti all'inizio della terapia e ogni 4-6 mesi ein grado di fo~re un utilissimo indice dell'evoluzione dell'infezione e della malattia (8).La persistenza di replicazione virale e di citolisi anche con temPoranee e brevi

30normalizzazioni non si associa ad una significativa caduta dei livelli anticorpali. Il titoloanticorpale cala significativamente solo nei soggetti che mantengono persistentementelivelli indeterminabili di viremia e transaminasi normali. La misura quantitativa dellarisposta anticorpale ne1 pazienti immunocompetenti utilizzando sempre la stessametodica (di comprovata riproducibilità) per ciascun paziente è perciò un mezzo digrande utilità nel monitoraggio dell'infezione e dell'epatite cronica C sia durante che dopola terapia (8). Va tenuto conto che sia per i livelli di viremia che degli anticorpidovranno essere definiti range di valori quantitativi abbastanza ampi e non veri e propricut-off. Vequilibrio tra replicazione virale e risposta immune è infatti diversa dasoggetto a soggetto e ciò che più conta ai tini diagnostici sono le variazioni nel tempoper lo stesso soggetto e non i valori assoluti riscontrati occasionalmente. La qualitàprincipale dei test diagnostici futuri dovrà perciò essere la riproducibilità e il compito delmedico sarà quello di accertarsi che ogni paziente venga sempre monitorizzato con lastessa metodica.L'introduzione di questi concetti nella diagnostica clinica permette anche dispiegare molte discrepanze e discussioni presenti nella letteratura specialistica. Adesempio è molto importante tenere conto che viremia e livelli delle transaminasi oscillanocon periodicità mensili, mentre il titolo anticorpale e l'entità del danno infiammatoriointraepatico variano in modo significativo su base semestrale e annuale rispettivamente.In base a queste considerazioni non è difficile trovare pazienti con danno epaticoevolutivo nonostante abbiano transaminasi occasionalmente normali. Studi prospetticihanno dimostrato che solo la determinazione mensile (per almeno 12 mesi consecutivi)delle transaminasi può escludere con sufficiente certezza un'epatite cronica alla biopsiaepatica. Periodicità più lunghe o monitoraggi di durata più breve non escludonoun'epatite cronica anche in presenza di transaminasi normali. Nel caso di un singoloindividuo con transaminasi normali la determinazione della viremia non costituisce uncriterio decisionale valido per la biopsia epatica. Infatti, seguendo il semplice criteriodella positività o negatività della viremia rischieremmo nel primo caso di eseguire labiopsia in soggetti che mantengono bassi livelli di replicazione virale pur essendo guaritif

}31dall'epatite C e avendo un fegato nonnale; nell'altro caso, rischieremmo di non eseguirela biopsia epatica in un paziente con epatite cronica evolutiva e fluttuazione temporaneadella viremia al di sotto della soglia di determinazione. L'indicazione alla biopsia è inveceposta più specificamente dalla presenza. di una elevazione delle transarninasi (ancheoccasionale) e/o dalla persistenza (oltre 6 mesi) di titoli elevati di anticorpi anti-HCV(come detto sopra). Invece, la persistente normalità dei valori delle transaminasi ben aldi sotto dei limiti della nonna in controJii mensili consecutivi per almeno 12 mesi puòevitare la biopsia epatica con sufficiente specificità diagnosticaBibliografia:l. Sonino F, Colloredo Mels G, Sellati G, Ideo G, Oliveri F, Colombatto P, BrunettoMR, (1993). Problems in diagnosing virai hepatitis. Gut (Supp.): S36-38.2. Sonino F, Brunetto MR, Negro F, Baldi M. Saracco G, Abate ML, Fabiano A,Venne G, (1993). Hepatitis C virus infection and disease. Diagnostic problems. JHepatol17 (Supp. 3): S78.82.3. Sonino F, Brunetto MR, Negm F, (1992). Diagnostic tools from molecular biology.Liver .!1: 213-216.4. Manzini P, Calvo PL, Abate MI, Cerchier A, Piantino P. Vallauri P, D'Antico S,Sympson B, Klannann R, Schiffer M, Callea F, Sonino F, Brunetto MR, (1994).Asymptomatic anti-HCV seropositive subjects include patients with chronic activehepatitis and individuals with nonnal liver: can we distinguish them? J Hepatol 20:68-70.5. Abate ML, Manzini P, Negm F, Baldi M, Saracco G, Piantino P, Brunetto MR,Sonino F, (1994). Detection ofhepstitisC virus RNA by reverse-transcriptase andpolymerase chain reaction: clinical applications of quantitative anaJysis. Clin andDiag Viro! l: 289-297.6. Brunetto MR, Torrani Cerenzia M, Oliveri F, Piantino P, Randone A, Calvo PL,Manzini P, Rocca G, Galli C, Sonino F, (1993). Monitoring the natura! course and

32response to therapy of chronic hepatitis B with an autornated semi-quantitative assayfor JgM anti-HBc. J Hepatol 12: 43 l -4367. Colloredo Mels G, Bellati G, Leandro G, Brunetto MR, Vicari O, Barzio M,Piantino P, Fornaciari G, Scudeller G, Angeli G, Bonino F, Ideo G, (1994).Fluctuations of viremia, aminostransferases and IgM antibody to hepatitis B Coreantigen in chronic hepatitis B patients with disease exacerbations. Liver H_·175-181.8 Brunetto MR, Calvo PL, Oliveri F, Colombatto P, Abate ML, Manzini P, Bonino F,(1994). Hepatitis C virus infection and liver disease. peculiar epidemiologica!features. Fems H: 259-266l

33DETERMINAZIONE DEI GENOTIPI DELL'MCV: ASPETTI DIAGNOSTICIED INTERESSE CLINICOElisabetta C ariani l, Antonella Ravaggi l, Angelo Rossini2l lll Laboratorio Analisi, Ospedale di Brescia e Istituto di Chimica, Università di Brescia,Pie Spedali Civili, l, 25123 BresciaZnJ Divisione di Medicina Generale, Ospedale di Brescia, P le Spedali Civili, l, 25123BresciaLa percentuale di mutazioni del genoma dell'HCV, calcolata intorno a w-3sostituzioni nucleotidiche per sito per anno (l), è simile a quella degli altri virus a RNA apolarità positiva. La notevole variabilità genomica. legata all'assenza di attivitàproojreading da parte deii'RNA polimerasi RNA-dipendente (2), ha potenzialiimplicazioni per il decorso clinico dell'infezione. L'analisi delle sequenze virali isolate daun singolo paziente ha permesso di osservare che il genoma dell'HCV presenta unelevato grado di eterogeneità, sia all'interno dello stesso prelievo che tra prelievi diversi.[noltre l'analisi comparativa di isolati indipendenti ha indicato l'esistenza di vari genotipivirati, alcuni dei quali con distribuzione geografica caratteristica.Entrambi gli aspetti dell'eterogeneità genomica deli'HCV (variabilità in un singolopaziente e variabilità genotipica tra gruppi di isolati) si accompagnano ad una diversapercentuale dì mutazioni a livello delle singole regioni genomiche. Infatti, i genicodificanti per le proteine dell'enveJope (El ed E2), analogamente a quanto e statodescritto in altri virus, presentano una percentuale molto elevata di mutazioni. Questopotrebbe essere dovuto al fatto che le proteine dell'envelope, essendo esposte allasuperficie del virione, sono uno dei bersagli principali del sistema immunitario deJI' ospitee vengono perciò sottoposte ad una pressione selettiva che privilegia i mutanti nonriconosciuti dalla reazione immune. Altre regioni del genoma virate hanno invece unasequenza più conservata. come la sequenza della regione non tradotta in 5' (5' UTR),

34coinvolta nel controllo della traduzione, o le sequenze codificanti per la proteina delnucleocapside (Core) e per la proteina NSJ (proteasi-elicasi) (Fig. l)Classificazione dei genotipi dell'DCVIn base alle divergenze di sequenza che, in alcune regioni genomiche, permettonodi definire sottogruppi virali, sono stati identificati diversi genotipi di HCV. Sono stateproposte varie classificazioni dei genotipi virali (3-7); le più frequentemente utilizzatesono riassunte in tabella l. I due primi genotipi identificati (definiti tipo I e tipo II daOkamoto et al.) furono originariamente isolati rispettivamente negli Stati Uniti ed inGiappone. In seguito, questi due tipi virali si sono dimostrati endemici anche in Europa,anche se non omogeneamente distribuiti nelle diverse aree geegrafìche. Altri genotipisono stati completamente sequenziati (tipi III e IV secondo Okamoto et al.) oparzialmente caratterizzati. Attualmente si considera che esistano almeno 6 grupp1principali di HCV (genotipi 1-6 secondo Simmonds et al.), ciascuno dei quali comprendediversi sottotipi (indicati con lettere minuscole). I genotipi 1, 2 e 3 sembrano essereubiquitari, con diversa prevalenza nelle popolazioni studiate (6, 8). Il genotipo 4 èsoprattutto frequente in Afiica ed in Medio Oriente, mentre il genotipo 5 è statoidentificato in Sud Africa e il g~ottpo 6 a Hong Kong (6).Possibili implicazioni della variabilità genotipica deii'HCVUna possibile implicazione della variabilità tipo-specifica delle proteine disuperficie è l'esistenza di determinanti sierotipici, soprattutto nella proteina El (3).Questo potrebbe essere rilevante per lo sviluppo di protocolli di immunizzazione, datoche le proteine di su~cie sono i maggiori candidati per i vaccini contro I'HCV (12) edato che i genotipi deii'HCV presentano una specifica distribuzione geografica.Poiché l'infezione con alcuni genotipi sembra essere correlata ad un particolaredecorso clinico e a diversa sensibilità al trattamento antivirale (9-11 ), la detenninazionedel genotipo infettante potrebbe rivelarsi clinicamente utile. La presenza di variazioni disequenza tipo-specifiche può essere utilizzata dal punto di vista diagnostico. I metodif

35finora proposti per l'identificazione del genotipo si basano su polimorfismi di restrizione(13, 14), PCR con primers specifici per i vari genotipi (15) ed ibridazione con sondegenotipo-specifiche (13, 1-4, 16, 17). Le regioni più frequentemente utilizzate per lacaratterizzazione del genotipo sono la 5'UTR ed i geni C, NSJ ed NS5.In base ai risultati di sequenza ottenuti su isolati italiani di HCV, abbiamosviluppato due test basati sulla PCR tres/ed e l'ibridazione differenziaJe perl'identificazione dei principali genotipi (l, 4) e sottotipi (Ula e IUlb). L'amplificazioneviene effettuata, nel primo caso, con gli stessi primer della S'UTR utilizzati per ladeternùnazione deii'HCV RNA. Il secondo test si basa sullo stesso principio e vieneeffettuato con primers e sonde situati nel gene E l ( 18). I prodotti di amplificazionevengono quindi ibridizzati mediante una metodica non isotopica, utilizzando sondederivate dai segmenti contenenti variazioni genotipo- e sottotipo-specifiche. Questoapproccio è stato scelto in quanto le sequenze pubblicate, insieme ai nostri dati,indicavano la presenza di zone variabili genotipo-specifiche nella 5'UTR (19, 20) esottotipo-specifiche nella regione El (7, 9, 21-23). Le variazioni del gene El consentonoin particolare l'identificazione dei sottotipi la ed Ib, che sono i più frequenti in Europa(13, 14, 16) e non sono facilmente discrinùnabili in base alla sequenza di altre regionigenomiche, come la 5'UTR (5, 14, 16, 20, 24). In entrambi i test è stata osservata unaperfetta riproducibilit• tra i risultati dell'ibridazione differenziale e i dati di sequenza.Epidemiologia e correluioni cliniche dei genotipi dell'H CVMediante l'applicazione dei metodi sopra esposti è stato possibile definire ladistribuzione epidemiologica ed alcune possibili correlazioni cliniche dell'infezione con idiversi genotipi dell'HCV.Sano stati analizzati fino ad ora 116 soggetti con infezione da HCV sintomatica enon. Il genotipo l è stato identificato in 88 casi (76%), con prevalenza del sottotipo 1 b(62 casi) rispetto all'la (20 casi). Le infezioni miste dovute ad entrambi i sottotipi sonostate evidenziate in 6 campioni, mentre il genotipo 2 era presente in 20 casi ( 17% ), ilgenotipo 3 in 5 (4%) e il genotipo 4 in 3 (3%). Pertanto, i genotipi l e 2 sono i più

36diffusi, essendo responsabili del 95% delle infezioni da HCV. Il sottotipo lb, mparticolare, risulta prevalente nella popolazione studiata {53.4% del totale), in analogiacon quanto riscontrato in Giappone (13, 14, 16).Dati precedenti indicano l'esistenza di una diversa sensibilità al trattamentoantivirale dei genotipi lb e 2 {10, I 1). Il primo sarebbe infatti associato ad una bassapercentuale di risposta, mentre il genotipo 2 sarebbe più sensibile al trattamento. Anchela presentazione clinica dell'infezione potrebbe essere influenzata dal genotipo infettante.Infatti, in un gruppo di donatori -di sangue anti-HCV e HCV RNA positivi con livelli ditransaminasi persistentemente normali abbiamo rilevato una prevalenza del genotipo 2significativamente maggiore rispetto ad un gruppo .di soggetti con transaminasi elevate. Ivari genotipi non sembrano però avere diversi livelli di replicazione. n titolo di viremia,analizzato mediante PCR competitiva in 86 campioni (38 infettati da sottotipo lb, 18 dasottotipo l a, 4 da entrambi i sottotipi, 20 da genotipo 2, 5 da genotipo 3 e 2 da genotipo4), ha permesso di osservare concentrazioni di HCV RNA compatibili con datiprecedenti (Il, 25), comprese tra Jo4.5 e JQ9.6 copie/m!. Non è stata tuttavia osservatanessuna variazione significativa tra campioni di soggetti infettati dai genotipi la, Ib, 2 e3, come già riportato in altri studi (26).Caratterizzazione genomica di isolati appartenenti ai vari genotipiPer un approfondimento delle possibili basi genetiche dell'infezione dovuta ai varigenotipi, la sequenza nucleotidica ed arninoacidica dei genotipi 1-4 è stata caratterizzataa livello delle regiorù C ed El. La sequenza di diversi isolati è stata comparata e lepercentuali di omologia hanno permesso di ottenere infol111llZioni sulla relazione geneticatra i vari ceppi di HCV.Nella regione Core l'allineamento di sequenza aminoacidica ha permesso diosservare una maggiore omologia tra i genotipi l e 4, mentre il genotipo 3 e, soprattutto,il genotipo 2 si sono rivelati molto più divergenti. f:-' omologia a livello aminoacidi copresente all'interno di ciascun genotipo era maggiore dCI 95%, mentre, tra il genotipo 2 egli altri genotipi, era pari al 77%.(

}37Nonostante la maggiore percentuale di variabilità (omologia del 75-90% aU'intemodi un genotipo e del 41)..80% tra diversi genotipi a livello aminoacidi co), il grado direlazione genetica tra geriotipi nella proteina E I è risultata sovrapponibile a quello dellaproteina C. L'analisi di sequenza di due regioni codificanti (C ed El) ha pertantodimostrato un grado di divergenza particolarmente elevato tra il genotipo 2 e gli altrigenotipi considerati, in accordo con quanto descritto su isolati provenienti da altre areegeografiche (6, 7). E' interessante notare come, in entrambe le regioni analizzate, lamaggiore divergenza di sequenza sia osservata tra i genotipi l e 2. che, in base ai risultatiprecedentemente esposti, sembrano essere associati a diversi profili di transaminasemia ea differente risposta al trattamento. Non è però noto se la diversa presentazione clinicasia legata ad una maggiore o minore evolutività dell'infezione.Utilità clinica della determinazione del genotipo virate nell'infezione da HCVI dati attuahnente disponibili indicano l'esistenza di differenze nel profilo clinico enella sensibilità al trattamento dell'infezione dovuta a genotipi diversi. Tuttavia.. il realesignificato clinico della determinazione del genotipo virate è tuttora in discussione, inquanto sia le manifestazioni cliniche della malattia epatica, sia la eventuale risposta allaterapia sono influenzate da molteplici fattori, quali l'età del soggetto, la duratadell'infezione e lo stato immunitario, che interagiscono in modo complesso. Un nostrostudio (14) ha indicato una particolare distribuzione epidemiologica dei sottotipi la edl h: il sottotipo l h è infatti generalmente isolato da pazienti di età più avanzata. Il fattoreetà potrebbe quindi influire sulla minore percentuale di risposta al trattamento deisoggetti infettati dal sottotipo l b. Va inoltre sottolineato che, nella maggior parte deglistudi pubblicati, la risposta alla terapia è stata valutata in base alla normalizzazione dellatransaminasemia; l'apparente sensibilità al trattamento deii'HCV di tipo 2 (11, 25)potrebbe essere in parte legata ai valori persistentemente nonnali di transaminasiriscontrati nella maggior parte dei soggetti infettati da questo genotipo,indipendentemente dalla terapia. Quindi, il criterio per stabilire la risposta dei soggetticon infezione da HCV di tipo 2 dovrebbe basarsi su parametri virologici (scomparsa

38deii'HCV RNA sierico) e non solo sui dati biochimici. Per valutare il reale impatto delladetenninazione del genotipo vira1e sulla decisione terapeutica sono pertanto necessanstudi ulteriori, che permettano una migliore conoscenza della storia naturaledell'infezione dovuta ai vari genotipi e delf'importanza relativa dei vari fattori chepossono influenzare l'esito deJ trattamento.Tabella 1. Principali dassifttuigai prepeste per i genotipi dell'H CV.ClassificazioniOkamoto et al. (3) Cha et al. (5) SUnmonds et al. (6) Bukh et al. (7)Mori et al.* (4)lal/laIl Il Jb llllbne Re le neIII III la III/laIV III lb IV/lbne III le lev• IV Ja (V)/JaVI• IV Jb nene ne 4a 4ane ne ne 4bne ne ne 4ene ne ne 4dne v ~. Sane ne 6a 6ane: non classificatot. .

1 1 eT E T E2 Il NS2 l NS3 l NS4 l NS5T(nucleocapside JlRNA polimerasiglicoproteine elicasi/proteasi RNA-dipendentedell'envelopeT lr 92-98 s1-91 55-75 ss-12 57-71 7D-80 65-79 66-79% di omologia nucleotidica tra i genotipi 1 e 2Figura l Divergenze di sequenza tra i genotipi l e 2 dell'H CV nelle varie regioni genomiche (3, 5).3'.:.26-671~"'...... ~'l GENOMA HCV l

l40Bibliografia:l. Ogata N, Alter HJ, Purcell RH, (1991). Nucleotide sequence and mutation rate ofthe H strain ofhepatitis C virus. Proc Nati Acad Sci USA 88 3392-33962 Holland J, Spindler K, Horodyski F, Grabau E, Nichol S, VandePol S, (1982). Rapidevolution ofRNAgenomes. Science 215: 1577-15853 Okamoto H, Kurai K, Okada SI, Yamamoto K, Lìzuka H, Tanaka T, Fukuda S,Tsuda F, Mishiro S. (1992). Full-len~h sequence ofhepatitis C virus genome havingpoor homology to reported isolates: comparative study of four distinct genotypes.Virology 188.331-341.4. Mori S, Kato N, Yagyu A, Tanaka T, lkeda Y, Petchclai B, Chiewsilp P, KurimuraT, Shimotohno K, (1992). A new type ofhepatitis C virus in patients in Thailand.Biochem Biophys Res Commun 183: 334-3425 Cha T A, Beali E, lrvine B, Kolberg J, Chien D, Kuo G, Urdea MS, (1992). Al leastfive related, but distinct, hepatitis C virai genotypes exist Proc Nati Acad Sci USA89 7144-71486. Simmonds P, Holmes EC, Cha T-A, Chan S-W, Mc Omish F, lrvine B, Beali E, YapPL, Kolberg J, Urdea MS, (1993). Classification ofhepatitis C virus into six majorgenotypes and a series ofsubtypes by phylogenetic analysis ofthe NSS region. J GenVirol 74: 2391-2399.7 Bukh J, Purcell RH, Miller RH, (1993 ). Al least 12 genotypes of hepatitis C viruspredicted by sequence analysis of the putative E l gene of isolates collectedworldwide Proc Nati Acad Sci USA 90 8234-82388. Dusheiko G, Schmilovitz-Weiss H, Brown D, McOmish F, Yap P-L, Sherlock S,Mclntyre N, Simmonds P, (1994). Hepatitis C virus genotypes: an investigation oftype-specific differences in geographic origin and disease. Hepatology 19: 13-189. Houghton M, Weiner A, Han J, Kuo G, Choo QL, (1991 ). Molecular biology of thehepatitis C viruses· implications for diagnosis, development and contro! of viraidiseases. Hepatology li: 381-388

~·;41IO. Okada SI, Akahane Y, Suzuki H, Okamoto H, Mishiro S, (1992). The degree ofvariability in the amino terminai region of the E2/NS l protein of hepatitis C viruscorrelates with respOnsiveness to interferon therapy in viremic patients. Hepatology16:619-624.Il. Yoshioka K, Kakumu S, Wakita T, lshikawa T, ltoh Y, Takayanagi M, Higashi Y,Shibata M, Morishima T, (1992). Detection ofhepatitis C virus by polymerase chainreaction and response to interferon-alpha therapy: relationship to genotypes ofhepatitis C virus. Hepatology 16: 293-299.12. Ralston R, Thudium K, 8erger K, Kuo C, Gervase 8, Hall J, Selby M, Kuo G,Houghton M, Choo QL, (1993). Characterization of hepatitis C virus envelopeglycoprotein complexes expressed by recombinant vaccinia virus. J Viro! 67: 6753-676!.13. Nakao T, Enomoto N, Takada N, Takada A, Date T, (1991). Typing ofhepatitis Cvirus genomes by restriction ftagment length polymorphism. 1 Gen Virai 72: 2105-2112.14. Takada N, Takase S, Takada A, Date T, (1993). Differences in the hepatitis C virusgenotypes in different countries. J Hepatolll: 277-283.15. Okamoto H, Sugiyama Y, Okada S, Kurai K, Akahane Y, Sugai Y, Tanaka T, SatoK, Tsuda F. Miyakawa Y, Mayumi M, (1992). Typing hepatitis C virus bypolymerase chain reaction with type-specific primers: application to clinical surveysand tracing infectious sources. l Gen Virol73: 673-679.16. Takada N, Takase S, Takada A, Date T, (1993). Differences in the hepatitis C virusgenotypes in different countries. J Hepatol 17: 277-283.17. Stuyver L, Rossau R, Duhamel M, Wyseur A, Vanderborght 8, Van Heuverswyn H,Maertens G, (1993). Typing of hepatitis C virus isolates and identification of new(sub)types by aLine Probe Assay (LiPA). J Gen Virai 74: 1093-1102.18. Ravaggi A, Zonaro A, Mario MG, Puoti M, Albertini A, Cariani E, (1994).Distribution ofviral genotypes in ltaly detennined by hepatitis C virus (HCV) typingby DNA immunoassay. J Clin Microbiol 32: 2280-2284.

4219 Bukh J, Purcell RH, Miller RH, (1992). Sequence analysis of the 5' noncodingregion ofhepatitis C virus. Proc Nati Acad Sci USA 89: 4942-4946.20 Simmonds P, McOmish F, Yap PL, Chan S-W, Lin CK, Dusheiko G, Saeed AA,Holmes EC, (I 993). Sequence variability in the 5' non-coding region of hepatitis Cvirus: identification of a new virus type and restrictions on sequence diversity. J GenViro! 74 661-66821 Kato N, Hijikata M, Ootsuyama Y, Nagakawa M, Ohkoshi S, Sugimura T,Shimotohno K, ( 1990). Molecular cloning of the human hepatitis C virus genomefrom Japanese patients with non-A, non-B hepatitis. Proc Nati Acad Sci USA 879524-9528.22. Takamizawa A, Mori C, Fuke l, Manabe S, Murakami S, Fujita J, Onishi E, AndohT, Yoshida l, Okayama H, (1991 ). Strucure and organization ofthe hepatitis C virusgenome isolated from human carriers. J Virol 65: Il 05-111323 Weiner AJ, Brauer MJ, Rosenblatt J, Richman K, Tung J, Crawford K, Bonino F,Saracco G, Choo QL, Houghton M, Han JH, (1991). Variable and hypervariabledomains are found in the regions of HCV corresponding to the flavivirus envelopean d NS 1 proteins and the pestivirus envelope glycoproteins. Virology 180: 842-84824. Chan SW, McOmish F, Holmes EC, Dow B, Peutherer JF, Follett E, Yap PL,Simmonds P, (1992). Analysis of a new hepatitis C virus type and its phylogeneticrelationship to existing variants_ J Gen Virol 73 t t 3 t· t 14125. Hagiwara H, Hayashi N, Mita E, Naito M, Kasahara A, Fusamoto H, Kamada T,(1993). Quantitation of hepatitis C virus RNA in serum of asymptomatic blooddonors and patients with type C chronic liver disease. Hepatology 11: 545·55026. Mita E, Hayashi N, Kanazawa Y, Hagiwara H, Ueda K, Kasahara A, Fusamoto H,Kamada T, (1994). Hepatitis C virus genotype and RNA titer in the progression oftype C chroni

43ASPE'ITI ISTOLOGICI DELL'EPATITE DA HCVLuisa Bercich. Mariafausta Sonetti, Giovanna Fabbreti, Laura Lucini, Francesco Callea.I Servizio di Anatomia Patologica Spedali Civili di Brescia.IntroduzioneNumerosi studi morfologici hanno concluso che l'epatite C non produce nel fegatolesioni specifiche e tanto meno patognominiche.Alcune lesioni nondimeno sono state da più parti considerate suggestive o più o menocaratteristiche. Tra queste si annoverano: la steatosi, gli aggregati linfoidi, il danno deidotti biliari(!).Studi clinici hanno dimostrato che una variabile proporzione di pazienti con epatitecronica C risponde al trattamento con Interferone (IF). Le modificazioni istologichedopo IF non sono univoche.Questo studio è stato intrapreso per valutare il significato delle principali lesioniassociate al virus C e per correlare le modificazioni istologiche con il decorso clinicodopo terapia con IF.Materiale dello studioSono stati reclutati 45 pazienti HCV positivi sulla base dei seguenti criteri:negatività per HIV e HBV, ipertransaminasemia da almeno 6 mesi, epatite cronicaaggressiva (CAH) istologicamente dimostrata. trattamento con IF 3M per 12 mesi,disponibilità di una biopsia epatica prima e dopo il trattamento.l pazienti sono stati divisi in 3 gruppi sulla base della risposta aii'IF: gruppo 1 =Resp

44La valutazione istologìca delle biopsie epatiche è stata principalmente indirizzata apiecemea/ necrosis, danno parenchimale, intensità della flogosi/fibrosi Questi parametrifanno parte dello schema analitico di Knodell (2)Parametri aggiuntivi da noi valutati sono stati: steatosi, aggregati linfoidi, danno dei dottibiliariRisultatiLe biopsie pre e post-trattamento sono state confrontate nei punteggi cumulativi edindividuali dei parametri considerati e riassunti in quattro categorie miglioramento,peggioramento, stazionario, normalizzazJone_Per quanto riguarda lo sCore AHI totale si è avutoMigtioram. Peggioram Stazion.Gruppo I (20 paz.) 12 4Gruppo 2 (17 paz.) Il 3Gruppo 3 ( 8 paz ) 4 2Normalizzaz432oooI parametri individuali sono risultati rispettivamenteA. Piecemeal necrosis:Miglioram Peggioram_Gruppo l (20 paz.) 7Gruppo 2 (17 paz.)Gruppo 3 ( 8 paz )93Staziono22Normalizzaz_1263oo8_ Danno parenchirnale:Miglioram.Peggioram_StazionNormalizzazGruppo l (20 paz.)676Gruppo 2 ( 17 p az.)Gruppo 3 ( 8 paz.)752o72

}45C. Flogosi portale:Miglioram. Peggioram.Gruppo l (20 paz.)IOGruppo 2 (17 paz.) 7Gruppo 3 ( 8 paz.) 4Stazion.o22Normalizzaz.IO82oooD. Fibrosi:Miglioram.Peggioram.Stazion.Normalizzaz.Gruppo l (20 paz.) 2567Gruppo 2 ( 17 p az.) 2Gruppo 3 ( 8 p az.)2IO63oGli altri parametri sono risultati: steatosi presente nel 50% delle biopsieiniziali=invariata; danno dei dotti presente nel 12% delle biopsie iniziali=invariato. Gliaggregati linfoidi si sono comportati come segue:Aggregati linfoidi:ScomparsaComparsa de novaPersistenzaAssenzaGruppo l (20 paz.)964Gruppo 2 (17 p az.)Gruppo 3 ( 8 p az.)42953oConclusioniI risultati di questo studio indicano che miglioramento istologico, valutatosemiquantitativamente attraverso l'AHI secondo Knodell, si è verificato in tutti i 3 gruppiindipendentemente dalla risposta clinica.In generale il miglioramento istologico è stato più significativo nei casi con punteggi piùalti alla prima biopsia.

'46Tra i parametri individuali, il danno parenchimale si è dimostrato il più sensibile,specialmente nei pazienti responder (R), dei quali il 50% si è normalizzato.In un certo numero di pazienti R con miglioramento dell'indice cumulativo di AHIsi è osservato aumento della fibrosi.Questa osservazione giustifica recenti tentativi di scorporare gli indici necroinfiammatoridalla fibrosi (3 ).Tra i parametri aggiuntivi analizzati in questo studio (steatosi, danno dei dotti, aggregatilinfoidi), solo l'ultimo si è significativamente modificato dopo IF infatti la loroscomparsa nei pazienti responder (R) è stata del 50% rispetto al 25% dei non responder(NR).Bibliografia:Scheuer P, ( 1991 ). Classification of chronic virai hepatitis: a need for reassessement.I Hepatology U: 372-3742 Knovell RG et al, (1981). Formulatìon and applicatìon of a numerica! sconngsystem for assessing histological activites in asymptomatic chronic active hepatites.Hepatology 1431-4353 Desmet VT et al., (1994)_ Classiflcation of Chronic Hepatitis: Diagnosis, Gradingand Staging_ Hepatology 20 august

)47STORIA NATURALE DELL'INFEZIONE DA VIRUS CRaffAella Romeo e Massimo ColomboIstituto di Medicina Interna Università degli Studi di Milano, Via Pace 9- 20122 MilanoIl virus dell'epatite C (HCV) è responsabile della maggioranza dei casi di epatitetrasfusionale e "sporadica". La fonte delle infezioni sporadiche è controversa poiché le viesessuale e perinatale sembrano solo marginalmente implicate nella trasmissione del virus.Questo si trasmette con bassa efficienza anche attraverso i contatti familiari o per punturaaccidentale.Epatite acutaL'intervaUo di tempo tra esposizione al virus e sviluppo di epatite è di 2-26 settimane,con un picco tra 6 e 12 settimane. L'intervallo medio tra esposizione e sieroconversione anti­HCV è minore, circa 2 settimane, così come lo è l'intervallo tra esposizione e comparsa diviremia (l). Durante la fase acuta, l'epatite ha generalmente un andamento clinico blando conlivelli di transaminasi che raramente eccedono le 1000 UI/1itro. Nel 75% dei casi, l'epatite èanitterica Più difficile è definire il profilo clinico dell'epatite sporadica. poiché tutti gli studiavevano come punto di inizio l'arruolamento di pazienti con malattie clinicamente rilevabili. Diconseguenza l'epatite sporadica è stata sottostimata, visto il gran numero di casi subclinìci chesfuggono al riconoscimento. Il decorso clinico dell'epatite è variabile. L'aspetto piùcaratteristico è rappresentato dall'andamento fluttuante e polifasico delle transaminasi (2). Lamaggior parte dei pazienti ha variazioni talvolta ricorrenti di alcune centinaia di IU/litronell'arco di una settimana. caratterizzate dalla progressiva diminuzione nel tempo dell'ampiezzadi queste oscillazioni. Alcuni casi mostrano apparente e protratta nonnallzzazione delle AL Tche potrebbe suggerire la guarigione. Tuttavia. in non pochi casi. questo andamento prelude adesacerbazioni enzimatiche asintomatiche. Accanto a questi casi acuti clinicamente silenti chesono probabilmente la maggioranza., ci sono casi con andamento clinico severo, caratterizzatida rapida progressione dell'epatopatia. L'epatite fulminante si verifica molto raramente nei

48pazienti infettati per v1a parenterale, e forse solo in pazienti immunodeficienti o conpreesistente epatopatia (3}. Due pazienti sottoposti a trapianto allogenico di midollo osseo,hanno sviluppato insufficienza acuta epatica dopo ripristino dello stato immunitario dovuto allasospensione della ciclosporina (4). In altri casi, l'HCV era implicato solo come cofattoreinsieme ad altri virus epatitici come HAV, HBV, HDV o all'uso di farmaci.Infezione cronicaV epatite cronica si sviluppa in oltre il 70% dei pazienti con infezione acuta posttrasfusionalee il 50% di quelli con infezione sporadica (5, 6). Esistono certamente casi diinfezione cronica con lesioni istologiche significative senza alterazione delle transaminasi (7).Meno certo è che possano esistere portatori "sani" di virus, cioè senza apprezzabili lesioniistologiche del fegato. Nella maggior _parte dei casi, l'infezione cronica è svelata dallapersistente elevazione delle transaminasi per un periodo superiore ai 6 mesi dall'esordio acuto,ed è accompagnata dalla sieropositività per anti-HCV e HCV-RNA. Circa il 20% dei pazienticon epatopatia cronica evolve in cirrosi, con decorso per lo più asintomatico. Pertanto, lasottostima dell'infezione cronica da HCV può avere conseguenze cliniche importanti. In unostudio multicentrico di 568 pazienti trasfusi tra il 1967 ed il 1980, la mortalità in generale nonera aumentata., ma fu riportato un aumento significativo del numero dei decessi per epatopatia(8). Il sanguinamento da varici esofagee e il carcinoma epatoceUulare sono le più comuni causedi decesso nel paziente con cirrosi. In Giappone e in Italia, il carcinoma epatocellulare HCVcorrelato è in aumento, poiché è una sequela a lungo termine di una epidemia di epatite Ctrasfusionale verificatasi nella popolazione 20 o 30 anni fa (9). Non sono ben definiti i fattoriche influenzano la severità dell'epatopatia e il tasso di progressione a cirrosi nei pazienti coninfezione C. Le covariate cliniche ed epidemiologiche predittive di severità, includono età delpaziente, durata della malattia, profilo sieri co delle AL T, presenza di cofattori quali infezioneda virus B o alcolismo, lo stato immunitario dell'ospite e fattori propri del virus quali ilgenotipo e la carica virate (10, Il). Numerose evidenze indicano che esistono tipi viratiprobabilmente dotati di maggiore patogenicità. Studi con4otti in Europa e in Giappone, hannosuggerito una associazione tra genotipo lb e malattia s~a (11). E' invece controverso sel'immunità dell'ospite può influenzare il corso della infezione, poiché a fronte di lavori secondo(

}49i qua1i la presenza ad esempio di coinfezione HlV non modifica la storia naturale della malattiac. altri dimostrano che la malattia epatica negli immunocompromessi può avere un andamentoparticolarmente severo, in r~lazionealla elevata replicazione HCV dimostrata nei soggetticoinfettati (12). Numerosi Pazienti emofilici multitrasfusi sottoposti a biopsia epaticadimostrano prevalenza di malattie croniche non progressive (13). Tuttavia. una rianalisi diquesti punti ha dimostrato che in una parte di questi pazienti la malattia può evolvere fino alcancro (14). L'HCV appare chiaramente il più importante fattore di rìschio nell'analisiretrospettiva condotta su 135 pazienti con cancro del fegato, nei quali ben il 65% risultavaanti-HCV sieropositivo (9). Questo dato era convalidato in uno studio prospettico di 447pazienti con cirrosi (15). In questo studio nel quale 20 l pazienti avevano cirrosi HCVcorrelata, 90 svilupparono epatocarcinoma durante un periodo difollow-up di 7 anni.Manifestazioni extraepaticheL'HCV è implicato nella maggior parte dei casi di crioglobulinemia di tipo II, condizionecaratterizzata dalla presenza di immunoglobuline omogenee, per lo più a componente IgM-Kme anti-IgG. Agnello e collaboratori (16) hanno dimostrato la presenza di HCV-RNA in 16 deil9 pazienti e anticorpi anti-HCV in 8. In 4 pazienti, quasi tutte le sequenze HCV-RNA eranoconcentrate nel crioprecipitato. Una discreta percentuale di questi pazienti aveva sindrome di!:-.)ogren, un'altra verosimile manifestazione extraepatica da HCV. In uno studio, il 29% di 20pazienti con infezione cronica C aveva scialoadenite linfocitica focale, cioè una lesioneistologica delle ghiandole salivarie labiali caratteristica della sindrome di Sjogren, mentrequesta lesione era presente solo nel 5% dei controlli con varie malattie ( 17).Benché questi studi dimostrino una stretta associazione tra HCV, crioglobulinemia escialoadenite, essi non provano l'esistenza di un legame patogenetico diretto. Numeroseosservazioni giocano a favore di un ruolo diretto deli'HCV nell'immunità. Esse sono lareplicazione del virus nelle cellule mononucleate (18), e la prevalenza di anticorpi antimuscololiscio, anti-microsoma di fegato e rene (LKM). anti-tiroide e anti-GOR (epitopiderivati dall'ospite), in molti pazienti con epatite.

'.j50Bibliografia:Farci P, A1ter ili, Wong B, et al_, {1991) A long-term study of hepatitis C vtrusreplication in non-A, non-B hepatitis. N Engl 1 Med 325: 98-1042. Alter JH, Purcell RH, Shih JW, et al., (1989). Detection ofantibody to hepatitis C virus inprospectively followed transfusion recipients with acute and chronic non-A non-Bhepatitis. N Engl J Med 321 1494-15003 Wright TL, Hsu H, Donegan E, et aJ.,'.(J991). Hepatitis C virus not found in fulminantnon-A, non-B hepatitis. Ann Intern Med ill: 111-1124 Kanamori H, Fukawa H, Maruta A, et aL, (1992). Case report: fulminant hepatitis C viraiinfection after allogeneic hone marrow transplantation. Am J Med Sci 303. 109-111.5 Alter MJ, Margolis HS, Krawczynski K, et aJ., (1992). The natura) history of communityacquiredhepatitisC in the United States. N Engl J Med 327. 1899-19056 Lampertico P, Rumi MG, Romeo R et al., (1994). A multicenter randomized controlledtrial of recombinant interferon-alpha 2b in patients with acute transfusion-associatedhepatitis C. Hepatology 19: 19-22.7. Alberti A, Morsica G, Chemello L, et al., (1992). Hepatitis C viremia and liver disease insymptom-free individuals with anti-HCV. Lancet 2_: 697-6988 Seeff LB, Baskeii-Bales Z, Wright EC, et al, (1992). Long-term mortality aftertransfusion-associated non-A, non-B hepatitis. N Engl J Med 327: 1906-1911.9 Colombo M, Kuo G, Choo QL, et al., ( 1989). Prevalence of antibodies to hepatitis C virusin Italian patients with hepatocellular carcinoma. Lancet II: 1006-1008IO Mondelli M, Colombo M, (1991). The emerging picture ofhepatitis C. Dig Dis 2: 245-252Il Nousbaum JB, Poi S, Nalpas B, et al., (in press). Decreasing prevalence over the lastdecades of infection by HCV type II (l b) in Europe, a genotype stili accounting for mostHCV related cirrhosis and hepatocellular carcinoma. Ann Intern Med.12 Eyster E, Fried MW, Di Bisceglie A, et al, (1994) Increasing hepatitis C virus RNAlevels in hemophiliacs: relationship to human immunodeficiency virus infection and liverdisease. Blood 84 1020-1023

5113 Mannucci PM, Colombo M, Rizzetto M, (1982). Non-progressive course ofnon-A, non-8chronic hepatitis in multitransfused hemophiliacs. Blood 60: 655-65814 Colombo M, Mannucci PM, Brettler DB, et al., (1991). Hepatocellular carcinoma mhemophilia. Am J Hematol 37 243-24615 Colombo M, de Franchis R, Del Ninno E, et aL, (1991). Hepatocellular carcinoma inItalian patients with cirrhosis. N Engl J Med 325 675-680.16. Agnello B, Chung RT, Kaplan LM, {1992). A role for hepatitis C virus infection in type Ilcryoglobulinemia. N Engl J Med 327: 1490-149517 Haddad J, Deny P, Munz-Gotheil C, et aL, (1992) Lymphocytic sialadenitis ofSjogren'ssyndrome associated with chronic hepatitis C virus liver disease. Lancet 339: 321-32318 Nissen E, Hohne M, Schreier E, {1994). In-vitro replication of hepatitis C virus in ahuman lymphoid cellline (H9) J Hepatol 20. 437

52MECCANISMI VIROLOGICI DELL'INFEZIONE.Maurizia Rossana BrunettoDipartimento Sperimentale di Gastroenterologia,Corso Bramante 88, TorinoPatologia Epatica, Ospedale Molinette,I virus parassitano organismi uni o pluricellulari, in grado di garantire la replicazione diacidi nucleici e la sintesi proteica e, utilizzando le cellule come una fucina biologica, produconoun numero estremamente elevato di nuovi virus con lo scopo di perpetuare la specie edinfettare nuove cellule. La progenie virale non è del tutto identica al virus progenitore, ma èsoggetta ad un 1 evoluzione conseguente alla selezione naturale delle mutazioni checontinuamente avvengono durante la replicazione virale. Tale condizione biologica costituisceun vantaggio per la sopravvivenza virale, infatti la capacità di moltiplicarsi vertiginosamenteorganizzandosi in popolazioni eterogenee, garantisce la capacità di adattarsi rapidamente allevariazioni ambientali e di selezionare di volta in volta le varianti virati più efficienti. E' oggipossibile studiare anche le singoli componenti di ogni popolazione virale amplificandoartificialmente i virus che la compongono e confrontandone le caratteristiche genetiche conquelle degli altri virus della stessa popolazione virate. Studi di questo tipo hanno rivelato comel'eterogeneità delle popolazioni virali possa essere paragonabile a quella delle popolazioniumane ( 1 ). Alcune delle variazioni genomiche riscontrate nelle popolazioni virai i sono stateassociate a particolari condizioni e fasi del ciclo vitale dei virus e si sono rivelateparticolarmente utili alla loro sopravvivenza Un tipico esempio di mutazioni utili allasoprawivenza dei virus sono quelle che, detenninando variazioni dell'involucro, sono in gradodi non farli riconoscere dagli anticorpi neutralizzanti o dalle cellule del sistema immune, che èdeputato all'eliminazione di elementi estranei all'organismo (l). I virus, come forme viventidifettive hanno bisogno di parassitare altri sistemi viventi e per tale ragione non causanousualmente la morte od una grave sofferenza delle cellule iilfettate: molte malattie virali, comela maggior parte delle epatiti, non sono causate direttamente dal virus, ma dal tentativo delsistema immune di eliminare le cellule che li albergano. Svariate sono le strategie usate dai{

53virus per sfuggire all'eliminazione da parte del sistema immune (Tab. l). Ai fini di eludere lasorveg]ianza immunitaria alcuni virus, come i retrovirus, hanno sviluppato la proprietà diintegrare il proprio acido nucleico in quello della cellula infettata. Un'altra strategia usata daivirus per sfuggire all'eliminazione immunologica è quella di cercare di indurre il sistemaimmune a tollerarli. Un modo tra i più evoluti ed efficaci è quello utilizzato dal virus dell'epatiteB (HBV) che ha entrambe le capacità suddette(!). L'HBV può nascondere il proprio acidonucleico integrandolo in quello della cellula infettata e può indurre tolleranza producendo uneccesso di materiale vira! e o particelle virai i difettive (almeno l 000 forme difettive per ognivirus vero e proprio) che distraggono 'l'attenzione del sistema immune. In questo modo i virionicompleti possono passare inosservati nella moltitudine di falsi virus che circolano nel sangue.L'alterazione dell'equilibrio tra replicazione virale, sintesi di proteine inducenti tolleranzae risposta immune antivirale può determinare la perdita della tolleranza immunologica conl'inizio della fase di immunoeliminazione e malattia (2). Alcuni dati sperimentali nell'uomo enello scimpanzé (vedi altre letture nella stessa sezione) indicano che anche nell'infezione daHCV il meccanismo principale di danno epatico è di tipo immunomediato (3, 4). Questeosservazioni pongono alcuni interessanti quesiti sui meccanismi di infezione e persistenzadeii'HCV in quanto esso è causa di infezione cronica in un numero di soggetti paragonabile aquelli cronicamente infettati dali'HBV. L'HCV tuttavia non ha la proprietà di integrare ilproprio genoma nel DNA della cellula infettata (5) e apparentemente non induce una vera epropria condizione di immunotolleranza (3). L'HCV come I'HBV è però in grado di infettare lecellule mononucleate del sistema immune e questa via di infezione rappresenta verosimilmentela sua porta di ingresso del virus nell'organismo (6). La prevalenza significativa dell'HCV nellamaggior parte delle patologie autoimmuni, sia sistemiche che organospecifiche, suggerisce cheuno dei meccanismi utilizzati per sfuggire all'eliminazione da parte del sistema immune siaquello di alterare le reattività immunologiche dell'ospite utilizzando a proprio favore alcunimeccanismi immunitari che sarebbero deputati all'eliminazione virale. Il virus infatti siconcentra e si maschera negli immunocomplessi circolanti e riesce abilmente a sfuggire a1Janeutralizzazione mutando rapidamente importanti epitopi del proprio mantello superficiale. Lafrequenza ed il tipo delle mutazioni che awengono a livello di una piccola regione ipervariabilelocalizzata a11'estremità NH2 della proteina di superficie E2 indicano che I'HCV ha un'elevata

54capacita' di mutare con modalità simili a quelle del virus dell'immunodeficienza acquisita (IDV)(7). La variabilità di questa regione appare associata alla persistenza virale ed è indipendentedal tipo e dalla gravità della malattia di fegato. Tuttavia il sistema immune del soggettoinfettato può sviluppare una risposta naturalmente o con l'aiuto della terapia con interferone ingrado di eradicare l'infezione virale. Lo dimostrano studi immunopatologici che hanno rivelatocome la comparsa di cellule mononucleate del sangue periferico (CD4) in grado di riconoscereun numero sempre maggiore di epitopi virali si associ alla guarigione dell'epatite C. I fattorivirologici e dell'ospite che condizionano l'efficienza di eliminazione del virus sono peròsconosciuti e solo il progresso delle conoscenze sulla biologia del virus e sui suoi meccanismidi replicazione potranno permetterei di individuarli in futuro.Tabella l.Meccanismi di persistenza virale in soggetto immunocompetenteTOLLERANZAEvadere la s01veglianzadel sistema immuneRESISTENZASfuggire ali' aggressionedel sistema immune*rimozione delle molecole di riconoscimentosulle cellule infette* cambiamento degli epitopi riconosciuti daanticorpi neutralizzati*abrogazione delle funzioni leucocitarie"escape" universali*localizzazione in cellule senza espressione diHLA*cambiamento degli epitopi riconosciutidai CTL"escape" individuali(

55Bibliografia:1. Sonino F, Brunetto MR., Purcell RH, Zuckermann AJ, ( 1991 ). Genetic heterogeneity ofhepatitis viruses: Clinica! Implications. J Hepatol (Supp. 4 ): 132. Sonino F, and Brunetto MR, (1994). Hepatitis B virus Precore mutants. Virai hepatitisand Liver Disease pp. 256-2603 Brunetto MR, Calvo PL, Oliveri F, Colombatto P, Abate ML, Manzini P, Benino F,( 1994 ). Hepatitis C virus infection and liver disease: peculiar epidemiologica! featuresFems li 259-266-t Botarelli P, Brunetto MR, Minutello MA, Calvo P, Unutmaz D, Weiner AM, Choo QL,Shuster JR, Kuo G, Benino F, Houghton M, Abrignani S, (1993). T-lymphocyte responseto hepatitis C virus in different clinica! courses ofinfection. Gastroenterol 104: 580-587_5 Choo QL, Richman KH, Han JH, Berger K, Lee C, Dong C, Gallegos C, Coit D, Medina­Selby A, Barr PJ, Weiner AJ, Bradley DW, Kuo G, Houghton M, (1991). Geneticorganization and diversity ofthe hepatitis C virus. Proc Nati Acad Sci 88. 2451-2455.6. Nishioka K, Suzuki H, Mishiro S, Oda T, (1994). In: Virai Hepatitis and liver Disease.Springer Verlag Tokyo7 Weiner AJ, Brauer M, Rosenblatt J, Richman KH, Tung J, Crawford K, Sonino F et al( 1991). Variable and hypervariable domains are tbund in the regions of HCVcorresponding to the flavivirus envelope and NS 1 proteins and the pesti virus envelopeglycoproteins. Viro!. 180: 842-848.

56AUTOIMMUNITA'.Francesco B. Bianchi, Luigi Muratori, Marco LenziCattedra di Medicina Interna Il, Istituto di Clinica Medica Generale e Terapia Medica,Università di Bologna_Negli ultimi due anni l'epatite cronica a verosinùle genesi autoimmune, ridefinita toutcours "epatite autoimmune" (EAl), è stata oggetto di attenta considerazione. Nell'autunno1993 l 'lnternational Autoimmune Hepatitis Graup (IAHG) ha proposto i criteri diagnosticidell'BAI sui quali i membri del Gruppo avevano raggiunto il consenso (1). Sulla base dellasomma algebrica dei punteggi, positivi o negativi, attribuiti ad una serie di parametri di minima(clinici, biochimici, positività di autoanticorpi sierici - ANA, SMA, LKMr, presenza dimarcatori virali, esclusione di eziologie note - farmaci, alcool - e presenza di patologieautoimmuni associate) e di parametri addizionali (istologia, autoanticorpi diversi daiprecedenti, presenza di ffi..A B8wDR3 o DR4, risposta alla terapia) il paziente in oggetto èconsiderato o meno affetto da c;matite autoimmune definita o probabile.Nell'autunno 1994, in occasione del Congresso Mondiale di Gastroenterologia di LosAngeles, è stata discussa, e contestualmente pubblicata (2), la nuova terminologia da usarenella definizione delle epatiti croniche~ accanto all'EAI figura una "Chronic Hepatitis,unclassified as to Virai or Autoimmune Origin"· l'introduzione di tale entità nosologica èmotivata dal fatto che in un certo numero di casi non è possibile una chiara distinzione traeziologia virale, suggerita dalla positività di classici marcatori, ed eziologia autoimmune,suggerita dalla presenza di autoanticorpi sierici, alcuni dei quali sono a tutt'oggi indistinguibilida quelli presenti nella classica EAI. Viene in tal modo codificato quanto riportato da noi (3) eda altri sulla sovrapposizione di momenti eziopatogenetici virali (in particolare I'HCV) edimmunologici in un certo numero di casi di epatite cronica. ·.Le caratteristiche deii'EAI, quali possono essere desunte dall'applicazione dei criteriproposti dall'IAHG, sono quelle di una malattia con spiccate alterazioni dei parametri(

57biochimici (AL T, y-globuline) ed istologici all'esordio, che è più frequente in pazienti di sessofemminile e risponde in modo in genere rapido e completo alla terapia steroidea, terapia che ènotoriamente in grado di modificare la storia naturale della malattia. In una analisi retrospettivadella casistica di epatiti criptògenetiche con positività dei classici autoanticorpi sierici,osservata in epoca pre-HCV, i soggetti che non sono risultati affetti da EAI, definita oprobabile, in base ai criteri IAHG si caratterizzano per una più moderata attività biochimica edistologica di malattia e risultano, nella maggior parte dei casi, anti-HCV e HCV RNA positiviEmerge chiaramente in tutte le casistiche che l'EAI LKM 1 -LC 1 positiva interessa, mprevalenza, soggetti in età infante-giovanile (pediatrica in più della metà dei casi, imèriore ai40 anni negli altri casi), mentre i soggetti anti-HCV!LKM1-LCJ positivi (quantiticabili tra il 3 eil 5% dei soggetti con epatite cronica da HCV) hanno un'età significativamente piU elevata eduna più moderata attività di malattia rispetto ai soggetti LKM1-LC1 positivi, anti-HCVnegativi, affetti da EAI. Questi dati, uniti all'osservazione della comparsa deli'LKM 1 in pazientigià infettati dall'HCV, fa ritenere che il fenomeno autoimmune (la comparsadell'autoanticorpo) sia secondario all'infezione virale.L'HCV non deve ritenersi pertanto causa di malattia autoimmune, come l'EAI, cherimane una affezione criptogenetica; attraverso meccanismi non ancora chiariti (mo/uu/armimicry? infezione di cellule immunocompetenti?) e probabilmente sulla base di unapredisposizione (geneticamente determinata?) a montare una risposta autoimmune, l'HCV puòindurre la comparsa di fenomeni autoimmuni: oltre all'LKM 1 , ali'LC1, all' ANA e nllo SMAsono esempi pertinenti di una tale possibilità la comparsa di crioglobuline (Ig anti-Jg mano- epoliclonaJi) nella crioglobulinemia mista correlata all'infezione da HCV e di anticorpi anti­GOR.

Bibliografm:Johnson P J. Md ariane IC.i. convenors. o n bchalf of tht' pan~:L( 1993 l Meetm_t.' rcponlnternational AutOimmune Hepatitis Group Hepatology l.R 998-1 00~TerminologY of Chromc llcpatitis. flepatic Allograft Re]cction. and Nodular LcsHltl~(''the Liver. Summa!)-' of Recommendatton~ Devclopcd b~ an lnternattonal \\'orkin~; Pat1\Supported bv the W or l d Congress of Gastroenterologv. Los Angeles, 19Y4. ( 19CJ·1l A m .lGastroenterol ~9 177-181_ìB~anchi FB. ( 199:-ì l Autmmmune hepatitts the lesso n oftht: chscovery of hcpatitt~, ( \'l fu:.;J Hepatol ~ 273-27)

59MODALITÀ DI TRASMISSIONE DELLE EPATITI NON-A, NON-B PARENTERALIAlfonso MeleLaboratorio di Epidemiologia e Biostatistica, Istituto Superiore di Sanità. Viale Regina Elena,299-00161 Roma.lntroduzioneLe epatiti non-A, non-B rappresentano circa il 20% delle epatiti acute notificate e, comegli altri tipi di epatiti da virus, anche questo ha mostrato nell'ultimo decennio la tendenza alladiminuzione (l). L'identificazione alla fine degli anni '80 del virus C (HCV) ha consentito diattribuire a questo virus gran parte delle epatiti non-A, non-B.Il ruolo deJJ'uso di droghe endovenose e delle trasfusioni nella trasmissione delle epatitinon-A, non-B parenterali è ben noto, ma questi due fattori di rischio spiegano una quota di casinon superiore al 500/o.Obiettivo di questa presentazione è di illustrare altre possibili modalità di trasmissionedelle epatiti non-A, non-B.Fonti dei dati e metodoVengono utilizzati i dati del Sistema di Sorveglianza delle Epatiti Virali Acute (SEIEVA)(l) e quelli di uno studio caso-controllo ospedali ero condotto a Napoli tra novembre 1987 emaggio 1991 (2).Metodo SeieyaIn seguito alla notifica dei casi di epatite virate acuta, ciascun paziente viene intervistatoda un operatore del Servizio di Igiene Pubblica della USL attraverso un questionario standarde vengono registrati i risultati dei principali marcatori dell'infezione da virus epatitici.n questionario indaga sui principali fattori di rischio delle epatiti a trasmissioneparenterale e di quelle a trasmissione oro-fecale. Vengono indagati i sei mesi precedenti perquanto riguarda l'esposizione ai fattori parenterali e sei settimane per quelle feco~orali. Copie

- ~6

OR ·.2 'i flJ_'i% C l-~ 407_3()) per i casi anu-HCV poSlll\1 tJR= 7 ~ t'6°n C!,·~·t ;t;~·lli dilli-l /CV negativi2 b_.22 O)( undtl'.ioni,11 i1Herv:nti ,~hirurgic1. rr:tlLltllèrHi tJt!Lm!Oiil\I"ICI ;.;d ; tr,tll

62Tabella 1Rischi relativi aggiustati* (O.R.) ed intervallidi confidenza al 95% (I.C. 95%).Epatite NonA,NonBSEIEVA 1989- 1993O.R.(l. C. 95%)•Trasfusioni di sangue 6.62(4.05- 10.8)Uso di droghe 17.3(12.7- 23.5)Interventi chirurgici 3.75(2.90- 4.85)Terapia odontoiatrica 1.33(1.13- 1.56)Altre esposizioni 1.27parenterali (1.07 - 1.52)Partners sessuali' 1.34(2 o più) (1.10-1.64)Contatti con portatori"HBsAg• Aggiustati anche per sesso,età, istruzione earea geografica*' Tatuaggio, agopuntura, buchi alle orecchie, rasatura dalbarbiere, manicure e pedicure.'*' Età ;:,15l'

l!63Tabella 2Percentuale di casi e controlli esposti ad uso di droghe per viaendovenosa e trasfusione con Odds Ratios (95% Intervalli diConfidenza) aggiustati, stimati con la regressione logisticapolicotomica in base alla positività anti-HCV. Napoli, Italia 1987-91l CONTROLLIanti-HCV POSITIVI anli-HCV NEGATIVI! (No. 1095) (No. 197) (No. 136)~~.1.) % (9S~~I.)···········-··········--··--··························r······················-····························-············--·························-··············································-··········Fattori di rischio l % % ( 95Droghe endovenose • O. 7 51.3 71.0 13.3 13.0(32.0-160.0) (5.3-31.0)Trasfusioni 0.8(periodo 1987-1989 )!14.849.0 4.6(17.0-140.0)7.0(1.9-27.0)Trasfusioni l 0.3(periodo 1990-1991 lil1.41.9 0.0(0.01-270.0)•Non calcolabile• Aggiustati per età, sesso, livello cl istruzione e per le abre variabili eklncate.

64Tabella 3Percentuale di casi e controlli esposti ai fattori di rischioconsiderati dopo l'escuslone di soggetti trasfusi e tossicodipendenti,con Odds Ratios (95% Intervalli di Confidenza) aggiustati, stimati perregressione logistica policotomlca in base alla positività anti-HCV.Napoli, Italia 1987-91.i CONTROLLI anli-HC\t POSITIVI anli-HCV NEGATIVI1 (No. 1081) (No. 79) (No. 114)Fattori di rischio l % % o.R. % o.R., . {95% C.l.) (95% C.l.)-········-···---···········----r----··-···················--·······--·····-··········-·-·--··---··-··········-·-·····Interventi chirurgici i 2.4 16.5 12.0 12.4 4.9i (4.0-35.0) (2.0-12.0)Ospedalizzazione 10.3 22.8 0.8 17.5 1.1(0.3-2.0) (0.6-2.3)Terapia odontoiatricai• 11.0 22.4 ( 1 .~~. 5 ) 13.2 (0.~~. 1 )Altre esposizioni 2.1 5.1 1. 7 5.4 1.811cutanee•• (0.5-6.0) (0.7-4.8)iPartners sessuate• .., 6.6 16.9 1.4 11.5(0.7-3.0)1.2(0.5-2.7)Consumo di frutti 5. 7 16.7 1.4 13.6di mare (0.6-3.6)2.2(1.0-5.1)• Aggiustati per età, sesso, livello di istruzione e per le attre variabili delralenco.•• Buchi alle orecchie, tatuaggi, agopuntura, pedicure e manicure.·-Età superiore ai 14 anni.(

65Bibliografia:Mele A, Stazi MA, CoronaR, Ferrigno L, Sagliocca L, Palumbo F, et al, (1990). Declineof incidence of A, B and Non-A, Non-B hepatitis in Italy_ Results of four years surveillance.( 1985-88) !tal. J. Gastroenterol22 274-280._, Mele A, Sagliocca L, Manzillo G, Converti F, Amoroso P, Stazi MA, et al (1994). Riskfactors far Acute Non-A,Non-B hepatitis and their relationship to antibodies far hepatitis Cv1rus: A Case-Contro! Study. American Journal of Public Health 84 (l O): 1640-433 Mele A, Stazi MA, Gill ON, Pasquini P, (1990). Prevention of hepatitis B in Italy: lessonsfrom surveillance of type-specific acute virai hepatitis. Epidemia! Infect l 04: 13 5-141~ Mele A, Sagliocca L, Palumbo F, Novaco F, Moiraghi A, et aL( 1993)_ Efficacy ofbloodscreening of donors for antibodies to hepatitis C virus in preventing post-transfusion non­Anon-B hepatitis. Joumal ofPublic Health Medicine !2, 4· 367-369.

66HCV: TRASMISSIONE INTRAFAMILIARE E SESSUALEMaria Chiaramonte, Professore associato di Gastroenterologia, Divisione di Gastroenterologia,Istituto di Medicina Interna, Università di Padova.(con la collaborazione di Umberto Lorenzoni, Specializzando in Gastroenterologia, Universitàdi Padova).L'infezione da HCV è una di quelle dimostrata essere trasmissibile con sangue e derivati.( 1 ). La sua epidemiologia ha dimostrato delle rilevanti analogie con altri virus a trasmissioneematica quali HBV ed IDV. In particolare si sono andati scoprendo sempre più casi diinfezione nei quali non era possibile identificare alcun rischio di tipo ematogeno. Tutto questoha portato ad ipotizzare una possibile trasmissione parenterale inapparente simile a quella chesi era dimostrata per I'HBV ed, in particolare, ad una trasmissione nell'ambito familiare e nellacomunità. Particolare attenzione suscita, naturalmente, la possibile trasmissione sessuale.Epidemiologia di DCV nell'ambito familiareÉ indubbio che la prevalenza di anti-HCV nell'ambito dei conviventi familiari deiportatori cronici di HCV è Sl.V'eriore a quella che si osserva nella popolazione generale (Tab.1 ). Tale fenomeno appare evidente soprattutto in aree geografiche ad alta endemia (AreaMediterranea e Giappone rispetto al Nord-Europa)Dagli studi epidemiologici più dettagliati nei particolari. emergono tuttavia alcunecaratteristiche peculiari:a) 1 clusters familiari descritti sono in genere di pochi elementi ( 2-3 casi nell'ambito dellastessa famiglia);b) 1 casi secondari di portatori di anti-HCV sono in genere adulti, i bambini o adolescentisono rarissimi ( Tabb. 2a, 2b, 2c, 2d);c) 1 casi secondari sono prevalentemente coniugi, anche, se non si escludono fratelli e figli(dati molto parziali sui genitori anche se indicativi di alta prevalenza) (T ab. 3) ..,(

_,_67,_Nell'ambito della convivenza familiare i fattori di rischio sono molteplici: possono essere·~·.,.gli stretti rapporti interumani diretti (es. rapporto sessuale, allattamento, ecc.) ma sono anche'~- condivisione di abitudini di vita ed eventualmente anche di fattori di rischio comuni (es.o;

6bNella valutazione dei dati deve essere tenuto presente cht.:- l coniugi riscontrati entrambi HCV positivi hanno. e vero, matnmoni più lungh1 ma sono difatto anche piu anziani (e nell'area Mediterranea la prevalenza di anti-HCY e massima nellafascia d'eta tra 50 e 60 anni (20) JNelle coppie più giovani costituite da entrambi i comugi HCV positiVI, emerge molto spessocome in entrambi sia presente una stona attuale o pregressa di tossicodipendenzal coniugi condividono anche altri fattori di rischio In uno studio recente da noi condotto eemerso come i principali fattori dt nschio per la trasmiss10ne di HCV in partner sessuali d1paz1enti anti-HCV positivt, fossero rappresentati da trasfusiom e/o uso dt droga e v ne1 cas,secondari nonché dalla condivisione di siringhe di vetro non a perdere nell'ambito familiare- Non esistono studi prospettici soddisfacenti (incidenza di nuovi casi in coniugi di portator1cronici di HCV, la difficoltà di realizzare questi studi è soprattutto costituita dal fattoretempo probabilmente importante per la trasmissione di tale agente virale)- E impossibile valutare con precisione l'avvenuto contatto con HCV a diftèrenza di HBY(assenza di marcatori sierologici di "pregressa infezione". dato soprattutto importante ne1coniugi)- La ricerca di HCV ~ RNA nel liquido seminai e e nella saliva ha dato risultati contrastanti(21, 22)In conclusione, l'ambito familiare rappresenta anche per I'HCV un'area di rischi

69Tabella l.ln° familiari casi secondari li CV+ riferirn.studiatibibliograficol'll-SA, 1989 ' 34 3/34 (8.8%) l 23l' USA, 1990 l 62 - 6li'lSpagna, 1991 ' 530 126/530 (4.9%) 5li!Spagna, 1992 302 (4.3%) 15Spagna, 1994 401 (J.2C!fo)lili14 l(;iappone, 1991 196 5/196 (8%) ! 24 irhailandia, 1992 92 5/92 (5.4%) l IO! l(;ermania, 1993 128 11228 (0.4%) l 25 '.""_'_;•_I_L_o_m_b_•_r_d·_·•_1._1_9_9_1_-+-__l'x_s __ J7/88'!l(7.9%) 26Italia (Lombardia), 1993 107 16/107 (14.9%) 2ll!lItalia (Toscana), 1994 159 14/159 (8.8%) 13Italia (multicentrico), 1994 1400 (6.5"!.,) 27Italia (Veneto), 1994 lO! l 35/401 (8.7%) nostra casisitica

Tabelht 2.cas1 secondan anti-HCV• m ambito famiharc. in rclaz10nc all et 6S 3(1 5 (16.7%)Tabella 2c (da Scand J Gastroenterol. !99l, 28. 343-34(1)età media (anni) ! 55.1 25.7 - jTabella 2d (nostra casistica)prevalenza di cas1 in anti-HCV+m relaziOne all'eta cd al grado di parentelaConiugi Figli Fratelli/Sorelle Genitoris 30 - - 15.4%. -> 30 12.9 1 Yo 14.3% 35.3% 21.0%

71I';Jbella 3.Prevalenza di Anti-HCV in relazione al grado di parentelar Coningi (%) Figli(%) Fratelli/sorelle (o/o) Genitori(%) Rif.bibliografico' 28 6.9 n.d. 54 3l' 4.7 n. d. n.d. n. d. 14rl12.7 12.7 Il 6.8 95.4 1.1 20.5 23 246.7 3 6.7 8.1 514.7 12.6 n.d. n.d. l 2l18 n.d. n.d. n.d. 13lHibliografia:l \Iter MD, Purcell RH, Shih JW et al .. ( 1989)_ Detection of antibodies to hepatitis C v1rusprospectively transfusion recipients with acute and chronic non-A. non-B hepatitis NewEngland Journal ofMedicine HL 1494-1500.Buscarini E, T anzi E, Zanetti R et aL, ( 1993). High prevalence of antibodies of hepatius C,-irus among family members of patients with anti-HCV positive liver disease_Scandinavian Journal ofGastroenterology 28 343-347~ Chang TT. Liou TC, Young KC et al, ( [994)_ Intratàmilial transmission of hepatitis Cvirus· the important role of inapparent transmission_ Journal of Medicai Virology 41. 91-06lCiordon SC Patel AH, Kulesza GW et al . ( 1992). Lack of evidence for the heterosexualtransmission of hepatitis C The American Journal of Gastroenterology 87 ( 12) 1849-!SSTRiestra-Menendez S, Rodriguez-Garcia M. Sanchez S et al, (1991) lntrafamilial spreaddfhepatitisCvirus.lnfection 1_~(6) 431-433

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74TRASMISSIONE NEI GRUPPI A RISCHIO.Pietro Dentice, Rosalba Buongiorno, Anna Volpe, Antonio Miglietta, Gaetano Lonero,Rodolfo SaccoIstituto Policattedra di Clinica Medica e Malattie Infettive dell'Università degli Studi di Bari.Piazza Giulio Cesare 70124 BariIntroduzioneLa disponibilità di metodiche immunoenzimatiche di seconda generazione per la ricercadegli anticorpi specif1ci dell'Epatite da Virus C (HCV) ha fornito importanti conoscenze sulladiffusione dell 1 infezione da HCV in categorie considerate a rischio (l, 2)_ La trasmissionedell'HCV per via parenterale o parenterale inapparentc e suffragata infatti dall'alta prevalenzadi soggetti anti-HCV positivi dopo epatiti acute post-trasfusionali e di donatori anti-HCVpositivi implicati in epatiti post-trasfusionali E' stato inoltre documentato Palto rischio d1infezione da HCV dopo somministrazione di emoderivati o lotti di immunoglobuline.Tossicodipendenti, emodializzati, trapiantati, soggetti sottoposti a cure odontoiatriche edoperatori sanitari, contaminati da sangue potenzialmente infetto, rappresentano le categorie incui sono state verificate più elevate prevalenze di positività per l'anti-HCVLa trasmissione parenterale inapparente (sessuale, perinatale ed intrafamiliare) risultaessere infrequente, probabilmente per la bassa concentrazione virale nei soggetti infettiLa prevalenza dell'ariti-HCV nei donatori di sangue in Italia e compresa tra l'l ed il 3%con alcune significative differenze tra le regioni settentrionali e meridionali, sensibilmente piùelevate rispetto alle prevalenze rilevate nei restanti paesi Europei (3, 4). La prevalenza aumentaproporzionalmente con l'aumentare dell'età e nei soggetti che presentano una alterazione delvalore delle transaminasiLa obbligatorietà introdotta in Italia nel 1990 dello screening per l'anti-HCV del sangueda trasfondere e l'utilizzo di metodiche di seconda e terza .generazione, che risultano esseremaggiormente sensibili e specifiche, hanno drasticamente ridotto l'incidenza di epatiti acute

75post-trastùsiOnali Negli ultimi anni e quindi disponibile nei centri trastUsionali un sangue p1ùsa:uro e a minor nschio di infezione per l'anti-HCV.l .a prevalenza di ant1-HCV in tossicodipendenti e risultata essere compresa tra i! 60 eJ'S0° o ( 5. 6, 7)_ Non si osservano differenze statiSticamente sigmfìcative tra tossicodipendentidelle diverse aree geogratìche, ne si osservano d1flèrenze significative tra i pazienti HIVpos!IÌVI cd HIV negativi. La trasmissione di HCV nei pazienti IIIV positivi e principalmentelegata alla tossicodipendenza, anche se non e del tutto esclusa la vta sessualetossJcodipendentl HCV ed HIV positivi presentano, inoltre, una evoluzmne peggiore della loroepatopatia, nspetto ai soggetti HIV negativi, ed una minore nsposta all'eventuale trattamentocun tnterferon. ~ci pazienti con çpatopatia cromca alcool correlata la prevalenza di ant1-HCV111 Italia e compresa tra il34 ed il 51% senza sostanziali dill'erenze geografiche tra il Nord ed ilSud.\!egli istituzionalizzati ricoverati per detìcit mentali e stata nscontrata una pn:valenza del·l 0 ·o 1 X) Scarsa igtene e contatti interpersonah rosso no Jàvorire la trasmiSSIOne dell'H(' VSessll, età, grado di malattia e durata della istituLionalizzaz10ne non ~embrano essere tintori dtr·i'lchio influenti per l'HCV_!l personale sanitario di assistenza accidentalmente esposto a sangue potenZialmentetntCtto e a rischio di poter contrarre l'infezione da HCV In Italia negli ultimi anm sono stati-;egnalati casi di trasmissione de!I'HCV a seguito di puntura accidentale con strumenti int'etti oper .:tmtaminazione mucosa attraverso micro-lestoni Questa evemenza ha suggento di:ntJctprendere studi epidemiologici sulla ditfus10ne degli dllttcorpl anu-HCV nella popola.lione,-,"P!Jllaliera. In questi studi e stata osservata una prevalenza di anti-HCV (l- 'i 0 'o),;l,!ruticatlvamente ptu elevala nspetto alla popolaz10ne dt comrnllo (9, IO, li l 'itullt,-,r,Jspettici .:ondotti in operaton ~amtari esposti al rischio di infez10ne hanno permesso .11r:,nare il tasso d1 sieroconverstone per !'HCV dopo puntura accidentale con ago infetto usato'r1 paziente HCV positivo_ Il tasso di sieroconversione c compreso tra lo 0,6 ed 11 2. 7~ 1 1).La prevalenza dell'anti-1-ICV negli emotìlici ragg1unge percentuali anche del 90%, specie

7bpazienti con aumento persistente o transitorio de!!c transammas1 e positivna per anti-HC\'Interessante e l'osservazione d1 assenza di anti-HCV positivita m un gruppo di emofìhc1 nntrattati con sangue o plasma. con transaminas1 nel! a norma e trattati esclusivamente con fattor'VIII pastorizzatoNei talassemici trasfusione-dipendenti la prevalenza supera il 60%. senza significati\,_differenze geografiche (l, 2) La positivita rer anti-HCV e strettamente correlata con il numc11 ·delle trasfUsioni, età c l'ipertransaminasemJa persistenteNegli urem1ci cromci in emodialisi periodica s1 osservano prevalenze variabili da centro ;centro (40-60%) Con le metodiche d1 pnma generaziOne e stata documentata una significati\'':correlazione tra HCV positività ed età del paziente. durata della dialisi e numero di trasfusion.(13, 14) Con l'aumento della prevalenza ottenuta con metod1che di seconda generazione. nn1sempre e stata osservata una chiara correlazione tra numero delle trasfusioni ed HC\positività. Recentemente nelle unita dialitiche si registra un decremento dei soggetti HC\positivi Ciò e dovuto all'uso di un sangue controllato ed alle diminuite trasfusioni per l'impieg(,dell'eritropoietina nella prevenzwne dell'anemia dell'emodializzato_ Queste precauzioniassociate all'isolamento dei pazienti anti-HC\' positivi, spec1e se con transaminasi elevatthanno contribuito a ridurre il tasso annuo di infez10ne nei nuovi pazienti immessi in dialisi ne_l!l:ultimi anniLa trasmissione di virus epatitici in soggetti sottoposti a trapianto d'organo suggensn·cautelativamente di non utilizzare organi di soggetti anti-HCV positivi Si potrà procedere s0lnin casi d1 estrema urgenza e di pericolo di vita, fornendo debita autorizzazione da parte delnceventeIn uno studio condotto in pazienti affetti da /.1chen Planus, affezione cronica cutaneomucosaad eziopatogenesi multifattoriale e complessa, e stata dimostrata un'associaziOnesignificativa fra Lichen Planus erosivo della mucosa orale ed epatopatia HCV correlata ( 15 lLa prevalenza di anticorpi anti-HCV in questo gruppo di pazienti e risultata del 36% facendointravedere una possibile associazione tra Lichen Planus ed epatite cronica HCV

77Bibliografia:Chiaramonte M, Stroffolini T, Caporaso N, Coppola R, Craxi A, Gaeta G, Sagnelli E,Zanetti A, ( !991 ). Hepatitis-C virus infection m Italy: a multicentric seroepidemiological~!Udy. I tal J Gastroenterol23: 555-5582 Schiraldi O, (1993 ). Epidemiologica! aspects of hepatitis C vtrus intèction in southern!taly Liver Pathophysiology, Dianzani e Gentilini Eds. pp 99-1053 Sirchia G, Almini D, Bellobuono A. Giovannetti A Marconi M and the ltalianCooperative Group, (1990). Prevalence ofhepatitis c virus and antibodies in ltalian blooddonors. Vox Sang 59: 26-29.4 De Stasio G, Lattanzio A, Vox E, (1990) HCV infection in transfusion medicine BullMol Biol Med 12 163-1785 Fruttaldo L, Schettino G, Coccoli M, Giannini P, Mangio F, (1994). Evidence of HCVintèction by means of RIBA in a population of dmg abusers. Virai hepatitis and Liverdisease pp. 483-484.6 Salvaggio A, Conti M, Albano A, Pian etti A, Muggiasca M, Re M, Salvaggio L, ( 1993 ).Sexual transmission of hepatitis C vims and HIV -l infection in tèma1e intravenous dmgusers. Eur J Epidemia! 2: 279-284.7 Cargne1 A, Gubertini G, Vigano P, ( 1992}. HCV e tossicodipendenza. Li gand Quarterlyu 183-185.8 Pregliasco F, Conti A, (1994). Prevalence of anti-HCV in institutionalised mentallyl1andicapped subjects. Eur J EpidemioJIO: 113-114() lppolito G, Petrosillo N, Puro V, (1994). Rischio di trasmissione nosocomialel()occupazionale dell'HIV e deii'HCV Giom Mallnf46: 374-376Stellini R Calzini A, Gussago A, Rodella A, Signorini A, ( 1993). Lo w prevatence of anti­HCV antibodies in hospital workers. Eur J Epidemici 2: 674-675l l De Luca M, Asciane A, Canestrini C, Di Costanzo G, Galeotta Lanza A, ( 1991 ).Prevalenza dell'anticorpo contro il vims dell'epatite C nel personale ospedaliero. MinervaGastroenterol37: 141-149.

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79LA TRASMISSIONE VERTICALE l PERINATALE DEL VIRUS HCVAlessandro Zanetti e il Gruppo di Studio*Istituto di Virologia, Università degli Studi di Milano, via Pascal38, 20133 Milano.Il rischio potenziale di trasmissione del virus dell'epatite di tipo C (HCV) per vmverticale/perinatale rimane ancora in buona parte da chiarire. I dati disponibili in letteraturasono mfatti molto contradditori dal momento che alcuni Autori riferiscono frequenzeditrasmissione elevate mentre altri riportano tassi molto modesti o addirittura nulli (l).Con lo scopo di valutare la presenza dell'anticorpo anti~HCV nelle donne gravide el'incidenza di infezione da HCV nel neonato, abbiamo esaminato, nel periodo gennaio 1990 -giugno 1993,21516 gravide (età media 28 anni, range 16-44 anni) afferenti a diversi ospedalidella Lombardia (2). Tutti i bambini nati dalle madri riscontrate positive per anti-HCV sonostati seguiti per un periodo di 3-46 mesi.A1l'esame sierologico, 250 donne ( 1.2%) sono risultate ripetutamente positiveall'anticorpo anti-HCV mediante EIA e RIBA e 195 (78%) hanno dato il loro consenso adessere arruolate nello studio. Alla nascita 193 dei 198 (99%) bambini esaminati risultavanopositivi per anticorpi anti-HCV. La percentuale di soggetti sieropositivi si riduceva al 60.6%(74/142) a 6 mesi di età e al 15% (18/116) al 12o mese di vita. Ai controlli effettuatisuccessivamente, solo 4 bambini, tutti nati da madri co-infette con HIV, rimanevanopersistentemente anti-HCV positivi. Infine due bambini sono diventati. nel corso delfnl/ow-up,anti-HCV negativi e successivamente ancora positivi (produzione ex novo di anticorpi attivi).Al momento 116 bambini sono stati seguiti per più di un anno (media 18 8 mesi, intervallo 12--l6 mesi). Di essi, 94 erano nati da madri con sola infezione da HCV e 22 da madritossicodipendenti con doppia infezione da HCV ed HIV. Nessuno dei 94 bambini nati dalprimo gruppo di donne si è infettato con HCV, anche se al parto il 55% di queste madri eranopositive per HCV-RNA. Al contrario, 8 dei 22 (36.4%) bambini nati dalle madri co-infette conIIIV si sono infettati con il solo HCV (5 bambini) o con entrambi i virus HCV e HIV (3bambini) Tutti i bambini che si sono intèttati esibivano lo stesso genotipo materno (genotipo

80la in 4 coppie, 3a in 2 coppie ed lb e 2a nelle rimanenti 2 coppie). Nessuna differenzasignificativa è stata osservata nella distribuzione dei diversi genotipi di HCV tra le madritossicodipendenti che hanno trasmesso e quelle che non hanno trasmesso l'infezione da HCV. Ilivelli di HCV-RNA (Quantiplex Assay) erano significativamente più elevati nelle donne coinfettecon HIV rispetto a quelle con la sola infezione da HCV (mediana 77.55x I05equivalenti l mi, range 12.56-351 7 vs 9.3337x w5 equivalenti l mi, range 3.5-104.8 x 1Q5equivalenti l mi; p< 0.05 mediante test di Wilcoxon)In conclusione i nostri dati indicano che il rischio di trasmissione materno-fetaledell'HCV è modesto quando la madre risulta infetta con il solo HCV, mentre diventanotevolmente più elevato quando la madre è contemporaneamente infetta con HIV ~~ lapresenza in circolo di un maggiore carica viraleBibliografiaTanzi E, Stringhi C, Paccagnini S, Profeta ML . Zanetti AR, (1993). ls HCV transmittedby the vertical/perinatal route? Arch Viro!, Suppl 8: 229-2342. Zanetti AR, Tanzi E. Paccagnini S et al.. Mother -to-infant transmission of hepatitis Cvirus. Lancet, in press.Gruppo di Studio: Bresciani Susanna, Mario Maria Grazia, Rodella Anna. PizzocoloGiuseppe, Padula D. (Brescia); Bulgarelli Jolanda, Caccamo Maria Letizia, Chiodo F.,D'Amico Elio, Magliano Enrico, Muggiasca Maria Luisa, Paccagnini Susanna, PillotonEnrico, Pozzoli R., Romanò Luisa, Stringhi Carlo, Tanzi Elisabetta (Milano); CambièGiuseppe, D'Agostino Francesco (Lodi), Vecchi Laura, Zapparoli Barbara (Monza).

·.--81TRASMISSIONE NELLA POPOLAZIONE GENERALE: FATTORI DI RISCHIOTommaso StroffoliniOspedale di Montefiascone (Viterbo)- Divisione MedicinaL'HCV è un virus presente nel sangue dei soggetti infetti, ove generalmente circola abasso titolo.Le modalità di trasmissione più efficienti sono rappresentate dalla trasfusione di sangueinfètto, dalla somministrazione di emoderivati infetti, dal trapianto di organi da parte didonatori infetti e dall'uso di aghi contaminati con sangue infetto, come frequentemente avvieneper i tossicodipendenti. Più della metà dei soggetti con epatite C non riporta alcuna dellesuddette esposizioni.Sono ammesse, anche se con diverso grado di efficienza, altre vie di trasmissione:perinatale, sessuale ed intrafamiliare.I risultati degli studi svolti per valutare il grado di efficienza di queste vie di trasmissionesono legati sia alla sensibilità e specificità del test anti-HCV utilizzato che alla possibilità d1quantizzare il livello di infettività del caso indice mediante titolazione dell'RNA virale.In generale il rischio di trasmissione di HCV è funzione del grado di viremia del soggettointètto, della durata della esposizione, della modalità ed entità dell'inoculo, della via ditrasmissione, dello stato immunitario del soggetto esposto.Un soggetto con alti livelli viremici di HCV può trasmettere l'infezione ad altri soggettiper semplice esposizione percutanea o mucosa di non eccessive quantità di sangue od altriliquidi biologici.Un soggetto con bassi livelli viremici di HCV può infettare altri soggetti solo medianteesposizione percutanea di una notevole quantità di sangue.

'82Il livello di viremia di un soggetto infetto è comunque fluttuante, pe11anto la probabilitadi un soggetto di infettare un altro e variabile nel tempo, aumentando ovviamente con la duratadi esposiziOne Differenze talvolta nscontrate nei risultati di studi sulla trasmissione sessuale edintrafamiliare riflettono differenti livelli di viremia dei soggetti studiati Inoltre al momento nonVI sono sufficienti dati sulla soglia minima di VJrcrnia necessana per trasmettere l'infeZioneIn generale st può affermare che le vie di trasmissione sessuale, perinatale edintrafamiliare svolgono un ruolo nella diffusione dell'infezione da HCVL'efficienza di queste vie è legata a fattori dell'ospite, del v1rus. de\ soggetto esposw(condizioni di immunodepressione facilitano notevolmente l'acquisizione dell'infezione) e delll'modalità con cui sì verifica l'incontro tra soggetto infetto e soggetto suscettibileL'efficienza di queste vie di trasmissione è comunque per I'H('V più bassa che per altnvirus ematici quali I'HBV e l'Hl\'Prevalenza nella popolazione generalt'Indagini sulla prevalenza di anticorpi verso il virus C (anti-HC'V) nella popolazionegenerale in differenti aree geografiche del modo sono state generalmente svolte sui donatorivolontari di sangueE' noto che tale popolazione non è rappresentativa della popolazione generale in quantoè già sottoposta ad altri screening per virus ematici (HBsAg, HIV), all'autoesdusione da par1L'di soggetti appartenenti a determinati gruppi a rischio ed al fatto di non rappresentare tutte lefasce d'etàLe prevalenze osservate sono in un rangç che và dallo 0,3% della Danimarca al 2% diT aiwan. La sola eccezione è rappresentata dall'Egitto, ove la prevalenza è del 13.6%_ In questoPaese il solo fattore di rischio indipendentemente associato all'infezione da HCV risultato lapregressa schistosomiasi

83Pochi studi sono stati effettuati nella popolazione generale utilizzando corretti criteri d1..:arnp10narnento che potessero fornire validi dati di prevalenza Una sintes1 di alcuni di questi~tudi è riportata nella tabella lDall'insieme delle indagini svolte s1a SUl donatori di sangue che nella popolaziOnegenerale emerge in tutti 1raesi del mondo una prevalenza etit·specitìca dell'infezioneestremamente bassa in età infantile e giovanile con un marcato incremento dopo i 50 anniIn Italia la prevalenza di antl·HCV è nsultata di 0,4% m un campmne naz1onale di 27-l9~o~gettid'età 3-19 anni ( 1) e di 0.48 1n un campione di 4()78 reclute tn1litari d'eta 18-26 anmprovenienti da tutte le Regioni (2)_l n contrapposizione alla bassa CJrco!azione del virus C nelle p1u giovani generaziom,l'Italia è un Paese con un'elevata prevalenza di soggetti adulti con epat1te cronicaHCVcorrelata (3, 4). Tale tènomeno piuttosto che riflettere un'esposizione al virus m etil adulta~embra essere l'espressione di un tipico etfetto coorte. Gli attuali soggetti adulti sarebbero statiesposti al virus anni addietro, allorquando carenti condizioni igieniche e socio·sanitarie nefavorivano la circolazione.Faltori di rischioE' importante premettere che nel valutare soggetti con intèzione cronica da HCV si devetenere conto che l'esposizione al virus risale ad anni precedenti, anche oltre JO nel caso di·,\Jggclti con cirrosi, considerata la lunga stona naturale della malawa Pertanto sia l'attualehvdlo di endemia osservato che i tàttori di rischio nportati dai soggetti infetti fi:ltogratàno una',nuazione di anni addietro.l làttori di rischio associati all'intèzione da v1rus C sono statJ valutati in uno studio caso·(Ontrollo recentemente conclusosi tn Italia nord·orientale, nel quale 500 epatopatici cronici! !CV +/HBsAg· sono stati contì-ontati con 500 soggetti non epatopat1c1 HCV ·li fl3sAg·

84Utilizzando la regressione logistica multipla per eliminare l'effetto confondente dei varifattori di rischio in esame si è evidenziato che le esposizioni indipendentemente associateall'infezione da HCV, accanto alle tradizionalmente note trasfusioni di sangue etossicodipendenza endovena, erano costituite dall'utilizzo di siringhe di vetro sia in famiglia chefuori dall'ambito familiare, dall'ospedalizzazione prima del 1970 e dall'essere stato in sanatorioInoltre stratificando i principali fattori di rischio per fascia d'età si è evidenziato che mentre latossicodipendedenza era riportata solo dai soggetti al di sotto dei 40 anni, gli altri tàttori dirischio erano più frequentemente riportati in soggetti d'età superiore ai 60 anniNel corso degli anni '50 e '60, fino alla prima metà degli anni '70, l'uso di siringhe di vetroera estremamente frequente; le siringhe e gli aghi venivano bolliti per alcuni minutiraggiungendo temperature non sufficienti ad inattivare i virus parenterali quali i virusdell'epatite B, delta e C. Inoltre sovente, soprattutto nelle fasce di popolazione meno abbiente,infermieri non professionali somministravano con proprie siringhe terapie parenterali aldomicilio dei pazienti Essendo utilizzata la stessa siringa per terapie parenterali a diversisoggetti è facile comprendere quanto ampia potesse essere la catena di trasmissione creata daun eventuale soggetto infettoTale modalità di esposizione ha svolto un ruolo importante anche nella diffusione deghaltri virus epatitici parenterali B e delta, come evidenziato da numerosi studi_ Fortunatamentedalla metà degli anni '70 l'uso delle siringhe di vetro è stato progressivamente abbandonato egi

85post-trasfusionale è quasi del tutto scomparsa, essendo i pochi casi ancora riscontratiattribuibili all'intervento chirurgico cui i soggetti si erano sottoposti.Accanto alla tossicodipendenza per via endovena, che comunque interessa solo unapiccola percentuale della popolazione italiana, esposizione tutt'oggi a rischio di infezione daHCV sono gli interventi chirurgici (particolarmente ginecologici) e la terapia dentaria, comeevidenziato da uno studio caso-controllo di recente effettuato sull'epatite acuta nonA, nonBPoichè tale esposizione interessa un'elevata percentuale della popolazione italiana è tàcilecomprendere che verso la prevenzione di tale modalità di trasmissione vanno indirizzati imaggiori sforzi.Negli ultimi anni in Italia studi di incidenza e prevalenzabanno chiaramentedocumentato una drastica riduzione della circolazione del vims 8 e delta dell'epatite qualeconseguenza dei miglioramenti delle condizioni igienico-sanitarie e SOCIOdemograficheche hanno fortemente influito sulla forza di queste infezioni virati. Poichè il virusC dell'epatite condivide con tali virus molte modalità di trasmissione, anche se a più bassogrado di efficienza, è ipotizzabile che i suddetti tàttori abbiano comportato anche una suaridotta circolazione.Lo scenano, peraltro drammatico, di alta diffusione del virus C tra gli epatopazientisarebbe la conseguenza di un evento prodottosi anni addietro. Con il progredire delle coorti digiovani attualmente poco esposti al virus C . è ipotizzabile che tra qualche lustro si potràassistere ad una notevole riduzione delle epatopatie croniche e degenerative correlate a taleVI fU S.

86Tabella l. Prevalenza di Anti-HCV nella popolazione generale.Paese Fasce di età (anni) ELISA HCV+ AutoreArabia Saud. l -IO I 0,9% Alfaleh et all991Taiwan l - 12 II O, l% Chang et al 1993Belize 18-44 II 0,4% Graig et al 1993Cameroon 5-70 II 12,5% Louis et al 1994. 'Italia 3- 19 II 0,4% Romanò et al 1994 ~• •lItalia 18-26 III 0,5% D'Amelio et al 1994 ~• 1 1·~

•87Bibliografia:1. Romanò L, Azara A, Chiaramonte M, De Mattia D, Gianmanco A, Moschen ME, ScarpaB, Stroffolini T, Zanetti AR, (1994). Low prevalence of anti-HCV antibody among Italianchildren infection (In Press).2. D'Amelio R, Stroffolini T, Matricardi PM, Nisini R, Tosti ME, Trematerra M, Villano V,Rapi celta M, Mele A, ( 1994 ). Lo w prevalence of anti-HCV antibody among Italian airforce recruits. Scand J Infect Dis (In Press).3. Chiaramonte M, Stroffolini T, Caporaso N, Coppola R, Craxi A, Gaeta GB, Sagnelli E,Zanetti AR, (1991). Hepatitis C virus infection in Italy: A multicentric seroepiderniologicalstudy. !tal J Gastroenterol23: 555-558.4. De Bac C, Stroffolini T, Gaeta GB, Taliani G, Giusti G, (1994). Pathogenic factors incirrhosis with and without hepatocellular carcinoma: A multicenter Italian study.Hepatology 20: 1225-1230.5. Chiaramorite M, Strotfolini T, Lorenzoni V, Minniti F. Conti S, Floreani A,Ntakinukimana E, Vian A, Ngatchum T, Naccaroto R, Risk factors in community acquiredHCV chronic infection: A case-contro! study in ltaly. J Hepatology (Submitted forpubblication).

88FATIORI DI RISCHIO PER EPATITE C NELLA POPOLAZIONE GENERALE:UNO STUDIO CASO-CONTROLLO.Mauro Zaccarelli, Maria Antonella Longa, Pasquale Noto, Gianna Tossini, Fabrizio Ferri,Ubaldo Visco Comandini*, Giuseppe Visco.Azienda Ospedaliera San Camillo, Forlanini, Spallanzani - Ospedale "Lazzaro Spallanzani" -Roma"' Istituto Malattie Infettive Università di Roma "La Sapienza"Introduzione e obiettiviLa scoperta e l'utilizzazione, negli ultimi anni, di nuovi, più sensibili e specifici metodi(EIA e RIBA 2) per la ricerca degli anticorpi anti epatite C (HCV Ab) ha rivelato l'esistenza, invaste aree del globo, fra cui l'Italia, di una endemia di proporzioni imprevedibili, provocata daquesto virus.Nell989, nell'ambito di una nostra indagine sierologica trasversale, finalizzata allo studio dellaprevalenza dell'infezione da IDV e da HBV, erano stati anche ricercati gli HCVAb sui sieri di9.037 reclute (di 17-20 anni di età), presentatesi alla visita di leva della Marina MilitareItaliana. Su questo campione di popolazione gli HCVAb erano presenti soltanto in n.18soggetti, con una prevalenza dello 0.2 %.Avendo la possibilità di analizzare i dati relativi a un elevato numero di pazienti che si eranosottoposti al test per l'epatite C in cinque grandi nosocomi romani, abbiamo effettuato unostudio caso·controllo, allo scopo di definire i possibili fattori di rischio per l'acquisizionedell'infezione da HCV nella popolazione generale.'iMateriali e metodiI soggetti che, nel corso di tre bimestri (maggio-giugno e settembre·ottobre 1993 efebbraio-marzo 1994), si erano presentati agli ambulatori 'di 3 Ospedali pubblici (Spallanzani.San Camillo, Forlanini) e di due Case di Cura Private (Ars Medica, Guamieri), site in 3diversi quartieri della città di Roma, onde effettuare prelievi ematici per indagini cliniche di(

..89vario tipo, sono stati intervistati mediante un questionario standard. Sui sieri di questi soggettiò stata eseguita la ricerca deii'HCVAb (IDA. Riba 2. [Orthol) e deii'HCVAbllgG (Qenbioco[Medi~al Svstem ]).. :· A tutti i pazienti testatf per HCV Ab è stato somministrato un questionario, cheraccoglieva dati demografici e informazioni su precedenti interventi chirurgici, terapieendovenose, ricoveri per parto o interruzione di gravidanza, donazioni di sangue, malattie qualiil diabete e trasfusioni di sangue. In particolare per gli interventi chirurgici e le pratichesanitarie che richiedevano somministrazione di terapia per via parenterale si è stabilito come;; punto di cut--offl'anno 1975, anno in cui sono entrate stabilmente in uso siringhe monouso-,_-..presso ospedali e strutture ambulatoriali, mentre per le trasfusioni si è cercato di valutare ilrischio prima del 1991, da quando cioè il test per HCV Ab sui donatori è entrato stabilmente inuso presso i centri trasfusionali.I soggetti risultati HCV Ab' positivi sono stati scelti come casi e per ciascuno è statoscelto un controllo random, HCV Ab negativo, accoppiato per sesso ed età (±l anno).Lo scopo dello studio era quello di determinare i fattori di rischio per HCV nella popolazionegenerale, pertanto i tossicodipendenti (TD) per via endovenosa sono stati esclusi in quantol'uso di droghe per via endovenosa era la via attraverso cui passava l'acquisizionedeU'infezione. Analogamente, poiché si voleva valutare il rischio legato a pratiche sanitarieavvenute prima dell975, sono stati esclusi dallo studio i soggetti nati dopo ilt970.I dati raccolti con il questionario sono stati inseriti in un database insieme al risultato deltest per HCVAb. L'esistenza di associazione statisticamente significativa con la positività perHCV Ab per ciascuna variabile di interesse è stata verificata mediante il test del chi-quadrato(analisi univariata); è stata inoltre effettuata un'analisi multivariata attraverso un modello diregressione logistica per determinare l'effetto indipendente delle variabili di interesse sullapositività per HCV Ab. Nell'analisi multivariata sono state incluse le variabili significative(p

90RisultatiIn totale sono stati tostati 5018 soggetti, di questi 226 (4,5%) sono risultati HCVAbpositivi.Quarantanove erano TD (33 HCV Ab positivi, 67,4 %).La prevalenza di HCVAb tra i non-TD era pertanto 3,9% (193/4969).Tra gli HCV Ab positivi 13 sono stati esclusi perché nati dopo il 1970 e Il per datimancanti.A 169 pazienti HCV Ab positivi (l 06 maschi e 63 femmine) sono stati pertantoaccoppiati 169 controlli come descritto nei metodi; l'età media dei casi era 55.9 anni (range25-79) e quella dei controlli 55.7 anni (25-80).In tabella l è descritta la distribuzione dei casi e dei controlli per le variabili consideratenello studio.La tabella 2 mostra il risultato dell'analisi univariata. Associazione statisticamentesignificativa con la positività per HCV Ab era presente per quattro variabili: intervento dipiccola chirurgia prima del 1975; ciclo di terapia endovenosa prima del 1975; storia di diabeteantecedente il 1975 e trasfusione prima del 1991. Al contrario non risultava associazionesignificativa per le stesse variabili dopo le stesse date.Le quattro variabili, più il ricovero per parto prima del 1975, rimanevano significativeanche nell'analisi multivariata, aggiustata per positività per anti-HBV (Tab. 3).Discuuionel dati desumibili dalle nostre osservazioni empiriche sembrano indicare la presenza diun'endemia di infezione da HCV con le seguenti caratteristiche epidemiologiche:prima comparsa del virus a partire dal quarto decennio di età e soprattutto suUa sua largapresenza fra gli ultra-50enni;baasa circolazione di HCV nei soggetti al di sotto dei 20 anm, al di fuori deltossicodipendenza per via endovenosa.Questa endemia, già da tempo in atto prima del 197S·.appare in regressione, dopo taleepoca, per un qualche possibile cambiamento intervenuto nella situazione epidemiologica.Questo cambiamento sembrerebbe essere costituito dalla cessata utilizzazione delle siringhe di..(

92Tabella l. Distribuzione delle variabili per casi e controlliFattori di rischio (RF) HCV+ IHCV-IN 169 1% IN 169 l%Donatore sangue prima 1975 15 9.2 7 j4.3Donatore sangue dopo 1975 16 9.5 16 9.5Terapia endovenosa prima 1975 51 31.3 14 21.5~• dopo 1975 113 17 7 118 IO .iIntervento grande chirurgia prima 1975 32 19.6 39 23.9Intervento grande chirurgia dopo 1975 23 13.6 24 14.2Intervento piccola chirurgia prima 1975 102 62.6 65 39.9"&- • dopo 1975 130 117.8 141 ]24.3 -Ricovero per parto prima 1975 6 9.2 l 1.5per parto dopo 1975 2 J31 14 162.Interruzione di gravidanza prima 1975 2 3.1 6 92'di • dopo 1975 3 4.6 5 17 7 lh_-,,Diabete prima 1975 8 4.9 l 0.6e dopo 1975 IO IOO IO 0.0 ,!>·Trasfusione di sangue prima 1991 24 14.7 8 4.9e di sangue dopo 1991 l I06 12 l j 2Operatore sanitario 4 2.5 7 4.3. . pei"'iiBcAb Il 6.7 16 J37conHBV 4 2.5 12 11.2l '·l!·•~(

93Tabella 2. Analisi univariata.-'- · Fattori di rischio OR !C al95% p' . '' Donatore sangue prima I 975 2.3 0.8-6.4 0.08Donatore sangue dopo 1975 LO 0.5-2.2 NSTerapia endovenosa prima 1975 4.9 2.4-9.8 < 0.001.· Terapia endovenosa dopo 1975 0.7 0.3-L6 NS''' b.tervento grande chirurgia prima 1975 0.8 0.4-L4 NS. Intervento grande chirurgia dopo 1975 LO 0.5-L8 NSIntervento piccola chirurgia prima 1975 2.5 L6-4.1 < 0.001' Intervento piccola chirurgia dopo 1975 0.7 0.4-L2 NS;-!)>;~ Ricovero per parto prima 1975 6.5 0.7-150.3 0.06•Ricovero per parto dopo 1975 0.5 0.1-3.2 NSInterruzione di gravidanza prima 1975 0.3 0.04-L8 NSInterruzione di gravidanza dopo 1975 0.6 0.1-2.9 NSDiabete prima 1975 8.4 L00-183.4 0.02Diabete dopo 1975 - - -Trasfusione di sangue prima 1991 3.4 1.4-8.5 < 0.01Trasfusione di sangue dopo 1991 0.5 0.02-7.2 NSOperatore sanitario 0.6 0.1 2.2Positività per HBcAb 1.9 0.6-6.0 NSConvivenza con HBV positivo 2.0 0.3-16.4 NS

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li,,' ,,,_._RUOLO DEL VIRUS DELL'EPATITE C NELLEDEGU OPERATORI SANITARL95INFEZIONI PROFESSIONALIjNicola Petrosillo, Francesco Albèrtoni, Vincenzo Di Nardo, Vincenzo Puro, Carla D'Ubaldo eGiuseppe Ippolito,Coordinamento del Programma Italiano per la Sorveglianza e il Controllo del RischioOccupazionale da IDV ed altri Patogeni a Trasmissione Ematica c/o Centro Riferimento AIDS-Ospedale Spallanzani- Via Portuense n, 292, 00149 ROMAGli operatori sanitari (OS) rappresentano una categoria a rischio per l'acquisizione diinfezioni da virus a trasmissione ematica. Prima dell'introduzione della vaccinazione, numerosisono stati i casi di infezione occupazionale, manifesta e non, da HBV. In letteratura sonoinoltre descritti casi di trasmissione parenterale occupazionale dell'epatite non-A, non-8 (l). Lamessa a punto di test di lahoratorio (EIA, RIBA, PCR, etc,) diretti nei confronti del virusdell'epatite C (HCV), il maggior responsabile delle epatiti non-A, non-B a trasmissioneparenterale, ha fornito nuove infonnazioni sul rischio da patogeni ematici degli OS,Stima del rischioLe principali fonti di informazione sul rischio di infezione da HCV negli OS sonorappresentate da: l) i casi riportati in letteratura internazionale, 2) gli studi di prevalenza, 3) glistudi di incidenza.Il primo caso di infezione occupazionale da HCV con sieroconversione documentata inOS e' stato descritto nel 1990 (2), ed in totale, a tutt'oggi, sono stati riportati in letteraturaalmeno 18 casi. La puntura accidentale con ago cavo contenente sangue e' la modalità piùfrequente di acquisizione dell'infezione, mentre più rara e' la possibilità di trasmissione per viamucosa, come documentata in un'infenniera italiana di dialisi (3). Da rilevare inoltre che inletteratura e' stata documentata la trasmissione dell'H CV con il morso umano ( 4 ), eventualitàpossibile in ambito occupazionale nosocomiale.

96L'analisi dei casi riportati in letteratura internazionale, oltre a risvegliare l'interessesull'esistenza di un rischio occupazionale, offre una panoramica delle circostanze in cui siverificano le esposizioni, ma non pennette una stima del rischio. Gli studi trasversali, pur con iloro limiti, permettono di conoscere la prevalenza di infezione nelle popolazioni di OS studiati,di confrontarle con quelle della popolazione generale o di altre popolazioni e di identificarealcune associazioni tra la presenza di infezione e fattori di rischio (occupazionali e non).Il tasso di prevalenza di anticorpi anti-HCV negli OS varia dallo O al 4,8% (5-13) asecondo della numerosità della popolazione studiata, dell'area di servizio, de1la provenienzageografica e del tipo di test usato.Mentre nella maggior parte degli studi la prevalenza di anticorpi anti-HCV non e' molto piùelevata rispetto alla popolazione generale o ad altre popolazioni di riferimento (es. donatori disangue), si e' spesso riscontrata una associazione tra prevalenza di anti-HCV e fattori di rischiocomunitario (es. pregressa trasfusione) (13), mentre l'associazione con una pregressaesposizione professionale (puntura accidentale) e' risultata debolmente significativa in alcunistudi (13) e assente in altri (6).Gli studi prospettici offrono dati più precisi sulla stima del rischio di infezione da HCVnegli operatori sanitari. I vari studi eseguiti hanno evidenziato tassi di sieroconversione, aseguito di esposizione professionale a fonte anti-HCV positiva, dallo O al IO% (7,9,14-17): ciòriflette le differenze tra le diverse indagini in termini di numerosità del campione, selezione deicasi e modalità di diagnosi.In particolare, Kiyosawa e coli. (15) hanno riscontrato 3 sieroconversioni per I'HCV inIlO OS esposti all'HCV (2,7%), mentre Mitsui e coli. (16) hanno sottoposto afollaw-up gliOS esposti a puntura accidentale da pazienti in cui era noto lo stato anti-HCV e HCV-RNA. Inquest'ultimo studio, tra i 130 OS esposti che al momento dell'incidente erano anti-HCVnegativi si sono verificate 8 sieroconversioni; 7/68 da pazienti HCV-RNA positivi, 1154 dapazienti anti-HCV negativi. Il tasso di sieroconversione in caso di puntura accidentale dapaziente fonte HCV-RNA positivo e' risultato del IO%Lanphear e coli. (17) hanno rilevato in IO anni 6 casf.di epatite occupazionale non-A,non B (4 con anticorpi anti-HCV) tra gli OS di un ospedale di 732 posti Ietti, con un'incidenzadi 21 casi per 100.000 OS per anno (tasso standardizzato di incidenza 2,96, 95% LC: 1,83-(

: ~'·;'-~-974,36), che e' circa tre volte maggiore di quella in un popolazione di riferimento. Tra i 50 OScon puntura accidentale da paziente fonte anti-HCV positivo vennero documentate 3sieroconversioni (tasso di sier?conversione : 6%).In Italia, Petrosillo '(7) e Stellini (9) non hanno riscontrato sieroconversionirispettivamente in 120 e 30 OS esposti ad HCV, mentre Ippolito (!4) ha riscontrato 2sieroconversioni (1,6%) su 123 OS esposti contestualmente ad HIV ed HCV.Gestione dell'OS esposto ad HCVLa possibilità di una profilassi post-esposizione dell'infezione da HCV attraverso lasomministrazione di immunoglobuline standard e' stata suggerita sulla base dei risultati ottenutiin alcuni studi sulla prevenzione dell'epatite non-A, non-B post-trasfusionale. L'efficaciadi tale profilassi nei confronti dell'HCV non e' stata tuttavia definitivamente dimostrata ed e'oggetto di contrastanti opinioni, anche per il fatto che non e' ancora chiaro quali siano glianticorpi neutralizzanti e se essi siano presenti nei preparati di immunoglobuline standard.Inoltre, in Italia dal 1992 tutti i derivati plasmatici prodotti nel nostro Paese devono provenireda donatori anti-HCV negativi, e dal gennaio 1993, in accordo con le direttive CEE, talenonnativa e' stata estesa a tutti i derivati plasmatici anche se prodotti fuori dell'Europa. Diconseguenza. le Ig standard non dovrebbero più contenere gli anticorpi anti-HCV attualmenteevidenziabili.Il follaw-up dell'OS esposto all'HCV prevede una visita medica e l'esecuzione del testanti-HCV al tempo O e a 6 mesi di distanza. L'OS deve essere invitato a segnalare in qualsiasimomento la comparsa di eventuali disturbi (18).ConclusioniIl rischio di infezione occupazionale da HCV degli OS e' basso ma non trascurabile.Non disponendo attualmente di un vaccino nei confronti di questo virus, l'unica prevenzioneattuabile e' quella della riduzione delle esposizioni professionali. Un maggior rispetto delleprecauzioni universali e, probabilmente, l'introduzione di presidi sanitari più sicuri possonoridurre al minimo il rischio degli OS di contrarre questa infezione.

(98RingraziamentiLavoro realizzato nelrambito del Programma Italiano per la Sorveglianza e il Controllodel Rischio Occupazionale da HIV ed altri Patogeni a Trasmissione Ematica, Progetto diRicerca sull'AIDS del Ministero della Sanità- ISS, Contratto 9201.04.Bibliografia:l. Mayo-Smith M, (1987). Type non-A, non-B hepatitis transmitted by a single needlestick.Am l lnfect Contro! ]2: 266-7.2. Vaglia A, Nicolin R, Puro V, lppolito G, Bellini C, De Lalla F, (1990). Needlestickhepatitis C virus seroconversion in a surgeon. Lancet 336: 1315-6.3. Sartori M, La Terra G, Aglieta M, Manzin A, Navino C, Verzetti G, (1993). Transmissionofhepatitis C via blood splash into conjunctiva. Scand l Infect Dis 25: 270-1.4. Dusheiko GM, Smith M, Scheuer Pl, (1990). Hepatitis C virus transmitted by human bite.Lancet ili: 503-504.5. Di Nardo V, Bonaventura ME, Chiaretti B, Petrosillo N, Puro V, Ippolito G, (1994). Lowrisk ofHCV infection in health care workers. Infection li: 115.6. Petrosillo N, Di Nardo V, Puro V, et al, (1993). Prevalence of IDV, HCV and HBVinfection arnong hospital personnel. J Hepatol18 (Suppl. 1): SI58:T-333.7. Petrosino N, Puro V, lppolito G, et al, ( 1994 ). Prevalence of hepatitis C antibodies inhealth-care workers. Lancet 344: 339-40.8. De Luca M, Aacione A, Vacca C, Zarone A, (1992). Are health-care workers at risk ofHCV infection? Lancet 339:1364-5.9. Stellini R, Calzini AS, Gussago A, Rodella A, Signorini A,(l993). Low prevalence of anti­HCV antibodies in hospital workers. Eur l Epidemiol2: 674-5.IO. Cooper BW, Krussell A, Tilton RC, Goodwin R, Levitz RE, (1992). Seroprevalence ofantibodies to hepatitis C virus in high-risk hospital ,personnel. lnfect Contro! HospEpidemiolll: 82-5.

~,,;...99Il. Zuckennan J, Clewley G, Griffiths P, Cockcroft A, (I 994 ). Prevalence of hepatitis Cantibodies in clinica! health-care workers. Lancet 343: 1618-20.12. Struve J, Aronsson B, Frenning B, Forsgren M, Weiland O, (1994). Prevalence ofantibodies against hepatitiS C virus infection among health care workers in Stockholm.Scand J Gastroenterol29: 360-2.!3. Polish LB, Tong MJ, Co RL, Coleman PJ, Alter MJ, (1993). Risk factors for hepatitis Cvirus infection among health care personnel in a community hospitaJ. Am 1 lnfect Control21: 196-20014. Jppolito G, Puro V, De Carli G, et al, ( 1994). Risk of occupational HIV infection afterneedlestick injuries. Tenth Intemational Conference on AIDS, Yokohama 7-12 August:271B.15. Kiyosawa K, Sodeyama T, Tanaka E, et al, (1991). Hepatitis C in hospital employeeswith needlestick injuries. Aon Int Med, ili: 367-9.16. Mitsui T, lwano K, Masuko K, et al, (1992). Hepatitis C virus infection in medicaipersonnel after needlestick accident. Hepatology !Q: Il 09-13.17. Lanphear BP, Linnemann CC, Cannon CG, DeRonde MM, Pendy L, Kerley LM, (1994).Hepatitis C virus infection in healthcare workers: risk of exposure and infection. InfectContro! Hosp Epidenùol U: 745-50.18. Petrosillo N, Puro V, Ippolito G, (1994). Proposta di un protocollo per la gestione delleesposizioni professionali a rischio biologico negJi operatori sanitari. Giom Ital lnfez Osped1(2): 29-38.

100VALUTAZIONE CLINICA DEL PAZIENTE CRONICO SINTOMATICO.Luigi Ortona, Andrea De LucaIstituto di Clinica delle Malattie Infettive, Università Cattolica del S. Cuore, L.go A. Gemelli 8,00168 Roma, Italia.IntroduzioneGli studi di clonaggio e sequenziamento del genoma del virus dell'epatite C (HCV)hanno reso possibile lo sviluppo di varie metodiche per la ricerca nel siero degli anticorpi anti­HCV (l) e dell'RNA genomico di HCV (2). Grazie a tali test è stato provato che l'HCV èl'agente eziologico di oltre il 90% dei casi di epatite non-A non-B (NANB). L'infezione acutada HCV decorre per lo più in maniera asintomatica e tende a cronicizzare nel 60% dei casi.L'epatite cronica da HCV mantiene per lo più un decorso subclinico ed evolve, nell'arco di 10anni, in circa il40% dei casi in cirrosi epatica (3) e, in un ulteriore 10% in epatocarcinoma (4).Recenti stime hanno evidenziato come il numero dei portatori di HCV in Italia sia di circaL 700.000 (5). Considerando il fatto che la maggior parte di essi presenta forme cliniche più omeno sintomatiche, nel nostro paese l'epatopatia cronica da HCV rappresenta un problemaclinico rilevante.La valutazione clinica del paziente con epatopatia cronica sintomatica associata alt 'HCVè un processo complesso. La stessa definizione di malattia cronica sintomatica si riferisce aduna serie ampia di situazioni cliniche e patologie epatiche che spaziano dal paziente pressochéasintomatico con parametri bioctùmici solo transitoriamente alterati e malattia epatica minimaal paziente con grave cirrosi epatica scompensata. La valutazione clinica del paziente cronico siprefigge inoltre diversi scopi a seconda della situazione. L'esame clinico sarà inizialmente voltoa stabilire l'effettiva cronicità del paziente e la diagnosi eziologica, oltre che il suo statuscomplessivo. Sarà inoltre importante acquisire gli elementi necessari a stabilire la suscettibilitàdel paziente alla terapia interferonica ed il tipo di trattamento da effettuare. La valutazioneclinica è infine indispensabile nel monitoraggio della risposta al trattamento instaurato..{

..lO!Per effettuare una valutazione clinica completa sarà necessario analizzare congiuntamentediversi parametri clinici, biochimici, virologici, immunologici ed i dati istopatologici, assieme aidati epidemiologici del pazient~- Analizzeremo di seguito i suddetti parametri, riportandone larelativa importanza in- quantO indicatori diagnostici di stato della malattia. come fattoriprognostici o predittivi di risposta alla terapia e la lorO utilità nel monitoraggio terapeutico.f.---Valutazione dei Parametri Epidemiologici, della Storia e dello Status Clinico delPaziente.La storia clinica ha lo scopo di mettere in evidenza i fattori di rischio e quindi la modalitàdi acquisizione dell'infezione. In Italia, i fattori di rischio più frequentemente individuabili sonola tossicodipendenza da sostanze per uso endovenoso (25% dei casi) e le trasfusioni di sangueo derivati (10%). Percentuali minori sul totale riguardano pazienti emodializzati, trapiantati,soggetti sottoposti a cure odontoiatriche, tatuaggi, agopuntura. personale sanitario, soggetticon storia di alcoolismo. Possibili anche se rare appaiono la trasmissione sessuale, maternofetalee intrafamillare. In circa la metà dei casi resta comunque impossibile stabilire un fattoredi rischio (6). L'individuazione di tale fattore, oltre che uno scopo epidemiologico, ha unsignificato clinico. L 'appartenenza ad una determinata categoria a rischio può ad esempioindirizzare il clinico verso la ricerca di eventuali coinfezioni con altri virus a trasmissioneanaloga (come HBV o IDV). Determinate modalità di acquisizione dell'infezionesembrerebbero inoltre correlate con i livelli di viremia e quindi con la risposta alla terapia coninterferoni: i pazienti con epatite post-trasfusionale presentano livelli di viremia siericasuperiori a quelli degli operatori sanitari o dei tossicodipendenti (7).Nella storia clinica del paziente meritano particolare considerazione pregressi episodi diepatite clinicamente evidente, coinfezioni con altri virus epatitici, eventuale infezione da IDV erelativo stadio di malattia, patologie autoimmuni, assunzione di farmaci epatotossici edeventuali emorragie digestive da varici esofagee. Occorre inoltre porre attenzione, nella storiadel paziente, ad aspetti clinici che rappresentano una controindicazione alla terapia coninterferone, come cardiopatie gravi, ipertensione non controllata, insufficienza renale, unastoria di comizialità, disturbi psichiatrici. Anche la gravidanza rappresenta una

102controindicazione al trattamento. L'età ed il peso corporeo del paziente come l'eventualedurata della malattia rappresentano importanti fattori predittivi di risposta alla terapia (7, 8)(vedi tabella).L'esame clinico completo del paziente ha lo scopo di mettere in evidenza sintomi e segniclinici di interessamento epatico. Nel paziente "sintomatico" il quadro clinico è spesso subdolo:egli lamenta per lo più una modica astenia con modesti disturbi digestivi e presenta al massimoepatomegalia. Ben più evidenti appaiono i segni dell'eventuale scompenso epatico. Questivanno sempre attivamente ricercati, poiché costituiscono una controindicazione alla terapiaantivirale e necessitano di un trattamento specifico. Dovranno quindi essere valutati eventualisegni di ipertensione portale, ritenzione idrosalina ed encefalopatia epatica (anche subclinica).La presenza di varici gastroesofagee è frequente nei pazienti cirrotici, anche in fase dicompenso e va ricercata attivamente mediante esame radiologico o endoscopico. Esse sonoresponsabili, in un numero rilevante di casi, di emorragia digestiva con mortalità elevata erischio di risanguinamento del 70% entro un anno (9). In circa il 6% dei casi, l'emorragia davarici rappresenta il primo segno di cirrosi, fino a quel momento ignota. Va posta inoltreattenzione ai dati clinici, strumentali e di laboratorio indicativi delle patologie primamenzionate che rappresentano controindicazioni al trattamento con interferoni.Parametri Biochimici, Emocoagulativi ed Immunologici.Le transaminas~ed in particolare le ALT, rappresentano naturalmente l'indicebiochimico di necrosi epatocitaria maggiormente affidabile per la diagnosi di epatopatia cronicaed il suo monitoraggio. La stessa cronicità viene definita, da un punto di vista biochimico, dalpersistere di livelli di transaminasi al di sopra dei limiti superiori della norma per più di sei mesi.Tutti i parametri di funzionalità epatica possono apparire alterati in misura variabile, a secondadella gravità del danno istopatologico. Tuttavia non esisté una correlazione costante fraparametri biochimici ed istologici: si verificano infatti diversi casi con valori nonnali dibilirubinemia, fosfatasi alcalina e globuline, con livelli di transaminasi appena al di sopra dellanorma ed un quadro bioptico indicativo di una forma cronica attiva grave. I pazienti con formapiù grave ed avanzata possono presentare iperbilirubinemia, ipoalbuminemia ed allungamentodel tempo di protrombina. L'ipergammaglobulinemia è frequente, particolarmente in pazienti..(

..103.)·r.'~;:con infiltrati plasmacellulari estesi a livello epatico. Livelli elevati di alcuni parametri biochimiciquali le yGT e la ferritina sierica, oltre che de!le ALT, sono predittivi di una scarsa risposta allaterapia con Interferoni (8) (vedi tabella).I livelli sierici di AL T · costituiscono il parametro biochimico principale per ilmonitoraggio della risposta alla terapia interferonica. Appare ormai sempre più evidente comeuna risposta biochinùca non sia, da sola, sufficientemente indicativa di un'autentica rispostaclinica, ne' tantomeno di guarigione, tuttavia il monitoraggìo di tale parametro mantiene unadiscreta affidabilità e, soprattutto, un insostituibile praticità rispetto a quello istopatologico evirologico. La risposta completa viene definita dalla no1111,alizzazione delle AL T a finetrattamento, mentre la riposta prolungata dalla persistenza delle AL T nei limiti di nonna fino a6 mesi dopo la sospensione della terapia.La presenza di autoanticorpi (ANA. anti-DNA, anti-muscolo liscio, anti-mitocondrio,anti-LKM) va sempre ricercata per valutare la presenza di forme autoimmuni anche in pazientianti-HCV positivi. Queste ultime necessitano infatti di un trattamento proprio. Nei pazientianti-ffiV positivi è fondamentale stabilire il livello dei linfociti CD4+.Il dosaggio dell'a-fetoproteina quale marcatore di epatocarcinoma epatico va sempre correlatoal quadro clinico ed ecografico del paziente. in quanto da solo è scarsamente sensibile (spessoè positivo solo nei tumori epatici di grandi dimensioni) e specifico (si innalza in tutte lecondizioni di replicazione cellulare elevata).Parametri Virologid.Ormai da 4 anni sono disponibili diversi saggi immunoenzimatici (ELISA) per larilevazione degli anticorpi anti-HCV. La specificità del risultato positivo di questi ELISA puòessere verificata mediante immunoblot con antigeni ricombinanti (RIBA). I test di secondagenerazione, presentano una sensibilità maggiore dei precedenti nella diagnosi eziologicadell'epatite cronica C. Nei pazienti con fattore di rischio evidenziabile e malattia epaticaclinicamente evidente, un risultato positivo con l'ELISA è teoricamente sufficiente per indicarel'HCV come causa di malattia: il 91-100% dei casi è confermato dal RIBA di secondagenerazione ( 10). Una piccola percentuale di pazienti può presentare un risultato indeterminatocon il saggio RIBA di seconda generazione. Nei pazienti con epatite cronica sintomatica

104questo rappresenta più frequentemente rispetto agli asintomatici un risultato realmentepositivo, in particolare in presenza di positività della banda degli anti-C22. L'impiego di saggidi terza generazione o la determinazione dell'HCV-RNA può essere utile nel chiarire il realestato di una parte di qUesti risultati indeterminati (Il).Alcuni autori hanno mostrato l'utilità del dosaggio quantitativo degli anticorpi anti-HCVnel monitoraggio della risposta terapeutica. In particolare la negativizzazione o la riduzionedegli anti-CIOO è stata dimostrata essere un utile marcatore di soppressione della viremia (12)ed è risultata significativamente correlata con una risposta biochimica prolungata alla terapiacon lnterferoni ( 13). Gli anticorpi di classe lgM diretti contro antigeni del core virate (IgManti-HCV core), per la determinazione dei quali non sono disponibili saggi commerciali, sonopresenti in una ristretta percentuale dei pazienti con epatopatia cronica HCV -relata e nonmostrano tanto una correlazione con l'attività della malattia quanto con i livelli di viremia (14).La ricerca di HCV-RNA mediante reazione polimerasica a catena dopo trascrizioneinversa (RT-PCR) nel siero dei pazienti con epatopatia cronica è raramente necessaria neipazienti immunocompetenti per indicare l'HCV come agente eziologico. Essa può invecerivestire un ruolo diagnostico in pazienti immunocompromess~ poiché questi possono rimanereanti-HCV negativi pure in presenza di infezione attiva. La determinazione della viremia siericamediante RT .. PCR si sta dimostrando sempre più utile nel monitoraggio della risposta altaterapia. La persistenza di HCV-RNA nel siero nei pazienti con risposta biochimica completa altennine del trattamento è predittiva di recidiva precoce (15). La viremia si negativizza neipazienti con risposta biochimica prolungata. ma in una parte di questi, una positivizzazionetardiva può essere predittiva di recidiva biochimica tardiva (16). Il dosaggio quantitativodeii'HCV-RNA (mediante RT-PCR o amplificazione del segnale tramite il nuovo saggioquantitativo bDNA) riveste un'importanza crescente nella selezione e nel monitoraggio dellaterapia antivirale. E' stato infatti dimostrato che i pazienti -con livelli più elevati di viremia .pretrattamento presentano più difficilmente una risposta clinica completa o prolungata ( 6, 11)(vedi tabella).L'influenza dei vari genotipi deii'HCV sulla progn~i della malattia epatica erisposta alla terapia con Interferoni è oggetto al momento di grande interesse. I genotipi l a ed ,·lb (secondo la classificazione di Simmonds (18)), sono associati ad una malattia epatica più'

}105grave e ad una peggiore risposta alla terapia, mentre i genotipi 2a, Ja e 4 mostrano risposteterapeutiche migliori (19), anche indipendentemente dai livelli viremici pretrattamento (20).Quando la detenninazione ;deJ genotipo potrà essere effettuata da un maggior numero distrutture, essa potrà divenirè un elemento di valutazione indispensabile per la decisione dellastrategia di trattamento da seguire. In tal senso appare promettente la messa a punto di un testsierologico per la differenziazione di tre sierotipi, corrispondenti ai tre genotipi prevalenti inEuropa (21 ), che si è dimostrato efficace nella valutazione delia predittività della rispostaall'lnterferon (22).Nei pazienti con epatopatia cronica da HCV deve essere valutata la presenza deimarcatori sierici di altri virus epatitici, quali I'HBV e I'HDV. Data la sovrapponibilità delle viedi trasmissione infatti, la coinfezione è relativamente frequente. Le percentuali più elevate dicoinfezione si trovano nei pazienti di età più avanzata e con epatopatia più grave (23). Ilfenomeno è frequente anche nei tossicodipendenti, spesso anche anti-fDV positivi.L'associazione HBV+HCV determina un'aumentata frequenza di sviluppo di epatocarcinoma(24). I pazienti con doppia infezione tuttavia, spesso non presentano segni di replicazionedell'HBV, lasciando ipotizzare che il virus C sia la causa principale del danno epatico (25). Ipazienti anti-IHV positivi presentano una carica virate di HCV più elevata e questa appareulterionnente incrementare con il progredire dell'immunodeficienza (26). E' quindi probabileche tali pazienti mostrino una minore risposta alla terapia con lnterferone. Pazienti anti-HIVpositivi immunocompetenti tuttavia, hanno presentato risposte biochimiche sovrapponibili aglianti-HIV negativi (27).Parametri Ecografici ed !sto patologici.L'esame ultrasonografico viene utilizzato aJlo scopo di escludere altre possibili cause diittero ed ipertransaminasemia e di evidenziare alterazioni parenchimali epatiche compatibili conepatopatia e segni di ipertensione portale non evidenti clinicamente, quali aumento dei diametridell'albero portale o minime quote di versamento ascitico. La guida ecografica in tempo realeappare inoltre estremamente utile nella riduzione del rischio connesso all'esecuzionedell'agobiopsia epatica. L'assenza di invasività. la riproducibilità, il relativo basso costo e lasensibilità nell'identificazione di masse focali epatiche rendono infine tale tecnica utile nella

( ..... .j106diagnosi precoce dell' epatocarcinoma mediante screening su larga scala di soggetti a rischioquali i pazienti con epatopatia cronica da HCV (28).L'esame istologico della biopsia epatica è un procedimento indispensabile perl'accertamento della patologia epatica e l'eventuale inizio di un trattamento antivirale. Alladivisione istopatologica classica in malattia minima. epatite cronica persistente, epatite cronicaattiva e cirrosi epatica. può essere affiancata una più fine detemùnazione, mediante punteggio,dell'indice di attività istologica (29). La presenza di cirrosi epatica (8), di aggregati Jinfoidi e dilesioni dei dotti biliari (7) ed un punteggio elevato dell'indice di attività istologica (20) sonoassociati a livelli di viremia più elevati e ad una peggiore risposta alla terapia. L'HCV puòessere messo in evidenza nel preparato istologico mediante immunoistochimica (30),ibridizzazione in situ (31) o RT-PCR (16). L'esame istologico a fine terapia è utile perdocumentare la risposta istologica alla terapia antivirale. La negativizzazione del virus nelcampione bioptico a fine trattamento può essere predittiva di risposta biochimica prolungata(16) ma non in tutti i casi (32).Parametri predittivi di una probabile risposta sfavorevole agli interferonipARAMETRI CLINICImaggiore durata della malattiaetà avanzata (>50 anni)nresenza di obesitàpARAMETRI BJOCHJMICIvalori elevati dì ALT, gGT, ferritina siericaPARAMETRI VIROLOGICIgenotipo lb· viremia elevatapARAMETRI ISTOLOGICIpresenza di cirrosi epaticapunteggio di fibrosi (Knodell) elevatopresenza di flogosi lobulare, aggregatilinfoidi, lesioni dei dotti biliari

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IlOASPETII CLINICI NELL'INFEZIONE DA HCV: VALUTAZIONE CLINICA DELpAZIENTE CRONICO ASINTOMATICONicola Caporaso, Giovanna Del Vecchio-Bianco, Eny Crafa, Mariella Forestieri,GabriellaSessa, Iole Falzarano, Pino lasevoli, Concetta Tuccillo, Filomena MoriscoCattedra di Fisiopatologia della Digestione, Dipartimento di Intemistica Clinica e Sperimentale"F. Magrassi 11 , Università degli Studi di Napoli- Via Pansini 5- 80131 NapoliDefinizione di portatore asintomatico di infezione da HCVPer "portatore asintomatico" di HCV si dovrebbe intendere un soggetto positivo perindici di infezione da virus epatitico C ( HCV ) che non presenti sintomi di patologia epatica.Da una definizione di questo tipo nasce un problema :quali sono i sintomi specifici di patologia epatica che bisogna escludere per definire unsoggetto asintomatico ?Nel 1978 abbiamo valutato la sintomatologia di esordio neUe epatiti croniche e nellacirrosi HBsAg positiva e negativa ( l ). Da quello studio emergeva che non esisteva un profilosintomatologico che consentisse di differenziare in marùera significativa i pazienti HBsAgpositivi da quelli negativi e che. quando presenti. i sintomi erano spesso generici ( astenia,dispepsia, turbe delflalvo, dolorabilità in ipocondrio destro, dimagramento ecc.), sovrapponibilie facilmente confondibili con quelli presenti in disordini funzionali dell'apparato digerente. Nonesisteva inoltre sintomatoiogia di esordio capace di differenziare le epatiti croniche dallacirrosi. Nella maggioranza dei casi Jlevidenziazione della malattia era dovuta a repertooccasionale. Concludemmo allora che "spesso le epatiti croniche presentano quadro clinicosfumato e scarsamente utile, da solo, per affermare l'esistenza ed il tipo di patologiaepatica".ij••l ' lDopo 16 anni abbiamo voluto rivedere le modalità di presentazione dellamalattia in 357 pazienti affetti da epatite cronica consecutivamente venuti aJia nostraosservazione daJ gennaio 1993 al dicembre 1994.(

't..IIIE' emerso che :l- attualmente la maggioranza ( 87%) deUe epatiti croniche osservata nei nostri reparti oambulatori riconosce etiolo~ da virus dell'epatite C;2- nella quasi totalità dei casi ( .90%) alla diagnosi di epatite cronica si giunge non per ipotesidiagnostiche e quindi per indagini ricttieste per sintomi "sospetti" ma per indagini eseguiteoccasionalmente (donazioni di sangue, screening di massa e/o di familiari ecc. ).Da questi dati emerge in maniera chiara che la stragrande maggioranza delle epatiticroniche è priva di sintomi specifici o anche solo sospetti di patologia epatica.Se quindi "per portatore asintomatico" si dovesse intendere un soggetto affetto da infezione daHCV con scarsa o nulla sintomatologia in questa categoria rientrerebbero la grandemaggioranza degli epatopatici cronici anti-HCV positivi.In realtà nell'uso comune si intende per portatore asintomatico di infezione da HCV ilsoggetto che in pieno benessere è occasionalmente rilevato essere anti-HCV positivo~ lamaggioranza degli studi sui portatori asintomatici riguardano infatti i donatori di sangue cheall'atto della donazione risultano anti-HCV positivi. In questo caso l'asintomaticità è garantitadal fatto che questi soggetti si sentivano bene a tal punto da compiere il gesto della donazione.Dai numerosi studi eseguiti in questa categoria di soggetti è emerso (2,3.4,5,6);l. Asintomaticità non va intesa come assenza di malattia epatica.Circa la metà dei donatori volontari di sangue risultati anti-HCV positivi hanno evidenziatoipertransaminasemia e quindi patologia epatica a vario grado di evolutività.2. Normalità delle transaminasi non significa assenza di patologia epatica.3. E' stata documentata presenza di patologia, anche severa, in soggetti che si presentavanocon normalità del quadro clinico e biournorale ../. Asintomaticità, normalità de/Je transaminasi e del quadro istologico non indicano inassoluto assenza di replica vira/e.In conclusione esiste il portatore asintomatico con segni clinici, laboratoristici e/o istologicidi patologia epatica ---> malato ed il portatore asintomatico senza segni clinici,laboratoristici ed istologici di patologia epatica ---> sano. Nell'ambito dei portatori saniesistono soggetti con persistente replica virale nonostante l'assenza di malattia.

112Approccio al portatore asintomatico11 soggetto " occasionalmente " risultato anti-HCV positivo pone una serie di problemiclinici e di rapporto medico-paziente. Le domande che più frequentemente vengono postesono:- sono ammalato ?- se sono ammalato, posso guarire ?-sono "pericoloso" per gli altri ?- come ho preso l'infezione ?Nel rispondere dobbiamo tenere ben presente che le conoscenze sulla storia naturale delportatore asintomatico sono tuttora largamente incomplete e che ci si trova molto spesso difronte ad un soggetto che si sente bene (spesso donatore di sangue) e che fino a qualche oraprima era convinto di essere privo di qualunque tipo di patologia. Ipotesi di storia naturale (possibile sviluppo di cirrosi ed epatocarcinoma) o di pericolosità per l'ambiente ( diftùsionedell'infezione) vanno evitate o comunque non date per certe.Presenza/assenza di patologia epatica (2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9)Alterazioni deiie transaminasi, anche lievi o fluttuanti, esprimono quasi sempre presenza dipatologia. l livelli di elevazione delle transanùnasi non si correlano in maniera stretta conpresenza 0 assenza istologica di cirrosi o con l'entità dell'attività istologica .Deriva da quanto esposto che, in presenza di elevazione degli indici di citolisi, è utileproseguire l'iter diagnostico anche con l'esecuzione di biopsia epatica, indispensabile in questicasi per la diagnosi e l'impostazione terapeutica corretta. Infatti in presenza di attivitàistologica e di elevazione delle transaminasi è da consigliare terapia con interferone. La storiasuccessiva è quella delle epatiti croniche da HCV.Jn assenza di qualsiasi segno clinico e Jaboraloristico di patologia epatica è utile controlloperiodico mensile, sia clinico che laboratoristico, per almeno sei mesi: in caso di persistentenormalità delle transaminasi è consigliabile detenninazione di HCV-RNA sierico. In caso dinegatività di HCV -RNA abbiamo elevate probabilità che si tratti di pregressa infezione daHCV guarita, con scomparsa anche della viremia e persistenza anamnestica di reazione.,(

1!3antieorpaJe anti-HCV. In questo caso si può rassicurare il soggetto anti-HCV positivo econsigliare quaJche altro controllo di transaminasi a distanza di 6-12 mesi.In caso di positività di HC'-:-RNA il discorso è più complesso.Alcuni Autori ritengono che tutti o quasi tutti i soggetti anti-HCV /HCV-RNA positivi, anchein presenza di normalità delle transaminasi, abbiano segni istologici di patologia epatica. per cuiconsigliano sempre l'esecuzione di biopsia epatica. Altri Autori invece sostengono che esiste ilportatore sano di HCV per cui in presenza di normaJità persistente delle transaminasi non siadel tutto giustificata resecuzione di biopsia epatica.E' largamente probabile che i differenti dati ottenuti sui soggetti anti-HCV positivi contransaminasi nonnali e quindi le diverse modalità di comportamento consigliate dipendano daltipo di casistica studiata : se si prendono in considerazione i soggetti anti-HCV positivi chegiungono alla nostra osservazione, avendo eseguito una sola determinazione delletransaminasi risultata nella norma, è possibile che alla biopsia epatica si evidenzino casi conepatopatie anche evolutive~ se invece si prendono in considerazione soggetti che in un followuplungo hanno sempre evidenziato normalità delle transaminasi aJiora è più probabile che sitratti di soggetti sani. E' infatti noto che nella storia naturale dell'epatite cronica da HCVesistano periodi anche lunghi di normalità delle transaminasi che si aJtemano a periodi dicitolisi anche intensa. E' quindi probabile che, più lungo è il periodo di nonnalità delletransaminasi osservato, maggiore è la probabilità che il soggetto anti-HCV positivo sia sano,nonostante la persistenza di viremia.Meccanismi di diffusione neO' ambienteI meccanismi di diftùsione dell'infezione da HCV non sono del tutto ben definiti. E'largamente documentata la possihilità di trasmissione dell'iniezione per via parenterale(trasfusione di sangue o emoderivati, siringhe e strumentario infetti ecc.); non sono a tutt'oggiben chiari gli altri meccanismi di trasmissione dell'infezione che certamente esistono. Emergeinfatti dalle varie casistiche che solo la metà, o addirittura meno, delle epatiti croniche da HCVriconoscono nella esposizione parenteraJe manifesta il momento di contagio. NeUamaggioranza dei casi è da ipotizzare trasmissione parenterale inapparente.

114E' stata documentata elevata prevalenza di anti-HCV positività e patologia epaticacorrelata nei familiari conviventi, specie coniugi, di propositi anti-HCV positivi (IO), maquesto non indica in maniera assoluta che la convivenza (intesa come mero contatto) consoggetti anti-HCV positivi ti& da considerare fattore di rischio di infezione da virus epatiti co C.In famiglia, infatti, si condividono altre abitudini che potrebbero giustificare le aggregazionifamiliari di anti-HCV positività (stesso dentista, uso - specie in passato - di siringhe di vetro,uso promiscuo di forbici, lamette ed altri strumenti taglienti ecc.).Sono in corso studi prospettici per valutare se la eliminazione di questi potenzialimomenti contagianti elimina il rischio di acquisizione familiare di infezione da HCV. Nell'attesadi avere dati certi e definitivi appare prudente e giustificato dare al soggetto anti-HCV positivole seguenti raccomandazioni:l. non donare sangue2. awertire i sanitari dello stato di anti-HCV positività3. evitare l'uso promiscuo di strumentario potenzialmente contagiante4. evitare che altre persone vengano a contatto con il sangue potenzialmente infettante.Esistono ancora dubbi sulla possibilità di trasmissione dell'infezione con i contatti sessuali oper via materno fetale. Queste vie di trasmissione sono quasi esclusive dei soggetticontemporaneamente anti-HIV positivi.Storia naturale e monitoraggio dd portatore sano di anti-HCVPer portatore sano di infezione da HCV si deve intendere il soggetto anti-HCV positivosenza segni clinici, laboratoristici ed istologici di patologia epatica. .Non è nota la storia naturale di questi soggetti: non è definito cioè se il portatore sano di HCVcon il trascorrere degli annil - si ammala2 - diventa HCV -RNA negativoUno studio preliminare (Il) di storia naturale di soggetti anti-HCV positivi, HCV-RNApositivi , sani anche istologicamente, sembra indicare che nel cors@ di due anni di monitoraggioclinico e laboratoristico:a- nessun soggetto diventa HCV-RNA negativo(

}115b - nessun soggetto mostra modifiche dei livelli di tt1111S8!1linasiAJio stato attuale delle conoscenze il soggetto riscontrato occasionaJmente anti·HCVpositivo deve essere controiJ~to periodicamente (ogni mese per i primi sei mesi) mediantemonitoraggio delle transaminasi. In caso di alterazioni anche lievi di AL T è consigliataesecuzione di biopsia epatica; in caso di persistente nonnaJità di AL T e di positività per HCV ~RNA, il monitoraggio di questi parametri neJ tempo e maggiori conoscenze di storia naturale ciindicheranno il comportamento da seguire. Dati preliminari sembrano indicare che èinopportuno iniziare terapia con interferone in soggetti con AL T normali anche in presenza diHCV-RNA positività (12). La detenninazione di lgM anti-HCV non offie in questa categoriaulteriori infonnazioni. I dati della letteratura (13) indicano, intàtti, che le IgM anti-HCV sononegative nei portatori sani di HCV ma anche che circa la metà dei soggetti anti-HCV positiviaffetti da epatite cronica non hanno reattività anticorpale di tipo IgM anti-HCV.l lil lBibliografia:l. Coltorti M, Del Vecchio-Bianco C, Caporaso N, (1978). Clinica delle epatopatie cronicheda virus B. Rass. Clin. Scient. 9-10: 10-172. Coltorti M, Romano M, Persico M, Morisco F, Tuccillo C, Caporaso N, ( 1995). SerumHepatitis C Virus RNA and Liver Histology in asymptomatic anti-HCV positive subjects.Infection in press.3. Estehan JH, Lopez-Tavalera JC, Genesca Jet al., (1991). High rate ofinfectivity and liverdisease in blood donors with antibodies to hepatitis C virus. Ann. Int. Med. 115: 443-4494. Alberti A, Morsica G, Chemello L, Cavalletto D, Noventa F, Pontisso P, Ruol A, (1992).Hepatitis C virus and liver disease in symptom-free individuals with anti-HCV. Lancet340: 697-6985 Yuki N, Hayasbi N, Kamada T, (1993). HCV viraernia and liver injury in symptom-freeblood donors. Lancet 342:4446. Brillanti S, Foli M, Gaiani S, Masci C, Miglioli M, Barbara L, (!993). Persistent hepatitisC viraemia without Jiver disease. Lancet 34 J : 464-465

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·-~-)117VALUTAZIONE CLINICA DEL PAZIENTE CRONICO ASINTOMATICOGiovanni RaimondoDipartimento di Medicina Inteina - Policlinico Universitario 98100 MessinaPossiamo definire portatore cronico asintomatico di virus dell'epatite C ogni soggettocon positività per anticorpi anti-HCV, confermata con test RIBA, che presenti indicibioumorali di funzionalità epatica normali e nessun segno clinico di malattia di fegato.L'individuazione di un portatore asintomatico è, ovviamente, un evento occasionale,tanto che tali soggetti vengono in genere identificati tra i donatori di sangue risultati anti-HCVpositivi ai routinari test di screening (1-3). Si tratta di una condizione che spesso crea dubbidiagnostici e terapeutici al clinico (4), e quanto essa sia rilevante è confermato dal numero distudi che continuano ad essere condotti su questo tema (5).Sono principalmente due le problematiche riguardanti lo stato di portatore asintomat_ico diHCV:l) non si è certi se un'infezione da HCV possa esitare nella completa eliminazione del virus, equindi se, in caso di mancata evidenziazione deii'RNA virale, gli anticorpi anti-HCV siano solosegno di pregressa infezione. Infatti, il non rilevare I'HCV-RNA nel siero potrebbe esseredovuto ad una transitoria riduzione della viremia a livelli talmente bassi da non essere rilevatidalla pur sensibilissima tecnica deJia doppia reazione a catena della polimerasi (nested PCR).2) E' incerto se un portatore "asintomatico" di HCV possa essere realmente e stabilmente"sano", non essendo stato ancora appurato se un'infezione cronica da HCV (confermata dallapositività per HCV -RNA) possa instaurarsi senza che si produca, nel corso degli anni, alcundanno epatico, come può verificarsi nel caso di infezione da virus B (HBV). Tra l'altro,ancora oscuri sono i meccanismi patogenetici alla base della epatopatia da HCV. Ritengoimportante ricordare che portatore sano di virus B è definito ogni soggetto positivo perHBsAg ed anti-HBe, negativo per IgM anti-HBc e HBcAg intraepatico, con funzionalità equadro istologico del fegato assolutamente nonnali (6, 7) e con attività replicativa del virus

--118soppressa a tal punto che la viremia non può essere rilevata con la tecnica di ibridizzazione dotb/ot, ma solo attraverso l'amplificazione del DNA mediante PCR (8).Nel caso di pazienti anti-HCV positivi ed HCV-RNA negativi, malgrado i sopracitatidubbi di interpretazione, l'atteggiamento clinico è solitamente univoco, soprattutto se il testanti-HCV RIBA dà un risultato indetenninato (positività per uno solo degli anticorpievidenziabili): non si opera alcun tipo di intervento, anche se è consigliabile eseguire unfol/owupdi questi soggetti controllando periodicamente gli indici bioumorali ed i rnarcatori virali.Per quanto riguarda i soggetti HCV-RNA positivi (da considerare i portatoriasintomatici propriamente detti) l'approccio clinico è controverso. Per meglio comprendere ilmotivo di tanta incertezza dobbiamo considerare i dati contrastanti emersi da studi divalutazione del quadro istologico epatico in questi individui. Sono stati infatti pubblicati deilavori in cui si dimostrerebbe che tutti i pazienti asintomatici, con persistente viremia e costantenonnalità degli indici di funzionalità epatica, presentano un quadro istologico di epatite cronicadi vario grado, e, in alcuni casi, anche di cirrosi (9, 10). D'altra parte, altri studi indicherebberoche lo stesso tipo di pazienti possa presentare un quadro istologico del tutto normale (Il, 12).Attenendoci ai primi lavori citati, dovremmo effettuare l'agobiopsia epatica in tutti i soggettirisultati HCV -RNA positivi, indipendentemente dai segni clinici e dagli indici bioumorali, inquanto l'esame istologico del tessuto epatico indicherà il grado di malattia cronica del paziente.Gli altri lavori, invece, dimostrerebbero J' esistenza di portatori cronici sani di infezione daHCV, per i quali, owiamente, l'agobiopsia epatica sarebbe una procedura inutile. Quale saràallora l'approccio clinico a questi pazienti?E' sicuramente importante effettuare dei controlli rawicinati (mensili) degli indicibioumorali di necrosi epatocitaria per un periodo di tempo prolungato (almeno un anno). In talmodo è di solito possibile riconoscere quelle forme, relativamente frequenti, di epatite cronicacon andamento ondulante delle transaminasi, caratterizzate da periodi, anche lunghi, dinormalità dei test di funzionalità epatica, intervallati da improvvise pousées di riattivazionedella malattia con picchi di ipertransarninasemia. Una volta identificate, la valutazione clinica diqueste forme sarà analoga a quelle delle epatiti croniche sintomatiche. Nel caso in cui,nonostante i ripetuti controlli, non si evidenzi alcuna alterazione degli indici bioumorali,l'atteggiamento del clinico potrebbe essere quello di astenersi da qualsiasi intervento, tenendo(

)..119presente, però, che soltanto l'esame istologico di un frammento bioptico può documentare concertezza l'assenza o meno di malattia epatica.Per concludere, un pr~blema recentemente aperto riguarda l'eventuale trattamentoterapeutico con interferone 'dei portatori asintomatici di HCV con ma1attia epaticaistologicamente dimostrata. Alcuni studi in tal senso sono in corso, ma. fino ad ora, sono statiriportati solo i dati preliminari di uno di questi (13). Tuttavia l'uso dell'interferone in questisoggetti desta più di una perplessità, e questo in quanto a) come già riportato in precedenza. lamancata evidenziazione deli'HCV-RNA nel siero non è indice sicuro di completa eliminazionedel virus, b) l'efficacia terapeutica dell'interferone nei pazienti con fanne tipiche di epatitecronica si osserva solo nel 20-25 % dei casi (14, 15), e c) una parte di questi, pur conpersistente nonnalità delle transaminasi, presenta permanenza della viremia ( 16, 17).Bibliografial. Serfaty L, Girai P, Elghouzzi MH, Jullien AM, Pouon R, (I 993). Risk factors forhepatitis C virus infection in hepatitis C virus antibody ELISA-positive blood donorsaccording to RIBA-2 status: a case-contro! survey. Hepatology l1: 183-187.2. Hagiwara H, Hayashi N, Mita E, Naito M, Kasahara A, Fusamoto H, Kamada T, ( 1993).Quantitation ofhepatitis C virus RNA in serum of asym-tomatic blood donors and patientswith type C chronic Iiver disease. Hepatology l1: 545-550.3. McGuinness PH, Bishop GA, Lien A, Wiley B, Parsons C, McCaughan GW, (1993).Detection of serum hepatitis C virus RNA in HCV antibody seropositive volunteer blooddonors. Hepatology .!J!: 485-4904. Ford C, (1994). Asymptomatic hepatitis C infection. More questioos than answers. BrMed J 308: 1235 (lettera)5 45th annua! meeting ofthe American Association for the Study ofLiver Diseases, (1994).Hepatology 20, Pt 2 Abs. n. 431, 552, 553, 556, 557, 635.6 De Franchis R, D'Arminio A, Vecchi M et al., (1980). Chroni

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121VALUTAZIONE CLINICA DEL PAZIENTE CRIOGLOBULINEMICO E DELPAZIENTE AUTOIMMUNEFrancesco B. Bianchi, Luigi Muratori, Marco LenziCattedra di Medicina Interna Il, Istituto di Clinica Medica Generale e T era pia Medica,Università di Bologna.La disponibilità di test affidabili e routinari per la dimostrazione di anticorpicircolanti diretti contro proteine del virus dell'epatite C (HCV) ha stimolato l'estensionedella ricerca di anti-HCV in patologie ad eziologia non nota, verosimilmente virale. Ilcampo che si è dimostrato a tutt'oggi il più fecondo di risultati è quello dellacrioglobulinemia mista (CM), definita essenziale (CME). La supposta operatività divirus epatitici nella genesi di tale situazione morbosa non è nuova: in passato è statosostenuto l'intervento deWinfezione da HBV (l); questi risultati non sono stati peraltroconfermati.Le prime osservazioni, condotte in paesi dell'area mediterranea, hanno segnalato chela prevalenza dell'anti-HCV nei pazienti con CME oscilla tra il 50 ed il 60% (2, 3, 4).Tali osservazioni sono state confermate negli studi successivi. Una volta acquisita lanozione dell'associazione tra HCV e CME, il problema che immediatamente si è posto èstato in buona misura nosologico: infatti i contributi più significativi hanno cercato didefinire i pazienti in studio suddividendoli in gruppi omogenei, che oggi possono esserecosì schematizzati:l. pazienti con epatite da HCV, in cui si ricerca la presenza della crioglobulinemia;2. pazienti con epatite cronica da HCV che, oltre al quadro clinico dell'epatopatia,presentano sintomi e segni di interessamento multisistemico extraepatico (cutaneo,renale, neurologico), indistinguibili da quelli che definiscono la CME;3. pazienti reumatologici, renali, neurologici in cui la diagnosi di CME induce a ricercarela presenza di infezione e di malattia epatica correlata aii'HCV.

122Nel primo gruppo la ricerca delle crioglobuline (C) sieriche ha dato esito positivo inpiù della metà dei casi In una delle casistiche più numerose ( 4) si tratta, nei due terzi deicasi, di C policlonali (tipo III, secondo Brouet et Al -5), presenti a bassa concentrazionenel siero_ Nel restante terzo dei casi è in causa una forma di tipo Il, in cui la componentemonoclonale è, nella grande maggioranza dei casi, di classe lgM k. Va segnalato cheun'affidabile caratterizzazione del tipo di C richiede l'applicazione di tecnicheimmunochimiche (come l'immunoblotting-IB) di uso non routinario; J'IB si è dimostratoinfatti più sensibile e specifico nell'identificazione di mono- o oligocloni rispetto alletecniche correnti (immunoelettroforesi, immunofissazione) (6). Nell'ambito dei pazientianti-HCV positivi il gruppo di pazienti con C si differenzia dal gruppo senza C per unapiù lunga durata di malattia, più elevati livelli di lg sieriche ed una maggiore frequenza diCIITOSI.Indizi di associato interessamento extraepatico sono presenti in un quarto circa deicasi, che vengono per questo a costituire il secondo gruppo_ La presenza o meno disintomatologia extraepatica sembra disgiunta dal tipo (II o Hl) di CM sierica. l sintomipiù frequenti sono, in ordine decrescente, porpora, neuropatia periferica, interessamentorenate, fenomeno di Raynaud e, più raramente, artralgie o artrite e vasculite.Il terzo eterogeneo gruppo è costituito da pazienti in cui la presenza del classicoquadro di CME (definito dalla triade sintomatologica "porpora, artralgie, astenia")stimola la ricerca dell'anti-HCV e dell'HCV RNA e lo studio del fegato. Nel 1992Agnello et Al (7) hanno confermato quanto già in precedenza segnalato (2) sulla strettaassociazione tra HCV e CME di tipo Il; riferiscono inoltre interessanti osservazioniaggiuntive che riguardano:una sorprendentemente maggiore sensibilità deii'HCV RNA rispetto all'anti-HCV diseconda generazione nell'identificazione dell'infezione da HCV;2. il fatto che l'HCV RNA (e quindi il virione HCV) ed i complessi anti-HCV/HCV siconcentrano significativamente nel crioprecipitato: questo suggerisce che I'HCVgiochi un ruolo nella patogenesi della CM;

-1233. il Fattore Reumatoide (FR) monoclonale rinvenuto nell'infezione da HCV è di tipoW A: questo lo caratterizza come un anticorpo naturale, codificato da geni della lineagerminativa senza o con poche mutazioni somatiche_ li FR monoclonale di tipo W Apotrebbe essere un anticorpo naturale diretto contro l'HCV, prodotto da specitici Blinfociti e l'infezione da HCV (degli stessi linfociti?) potrebbe essere responsabile dellaloro proliferazione.Il riscontro di CM associata ad infèzione da l-l CV, con o senza segni di malattiaepatica, pone oggi pochi problemi sotto il profilo della terapia farmacologica: numerosi.~tudi,anche controllati (8, 9), indicano un etfetto benefico dell'aiFN con risultati positivis1a sulle manifestazioni cliniche, epatiche ed extraepatiche, sia sui parametri bioumorali.In generale i risultati sembrano tuttavia leggermente inferiori a quelli osservati nellamalattia da HCV senza crioglobulinemia.Rimane aperto il quesito che riguarda l'approfondimento diagnostico da mettere inatto nel caso del riscontro di una CM con positività deii'HCV, con o senza epatopatia.L'osservazione che la presenza dì lg monoclonali si associa spesso alla presenza dimonotipi midollari che configurano la presenza dì un linfoma non Hodgkìn a basso grado(segnalazione effettuata in epoca pre-HCV -l O) è attualmente oggetto di attiva ricerca.Bibliografia:Levo Y, Gorevic PD, Kassab HJ, lucker-Franklin D. Franklin EC, (1977)..\ssoc1ation between hepatitis B v1rus and essenualmixed cryoglobulinemm. N EnglJMed296: 1501-15042 Ferri C, Greco F, Longombardo G, Palla P, Moretti A, Marzo E. Fosella PV, PaseroG. Bombardieri S, ( 1991 ). Antibodies to hepatitis C virus in pat1ents with mixedcryoglobulinemia. Arthritis Rheum. 34. 1606-1610

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125INFEZIONE DA VIRUS DELL'EPATITE C (HCV): PROBLEMATICHE CONNESSEAL TRAPIANTO DI FEGATOErica Villa, Antonella Grottola, Paola Buttaloco, Annalisa Merighi, llva Ferretti, FedericoManentiCattedra di Gastroenterologia, Università di ModenaL'infezione con il vtrus dell'epatite C {HCV) è un evento piuttosto comune dopotrapianto epatico: la recidiva è molto frequente (l, 2) mentre nuove infezioni si verificano inpercentuali variabili anche se no p molto elevate (l, 4 ). I problemi principali, fra lorostrettamente collegati, che si pongono in questi pazienti sono essenzialmente tre: l. lecaratteristiche dell'infezione dal punto di vista biologico-molecolare; 2. l'interazione fra HCV esituazione immunologica del paziente dopo il trapianto (situazione questa che condizionanotevohnente la diagnostica dell'infezione); 3. l'effetto a lungo termine dell'infezione da HCVsulla situazione clinica epatica.Per quanto riguarda le caratteristiche dell'infezione dal punto di vista biologicomolecolare,i pazienti in cui si ha una recidiva, presentano elevati livelli di viremia già pochigiorni dopo il trapianto. Questo dato contrasta in parte con la valutazione che era stata fattainizialmente con i tests anticorpali (l). Questi infatti mettevano in evidenza una percentuale diinfezioni da HCV nel post-trapianto molto inferiore a quelle poi dimostrata successivamentec-A)n le tecniche di biologia molecolare che, valutando direttamente la presenza del genomavirate, owiavano alla sottostima del tests anticorpale (5, 6). Verosimile responsabile di questascarsa positività anticorpale è la pesante immunosoppressione del periodo post-trapianto chepuò determinare una diminuzione marcata (nei p. già infetti prima del trapianto) oun'incapacità a produrre anticorpi anti-HCV (nei p. neo·infetti). Dal punto di vista dei genotipideii'HCV, vi sono numerose indicazioni in letteratura che in caso di reinfezione, il ceppo che siritrova dopo il trapianto è lo stesso che il paziente presentava prima del trapianto ( 6, l l) anchese il virus tende a diminuire la sua eterogeneità con solo modeste differenze di sequenza fra ivari sottotipi che lo costituiscono (7, 8).

126Più interessanti sono gli eventi che si presentano nei pazienti trapiantati che non eranoprecedentemente anti-HCV positivi: in una serie di pazienti osservati nel nostro Istituto, in unintervallo di tempo che va da un mese a quattro-cinque mesi dopo il trapianto, è identificabileuna transitoria positività per I'HCV RNA Successivamente, nonostante non si sviluppi alcunodegli anticorpi identificabili con le metodiche attuali, l'infezione non cronicizza, tanto che adistanza di un anno o più dal trapianto, solo uno di sei pazienti risulta cronicamente infettatoda11'HCV (6). Una parziale spiegazione di questa peculiarità si può trovare nel fatto che solouno dei pazienti si è infettato con un HCV di genotipo Il mentre tutti gli altri si sono infettaticon un genotipo l o III (che possono essere genericamente considerati meno patogeni).probabilmente in conseguenza della differente provenienza geografica dei donatori (essendoquesti pazienti stati trapiantati in Belgio, in cui il genotipo II è meno frequente rispettoall'Italia). E' sicuramente curioso considerare il fatto che questi pazienti non diventanocronicamente infetti con I'HCV nonostante l'immunosoppressione a cui vengono sottopostinello stesso momento in cui vengono in contatto con l HCV. Non è ben chiaro il meccanismocon cui questi soggetti riescono a superare l'infezione da HCV; è possibile che questi soggettiproducano anticorpi che non sono attualmente identificabili per la limitatezza dei metodidisponibili. D'altro canto, la peculiarità del sistema immunitario di questi soggetti è benillustrata dall'unico caso che dopo essersi infettato non è riuscito ad eliminare l'infezione_Questo soggetto, dopo due anni ed oltre di infezione dimostrata solo dalla presenza di HCVRNA, nel momento in cui l'immunosoppressione è stata notevolmente diminuita, ha sviluppatouna reattività C33 isolata, che tale si mantiene a distanza di altri due anni di osservazione.Questo profilo immunologico ristretto è abbastanza tipico dei soggetti immunedepressi, che lomantengono immutato per anni dopo l'infezione primaria (9, 10).Per quanto riguarda l'effetto a lungo termine dell'infezione da HCV sulla situazioneclinica epatica, il dato più rilevante non sembra essere tanto la recidiva dell'infezione quanto ilgenotipo che la caratterizza. Quando questo è di tipo II infatti (senza nessuna differenza sedovuto ad una recidiva o ad una nuova infezione) la malattia epatica che si viene a creare èmolto spesso severa (Fig. l). Ad ~rnpio, di ventidue pazienti traPiantati che abbiamo seguitoper un tempo medio di 3 anni, 8 avevano un'infezione dopo il trapianto caratterizzata da ungenotipo II: tutti questi presentavano un'epatite cronica severa ed un di questi, dopo tre anni

127dal primo trapianto, aveva già sviluppato una cirrosi epatica. Al contrario, dei 5 pazienti chenel post-trapianto risultavano anti~HCV positivi ma con genotipo diverso dal Il, solo unoaveva un'epatite cronica severa mentre gli altri non presentavano alterazioni epatiche rilevanti(Fig. I) (6). Ancora migliore ·(e in accordo con quanto segnalato in letteratura) (Il) lasituazione epatica dei pazienti anti-HCV negativi prima del trapianto e che si sono solotransitoriamente infettati dopo il trapianto: in questo piccolo sottogruppo, la sporadicapresenza di alterazioni epatiche era dovuta esclusivamente a complicanze di tipo colangitico enon epatitico.Nel complesso, quindi, l'infezione da HCV, soprattutto quando è caratterizzata da ungenotipo II, condiziona pesantemente l'esito a lungo termine del trapianto epatico. Ovviamentequesti dati suggeriscono alcune considerazioni di carattere generale: a) poiché il trapiantoepatico non è purtroppo una possibilità terapeutica disponibile per tutti i pazienti che neavrebbero necessità, nella decisione di chi mettere in lista di trapianto preferenziale dovrebberoessere favoriti quei pazienti che hanno una malattia epatica non dowta aii'HCV, in quanto essihanno una possibilità di sopravvivenza a lungo termine sicuramente migliore dei pazienti anti­HCV positivi; b) la genotipizzazione deli'HCV dovrebbe far parte dello screening pre-trapiantoed i pazienti con genotipi diversi dal II dovrebbero essere considerati in prima istanza rispetto aquelli infettati con genotipo Il

~~ ~,128Figura l. Caratterizzazione dei genotipi deii'HCV (valutati secondo la metodica di Okamotoet al., 1992) prima e dopo il trapianto epatico in relazione con la diagnosiistologica a tre anni dal trapianto.Pre-Ull'Gemtipo l Il m IVN. 1.•NC2 3. 4. 5.,•6.•7.•8.•••9.••10.•11.••12.13. • ••~14. t• •c15.t•16. :z:17.1819.20.21.22.3 M'>i 'tf!l w1 m IV•NC·"'< •~·•.~-..·i•• !" •• •:z:Q----. .''·'·'·-·•-~___• •:J•8... ,..:.J·.,,:_.:.:J ~J. '-...:..:! :::: ~t! :-.1--.,..2Am

1294 Dussaix E, de Paillette L, Laurent-Puig P et al., (1993). Hepatitis C virus infection inpediatric liver transplantation. Transplantation 55: 795-798.'5 Villa E, Ferretti l, Fratti N et al., (1991). HCV RNA in serum of-asymptomatic blooddonors involved in post-transfusion hepatitis (PTH). J HepatoiU: 256-259.6 Villa E, Grottola A, Buttafoco P, et aJ. (In press). Long term follow-up of hepatitis Cvirus (HCV) infection in liver transplant patients. Clinica! Transplantation.7 Martell M, Esteban JL, Auer J. Genesca J, Weiner A, Esteban R et al., (1992). Hepatitis Cvirus (HCV) circulates as a population of different but closely related genomes:quasispecies nature ofHCV genome distribution. J Virol66: 3325-32298, Martell M, Esteban JL, Auer J, Vargas V, Esteban R, Guardia J, Gomez J, ( 1994)Dynamic behaviour of hepatitis C virus quasispecies in patients undergoing orthotopicliver transplantaton. J Virol68: 4325·3436.9. Vallari DS, Jett BW, Alter HJ, et aL, (1992). Serological markers of posttransfusionhepatitis C virai infection. J Clio Microbiol 30: 552-556_IO. McOrnish F, Chan S-W, Dow BC, et al., (1993). Detection ofthree types ofhepatitis Cvirus in blood donors: investigation of type specific ditferences in serologic reactivity andrate of alanine abnormalities. Transfusion 33. 7-13Il. Bourgeois N, Sznajer Y, Botembe N, et aL (1993) Hepatitis C infection after livertransplantation. J Hepatol1_!: Sl8

130INTERFERON IN CHRONIC HEPATITIS C: AN EVALUATION Of'EFFECTIVENESS AND UNRESPONSIVENESS,Antonio Craxi, Cristina Linea, Silvio MagrinIstituto di Medicina Generale e Pneumologia, University of Palermo, c/o Divisione di MedicinaInterna, Ospedale V_ Cervello, Via Trabucco 180,90100 Palermo, Italylntroductionlnterferons are a part of a complex network interacting with other regulatory factors,such as cytokines and cellular growth factors, which serve as a defence mechanism against viraiinfections The activity of a1pha-IFN against hepatitis C virus is due to a direct antiviral effect,namely the induction of an antiviral state in the infected celi by enhancement of 2-5oligoadenylate synthetase, protein Kinase P l, ribonuclease L activities. Immune recognitionand clearance ofvirus-infected cells is facilitated by IFN-induced enhancement of MHC class lantigens expression on the hepatocytes, in association with virai proteins. IFN can modifY thecellular membrane, thus making diffkult the release of virìons_ Moreover, theimmunomodulatory actlvity of IFN, causing activation of NK cells and macrophages and alsoincreased cytotoxic T celi function, is probably important in reducing the number of cellsharboring replicating virus_ These activities of IFN can be affected by many variables, relatedt o the infected host. t o the virus and to the drug itself (Fig l), mutuously influencingthemselves in a complex interplay.Since the early pilot studies of alpha-interferon therapy for chronic non-A, non-Bhepatitis, an enonnous amount of experience on the use of interferons has accumulatedthrough uncontrolled and controlled studies. lnitial enthusiasm toward antiviral treatment withIFN has however been progressively mitigated by the fact that not ali patients with chronichepatitis C respond to the drug, and that only a proportion ofresponders will mantain a longlastingbenefit, hence being truly cured of the disease Review by metaanalysis of therapeutictrials performed up t o 1991 ( 1) shows that 5O t o 600/o of ali patients with chronic hepatitis Creceiving IFN at a dosage == 3 MU t.i.w. for at least six months reach norma! alanine

131aminotransferase levels while on therapy. However half or more of these responders to IFNrclapse to high AL T levels within a few months after stopping the drug, thus reducing theJong~term response rate to 20~25%. Retreatment of relapsers may obtain a new response,usually followed again by relapse, in a substantial proportion of cases, while non-respondersJre refractory to retreatmentUnsatisfactory results of IFN, and therefore the need fora better selection of patients tobe treated and of alternative approaches for non-responders. might be mitigated by a betterunderstanding of the mechanisms underlying the unresponsiveness to IFN_ In this review. we..,hall reassess some of the available knowledge on the etfectiveness of IFN. in the light of theposstble mechanisms of non-response.llost-related factorsSlage of liver disease: The stage of liver disease is probably the most important tàctor mJetermining the response to IFN Two different points need t o be considered, 1 e. the degree oftntlammatory activity and the amount of fibrosis_Chronic HCV infection causes liver celi damage by both direct cytopathicity and1mmune-mediated mechanisms (2). The relation between histological activity of liver diseasemd likelihood of response is less clearcut than in chronic hepatitis B ( 3 ). Most studies in tàct'>uggest that the effectiveness of IFN is similar in patients with chronic persistent and in thosewith chronic active hepatitis.Fibrosis is a hallmark in the natura! history of chromc hepatitis, signalling the evolutionroward cirrhosis Once severe tihrosis and cirrhotic nodules appear in the liver, the likelihood1lf response to lFN is diminished. AJmost ali large studies of prognostic tàctors tn chronichepatitis C (4-9) are actually concordant in establishing ctrrhosis as the single item mostpredictive of non-response to IFN. The long-term response rate tn patients with cirrhosis canhe as low as 5% (4) Unresponsiveness could be due to the long time elapsed since tirst contact·.vith the virus, but a/so to intèction with a more pathogenic and IFN-resistent strain of HCV'Sdection of IFN-resistent virai mutants under the pressure of endogenous IFN is alsoconceivably involved (IO, li)_ Vascular factors intrinstc to c1rrhosis might also conceivably'-liter the biovatlability and pharmacokinetics of fFN A recent study (l 2) and preliminary data

132(Asciane, Hepatology, 20, 294A, 1994} indicate that high serum levels of hyaluronate and oflaminin, both indicators of active collagen metabolism, are predictive of unresponsiveness toIFN in chronic hepatitis C, independently from cirrhosis This suggests that increased collagendeposition on the sinusoidal pole of hepatocyte might affect IFN tumover in the liverTiming of infection: Chronic hepatitis C infection display a complex kinetics of events,unfolding over many years with alternate phases of virai replication or quiescence and ofimmune tolerance or clearance to an heterogeneous virai population (13). IFN is likely to bemore etfective when at the same time the immune mechanisms involved in virai clearance arealready activated and the replicative drive of the virus is failingHCV infection of children is rare, due to the ineffectiveness of mother-to-childtransmission (14). Experience with treatment of pediatric HCV infection is hence limited. Theonly published study (15) report an incidence ofnon-response similar to adults.The length of time elapsed since primary infection at the moment of starting IFN treatment isan important variable in determining response. The longer the virus has been in the host, thehigher is the JìkelihOod of selectìon of IFN-resistent virai strains. The probability ofdevelopment of cirrhosis, which is in itself a major determinant of non-response, is clearlytime-dependent. Long-term presence of virus-encoded proteins in the host might mantain andenhance tolerogenic mechanisms in the immune System ( 16, 17) The effect of duration ofinfection on non-response is quite clear for HCV. A recent study from our group (4) identifies.besides the absence of cirrhosis, a short (lower than 24 months) disease duration as stronglypredictive of primary and long-term response t o IFN. In this study known hepatitis C infectionsince over 60 months was associated to a low chance of normalizing aminotransferases.independently from cirrhosis at multivariate analysis. This suggests that resistence to IFN,when HCV infection has been present for a long time, is due both to virus-related factors( selection of strains less sensitìve to IFN) and to cirrhosis itselfRace: Trials of IFN for chronic HCV infection in Orientai (mostly Japanese) patients showrates of response comparable to those of Caucasians. Some inconsistencies in the responserates can be attributed to the different pattern of infecting HCV types ( 18). Some Japanese

133trials bave also used schedules of IFN administration which are not comparable for Iength anddosage to Western studies.Sex: No clear etfect of sex on the rate of response t o IFN in chronic hepatitis C is seen bymetaanalysis (l).A.ssociated diseases:I I:MMUNOSUPPRESSION· A sizable proportion of subjects with chronic hepatitis C arecoinfected by the human immunodeficiency virus (HIV). The drastica! reduction in CD4lymphocytes in the advanced phase of HIV infection causes profound hyporesponsiveness t oHCV-encoded proteins. The clinical expression, natura! course and response to antiviraltherapy are ditferent in the HIV infected subject who already has clinica! evidence ofimmunosuppression. Virai interference can be important, in these patients often harboringmultiple infections, in determining loss of HBV, HDV or HCV replication (19). Ultimately theprognosis and survival of the individuai patient are strictly related to HIV infection and t o thedegree ofimmunosuppression.HCV-related chronic liver disease, albeit also linked to immunopathogeneticmechanisms, is strictly dependent on direct virai cytotoxicity (2, 13). Chronic hepatitis C inHIV infected subjects behaves similarly than in normally immunocompetent individuals. Amore severe course of disease has been reported (20, 21 ), and might be due to the lack ofmechanisms of containment of HCV infection. It is difficult however to assess in these verysick patients the possible negative role of other cofactors. A summary of published results ofIFN therapy in these patients is presented in Table l The overall short-term response rate,measured on AL T normalization, is 29%_ This compares unfavourably with the 50% responserate (l) reported in non-HIV infected patients, but stili suggest some effect ofiFN. In fact, theonly study assessing long-term HCV-RNA loss reports disappearance of viraemia in 4/14 cases(29%), showing that HCV clearance can be obtained also in immunosuppressed hosts. Theseresults are comparable to those obtained in subjects undergoing pharmacologicalimmunosuppression after liver (22.23) or kidney transplantation (24-26).

!34li. IRON OVERLOAD. lt has been recently reported that, in patients with chronic viraihepatitis of any etiology, the hepatic iron content was almost twice in non-responders to IFNtherapy as compared to responders (27). The same study showed a weak correlation betweenserum ferritin and hepatic iron leve!. Since iron is a necessary cofactor for DNA and RNAsynthesis, an excessive hepatocyte iron pool might facilitate the intracellular assembly ofvirions. Phlebotomy has been proposed as a mean to enhance response to IFN by causingdepletion of liver iron. Clinica! experience is stili awaited. Results in subjects with massive ironoverload, such as polytransfused 13-thalassaemia patients with chronic hepatitis C, areconflicting. Ali published studies (28-30) find a negative correlation between iron overload andlikelihood of biochemical and histological response. However, in the absence of cirrhosis, theoverall rate oflong-term success is similar to that obtained in non-thalassaemic subjects. Thisshows that even in the presence of massive iron overload IFN can stili affect replication ofHCV.III. AUTOIMMUNE PHENOMENA: Evidence of autoimmunity may coexist with chronicvirai hepatitis, more often with HCV or HDV than with HBV (31-35). While earlier studiesdebated whether the presence of autoantibodies represented true autoimmunity or a secondaryresponse to infection, it is now clear that up t o 1 O% with otherwise typical chronic hepatitis Cmay bave serum autoantibodies at significant titres in serum, coexisting with active HCVreplication. These antibodies are mostly anti-liver/kidney microsomes (LKM), but sometimesanti-nuclear. IFN therapy in these subjects has usually been avoided, on the basis of possiblereactivation ofunderlying autoimmune hepatitis. A small-scale study (F. Bianchi, unpublished)actually reports ineffectiveness of IFN treatment in 6 patients with LKM-positive chronichepatitis C, with disease reactivation in 3 However in our experience (36) no significantditferences in the rate of response to IFN are observed when treating such patients. It isconceivable that, among a vast majority of cases with "true" hepatitis C and secondary immunephenomena, a few subjects with autoimmune hepatitis and associated HCV infection may hideIV. CHOLESTASIS: Mild features of biochemical cholestasis are not uncommon in chronichepatitis C. These consist mostly in a raised gammaglutamyltransferase and alkalyne

135phosphatase, without hyperbilirubinemia or symptoms. Bile duct damage and epithelioidgranulomas around biliary structures in the portai tract are often seen in liver biopsies frompatient with HCV-related liver disease (37). Cholestatic features and the presence ofbile ductdamage are variably related to HCV replicative levels (38-40). Elevated levels ofgammaglutamyltransferase are predictive of a poor response to lFN {8,41,42), albeit lessstrongly than cirrhosis or HCV-RNA level (4). Subjects with chronic hepatitis C andcholestasis might be infected by a more resistent HCV strain. No association with a speciticHCV genotype has been demonstrated. In these patients a moderate efficacy ofursodexoycholic acid (UDCA) in normalizing liver tests and improving liver biopsy tèatureshas already been demonstrated (43,44) No convincing effect on HCV viraemia was howeverfound. Randornized trials exploring combined therapy with UDCA and IFN are under way.Virus-related factorsVirai type: HCV is a highly heterogeneous virai agent, encompassing a range of different viraitypes and subtypes (18,45,46). Many classifications of HCV types based on sequencevariations of different HCV region have been proposed. Thus, studies dealing with therelationship between HCV type and response to IFN are not stnctly comparable, since ditferentregion of the HCV genome have been used for genotyping. Earlier studies mostly usedOkamoto's classification ( 47), while the most recent attempts of HCV classlfication ha ve beenperfOrmed on the 5' UTR region (48). The following comments relate to HCV dassitìcation0ased on S' UTR. Differences in the pathogemcity of the various types of HCV have beenreported. Some studies show a higher prevalence of cirrhosis among subjects mtected withtype lb (49-51), but other workers (52) do not confirm this issue. Geographical heterogeneity·.1f distribution of HCV infection ( 18, 53-55) might be partly respons1ble for discordance, sincethe prevalence ofgenotypes supposed to be less pathogenic (types la, 2 and 3) is low in some...:ountries (18, 53). The relationship between HCV type and response to IFN is also.:ontroversial. In tàct, there is clear evidence that subjects infected with genotype l b respondeless well to lFN treatment than those infected by genotype l a, 2a or 3 (56-60) This ditference1n response might be at least m part rel~ted to the leve! of pre-treatment viraemia and to the'itage of liver d1sease (leve! of histological fibrosis and/or definite c1rrhosis). Studies assessing

136clinica1 and virological variables of responsiveness to IFN have shown that pre-treatmentviraemia and cirrhosis are independent predictive factors of response to JFN_ However, thereare conflicting results for the inclusion of HCV type as an independent predictive factor. Infact, the link betewen HCV type and response to IFN is more evident in some geographica!areas where the infection is frequently due to HCV of non- I b genotype. In areas of high HCVtype 1 endemicity such as Southern Europe, the majority of responders to IFN are actuallyinfected by HCV type l (53,61), confinning that unresponsiveness of this virai type is arelative, rather than absolute, phenomenon In these patients, typing of the virus in regionsother than the currently used 5' non coding terminus might disclose other virai (sub)types Thebiologica! mechanisms linking a specific virai type to IFN responsiveness is currently unknownVira/ mutanls: Occurrence of virai mutation during chronic infection is a well-knownphenomenon for HCV (62-67). Mutations may exert a profound influence on virai replìcativeability, pathogenicity and sensitivity to endogenous and exogenous antiviral actionsThe infection may be due to a virai strain whose likelihood of responding to IFN 1salready low at the time of starting therapy. Variations of the HCV quasispecies under IFNtherapy are known to occurr_ This is especially frequent in the hypervariable E2/NS l region( 1 O, 11 ), and seems to correlate both to reactivation ofliver disease and to IFN resistance.Drug-related factorsDosage and schedule of IfN: Patients with chronic hepatitis C usua1Jy receive alpha-IFN atdose of3 MU t. i. w. for 6 months, according to the experience accumulated in the earlier trialsSince only o ne every four treated subjects obtain a sustained remission ( 1) an d a t least anotherone relapse after therapy, patients who respond and relapse may require retreatment. Efficacyof retreatment in obtaining long-term remission is actually unknown. Some investigatorssuggest that prolonged treatment ( up t o 12 months or more) might reduce the relapse rate insubjects obtaining complete ALT nonnalization (68). Our expe.rience in patients predominantlyinfected by genotype 1 b suggests that treatment with high doses of alpha-IFN over a briefperiod (t o tal dose of 420 MU in 6 months) is equivalent, in terms bot h of respOnse rate an d of

1)71lrevention of relapses, to a longer treatment period (total dose of 600 MU in 12 months)(69,70). Prolonged interferon adrninistration to patients with chronic hepatitis C is poorly.1ccepted and might favour drug resistance. A pulse~treatment schedule would be preterred for,·ornpliance and costs. Preliminary evidence (71) suggests a comparable sustained response'

' •( j!38Anti-interjeron antibodies (anti-IFN): The appearance of anti-IFN antibodies has beendocumented in treated patients with chronic hepatitis B and C (86-91 ). The prevalence of suchantibodies, classified as neutralizing or non-neutralizing according to their abilìty to block thebiologica! effects of IFNs, is highly variable in published studies, ranging from 1 to 20 % inrelation to schedule of IFN and also to the assay used for their detection. When enzymeimmunoassays (EIA) and the antiviral neutralization bioassay (ANB) are compared, anti-IFNantibodies occurr earlier by EIA t han by ANB. The higher sensitivity of the former test ishowever counterbaJanced by the lack of clinical significance of non-neutralizing antibodies.The latter are detected by EIA, but not by ANB, which discloses only blocking factors (i.e.neutralizing antibodies).The influence of IFN antibodies on the ther.apeutic effectiveness of IFN is stilicontroversia!, and at least partly related to the discordance between assay systems. High titersof anti-IFN antibodies seem to modulate the biologica! properties of IFN, reducing its antiviraleffect and immunomodulatory actions. Actual interference on the clinical course of infectionmay depend from the timing of onset of the antibody response. In chronic hepatitis Cappearance of anti-IFN antibodies after ALT normalization is not associateci to a significantloss of IFN effect. Anti-IFN antibodies bave also been included among the causes of AL Televation during IFN treatment (so-called breakthrough) when high titers are produced (90).Breakthrough hepatitic reactivations are found in less than 5% of subjects with chronichepatitis C treated with doses ofOIFN = 3 MU t.i.w_ Failure ofiFN therapy can be attributedto anti-IFN antibodies only if the biochemical reactivation is concomitant with the appearanceofantibodies (91).Anti-IFN antibodies may bave a role in the failure of response to IFN both in patientswho show an initial response and in those who never respond t o therapy. However only a smallminority of subjects who do no t respond ha ve an ti-IFN antibodies, confinning t ha t blocking ofIFN actions occurs only in selected cases. Antibodies to IFN are on the other band found alsoin patients with a complete and long-lasting response. Hence the appearance of anti-IFNshould not be considered as an indication to stop treatment, when otheJ;Wise effective.

139Figura I. F ACTORS lNFLUENCING THE EFFECTIVENESS OF INTERFERON INCHRONIC HEPA TITIS C------------------·fabella I.CHRONIC HEPATITJS C IN HIV-INFECTED INDIVIDUALS IFN TRIALS't riai pls C04 status40 ~ 200SA' SR' LA" LA'ALT RNA ALT RNA92 78 ~400193 11 any4 6 anys 7 dny6 14 2 4007 12 anyOVERALL 1613 355 3 4 4446 (29%)$ Shor1· Term respor1se• Long-TeiTTl response• alfa-IFN ~ 3 MU 1.1 w tor ~ 6 months1 Garc1a-Samamego. J Hepatol. 16.5122, 1993.2. Del Poggio, J Hepatol, 18:5112, 1993.3. Schwarz. Hapatotogy, t8:254A, 1993.4 Areias, Hepatotogy, t8·222A, 1993.S Sangarmano, Hepatology, 1 8:253A. 1993.6_ Mariotl, J Med Virol, 40:107, 1993.l Boyer, J lnl Ois, 165:723, 1992.

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149VALUTAZIONE DEL TRATTAMENTO A LUNGO TERMINE CON IFNGiuseppe Visco, Evangelo .Boumis, Fabrizio Ferri, Maria Antonella Longo, Pasquale Noto,Gianna Tossini, Mauro Zaccarelli.Centro di Epatologia Ospedale "L. Spallanzani", Via Portuense 292-00149 RomaCome è noto, i decreti di registrazione dei preparati a base di alfa-lFN, che risalgonoormai ad alcuni anni or sono, indicavano in 6 mesi la durata prevista per il trattamento perl'epatite cronica C (E.C.C.). Essi. inoltre, precisavano che, in caso di pazienti non responsivi,dovesse essere presa in esame l'interruzione della terapia dopo 16 settimane di trattamentoe che l'esperienza in materia di ripetizione del trattamento era limitata. Si noti che larisposta terapeutica viene ancora oggi espressa soltanto in termini di livelli di GPT_ [neffetti, la ricerca del genoma virale deli'HCV (con la PCR o con altri metodi, oltretuttopiuttosto costosi), nonostante l'aiuto fornito alla conoscenza di questa malattia, ha un valoresoltanto complementare, non essendo di pratica utilità nella clinica: non lo è prima diiniziare la terapia né per monitorizzare l'efficacia di questa né, infine, a fini prognostici (8).In questi ultimi anni si sono avute però varie segnalazioni indicative di una possibilemaggiore efficacia di cicli di cura prolungati e/o ripetitivi Ci sembra quindi utile tentare unamessa a punto sullo "stato dell'arte" dell'argomento, finalizzata all'ottimizzazione della duratadei trattamenti con lFN deii'E.C C Nel 1989 Davis (l) e Di Bisceglie (2), con i loro studicontrollati avevano dimostrato r,he ridirli ~lfa-IFN (a J MU x 317 gg) per 6 mesi consentonola normalizzazione (per oltre l anno la c.d . . ~uslained re:-.ponse [R.S.]) dei valori delle SGPTin un quarto circa dei casi trattati_Studi ulteriori hanno però segnalato che, prolungando i trattamenti fino a 12 mesi, lepercentuali di S. R. potevano salire dal 18,8 al27,7 (3) o dal29 a oltre il 50% (4)(5). Se peroil fo/Jow-up dei pazienti era mantenuto per 3 anni, le S R. si riducevano poi a1 36% (6).Si è quindi giunti alla conclusione che, quanto meno nei responders, il trattamento possa esseremantenuto per almeno 12-14 mesi (7)(8): soltanto, però, se a dosi piene, in quanto lasuccessiva riduzione della dose, dopo 1 primi 6 mesi, sembra tàvorire le recidive (9).

150Resta però ancora da chiarire:a) se. nei non-responders (N.R.), sia remunerativo protrarre il trattamento oltre le lbsettimane di cura; b) se vi sia evidenza di vantaggi reali nel ritrattare i pazienti, già re.sponders(R), che recidivano dopo la sospensione dell'IFN (8), c) come ci si debba comportare in queipazienti, inizialmente R, nei quali le GPT risalgono in corso di trattamento con IFN (c.dhreakthrough (Bt.))Esperienze personaliAHo scopo di fornire un contributo alla definizione di questi 3 punti, abbiamo esaminatoretrospettivamente le cartelle cliniche di n_1878 pazienti affetti da E.C.C. e sottoposti atrattamento con IFN presso il nostro Centro, dal 1.1 O. 1984 al 30.9.1994Criteri di selezione. Dal suddetto materiale sono stati scelti 1 pazienti che ottemperavano airequisiti riportati in tabella l. Nell'ambito di questi, abbiamo ulteriormente selezionato tuttiquelli ai quali era stato applicato il protocollo terapeutico attualmente vigente nel Centro,consistente nelle alternative di seguito riportate ed anche riassunte in tabella 2.1 Nei R.I. (re~ponders iniziali}, mantenimento della cura (stesso IFN, stesse dosi)11 fino all2° mese di trattamento_ Questo protocollo è stato applicato fino al 1.6.1988 e.successivamente1.2. mantenimento del trattamento con IFN per oltre il 12° mese, nelle seguenti circostanze emodalità·l 2. l In caso di R.S., stesso IFN e stessa dose fino all2° mese di normalità delle GPTl 2. 2. 1 ln caso di Bt., raddoppio della dose di lFN ----+l 2.2.2 ----+Se N.R. ·cambio del tipo di alfa-IFN, sempre a dose doppia. ----+1.2_2 3 ----+Se ancora N.R.· aumento della dose dell'IFN in uso. fino ad un massimo di 9-10.MU x 317 gg owero di 9-1 O MU/2 gg1.2.2.4. Se RS. ma effetti collaterali così gravi da suggerire la sospensione dell'alfa-IFN.passare al beta-IFN. 6 MU x3!7 gg2 e 3. Nei NRJ (non responder!ì iniziali) e nelle RE •. passaggio al protocollo 1.2.2

151I dati dei pazienti così selezionati sono stati analizzati e per Ciascuno è stata fatta unavalutazione finale, secondo i criteri riportati in tabella 3.RisultatiCome risulta dalla figura l, applicando i criteri sopra riferiti sono stati ammessi allostudio n. 218 pazienti trattati con IFN, di cui 29 per un massimo di 12 mesi (media 8.5), dettigruppo C (controlli) e n. 189 per oltre 12 mesi (media 32.8) (gruppo T o testandi).f ,a distribuzione delle diagnosi istologiche e del numero di IFN usati nei 218 pazienti sonoriportati nelle figure 2 e 3, mentre in tabella 4 vengono confrontate le caratteristicheJemografiche dei due gruppi (T e C), con la conferma della sostanziale omogeneità dei duegruppi.Nella figura 4 sono riportati i risultati terapeutici globali, mentre nelle Tabelle 5~ 8 i"iuddetti risultati sono stati messi a reciproco contfonto, con analisi uni- e multivariata.Discussionel problemi ancora da risolvere per poter ottimizzare la durata dei trattamenti conIFN sono, a nostro giudizio, i seguenti:l) Se sia corretto interrompere la cura di una E.C.C, dopo soli 4 mesi nei N. R., senza aversaggiato l'effetto di dosi più elevate dello stesso IFN, o di un altro tipo di IFNOrbene, i dati ricavati dal nostro studio controllato ma retrospettivo sembrano, in merito.'fornire indicazione sul fatto che il prolungamento della cura, m una con l'utilizzazioneconsecutiva di più tipi di IFN, può portare a un aumento significativo delle R. S.E' pur vero che nel medesimo studio i risultati erano apparentemente meno brillanti ne1pazienti trattati con più tipi di IFN, ma si tratta di un dato chiaramente deformato dal fatto..:he proprio nei pazienti più resistenti erano stati usati più tipi di IFN.2) Se esistano reali vantaggi, e quali, nel protrarre il trattamento con IFN da l a 2, 3 o p1ùanm.

!52Come abbiamo già detto, anche sotto questo aspetto sia i dati della letteratura (Il, 12) chele nostre esperienze ( 13) sembrano fornire indicazioni positive.3) Se esistano reali vantaggi, e quali, nel modificare, nell'uno o nell'altro senso, il dosaggiodeli'IFN in corso di trattamento, e cioèa) iniziando con dosi basse e raggiungendo gradualmente quelle di mantenimento_Da questo punto di vista il nostro studio non fornisce risposta ma, in un recenteconvegno ( 14 ), si è giunti alla conclusione che questa modalità di cura sia accettabilesoltanto nel trattamento dei pazienti che hanno anche una cirrosi epatica, che potrebbescompensars1b) iniziando con dose piena e riducendole in seguito. Non abbiamo espenenzapersonale in merito, dato che il nostro protocoilo non prevedeva questo indirizzo e laletteratura non sembra orientata in tal senso (9). Peraltro, sempre nella citataConferenza (14) sono state portate anche varie segnalazioni favorevolic) iniziando con dose piena ed aumentando in caso di non completo successo Quil'applicazione del nostro protocollo sembra essere stata vantaggiosa, in quanto (Tabb.7, 8) il rischio di ottenere una risposta negativa dalla cura è significativamente più bassonei pazienti trattati per oltre più di l anno e con dosi crescenti_4) Se ci sia un vantaggio nel riprendere il trattamento con IFN in quei pazienti, già R., ricadutidopo la prima sospensione. Anche in questo campo le nostre esperienze sembrano fornireuna indicazioni positive.5) Se esista uno spazio per il trattamento protratto con ~-IFN nei pazienti intoJlerantiEsistono già numerosi contributi favorevoli a tale indirizzo. Anche una parte dei nostripazienti è stata trattata con questo protocollo (Tab. 2) ma i dati finora in nostro possessonon consentono di giungere a conclusioni definitive

153TABELLA l. Criteri iniziali di ammissione allo studiol. Diagnosi clinica e biQPtica di eoatite cronica (attiva o persistente, con o senza cirrosi).2. Sierologia positiva per HCV Ab (ELISA e RIBA)3 Transaminasi GPT elevate (x almeno l ,5 i v.n.) per almeno 6 mesi, anche nonconsecutivi.4 Trattamento iniziale alfa-IFN (r2a, r2b, N· l, o N-3) 3 MU x 317 gg o 3 MU/2 gg x 16settimane. ( + deflazacort 6mg + ranetidina 150mg p.o, con le prime 6 dosi diIFN(!O))5. F ollow-yp oer almeno 2 anni, do o o la sospensione.TABELLA 2Protocollo terapeutico nell'E. C.C.(su pazienti già selezionati in base alla Tab. l)Gruppo RI. RS SE R.E TrattamentiTipo IFNDoseSosp.meseterapiaal 12' Sosp. al 12'di mese diR S.lu + + - o stessi inizialii 1.2.1. + + - o stessi inizialil 2.2.1. + - - o stesso doppia1222 + - - o altro doppia1.2.2.3. + - - o stesso tripla12.2.4. + + + o beta- 6MUx3/7gg2. - o - o l passa a l 2.23. + + o + l passa a 1.2.2+--------+++++++R.I.= GPT normalizzate entro r meseR.S.= GPT sempre normali sotto trattamentoS.E.= effetti collaterali graviR. E.= risalita GPT per oltre 3 mesi, dopo la sospensione

.,154TABELLA 3 -Criteri di valutazione dei risultatif-'-'-"Ri::'. s""oco,st,a"n"u"ll"'~'-"- (rNl_:L:='--"m"a'"n"ca,t.,a-'n"o"rm:c.ea1,iz,zeea"-zi,o:cn"e~G,.,P_T,________ Jf'2c_. 2Ri~·IS~SP ;c

155TABELLA 5 Analisi univariata per pazienti con risposta nulla verso risposta parzialeototaea l d a l meno un anno d a Il a sospens1one d e l tratt amento con IFN1 v ana . bT 11 Odds Ratìo* l1c 95% lP'' Di'!lf_no.-.,i istoloJ!ica'i Epatite cronica attivaIO: Epatite cronica evolutiva l 6 0.6-4.4 NS1 Cirrosi attiva 0.9 o 3-2 5 NSl li·. Ourata trattamentoi!2 mesi IO- 12 mesi 18 o 6-5 4 NS i' l FN u.

156TABELLA 7Analisi multivariata per pazienti con risposta nulla veno rispostapaniale o totale.Variabili l Odds Ratio• IC95% ]l'_Epatite cronica evolutiva 1.7 0.6-4.4 NSCirrosi attiva 0.8 0.2-2.3 NS~ 12 mesi 3.4 1.0-11.3 0.04Più tipi di IFN 1.8 1.2-2.7 0.004* Probabilità di presentare risposta nulla rispetto a parziale o completa_TABELLA 8Analisi multivariata per pazienti con risposta earziale o nulla versorisposta totale.Variabili l Odds Ratio• IIc 95% lPEpatite cronica evolutiva 0.9 0.1-0.9 NSCirrosi attiva 2.2 0.3-2.4 NS.s 12 mesi 4.5 1.2-16.9 0.02Più tipi di IFN 3 .l 1.8-5.1 < 0.001* Probabilità di presentare risposta parziale o nulla rispetto a completa_

157....IO'oFigura l. Distribuzione dei pazienti per durata di trattamento (218 pazienti)....l o' •oo.--- ·---------- -- --1--media 32.8 mesimedi1 8.5 mesi:...< 12 ll-11 IJ.U Js..JO >limal di trattamentoFigura l. Distribuzione delle diagnosi istologicbe all'inizio deUa terapia (218 pazienti)Cirrosi aWw 39EC evolutiva 19 17.9%13.3% ~...,_~--~-ECA ISO68.8%Figura 3. Distribuzione dei pazienti gruppo T per numero di tipi di IFN somministratidurante il trattamento (189 pazienti)l tipi diiFN26 •.. 1:_·~,.~--~.~4 dpl di IFN7.8-tol tipo diiFN:zt.7•t.l tipi diiFN44.4%

!58Figura 4. Distribuzione dei pazienti per risposta clinica ad almeno un anno dallasospensione del trattamento (218 pazienti)Risposti! totale 48Risposta nulla 3214. 7°/oRlsposla parzJalt 13863.3°/oBibliografia:1. Davis GL, Balart LA, SchiffRR, et al.. (1989). Treatment ofchronic hepatitis C with T·IFN alfa. A multicenter randomized, controlled trial. N Engl J Med 321 150!-1506.2. Di Bisceglie AM, Martin P, Kassianides C, et aL, (1989). r-IFN alfa therapy for chronichepatitis C. A randomized, double-blind, placebo-controlled trial. N Engl J Med 32l.1506-1510.3 Metreau JM, and the French Group for the Study ofNANB/C chronic hepatitìs treatment,(1993). Result of!ong term IFN treatment ofC/CAH Gut (Suppll) S!!2.4. Ideo G, (1994). alfa-IFN treatment of chronic hepatitis C: regimen optimization toimprove the response rate 2nd Intnl. Symp on Lymphoblastoid alfa-IFN., p. 10.5 Minola E, Finazzi MG, Fracassetti O, et al., (1994). Treatment of chronic active Chepatìtis with lymphoblastoid alfa-IFN 2nd IntnL Symp. on Lymphoblastoid alfa-JFN,p.42.6. Civeira MP, (1994). IFN treatment of chronic hepatitis C 2nd Intnl. Symp. onLymphoblastoìd alfa-IFN., p 15.7 Cuthbert JA, (1994) Hepatitis C: progress and problems. Clin Microbìol Rev 1: 505-532.8. Alberti A, Caporaso N, Colombo M, et aL, (1994). Trattamento con IFN dell' E.C.CConsensus Paper n. l, Roma 21.4.94, Accademia Nazionale di Medicina.

!599 V alla D, Babany G, Ouzan D, et al., (1994). Prevention ofrelapse in patients with chronicnon-A, non-8/C hepatitis who respond to alfa-IFN_ A controlled multicenter trial of Jowdosemaintenance therapy. J Hepatolll: 774-8.IO. Visco G, Boumis E, Noto' P, Visco Comandini U, (1991). Prevention of side-etfects of!FN., 337: 741.Il Toyoda H, Nakamo S, Takeda l et al., (1994). Retreatment ofchronic hepatitis C withIFN. AM J Gastroentero189: 1424-1426!2 Cimino L, Citarelle C, Nardone G, Budillon G, (1992). Lymphoblastoid IFN in chromchepatitis C patients non responderto recombinant IFN-a1fa _ HepatollQ. 41913 Visco G, Longa MA, Ferri F, Tossini G, (1994). HVC CAH patients secondary nonrespondersto interferon: clinica! response to re-treatment with natura! vs recombinantinterferon_ Proc. 2st Inter_ Symp_ on Lymphoblastoid alpha-IFN, Barcellona.14 Atti Consensus Conference su "Trattamenti Protratti con IFN nell' Epatite CronicaVirale'', (1994)_ Roma 14 dicembre (in corso di stampa).

160FATTORI PREDITfiVI DI RISPOSTA ALL'INTERFERONE NELL'EPATITECRONICA DA HCV.Alfredo Al berti, Liliana Chemello, Patrizia Pontisso.Clinica Medica II, Università di Padova, via Giustiniani, 2 - PadovaL'epatite cronica da virus C è malattia spesso asintomatica, ma che può avere decorsosubdolo ed evolvere in cirrosi in una percentuale significativa di pazienti. L'evoluzione è lenta,awiene in genere nell'arco di 15-20 anni, e non esistono elementi predittivi certi capaci diidentificare con soddisfacente specificità e sensibilità i pazienti destinati ad esito sfavorevole edistinguerli da quei casi nei quali l'infezione cronica non si complica con patologia epaticaclinicamente significativa. D'altra parte i pazienti asintomatici portatori dì infezione cronica daHCV rappresentano una riserva di infezione per la comunità e sono molto probabilmenteimportanti fonti di diffusione della malattia. Queste considerazioni sono la base razionale dellaintensa attività di ricerche sperimentali e cliniche condotte negli ultimi anni allo scopo didefinire interventi preventivi e terapeutici efficaci al controllo dell'epatite da HCV.Dal punto di vista terapeutico gli interferoni, ed in particolare l'interferone alfa, si sonodimostrati efficaci nel trattamento dell'epatite cronica da HCV. Sfortunatamente, solo la metàcirca dei pazienti risponde con completa scomparsa dell'attività di malattia, e una percentualeancora minore dimostra efficace soppressione dell'attività virate, ed in molti pazienti la malattiariprende vigore subito dopo la sospensione della terapia. Questi risultati, ancora deludenti intermini di reale efficacia clinica del trattamento interferonico, sono ottenuti con unacontroparte di costi senz'altro elevati e di effetti collaterali frequenti, spesso fastidiosi e talvoltaanche pericolosi per la salute del paziente.In questi ultimi anni quindi gli sforzi maggiori sono stati concentrati da un lato sullostudio dei fattori predittivi capaci di identificare i pazienti con epatite C suscettibili di curaradicale con interferone e dall'altro sulla ricerca di altri fartÌlaci eventualmente efficaci neipazienti non responsivi all'interferone.

161Numerose variabili sono state descritte associarsi ai diversi tipi di risposta all'interferone.L'approccio utilizzato nei vari studi è stato essenzialmente quello dell'analisi univariata eJomultivariata dei fattori pred~ttivi nell'ambito di numerosi parametri pretrattatamento valutati suampie casistiche, in genere in studi clinici condotti per valutare l'efficacia dell'interferone alfanel trattamento dell'epatite cronica da HCV. Il significato, ed anche alcuni limiti interpretativi,di questi approcci metodologici sono stati recentemente focalizzati da Davis (l).La maggior parte degli studi ha preso in considerazione innanzitutto le variabili associatea risposta primaria aWinterferone, owero al realizzarsi di una risposta in terapia, connormalizzazione completa delle transaminasi ed eventualmente scomparsa di HCV -RNA nelsiero, indipendentemente dal fatto che la risposta fosse poi mantenuta dopo sospensione dellaterapia. Altri studi hanno invece valutato i fattori predittivi di risposta più a lungo termine.analizzando quelli che si associano a risposta sostenuta, ovvero che si mantiene anche doposospensione della terapia presupponendo una possibile guarigione definitiva dall'epatite C coneradicazione della infezione, nonché quei fattori che si associano a risposta transitoria seguitada ricaduta di malattia dopo sospensione dell'interferone e a non risposta, ovvero ad unmancato effetto significativo della terapia sia durante che dopò il ciclo di trattamento. Sonostate identificate variabili di tipo clinico, così come fattori di tipo virologico, associati ai diversiprofili di risposta ed eventualmente utili nel fornire una previsione attendibile sull'esito deltrattamento. Altri studi, infine, sono stati dedicati all'analisi di modificazioni precoci in corso diterapia che possono essere utilizzati per predire eventi più tardivi, quali l'efficacia a lungotermine del trattamento.Le variabili pre-terapia identificate nei vari studi come associate a risposta completa sonoriassunte nella tabella l. Come si può evincere da questa tabella, si sono dimostrati associati arisposta all'interferone numerose variabili demografiche, cliniche e di laboratorio caratteristichedel paziente, così come alcune variabili più strettamente connesse con ragente infettivo.Ovviamente i dati hanno dimostrato una notevole variabilità, con differenze da studio a studioalquanto significative, conseguenza soprattutto dal fatto che spesso le casistiche analizzatedifferivano in modo sostanziale per tipologia di pazienti e stadio di malattia, così come per iltipo e dosi di IFN utilizzate.

162Anche noi abbiamo di recente studiato con analisi univariata e multivariata i principalifattori predittivi di risposta all'interferone nell'epatite cronica da HCV (12; 13).Sono stati analizzati i dati relativi a 481 pazienti consecutivi trattati m 3 studirandomizzati condotti fra il 1988 ed il 1993. I criteri di inclusione ed esclusione erano identiciper i tre studi e i trattamenti previsti variavano da un ciclo convenzionale di 6 mesi diintetferone alfa somministrato alla dose di 3 MU per 3 volte alla settimana a cicli più aggressivicon dosi iniziali di 6 MU e prolungamento del trattamento sino a 12 mesi La dose totale diinterferone somministrata variava quindi fra 240 e 620 MU. Tutti i pazienti sono stati osservatiper almeno 12 mesi dopo la sospensione della terapia rendendo così possibile unaclassificazione in 3 gruppi di risposta:l) Risposta sostenuta a lungo termine, con normalità-delle transaminasi mantenuta sino a 12mesi dalla sospensione della terapia.2) Risposta trasitoria, con normalizzazione delle transaminasi durante il trattamento eriattivazione di malattia dopo la sospensione dell'interferone3) Assenza di risposta significativa, ovvero assenza di normalizzazione delle transamìnasidurante la terapia.Le tabelle 2 e 3 descrivono le variabili che sono state ritrovate associate con la rispostatipo l e tipo 3 nell'analisi univariata. Questa analisi non prevedeva la valutazione dei livellibasali di viremia dal momento che questo parametro è stato valutato solo in un sottogruppo dipazienti, dati gli elevati costi della metodica. Anche nella nostra esperienza, come in numerosialtri contributi della letteratura, bassi livelli di HCV-RNA sono risultati associati a ripostasostenuta mentre i livelli più elevati si sono osservati nei pazienti senza risposta.Per meglio definire il valore predittivo dei diversi parametri esplorati, è stata quindieseguita un'analisi multivariata per ogni tipo di risposta alla terapia. In questa valutazione, lavariabile più significativa a livello statistico nel predirne la risposta tipo l è risultato il genotipovirale, con risposta sostenuta significativamente più elevata per i genotipi HCV-3 e HCV-2arispetto al genotipo HCV-lb. Altre variabili risultate associate alla risposta tipo l erano ladurata di malattia e l'età di paziente, così come l'uso degli schemi" .di trattamento più aggressivi.Per quanto concerne la risposta tipo 2, le variabili associate sono risultate le seguenti: durata dimalattia, infezione da HCV-lb, e sesso femminile, mentre la risposta tipo 3 risultava

163dipendente dai livelli basali di GGT, dal peso corporeo e dall'uso dei dosaggi mtnlffil diinterferone. E' da notare che in queste analisi i livelli basali di transaminasi e soprattutto ilquadro istologico pre-terapia non sono risultati parametri significativi per quanto concerne unaassociazione con la risposta all'interferone. I pazienti cirrotici dimostravano anche nel nostrostudio, come in molte aJtre analisi, una ridotta risposta alla terapia ma ciò è risultato evidentesolo neWanalisi univariata mentre neWanalisi multiva[iata la cirrosi usciva dal gruppo dellevariabili significative in quanto colineare ma meno potente del rilievo di GGT elevate.Sulla base dei risultati dell'analisi multivariata e del diverso "peso" statistico delle diversevariabili ritrovate significative, è stato possibile elaborare una semplice formula per calcolarel'indice predittivo di risposta alla terapia in pazienti con epatite cronica da HCV (Tab_ 4)_L'indice predittivo è stato quindi valutato in una casistica di 170 pazienti trattati conintertèrone per epatite cronica C ma non utilizzati per il calcolo dell'indice. E' stata cosìevidenziata una discreta linearità fra indice prognostico e probabilità di risposta alla terapia,che variava dallo 0-5% in pazienti con indice inferiore a 2 sino al 60-80% nei casi con indicesuperiore a 4 .5. La validazione prospettica dell'indice predittivo è attualmente oggetto di unostudio multicentrico.E' interessante notare come la maggioranza dei pazienti con c1rros1 da no1 osservatiottenevano un indice predittivo basso, motivato soprattutto dall'età spesso avanzata, dallaprevalenza di genotipo HCV-Ib e dai livelli elevati di GGT e si collocavano quindi nell'ambitorlei pazienti con minor probabilità di risposta alla terapia.A fianco dei parametri utilizzabili per una valutazione pre-terapia delle probabilità dirisposta all'interferone, dati di notevole interesse applicativo derivano anche da quegli studi chehanno valutato le modificazioni precoci delle transaminasi e della viremia in corso di terapiaallo scopo di utilizzarli come marcatori predittivi di risposta a lungo termine_ In quest'ambito.una precoce nonnalizzazione delle transaminasi (2), la scomparsa di HCV -RNA dal siero e dalfegato (14) sono risultati associati ad aumentata probabilità di sviluppare una risposta che simantiene anche dopo sospensione delrinterferone.Il dato più interessante dal punto di vista pratico è senz'altro quello relativo al rilievo,confermato da più studi, che la normalizzazione precoce delle transaminasi è correlata ad unapiù elevata probabilità di una risposta che si mantiene anche dopo sospensione del trattamento

164Questo parametro, nella nostra esperienza, dimostra senza dubbio elevata sensibilità, maspecificità appena soddisfacente, mentre meno solido appare il valore predittivo dellascomparsa di HCV-RNA dal siero in corso di terapia. Nei pazienti che dimostranonormalizzazione delle transaminasi in corso di terapia la persistenza di positività sierica perHCV-RNA è senz'altro predittiva di riattivazione della malattia dopo sospensiOnedell'interferone ma la scomparsa di HCV-RNA dimostra scarsa efficacia predittiva.I risultati sin qui ottenuti hanno quindi permesso di identificare numerosi parametri utiliper predire la risposta alla terapia interferonica in pazienti con epatite cronica da HCV.Ulteriori studi sono peraltro necessari per definire la loro validità nell'ambito prospettico e ilmodo più razionale di un loro impiego nell'approccio clinico al singolo paziente, tenendo contoanche degli aspetti etici e dei costi della terapia.Tabella l: Fattori pre~terapianell'epatite cronica da HCV.associati a risposta completa al trattamento interferonicoAnalisiUnivariataMultivariataAutoreDavis (2)Weiland (3)Causse (4)Serfaty (5)V an Thiel (6)Okada (7)Kobayashi (8)Davis (2)Perez (9)Serfaty (5)Tsurbata (l O)Hagiwara (Il)Fattori associati a rispostaDose di IFN, peso corporeo, istologiaPeso corporeo, durata malattia, istologiaSesso femminile, età, istologiaEtà, storia di tossicodipendenza, AST,bilirubina, carico di FeCarico di FeGenotipo HCVLivelli di viremiaPeso corporeo, istologiaIstologia, ferritinaGGT. sali biliari, RIBAGenotipo HCVLivelli di viremia

~··165Tabella 2:variabili associate a risposta sostenuta a lungo termine (analisi univariata)VariabilepDose IFN 0.002Età 0.002Durata di malattia 0.002GGT basali 0.0001Genotipo HCV-2 0.0001Genotipo HCV-3 0.0001ALT basalinsAST basalinsSessonsPeso corporeonsIstologia epaticansProfilo anti-HCV (RIBA)nsTabella 3:Variabili associate a non risposta all'interferone (anaJisi univariata).VariabilepDose IFN 0.05Età 0.002Peso corporeo 0.05Cirrosi 0.006GGTbasale 0.0001SessonsDurata di malattiansALT basalinsAST basalinsProfilo anti-HCV (RIBA)ns

166Tabella 4:Indice prognostico per predirre la probabilità di risposta sostenuta alla terapiainterferonica nell'epatite cronica da HCV.VariabileA) Età

1673 Weiland O, Schvarcs R, Wejstal R, Norkrans G, F.yden A, (1990). Therapy of chronicpost-transfusion non-A. non-8 hepatitis with interferon alfa-2b: Swedish experience. JHepatolll (Suppl 2): 57-62.4 Causse X, Godinot H, Otizan D, et al., (1991). Comparison of l or 3 MU ofinterferona1fa-2b and placebo in patients with chronic non-A, non-B hepatitis. Gastroenterology101: 497-502.5 Serfaty L, Girai P, Loria A, Andreani T, Ledendre C,· Poupon R, (1994). Factorspredictive of the response to interferon in patients with chronic hepatitis C. J Hepatol _li.12-7.6. Van Thiel DH, Gavaler JS, Wright Hl, Friendlander L, (1992). Responses to alfainterferon therapy are influence by the iron content of liver (abstract). GastroenterologyA904.7 Okada SI, Akahane Y, Suzuki H, Okamoto H, Mishiro S, (!992). The degree ofvariability in the amino terminai region of the E2/NS l protein of hepatìtis C viruscorrelates with responsiveness of interferon therapy in viremic patients. Hepatology 16:619-24.8. Kobayashi Y, Watanabe S, Konishi M, et aL, (1993). Quantitation and typing of serumhepatitis C virus RNA in patients with chronic hepatitis C treated with interferon-beta.Hepatology }1: 1319-25.9. Perez R. Pravia R. Linares A, et al., (1993). Response related factors in recombinant· ·interferon alfa-2b treatment ofchronic hepatitis C. Gut 34 (Suppl): 8139-40.IO. Tsubota A, Chayama K, Arase Y, et al., (1993). Factors useful in predicting the responseto interferon therapy in chronic hepatitis C. J Gastroenterol Hepatol ~: 535-9.Il. Hagiwara H, Hayashi N, Mita E, et al., (1993)_ Quantitative analysis ofhepatitis C virusRNA in serum during interferon alfa therapy. Gastroenterol. 104: 877-83.12. Chemello L, Alberti A, Rose K, Simmonds P, (1994). Hepatitis C serotype and responseto interferon therapy. N Eng1 J Med llQ: 143.13. Chemello L, Cavalletto L, Noventa, et al., ( 1995). Predictors of sustained response,relapse and no response in patients with chronic hepatitis c treated with alpha-interferon. JVirai Hepatitis (in corso di stampa).14. Camps J, Garcia-Granero M, Riezu-Boj JL, et al., (1994). Prediction of sustainedremission of chronic hepatitis C after a 12 month course of altà-interferon. J Hepatology:U: 4-11

168TERAPIA CON INTERFERONE NEI "CASI DIFFICILI"Evangelista Sagnelli, Francesca Maria Felaco, Lucia Aprea, Vincenzo Messina, FelicePiccinino.Istituto di Malattie Tropicali, II Università di NapoliNumerose e di diverso ordine sono le situazioni cliniche che rendono "difficile" la terapiadelle epatiti croniche con a lnterferone (a-IFN). Alcune situazioni sono relative allo stadiodella malattia, all'età del paziente ed alla concomitanza di malattie associate, che potrebberorappresentare controindicazioni all'uso del farmaco.Per quanto concerne le malattie associate va precisato che psicosi e malattie autoimmuni(epatiti, tiroiditi, etc.) rappresentano controindicazione assoluta alla terapia. Altre patologic,quale l'epilessia, turbe psichiche minori, modificazione della conduzione intracardiaca,l'ipertiroidismo ed il diabete mellito, non necessariamente escludono la terapia con a-IFN, incaso di documentata indicazione al trattamento, sempre si raggiunge un controllo stabile diqueste patologie con terapia appropriata.Sono infatti stati trattati nel nostro Istituto numerosi pazienti i quali presentavano talisituazioni e nella maggioranza dei casi è stato possibile ultimare il trattamento con variazioni didosaggio di a-IFN, resesi di volta in volta necessarie, controllando contemporaneamente ilcompenso farmacologico della malattia associata. Per i pazienti con epilessia è indispensabilesia il monitoraggio dei livelli ematici dei farmaci specifici per essere certi dell'efficaciaterapeutica nella prevenzione dei sintomi, sia il controllo elettreoencefalografico.La terapia con a-IFN è stata inoltre possibile in pazienti con ipertiroidismo, monitorandoattentamente la funzione tiroidea ed adeguando la terapia specifica, e nei diabetici nei quali nonsi è mai osservato una diretta interferenza dell'a-IFN sui livelli di glicemia.Abbiamo inoltre osservato· sviluppo di ipotiroidismo co~ segni clinici di malattia, in corsodi terapia con a-IFN in una paziente. Tale terapia è stata prontamente sospesa e la funzionetiroidea corretta con terapia sostitutiva; per la notevole severità dell'attività istologica della

169malattia epatica, prevto parere favorevole dell'endocrinologo, la terapia con a.-lFN è stataripresa, ottenendo remissione completa della transaminasi. Nonostante il successo della terapiacon a.-IFN, riteniamo ancora, che l'ipertiroidismo preesistente o comparso in corso di terapiacon a.-IFN sia comunque una controindicazione a tale terapia, fino a quando non si avrannoevidenze positive più numerose.L'età dei pazienti non è considerata in assoluto come una variabile in grado dideterminare l'ammissione al trattamento con a.-IFN, anche se la maggior parte degli studicontrollati non include pazienti al di sopra dei 65 anni o al di sotto dei 6 anni.Nei bambini il farmaco è ben tollerato, anche se in alcuni casi può persistere febbre perlunghi periodi e più frequentemente negli adulti può insorgere neutropenia, limitazioni per ilproseguimento della terapia.Non abbiamo trattato numerosi pazienti con più di 65 anm, m presenza di attivitàistologica ed in buone condizioni generali, ed il farmaco è stato in genere ben tollerato.La presenza di cirrosi è un altro fattore che può far considerare un paziente come un"caso difficile". E' noto infatti che la presenza di cirrosi rende irrealizzabile lo scopo principaledella terapia con a.-IFN e cioè la prevenzione di questo esito è che, quindi, in questi casi laterapia si propone solo di ridurre o abolire l'eventuale attività istologica, anche se non è statoancora chiarito se ciò sia di reale giovamento. E' riportato in letteratura che la percentuale dirisposta alla terapia nei pazienti con cirrosi è inferiore rispetto a quella osservata in quelli senzacirrosi e che si assiste nei pazienti definiti responders a frequente riattivazione doposospensione del trattamento. Inoltre i pazienti con cirrosi spesso presentano marcataleucopiastrinopenia, preesistente o in corso di terapia e ciò obbliga spesso ad utilizzare dosaggipiù bassi di quelli in genere praticati e quindi meno attivi. La nostra casistica comprende 135pazienti con cirrosi anti-HCV positivi in stadio A di Child. Di questi 48 sono stati trattati cona.-IFN alla dose di 3 MU tre volte a settimana e 69 alla dose di 1,5 MU tre volte a settimana.Nel gruppo dei 48 con dose di 3 MU la diagnosi era istologica in 42, mentre per 39 dei69 trattati con dose di 1,5 MU la diagnosi di cirrosi era possibile senza biopsia, più spesso perpiastrinopenia che a volte controindicava la biopsia stessa. Conseguentemente il gruppo dipazienti trattati con dose di l, 5 MU includeva un cospicuo numero di pazienti con malattia unpd più avanzata. Tutti i pazienti con cirrosi inclusi nel nostro studio presentavano elevati valori

170di transaminasi (3-15 volte i valori normali, mediana 6) condizioni da noi stabilite, perl'ammissione al trattamento. Completa remissione delle transaminasi in corso di terapia è stataosservata in 17 (35,4%) dei 48 pazienti trattati con dose di 1,5 MU. La terapia con dose di 3MU era ugualmente efficace nei pazienti con età < SO anni ed in quelli di età > SO anni, mentretra i pazienti trattati con dose di l ,5 MU la completa remissione delle transaminasi si èosservata in l (6%) di 15 pazienti con età< 50 anni ed in 16 (29,6%) di 54 pazienti con età>50 anni, una osservazione questa indicante che la dose ridotta può avere qualche efficacia neisoggetti più anziani e forse osservati in una fase in cui l'attività della malattia tendeva aUaremissione. Tra i pazienti con trattamento di 3 MU tre volte la settimana, quelli contransaminasi iniziali> 5 volte i valori massimi normali (9/21 ""42,8%) più frequentemente diquelli con valore più bassi (8/27 = 29,6%) hanno mostrato una completa remissione delletransaminasi. Non si è invece osservata correlazione tra tipo di risposta alla terapia con a-IFNe valori pre-trattamento delle transaminasi nei pazienti trattati con dose di l, 5 MU.l dati di questo studio indicano la scarsa efficacia della somministrazione della dose dil, 5 MU tre volte la settimana in pazienti con cirrosi . Va considerato tra le condizioni difficilinella terapia con IFN la leucopiastrinopenia. Con neutrofili inferiori a 1000/mm3 e piastrineinferiori a -SO.OOO/mm3 la terapia è controindicata e, se tali valori si osservano comeconseguenza della terapia, essa va sospesa. La leucopiastrinopenia è una costante nei pazienticon cirrosi, tuttavia nella nostra casistica l'interferone solo raramente ha indotto una riduzionetanto marcata da obbligarci a dimezzare la dose o a sospendere temporaneamente il farmacoOltre alle difficoltà sopra rappresentate, bisogna considerare che è spesso problematicosospendere la terapia con a.-IFN in pazienti con cirrosi e buona risposta al trattamento poichéla riattivazione è molto frequente e si è tentati a riprendere il trattamento ed a proseguirlo perlunghi periodi. Sono quindi necessari studi controllati che includano anche pazienti non trattati,per comprendere se la dose interferone 3 MU somministrata tre volte a settimana sia di utilitàper alcuni pazienti con cirrosi o se alla completa remissione delle transaminasi possa noncorrispondere un reale vantaggio in termini di soprawivenza.

171Bibliografia:l. Jacyna NR, (1992). a.-interferon therapy in chronic hepatitis C infection: what bave we\eamt so far? Eur. Gaestroenterol,4: 703-706.2. Tinè F, Magrin S, Craxì A, Pagliaro L, ( 1991 ). Interferon in NonA, NonB hepatitis. A metaanalysis of randomized clinica! trials. J Hepatol 11: 192-199.3 Marcellin P., Ponteau M., Colas Linhart N., Bok B. (1993). Thyroid function and interferontreatment in chronic hepatitis C. Gut 34. 574.4. Fabris P., Beterle C., Floreani A (1992). Development oftype l diabetes mellitus duringinterferon alpha therapy for chronic hepatitis. Lancet 340: 548.5. Shindo M, Di Bisceglie AM, Hoofnagle JH, (1992). Acute exacerbation of liver diseaseduring intetferon al p ha therapy for chronic hepatitis- Gastroenterology l 02: 1406-1408.6_ Lenzi M, Bellardini G, Fusconi M, Cassani F, Selleri L, Volta U, Zauli D, Bianchi FB,(1990). Type 2 autoimmune hepatitis and hepatìtis C virus infection. Lancet 335:258-259.

172NUOVE PROSPETIIVE DI TERAPIAAntonio Ascione, Giovan Giuseppe Di CostanzoFisiopatologia Epatica- Ospedale Cardarelli - NapoliLa terapia delle malattie epatiche croniche correlate al virus dell'epatite C (HCV) non è atutt'oggi soddisfacente. Infatti l'interferone (IFN}, unico farmaco correntemente usato nellaterapia di tali patologie, garantisce una risposta stabile in media nel 20-25% dei casi (l). Per ilsempre più diffuso uso delt'IFN, si è registrato un incremento del numero dei pazienti non allaterapia e della spesa sanitaria, e tale problema rappresenta oggi un notevole peso umano esociale. Tra i motivi dell'insuccesso della terapia un ruolo fondamentale ha la incompletadefinizione delle cause e dei meccanismi di resistenza all'IFN. I fattori considerati sonomolteplici e possono essere classificati in:a) fattori correlati all'ospite (ad es: età e sesso del paziente, età della malattia, presenza dicirrosi, anticorpi anti-IFN),b) fattori correlati al virus (ad es: genotipo, carica virale),c) fattori correlati al farmaco (ad es: schedula terapeutica, tipo di IFN)_Noi riteniamo che in molti casi l'insuccesso terapeutico sia determinato dallacontemporanea presenza nello stesso paziente di più fattori Tale teoria fornisce un'interessantechiave di lettura dei risultati emersi dagli studi pubblicati sull'argomento, potendone anchegiustificare le numerose divergenzeIl trattamento dei pazienti affetti da malattia epatica cronica da HCV e con recidiva allasospensione o non responder alla terapia con lFN rappresenta una delle principali sfide dellamoderna epatologia. Le possibili strategie terapeutiche finora esaminate possono essereclassificate in quattro gruppi.l) differente schedula terapeutica con lo stesso tipo di IFN,2) uso di un differente tipo di IFN;3) terapia combinata con IFN più altri farmaci;4) uso di antivirali da soli.;

173La prima scelta terapeutica è di solito impiegata in pazienti con recidiva più che in casodi veri e propri non responders.L'uso di un differente ti~o di IFN è l'alternativa finora più frequentemente impiegata.migliori risultati sono stati Segna1ati con l'uso deii'IFN alfa linfoblastoide in pazientiprecedentemente trattati con altri tipi di IFN. Questo farmaco si è dimostrato in grado dinormalizzare i valori delle aminotransferasi in circa il l 0-20% dei casi, purtroppo è alto ilnumero delle recidive alla sospensione del trattamento (2). l risultati preliminari di un nostrostudio ancora in corso sono incoraggianti: circa il 50% dei pazienti ha normalizzato leaminotransferasi durante la terapia. Tuttavia è indispensabile una prolungata osservazioneprima di poter trarre conclusioni definitive.Per quanto concerne la terapia combinata, è possibile selezionare tre tipi di farmaci daassociare all'IFN:a) farmaci che aumentano gli effetti dell1FN;b) fannaci con meccanismo d'azione differente dali'IFN;c) antivirali.Un interessante studio in vitro ha dimostrato che il blocco della ciclo- e della lipoossigenasiamplifica il segnale di trasduzione deii'IFN alfa (3). Pertanto la contemporaneasomministrazione di farmaci antiinfiammatori non steroidei dovrebbe teoricamente accentuaregli effetti dell'IFN. In uno studio pilota abbiamo valutato l'uso del sulindac in combinazione conI'IFN in non responder con malattia epatica cronica da HCV. Abbiamo pretèrito il sulindacperché è un profarmaco che viene attivato nel fegato ed ha un recircolo entero-epatico, haun'alta biodisponibilità, una lunga emivita ed infine inibisce non solo 1a cicloossigenasi ma inparte anche la lipoossigenasi. Senza interrompere la terapia con IFN abbiamo somministrato ilsulindac alla dose di 200mg l O e 4 ore prima dell'iniezione dell'IFN per un periodo di 3 mesi. Intutti i pazienti abbiamo registrato un incremento della 2'-5' oligoadenilato-sintetasi, indice diamplificazione del segnale di trasduzione deii'IFN, senza tuttavia ottenere la nonnalizzazionedei valori delle aminotransferasi (4). Una possibile causa di resistenza all'IFN è il verificarsi diuno stato proossidativo nelle cellule intèttate dall'HCV, che potrebbe facilitare laperossidazione dei li p idi di membrana e danneggiare il genoma cellulare. T aie alterazionesarebbe determinata da una riduzione dei livelli intracellulari di glutatione ridotto ed un

174aumento delrespressione della superossido dismutasi. La normalizzazione dei valori diglutatione ridotto potrebbe favorire l'effetto deli'IFN. In uno studio pilota l'aggiunta a talecitochina di N-acetii cisteina, un precursore del glutatione ridotto, alla dose di 1800 mg/diedeterminò un aumento dei livelli di glutatione ridotto, una significativa inibizione della replicavirate intralinfocitaria e la normalizzazione dei livelli di aminotransferasi nel 41% dei pazienti(5 ).Anche per quel che riguarda i farmaci con meccanismo d'azione differente dall'IFN dacombinare ad esso le esperienze sono ancora preliminari Un fattore che, secondo noi, ha unruolo importante quale causa di resistenza alla terapia con IFN è rappresentato dalla fibrosi edalla destrutturazione epatica. Nella nostra esperienza livelli sierici del frammento Pl dellalaminina (correlati con l'alterazione della struttura epatica e con un attivo turnover dellemembrane basali) maggiori o uguali a 2 U/ml sono predittivi di una maggiore resistenza aliaterapia con IFN (6). L'alterazione della matrice extracellulare può teoricamente ostacolare ladiffusione intraepatica del farmaco determinandone una riduzione dell'efficacia ed essere causadella maggiore resistenza alla terapia che si osserva in caso di cirrosi epatica. Pertanto stiamoattualmente sperimentando l'uso combinato deii'IFN e della colchicina onde sfruttare l'effettoantiinfiammatorio ed antifibrotico di tale farmaco. In quest'ottica, l'introduzione in futuronell'impiego clinico di nuovi farmaci antifibrotici dotati di maggiore potenza e selettivitàd'azione fornirà una nuova possibilità per verificare quest'approccio terapeutico alternativo. Lapresenza atristologia di danno dei dotti biliari è stato da alcuni correlato ad una maggioreprobabilità di non risposta alla terapia con IFN. L'impiego della combinazione acidoursodesossicolico ed IFN sembra ridurre il numero di pazienti con recidiva alla sospensione deltrattamento, ma tale dato è da considerarsi ancora preliminare (7).Tra i farmaci antivirali la ribavirina è il farmaco più sperimentato da solo o incombinazione nella terapia delle malattie epatiche croniche da HCV. E' un analogonucleotidico dotato di ampio spettro d'azione contro virus sia a RNA che a DNA (8) conmeccanismo non ancora completamente definito (9). In pazienti con epatite cronica da HCV siè dimostrata in grado di ridurre significativamente i livelli di aininotransferasi e dell'RNA delvirus C nel siero dopo 3-6 mesi di trattamento (10-11). Tuttavia un problema è la ripresa quasicostante deWattività citolitica e della replica virale alla sospensione del farmaco. I datii

175preliminari di uno studio multicentrico europeo (Benelux) mostrano una buona efficacia dellaterapia combinata con IFN e ribavirina in pazienti con epatite cronica da HCV non responder aterapia con IFN. Viceversa la terapia con ribavirina da sola è risultata inefficace ( 12). L'usocombinato della ribavirina e de!l'IFN alfa sembra avere un effetto sinergistico aumentando nonsolo il numero delle risposte in corso di terapia ma soprattutto riducendo la frequenza direcidive alla sospensione. Un effetto sinergistico dei due farmaci era stato precedentementesegnalato in vitro ( 13). Ulteriori studi controllati con differenti schedule terapeutiche (inparticolare l'uso combinato con alfa IFN per un periodo più prolungato) sono indispensabili perdefinire la reale utilità della ribavirina in questa patologia. Le prospettive future per una terapiapiù efficace dell'infezione da HCV sono probabilmente rappresentate dalla scoperta di nuovifarmaci antivirali diretti, dotati di una maggiore capacità di inibizione della replica di questovirus, e dal perfezionamento della terapia genetica che, attraverso l'uso di oligonucleotidiantisenso e di ribozimi antivirali, può diventare un presidio molto importante nella terapia dellepatologie epatiche da HCV.In conclusione, la terapia dei pazienti con malattia epatica cronica da HCV si basa tuttorain prima istanza sull'uso dell'IFN alfa. In pazienti non responder può essere utile una terapiacon IFN linfoblastoide . nel caso di trattamento precedente con altro tipo di IFN, o c_on IFNcombinato con ribavirina. La migliore comprensione dei fattori di resistenza aii'IFN consentiràprobabilmente in futuro di scegliere la terapia più efficace da adottare nel singolo paziente. Trai tàrmaci da combinare all'IFN per aumentarne la resa terapeutica, oltre gli antivirali diretti, ipiù promettenti sono a nostro avviso gli antifibrotici e gli antiossidanti. Il futuro della terapiadell'infezione da HCV è probabilmente rappresentato dalla scoperta di nuovi e più potentitàrmaci antivirali e dal perfezionamento della terapia genetica.Bibliografial. Tinè F. Magrin S, Craxì A, Pagliara L, (1991). Interferon for non-A, non-B chronichepatitis. A metanalysis of randomized clinica! trials. J Hepatol U: 192-199.

1762. Budillon G, Cimino L, D'Ascoli B, Napolitano PV, (1993). Lymphob1astoid interferon inchronic hepatitis C patients who were "non responders" to recombinant interferon a1pha(riFN alpha). Arch Virol (Suppl) ~: 249-2553. Hannigan GE, Williams BRG, (1991). Signa) transduction by interferon-alpha througharachidonic metabolism. Science 251: 204-2074. Di Costanzo GG, Ascione A, Galeota Lanza A, et al (1994). Adjuvant therapy forinterferon-resistant patients: do cyclooxigenase inhibitors ha ve any role? A pii o t study. JHepatol in press.5. Beloqui O, Prieto J, Suarez M, et al, {1993). N-acetyl cysteine enhances the response tointerferon-alfa in chronic hepatitis C: a pilot study. J lnterfRes Jl: 279-282.6. Di Costanzo GG, Ascione A, Galeota Lanza A, et al, ( 1994). Resistance to alfa interferontherapy in HCV chronic liver disease: role ofhepatic fibrosis. Hepatology 20: 294A.7. Angelico IM, Gandin C, Pescarmona E, et al, (1993). lnterferon alfa with or withoutursodeoxycolic acid (UDCA) in the treatment of chronic hepatitis C. Fina! report of arandomized controlled clinical trial. Gastroenterology 104: 871A8 Sidwell R, Hoffinan J, Kharp L, et al, (1972). Broad-spectrum activity ofvirazole: 1-beta­D-ribofuranosyl-1 ,2,4-triazo1e-3-carboxamide. Science 117: 705-706.9 Patterson JL, Femandez-larsson R, ( 1990). Molecular mechanisms of action of ribavirin.Rev Infect Dis 12: 1139-1146.10 Reichard O, Andersson J, Schwarcz R, Weiland O, (1991). Ribavirin treatment for chronichepatitis C. Lancet 337: 1058-1061Il Di Bisceglie AM, Shindo M, Fong T-L, et al, (1992) A pi1ot study ofribavirin therapy forchronic hepatitis C. Hepatology 16: 649-65412 Brouwer JT, Nevens F, Michielsen P, et al, (1994). What options are left when hepatitis Cnot respond to interferon? Placebo-controtled Benelux multicentre retreatment trial onribavirin monotherapy versus combination with interferon. J Hepatol 21(Suppl 1 ): S 17.13 Weiss RC, Oostrom-Ram T, (1989). Inhibitory effects ofribavirin alone or combined withhuman alpha interferon on feline infectious peritonitis ··virus replication in vitro VetMicrobio12Q: 255-265

177INFEZIONE DA HCV: IMPLICAZIONI NELLA PRATICA TRASFUSIONALEGiuseppe de StasioServizio di Immunoematologia e Trasfusione, Ospedale "Di Venere", BariI risultati della sorveglianza dell'epatite acuta in Italia dimostrano che l'incidenzadei casi di epatite NANB notificati è di 2-3 per 100.000 per anno, e che il 18 o/o dei casipresenta una storia di trasfusioni di sangue (Mele 1990). Dal 1987 si è osservato in Italiaun leggero declino nell'incidenza dell'epatite NANB associata a trasfusione, declino che èdiventato più consistente nel 1990 e nel 1991, dopo l'introduzione dello screening anti­HCV nelle strutture trasfusionali del Paese. Nel 1990 si è avuto un calo del 31 o/o rispettoall989, e nell991 del67% rispetto ali990 (Mele 1993).Per attribuire, però, con certezza un caso di epatite ad una pregressa trasfusionebisogna studiare la coppia donatore/ricevente per escludere ''un'epatite daospedalizzazione". Pazienti chirurgici che non avevano ricevuto trasfusioni di sangueallogenico presentavano epatite nel2-3,3% dei casi (Stevens 1984, Aoki 1993).La trasfusione di sangue anti-HCV positivo determina l'insorgenza dell'infezione daHCV nella maggior parte dei riceventi (fino all'88%) (Esteban 1990, 1991, Van der Poel1989,1991, Alter 1989, Barrera 1991). Le unità anti-HCV positive al test EIA di Igenerazione e confermate con il RIBA 2 hanno fatto registrare un 93 % disieroconversioni, mentre quelle EIA reattive ma RIBA 2 negative solo l'Il % ( Aoki1993).Non tutti i soggetti anti-HCV positivi sono necessariamente infettanti (Alter 1989),inoltre, l'epatite post-trasfusionale C può manifestarsi anche con la trasfusione di sangueanti-HCV negativo (Esteban 1990). Quest'ultima evenienza potrebbe suggerire l'esistenzadi un altro agente eziologico (non-A, non-B, non-C) (Mosley 1990), ma spesso neiriceventi di sangue anti-HCV negativo si registra una sieroconversione anti-HCV

'178(Barrera 1991 ). Il che testimonia che i test diagnostici attualmente in uso non hannoancora una sensibilità soddisfacente per lo screening dei donatoriCirca il 10 % dei pazienti infettati con HCV e con normale stato immunologico simostra persistentemente negativo all'anti-HCV, anche dopo follow-up prolungati (Alter1993 ). Soggetti con disordini da immunodeficit possono non sieroconvertire affatto oavere finestre di sieroconversione molto più lunghe di quelle che si osservano neisoggetti con normale funzione immunologicaUna certa quota di donatori positivi al test ELISA anti-HCV non è implicata in casidi epatite nel ricevente. Per discriminare i positivi infettanti da quelli non infettanti, erastato suggerito di tener conto del rapporto di densità ottica del campione rispetto alvalore di cut-offELISA (V an del Poel 1990b) Un rapporto ELISA inferiore a 2,5 non siaccompagnava a nessun caso di epatite nel ricevente (V an der Poel 1990b ). In altri studi,però, si sono avuti casi di epatite anche con rapporti di 1,5 (Barrera 1991)_Il test di conferma RlBA aumenta la specificità dello screening. con una minimaperdita in sensibilità (Van der Poel 1990b, Ebeling 1990b). 31137 riceventi di sangueRlBA positivo manifestavano epatite, contro 3/21 che avevano ricevuto sangue anti­HCV positivo, RlBA negativo o indeterminato {Barrera 1991 ).L'alta specificità della conferma con il RlBA ha fatto affermare a Van der Poel(1991) che i donatori ELISA-positivi non specifici. cioè negativi alla conferma al RIBAdi Il generazione, possono essere riammessi alle donazioni_La Associazione Americana delle Banche del Sangue ( AABB) e la Food and Dru~Admini.o;tration (FDA) hanno proposto un algoritmo per la riammissione alla donazionedei donatori con un test ELISA anti-HCV positivo (AABB Algorithm 1993, Holland1993, FDA 1993) (Tab 2)Secondo questo schema, il donatore ripetutamente reattivo al test di screening conl'ELISA, deve essere rinviato definitivamente. L'unità raccolta va eliminata. Adiscrezione della struttura trasfusionale, il donatore implicato-. può essere ulteriormentevalutato per un possibile rientro tra i donatori attivi_ Dopo sei mesi dalla primadonazione, si ripete il test ELISA anti-HCV_ Se ripetutamente reattivo, il donatore è

179escluso dalle donazioni in via definitiva. Se non è reattivo, SI esegue un testsupplementare. Con un risultato indeterminato o positivo del test supplementare, si rinviail donatore definitivamente: In presenza di un test supplementare negativo, il donatorepuò essere riammesso alle donazioni.Le raccomandazioni della FDA hanno ribadito la necessità di escludere dalledonazioni i soggetti che nell'anno precedente la donazione abbiano avuto contatti stretticon pazienti affetti da epatite virale o che abbiano ricevuto trasfusioni.E' possibile che la conservazione a freddo nduca l'infettività dell'HCV. E' statosegnalato da V an der Poel (1991 ), infatti, che un concentrato eritrocitario conservato per28 giorni non causava infezione da HCV nel ricevente. Anche le emazie congelatesembrano ridurre il rischio di trasmissione dell'HCV (Norol 1993).Secondo ( 1992), il rischio residuo di trasmissione dell'H CV per unità di sanguetrasfuso (negativo ai test di II generazione) oscillerebbe tra 1/2000 (0,05 %) a 1!6000(0,017 %).Uno studio prospettico di Seef (1992) sulle conseguenze a distanza dell'infezioneda HCV non risolta ci offre qualche rassicurazione. Durante un jol/ow-11p medio di 18anni, la mortalità in toto, dovuta ad ogni causa, dei riceventi di trasfusioni che avevanocontratto un'epatite acuta non-A, non-B era simile a quella di un gruppo di controllo disoggetti trasfusi che non avevano contratto infezione. La mortalità, però, per malattiaepatica era più alta rispetto al gruppo di controllo. Questo studio confenna quanto giànoto, che l'intèzione da HCV cronica non presenta a breve termine una prognosi grave,anche se la storia naturale dell'infezione da HCV non e ancora completamente chiarita.I test ELISA anti-HCV in commercio di III generazione presentano una magg10resensibilità e specificità rispetto a quelli di Il generazione, soprattutto per la migliorereattività NS3 e non per l'aggiunta della NSS (Vernelen 1994). Per la sensibilità del test.la scelta e la presentazione degli epitopi codificati da NS3 sembrano più importanti dellapresenza dei peptidi NSS (Maisonneuve 1994). Anche se sono descritte rare conversioniche iniziano con reattività isolate anti-NSS, in genere i donatori di sangue con questoprotìlo sierologico non sono viremici.

180Gli studi di sequenziamento dei vari isolati virali mettono in evidenza un certaeterogeneità virale dell'HCV, cui potrebbero corrispondere sierotipi non identificabili coni test attualmente disponibili. Questa evenienza sembra fortunatamente poco probabile,data l'alta omologia (97%) riscontrata a livello della regione del core virate.L 'HCV RNA è ri1evabile nel siero del paziente già dopo l settimana dallatrasfusione e, comunque, 4-5 settimane prima della elevazione delle transaminasi (Farci1991). La viremia persiste per meno di 4 mesi nei casi di epatite acuta che evolvonoverso la guarigione, mentre persiste per 10-14 anni nei pazienti con epatite cronica (Farci1991). Durante la fase acuta dell'infezione primaria da HCV, v'è un periodo di diversimesi di sieronegatività, durante i quali I'HCV RNA è Punico marcatore diagnostico diinfezione. Il comportamento degli anticorpi contro i diversi peptidi HCV non si presta adun giudizio prognostico circa Jlevoluzione della malattia. Solo la ricerca dell'H CV -RNAha un valore prognostico. La clearance deli'HCV-RNA correla con la risoluzione dellamalattia, mentre la persistenza predice una progressione verso una forma cronica diepatite (Farci 1991). L'HCV RNA è un marcatore specifico e sensibile di malattia epaticanei soggetti anti-HCV positivi, indipendentemente dai valori di AL T (Aiberti 1992).L'anti-CIOO tende a scomparire (3-9) anni, mentre l'anti-C22 e l'anti-C33 scompaionomeno frequentemente (20-40 % dei casi). In questi casi rimane da chiarire se si è difronte ad una infezione persistente o a guarigione. Nel 10-50% dei casi I'HCV RNA èpresente nel siero, il che deporrebbe per una cronicizzazione.In uno studio sperimentale su scimpanzè con inoculazioni sequenziali l'anti-C l 00 el'anti-NSS ricomparivano nell'animale infettato una seconda volta in concomitanza dellaricomparsa della viremia, suggerendo quindi che questi anticorpi potrebbero essereespressione di replicazione virale (Farci 1992). Gli stessi anticorpi scomparivano con laperdita della viremia, mentre persistevano in animali con infezione cronica_Episodi multipli distinti di epatite acuta NANB sono stati osservati ne1tossicodipendenti (Mosley 1977), emofilici (Hruby 1978), o!l'odializzati (Galbraith 1979)e talassemici (Lai 1994)(

181In uno studio condotto su tre pazienti talassemici, nel secondo episodio, checompariva rispettivamente 48, 17 e 21 mesi dopo la risoluzione dell'infezione primaria, siassisteva ad una ricompar9a della viremia. Questa in due casi era imputabile a reinfezionecon un ceppo HCV diverso (differenze nelle regioni E1-E2/NSI). in un altro ariattivazione di un'infezione primaria o a reinfezione con un ceppo nuovo mastrettamente correlato (Lai 1994). Queste osservazioni cliniche confermano quelle fattenello scimpanzè dalla Farci ( 1992), secondo le quali l'infezione da HCV non induceimmunità protettiva.Dal punto di vista pratico, nello screening dei donatori di sangue è importanteseguire lo schema decisionale seguente:Tabella l.Schema decisionaleElisa anti-HCV positivolControllo in doppiolAssenza di anti-HCV++ +Test di conferma di II generazionelPos- Distruzione dell'V.- Notifica al donat.- Esclusione definitiva- Consulenza gastroenterologicaIn d- Distruz. U.- Monitoraggio deldonatore\Neg- Distruzione cellule- Possibile recupero plasmax: emoderivati inattivati- Nessuna notifica====--===================--======================================

182Se allo screening si ha un risultato positivo o border line (Rapporto DOCamp.!Cut-off> 0,5), è consigliabile controllare in doppio la reattività del campione, perpoi procedere ad un test di conferma prima della notifica al donatore.L'importanza dell'anamnesi del donatore come momento fondamentale per migliorare lasicurezza della trasfusione è stata ribadita dal D.M. del 15/1/91 all'artJ. Nello stessoarticolo si richiama anche l'attenzione sull'obbligo di predisporre un questionario perl'autoesclusione dei donatori con comportamenti a rischio di malattie trasmissibili con ilsangue_Soprattutto nei pazienti chirurgici, l'incidenza di epatite può essere ulteriormenteridotta diminuendo il volume del sangue trasfuso e facendo ricorso alle tecniche dirisparmio del sangue omologo (autotrasfusione mediante predeposito, recuperoperioperatorio, emodiluizione, misure farmacologiche per ridurre le perdite emorragiche.fattori di crescita emopoietici).E' stata studiata la profilassi dell'epatite post-trasfusionale NANB con lasomministrazione di immunoglobuline ai riceventi di trasfusioni di sangue, ma i risultatisono stati insoddisfacenti e contraddittori. Alcuni studi hanno segnalato la possibilità checerti lotti di preparazioni di immunoglobuline possano ridurre la percentuale di casi itterici di epatite post-trasfusionale NANB (Seef 1981 ).A partire dal 1985 la infettività virate dei plasmaderivati è stata attenuata mediantetrattamento al calore in ambiente secco, sotto forma di vapore, in fase liquida, ecc.I concentrati commerciali di fattori della coagulazione vengono preparati da pooldi plasma proveniente da molte migliaia di donatori, fino a 20.000. Il pool comportacome conseguenza una grossa contaminazione virate, anche laddove la prevalenza di uncerto virus nella popolazione di donatori è estreffiamente bassa.In un anno, pazienti con forma grave di emofilia possono essere esposti ad lmilione di donatori (Aledort 1993). Per questo motivo, i dati di sieroprevalenzadimostrano che la maggior parte degli emofilici presenta segn.i di epatite (Brettler 1990,Schullman 1990). Fino al 70-90% degli emofilici ha AL T elevate e circa il 20% presenta

183epatite cronica attiva e/o cirrosi documentate da biopsia (Spero 1978, Cedarbaum 1982,Hay 1985).Per preparare plasmf!.derivati sJcun, nel ciclo di produzione sono previsteprocedure di inattivazione virate.Sono stati sperimentati diversi metodi di inattivazione virale, tutti miranti a nonalterare l'attività biologica delle proteine plasmatiche.La sterilizzazione dei plasmaderivati !abili mediante il riscaldamento delprodotto finale liofilizzato nel contenitore finale (dry heating) ha il vantaggio dellasemplicità, per cui potè essere introdotto in tutti i protocolli di produzione (Colombo1985)Tabella 2.Algoritmo per una possibile namm1ssione alla donazione di donatorifalsamente positivi all'anti-HCV EIAT est di confermaeseguitol lInd. o ReattivolRinvio definitivoReattivo aJI'EIAl ( ripetutamente) \Neg6 o più mesi diintervallo. Altro prelievollRitestare con altro EIA del commerciollReattivoNon reattivolRinvio definitivoTest di conferma noneseguitollT est di contèrma (es. RISA)llNon reattivoIndet. o reattivolRinvio definitivoDonazionelEIAllReattivo Non reattivollRinvio definitivo Donatore idoneoAABB 1993=====================~========================================

184Sono state scelte temperature diverse e tempi diversi, fra 60°C per 30 h e 68°C per 72 h.In Inghilterra si è fatto uso anche di 80°C per 72 h (Study Group of the UK HemophiliaCentre 1988). Purtroppo, le prove di valutazione della tecnica di inattivazione viralenello scimpanzè e gli studi clinici hanno dimostrato che il calore secco ha un'efficacialimitata, con l'eccezione forse del procedimento inglese ad 80°C. La liofilizzazionestabilizza non solo il fattore VIII, ma anche i virus contaminanti.Il trattamento al calore in soluzione acquosa a 60°C per 10 h (pasteurizzazione) èstato utilizzato con successo sin dalla fine degli anni '40 per preparare l'albumina umana,che è notoriamente un prodotto sicuro. L'albumina prima della pasteurizzazione vienestabilizzata con sodio caprilato o con N-acetiltriptofanato. Purtroppo, i fattori dellacoagulazione nelle stesse condizioni perdono la loro attività biologica. Bisogna impiegarecome stabilizzanti altre sostanze, a basso peso molecolare, soprattutto alteconcentrazioni di saccarosio e di aminoacidi. Il fattore VIII così prodotto, a partire dal1981, è risultato privo del rischio di infezione di epatite e AIDS.Questo metodo è stato successivamente applicato al fibrinogeno, alla antitrombinaIII, al C 1 inattivatore e ai fattori del complesso protrombinico.Il trattamento con un solvente organico, iltri(n-butìl)fosfato (TNBP) incombinazione con il sodio colato, è molto efficace nell'inattivare i virus contaminanti delsangue (HBV, NANBV, HIV) (Horowitz 1985, Guerois 1991) che sono muniti dicapsula lipidica, ma non è efficace nei confronti di virus senza capsula lipidica qualil'HA V e il parvovirus B 19 (Mariani 1993)n metodo solvente/detergente, che è tra quelli attualmente in uso per l'inattivazionevirale dei plasmaderivati, viene anche sperimentato per l'inattivazione dei virus nel plasmafresco congelato. Non è possibile utilizzarlo per gli eritrociti, perchè le emaz1econtengono lipidi essenziali che sarebbero distrutti ne1 processo di inattivazione.Le immunoglobuline preparate con il metodo di frazionamento del plasma metanolo freddo (Cohn 1946, Oncley 1949) sono generalme_nte considerate sicure perquanto riguarda la trasmissione dei virus epatitici.

185Sette preparazioni di immunoglobuline endovena ottenute da un pool di plasmacomposto di unità anti-c l 00 negative non trasmettevano l'epatite a tre scimpanzè,nonostante il plasma non'. frazionato trasmettesse I'HCV quando veniva trasfuso a duescimpanzè (Biswas 1994). Non sono chiari i motivi di questa apparente sicurezza delleimmunoglobuline.Una ricerca eseguita con la R T -PCR (reverse transcription and nested polymerasechain reaction) in campioni di immunoglobuline ha rivelato che il procedimento difrazionamento di Cohn-Oncley porta ad una riduzione dell'HCV RNA corrispondente adun fattore di 4, 7 x 10e4 rispetto al plasma di partenza (Yei 1992).Uno studio condotto con la tecnica RT-PCR su molte preparazioni commerciali diimmunoglobuline ha messo in evidenza che alcuni lotti presentavano l'HCV RNA, mconcentrazioni ampiamente variabili (Yu 1994).La presenza deli'HCV RNA neiJe preparazioni di immunoglobuline dipende dallacarica virate presente nel plasma di partenza ma anche dal processo di lavorazioneadottato. Attualmente, durante il processo di produzione delle immunoglobulineintramuscolari non sono previsti passaggi di inattivazione virate, mentre per quelleendovena c'è un trattamento aggiuntivo, quale il frazionamento con polietilenglicole, lacromatografia a scambio ionico o il trattamento a pH 4, ognuno dei quali agiscerimuovendo e/o inattivando i virus.In uno studio di coorte eseguito su pazienti trattati nel 1993 con diversi preparaticommerciali per valutare l'associazione fra infezione da HCV e immunoglobulineintramuscolari, su 513 persone esaminate non è stata rilevata nessuna sieroconversionefino a sei mesi dopo la somministrazione delle immunoglobuline (CDC 1994).Nello studio di Yu (1994), I'HCV RNA è stato individuato nella maggior partedelle preparazioni intramuscolari controllate e in alcune di quelle endovena e presentamolte caratteristiche proprie del virus integro. Ciononostante, secondo Yu (1994) leimmunoglobuline rimangono un prodotto sicuro per quanto riguarda la trasmissione diepatite (Yu 1994). Questa sicurezza può essere dovuta a molti fattori: la presenza dianticorpi protettivi nelle Ig (Finlayson 1990), l'inattivazione del virus durante il processo

186di lavorazione, la rimozione dei virus durante la lavorazione. Il frazionamento di Cohn­Oncley porta all'allontanamento di una parte deli'HCV RNA dalle immunoglobuline, mal'etanolo ha un effetto scarso o nullo sulla concentrazione di HCV RNA in quanto nondistrugge la capsula dell'HCV Nonostante sia stata riportata la mancanza di immunitàprotettiva contro la reinfezione da HCV (Prince 1992, Farci 1992), la possibilità dianticorpi neutralizzanti allo stato attuale non può essere esclusa (Yu 1994) Uno studiopreliminare, in un modello sperimentale nello scimpanzè, ha dimostrato che Igsperimentali con un alto titolo di anti-HCV (ma senza HCV RNA) prolungano il periododi incubazione, anche se non prevengono l'infeziOne da HCV (Krawczynski 1993 ).Risultati simili sono stati osservati nello scimpanzé Immunizzato con proteinericombinanti deli'HCV {E l e E2) che evocano una protezione verso inoculi a basse dosidi HCV e non su quelli a dosi elevate {Choo 1994 )-Nonostante quanto riferito. 112 casi di sieroconversione HCV da immunoglobulineendovena sono stati riportati al CDC di Atlanta nel 1994. Tutti i casi erano associati apreparazioni ottenute con lo stesso processo produttivo. Non sono chiare le ragioni diquesti episodi di trasmissione, poiché le immunoglobuline incriminate erano statesottoposte a trattamento con solvente-detergente, ma è probabile che si sia trattato di unerrore nel ciclo produttivoIn conclusione, è possibile affermare che le immunoglobuline endovena delcommercio sono ragionevolmente sicure. sempre che nel processo di produzione smprevista una specifica fase di inattivazione e/o rimozione virale (Suomela 1993). lnmancanza, la trasmissione di alcuni agenti virali deve essere considerata un rischiopiccolo ma reale (Casteels-Van Daele 1990)Bibliografia:AABB revised anti-HCV reentry algorithm., ( 1993 ). Blood Bank Week l 0: 32. AJberti A, Morsica G. Chemello L et al., (1992)_ Hepatitis C viraemia and liverdisease in symptom-free individuals with anti-HCV. Lancet 340: 697-98

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191LA SORVEGLIANZA DELLE EPATITI POST-TRASFUSIONALI IN ITALIA EALL'ESTERO.Emilio Mannella, Michelina Miceli, Angela Di Lorenzo, Assunta Gallo.Centro Nazionale Trasfusione Sangue- C.R.I.Via B. Ramazzini 15, 00151 ROMA.l rischi collegati alla terapia trasfusionale sono dovuti alla complessità e al numerodi persone coinvolte nel sistema trasfusionale e, più specificatamente, a errori umani e ailimiti delle tecniche diagnostiche e dei metodi di screening. I momenti del rischiotrasfusionale sono correlati con la selezione del donatore, con la caratterizzazionebiologica dell'unità di sangue e con l'interazione unità di emocomponente/ospite.Dal punto di vista infettivologico e in particolare per la prevenzione delle epatitipost-trasfusionali (EPT), sono questi i momenti importanti da sottoporre a sorveglianza.Certamente le misure messe in atto per tale prevenzione si sono dimostrate molto efficacinel ridurre enormemente le epatiti post-trasfusional~ tuttavia esiste ancora un rischioresiduo per cui, senza tema di smentita, si può affermare che il sangue non è mai statosicuro come oggi per le attenzioni poste da più parti, ma che, comunque, il grado disicurezza non é assoluto.Questa situazione ha fatto in modo che venissero opportunamente sviluppati isistemi di sorveglianza delle varie fasi nei diversi paesi con nonnative spesso differenti.Per meglio valutare la situazione abbiamo voluto paragonare la sorveglianza delle epatitipost-trasfusionali in Italia e in alcuni paesi.Allo scopo è stata avviata una inchiesta con l'ausilio della Croce RossaInternazionale, più precisamente con l'intervento del Dipartimento del programma delsangue della stessa Croce Rossa Internazionale. Alle Organizzazioni Trasfusionalicentrali dei vari Paesi sono state poste domande relative criteri di selezione del donatore,

192allo screening pre-trasfusionale, alla normativa di scelta e utilizzazione dei k.it, al tipo disorveglianza attuata, ai programmi di /ook-back.Per ciò che concerne la selezione del donatore in massima parte sono stati attivatiprogrammi educazionali e di autoesclusione delle donazioni per soggetti con fattori dirischio per infezione da virus epatitici, nel più ampio quadro della prevenzione delleinfezioni associate alla trasfusione.Sono permanentemente esclusi in tutti gli stati i donatori HBSAg +, anti-HCV +,quelli tossicodipendenti e, nella maggior parte dei Paesi interpellati, i soggetti con storiadi epatite o ittero implicati in più di un caso di epatite post-trasfusionale, in linea conquanto previsto dal Consiglio d 'Europa.Sono invece causa di inidoneità temporanea, ma con differenze temporanee tra ivari Paesi, i soggetti con comportamenti a rischio d'infezione da virus epatitici. Più inparticolare in italia i soggetti che hanno subito trasfusioni sono sospesi per cinque annimentre in Francia, Gennania, Inghilterra, Usa, Canada, Giappone sono sospesi perdodici mesi ; i soggetti che hanno subito interventi chirurgici , tatuaggi , agopuntura oforatura d eli' orecchio, in condizioni non igieniche, sono sospesi nei vari paesi , per unperiodo da sei a dodici mesi . Mentre in Italia tali soggetti , se hanno utilizzato per questaprocedura materiale monouso, sono considerati idonei alla donazione (1, 2). I soggetticon epatite a genesi poco chiara vengono permanentemente esclusi, mentre in Gennaniavengono considerati non idonei per cinque anni e in Inghilterra per dodici mesi. Notevolediscrepanza e dubbi interpretativi esistono invece sul comportamento da tenere con isoggetti sottoposti a trattamenti dentari, tuttavia la maggior parte dei paesi esclude dalladonazione coloro che hanno subito intervento chirurgico dentario per tre mesi, mentrel'estrazione dentale viene considerato, motivo di esclusione per tre giorni in Gennania eventiquattro ore in Inghilterra, laddove in Italia si viene considerati idonei in questaultima situazione .Concordemente in tutti gli stati lo staff sanitario è considerato idoneo se non èstato soggetto ad incidenti (tagli e/o punture occidentali) compreso quello operante neilaboratori e nei reparti di malattie infettive.

193In ogni caso anche la legislazione vigente in Italia (legge 107/90 e decreti di attuazione) èsensibilmente più restrittiva di quelli di altri paesi, ma comunque in linea con quantoprevisto dal Consiglio d'Europa.Altro aspetto di notevole importanza è quello relativo allo screening sierologicodelle unità di sangue e/o plasma.Le risposte ottenute da circa 25 Paesi dimostrano concordemente che ormai in tuttiviene eseguita la ricerca sistematica deii'HBsAg e dell'anti-HCV_ Un comportamentodiscrepante si ha nei confronti della ricerca dell'anti-HBc: questa viene eseguitasistematicamente in Francia, in Grecia, in Portogallo, negli USA, in Giappone ed inCorea, negli altri stati viene eseguito di volta in volta sui nuovi donatori e non sempre(Italia, Lussemburgo, Svezia), non sistematicamente (Austria, Belgio, Danimarca,Germania, Norvegia e Spagna) e, infine, non viene eseguita in Finlandia, Olanda,Svizzera, Turchia, Inghilterra, Canada, Australia e Tailandia.H medesimo comportamento discrepante é rilevabile anche a propositodell'esecuzione dell'ALT: accanto a Paesi in cui é obbligatoria l'esecuzione (Austria,Finlandia, Francia, Germania, Italia, Lussemburgo, Portogallo, Spagna, Svizzera, USA,Hong Kong, Giappone) vi sono paesi in cui non viene eseguita (Danimarca, Olanda.Norvegia, Turchia, Inghilterra, Canada Australia, Corea, Tailandia) e altri in cui vieneeseguita saltuariamente e per ragioni particolari (Belgio, Grecia, Svezia).Ancora più discrepante é il comportamento nei confronti della ricerca delleinfezioni da CMV probabilmente in dipendenza della situazione epidemiologica delsingolo paese (3).Comunemente, ove si eccettui qualche paese (Portogallo, Corea. tra i paesi chehanno risposto, per i quali non é obbligatoria la registrazione), nella maggior parte i Kitper l'esecuzione dello screening sierologico vengono valutati e approvati da unOrganismo tecnico (che varia a seconda d eU' organizzazione sanitaria dei diversi Paesi)del Ministero della Sanità e la concessione alle Ditte dell'autorizzazione alla venditacostituisce l'atto finale e necessario. Tuttavia, per ciò che concerne i kit per la

194rilevazione deli'HBsAg e degli anticorpi anti-HCV, i criteri di approvazione sono diversiper i vari paesi. A scopo esemplificativo si riporta la sensibilità minima dei kit per loscreening dell'HBsAg in alcuni paesi. per il Canada, gli USA, Svizzera i kit debbonorilevare almeno 0,3 nglml per i due sottotipi ad e ay; per il Liechtstein, Austria,Inghilterra, Francia e Spagna la sensibilità minima richiesta é di 0,5 l nglml; per laGermania la sensibilità minima é di O, l ng/mL In Italia, Spagna, Svezia e Danimarca(Paesi nei quali esiste l'obbligo della registrazione) non é prevista una sensibilità minima,come peraltro awiene in Portogallo. Comunque in ogni Paese esistono strutture spessotrasfusionali che valutano le performance dei kit per testi sierologici.In tutti i Paesi, anche in quelli nei quali non vi é obbligo di registrazione dei Kit,vengono svolti programmi di valutazione esterna di qualità. La partecipazione agliesercizi é obbligatoria in alcuni paesi (Germania, Usa, Canada etc.) e fà.coltativa in altri(Italia, Spagna, Grecia, Portogallo, etc). A ciò si aggiunge che in alcuni Paesi éobbligatorio eseguire una continua valutazione interna di qualità, come in Francia e inItalia (anche se questo dato tecnico non viene sottolineato espressamente). Il Consigliod'Europa prevede, ad esempio che per ogni seduta di screening per l'antigene disuperficie del virus dell'epatite B venga saggiato un siero contenente 1 ng/ml di HBsAg.L'analisi comparativa delle linee-guida relative all'algoritmo di screening delle infezionida virus epatitici sulle unità di sangue e/o plasma e di conferma dei risultati, pur conalcune diversità per i vari Paesi, ha dimostrato nel complesso uguali filosofie di fondo. Inparticolare gli algoritmi in vigore in Francia, Inghilterra (4) e negli USA e quelli propostiin Italia dal Gruppo di Studio per l'epatite post-trasfusionale (EPT) rispettivamente perHBsAg e per anti-HCV sono fra quelli più completi e restrittivi. Tali protocolli operativicomprendono, oltre che gli algoritmi di screening e di conferma, anche il primo jollowupdel donatore positivo e l'awio eventuale di quest'ultimo alle unità di diagnosi e cura.Un ulteriore punto delicato é costituito dal comportamento da tenere nei confronti deidonatori che presentano test ELISA di screening ripetibil~ente positivi per HBsAg oper anti-HCV e test di neutralizzazione (per HBsAg) e supplementari (HCV) negativi.Per ciò che concerne l'HBsAg numerosi algoritmi, tutti diver~i fra loro, vengono attuatil

!95o sono stati proposti, ma tutti sono particolarmente restrittivi e per la maggior parte'prevedono fol/ow-up del donatore (alcuni, come quello inglese, particolarmentecomplessi da seguire per il' donatore) durante il quale é prevista anche la ricerca delDNA virale mediante PCR.Per ciò che concerne, invece, le positività per I'HCV,l'algoritmo di screening prevede che nella maggior parte dei casi l'unità di sangue vadaeliminata e non sono previsti criteri di riammissione alla donazione. L'AssociazioneAmericana delle Banche del Sangue, proprio per la mancanza di veri e propri test diconferma e per i risultati positivi con test di II generazione, ha elaborato un criterio dirientro che prevede la riammissione alla donazione qualora un donatore risulti negativo altest di III generazione con negatività contemporanea dei test supplementari approvati(5).Discrepanti e per lo più sottovalutati appaiono in queste linee guida i problemirelativi ad altri virus epatitici, quasi assenti infatti appaiono quelli connessi con il CMV econ i pazjenti immunocompromessi.Un ultimo momento importante della prevenzione dell'EPT é costituito dal tipo disorveglianza effettuato nei vari Paesi. Per la massima parte dei vari stati la sorveglianzaé passiva e soltanto la Svizzera dal prossimo anno dovrebbe introdurre la sorveglianzaattiva delle EPT. La denuncia dei casi di EPT alle autorità sanitarie e ai serv1z1trasfusionali stessi é obbligatoria nella maggior parte delle Nazioni, compresa l'Italiadove però ai Servizi Trasfusionali non pervengono i dati di ritorno delle complicanzeinfettive della terapia trasfusionale.I programmi di look-hack infine sono avviati in tutti gli Stati e si limitano,probabilmente per gli stessi nostri problemi,alla ricerca dei riceventi delle unità disangue provenienti da donatori divenuti positivi per HBsAg o anti-HCVL'analisi delle linee guida e delle normative dei venticinque Paesi che hannorisposto e che partecipano al programma sangue della Società della Croce RossaInternazionale permettono di affermare che il sistema di sorveglianza delJe EPT attuatoin Italia nelle linee generali, delineato dalla legge 107/90 e integrato e meglio specificatonelle proposte del gruppo di studio Epatite della SIMTI, è sicuramente efficace e in linea

196con i sistemi di sorveglianza più avanzati. Le puntuali indicazioni circa la selezione deldonatore, i programmi educazionali alla donazione del sangue, i questionari diesclusione e/o autoesclusione dalle donazioni , gli algoritmi di screening e di confermadei risultati, i criteri di protezione del donatore, i criteri restrittivi di ammissione eriammissione alla donazione e l'attivazione effettiva dei programmi di /ook-back, sonoefficaci nel prevenire le epatiti post-trasfusionali.Tuttavia alcuni momenti di tale sorveglianza sono da perfezionare e in particolare:• si ritiene necessario che, al pari di quanto si verifica negli altri Paesi, gli organismipreposti al controllo e all'approvazione dei kit conunerciali per le rilevazionideli'HBsAg e degli anticorpi anti-HCV facciano pervenire le notizie relative aglistessi kit in modo tempestivo e puntuale.• è auspicabile poter disporre delle notizie tecniche sulle caratteristiche di performancedei vari kit con le indicazioni di merito e le caratteristiche di utilizzabilità.• per ciò che concerne la rilevazione dell'antigene di superficie dell'epatite B ènecessario che venga introdotto il concetto di sensibilità minima del kit come avvienenegli altri Paesi. In base a questo concetto i kit che non rilevano una quantità minimadi HBsAg non possono essere utilizzati nei servizi trasfusionali.• è importante ricordare che è obbligatorio effettuare il controllo di qualità interno(legge 107/90).• attivare ed estendere i programmi di /ook-backL • attuazione di questi momenti, unitamente alla già buona normativa esistente inItalia e al perfezionamento di linee guida da parte del gruppo di studio delle Epatiti,sicuramente porterà ad un ulteriore miglioramento della sicurezza della terapiatrasfusionale.

•197Bibliografia:l. Anonimo. (1990). Transfusion Transmitted Viruses. Technical Manual AABB.AABB Ed. Arlington. pag 49.2. Cecchi R, Del Vecchio S, Durso S, (1993). La regolamentazione dei trattamentitrasfusionali in Germania ed in Italia: Aspetti deontologici e giuridici. La Trasfusionedel Sangue. 38 (6): 387-399.3. Anonimo, (1994). Le tableau des tests de laboratoire. Federation intemationale desSociétés de la Croix-Rouge et du Croissant-Rouge. Department du Programme deSang. Transfusion Intemationale 63: 4-5.4. Anonimo, (1994). Alghorithm for mandatory microbiological testing. In Guidelinesfor the Blood Transfusion Service. Editore HMSO. London, 1994 Sezione l.Annex III. pag.I09.5. Anonimo. (1993). Reentry Algorithm Devised for HCV. Blood Bank Week.~: 2.

198STUDIO SUI RICEVENTI UNITA' DI EMOCOMPONENTI DA DONATORISUCCESSIVAMENTE SIEROCONVERTITI HCVOsvaldo GiachinoCentro Trasfusionale AVIS "A Colombo" via Ventimiglia l, 10126 Torinolntroduziont>In seguito all'introduzione dello screening sulle unità di sangue, l'incidenzadell'epatite C post-trasfusionale si è ridotta drammaticamente_ Allo scopo di misurarel'entità di questa riduzione, valutare l'efficacia delle strategie di prevenzione, e tentare diquantificare il rischio residuo di trasmissione, abbiamo effettuato una sorveglianzaprospettiva di una popolazione di soggetti con B-talassemia trasfusione-dipendente HCVnegativi, per un periodo di 4 anni Inoltre abbiamo identificato i donatori HCV negativi auna precedente donazione. in seguito risultati positivi. per evidenziare, tramite il /ookhackdell'ultima donazione negativa, una possibile sieroconversione del pazientericeventeMetodi di screeningDeterminazione AL T (valore soglia 54 U/1 )Aprile 1990-aprile 1991: Test anti-HCV E.Ll.S.A. l generazione (NS4). (ELISA l)Maggio 1991- giugno 1994. Test anti-HCV II generazione (+NSJ + c22). (ELISA 2)Luglio 1994 inizio test anti-HCV Ili generazione. (+NSS). (ELISA 3)Studio prospettivoPazienti: 38 soggetti con B-talassemia, ELISA 2 negativi al momento dell'inizio delloscreening ELISA l (aprile 1990), (come evidenziato in . seguito su sieri storiciconservati). Tali pazienti erano parte di un più ampio gruppo (147 soggetti) studiati condeterminazione dell'AL T a ogni ciclo trasfusionale (in media 25gg.). Veniva fatta

•199diagnosi di epatite quando si osservava un aumento AL T> 2.5 volte la media dei valori. .registrati nell'anno precedente, confermato ad almeno l settimana di distanza.Trasfusioni: Nel periodo di osservazione sono state trasfuse 786 unità ELISA l negative(aprile 1990-aprile 1991) e 2819 unità ELISA 2 negative (maggio 1991-luglio 1994).Risultati: Nel periodo di sorveglianza, 7 pazienti su 38 hanno mostrato un aumento delvalore AL T compatibile con la diagnosi di epatite, dei quali 5 nel periodo di screeningELISA l; 4 pazienti hanno mostrato una sieroconversione HCV, e in tutti i casi è statoevidenziato un donatore ELISA l negativo, ELISA 2 positivo.In 3 pazienti non si èosservata sieroconversione. La Tab. I mostra i dati clinici rilevanti dei casi riportati Ilrischio di sieroconversione HCV relativo alla trasfusione di unità sottoposte a screeningELISA l era di 0.5/100 unità. Non si sono osservati casi di sieroconversione in seguito atrasfusione di unità sottoposte a screening ELISA 2.Studio /ook-backSono stati individuati 2 gruppi di donatori in rapporto alle diverse metodiche discreening successivamente adottate.Gruppo l) Donatori ELISA 2 positivi, con almeno una donazione ELISA l negativanell'anno precedente.Gruppo 2) Donatori ELISA 2 positivi (oppure ELISA 3) con donazione precedenteELISA 2 negativa.Gruppo l:Sono state individuate 234 donazioni provenienti da 185 donatori. Di queste l 08erano state inviate a S.I. T. extraregione e non sono state incluse nello studio~ 37 eranostate eliminate prima dell'assegnazione per cause varie ( 4 per ALT oltre il limiteaccettabile). Le 89 unità rimanenti risultavano, in base alle nostre registrazioni, assegnatee trasfuse a pazienti in reparti direttamente serviti dal nostro servizio. La consultazionedelle cartelle cliniche dei pazienti ha permesso di rilevare che l S unità non erano staterealmente trasfuse e che 20 pazienti erano deceduti nel corso del ricovero associato con

200la trasfusione indagata. 21 pazienti politrasfusi risultavano già HCV positivi prima dellatrasfusione in oggetto. Dei 33 pazienti rimasti, 8 risultarono irreperibili; 8 erano decedutinel periodo fra la trasfusione e lo studio; 4 non acconsentirono a sottoporsi al prelievo~13 soggetti furono sottoposti al controllo post-trasfusionale. Dei 13 riceventi, 6 (46%)sono risultati HCV positivi e 7 HCV negativi. La tabella II mostra il pattem sierologicodei donatori implicati.Gruppo 2:I soggetti in questo gruppo rappresentano le reali sieroconversioni nellapopolazione dei donatori. Nel periodo di 3 anni posteriore all'introduzione del testELISA 2, sono stati identificati 7 donatori con evidenza di infezione recente. 4 avevanoeseguito una donazione nel corso dell'anno precedente al riscontro di positività anti HCV(Tab. III)Non è stato osservato nessun caso di sieroconversione HCV nei riceventi ladonazione HCV negativa. (l paziente sottoposto a dialisi cronica risultava giàsieropositivo precedentemente alla trasfusione m oggetto). L'incidenza dellasieroconversione sul totale delle donazioni (circa 240.000) risultava di 0,0029 %.Considerando un periodo di 5 anni (1988-1994) nella stessa popolazione di donatoriabbiamo osservato 12 sieroconversioni HIV (7 nell'anno precedente, 5 entro i 2 anniprecedenti la donazione HIV positiva). Anche in questo caso non si sono verificatetrasmissioni del virus mediante trasfusione. L'incidenza sul totale delle donazioni è statadello 0,003%.DiscussioneI risultati ottenuti confennano che la prevenzione dell'epatite da HCV correlata conla trasfusione è risultata molto efficace a partire dall'introduzione del test di IIgenerazione, come dimostra l'assenza di trasmissione del virus nella popolazione dipolitrasfusi considerata.

•201•Per quanto riguarda lo studio look-back per i donatori del gruppo l, la presenza diuna reattività c33 al RIBA II si è dimostrata correlare con l'efficacia di trasmissione delvirus. Il numero di infezioOi post-trasfusionali potenzialmente rilevanti dal punto di vistaclinico, è risultato minore di quanto teoricamente atteso a causa dell'elevato numero diunità non assegnate o non trasfuse per vari motivi. Il 38% dei pazienti trasfusi (28 su 74)era deceduto entro 2 anni dall'episodio trasfusionale (%molto vicina a quella riportata inun recente studio in USA) (l). Entrambi i fattori (% di unità non trasfuse e % di pazientiprecocemente deceduti per la malattia dibase) sono importanti per valutarecorrettamente il rapporto fra la prevalenza di un dato agente infettante nei donatori e ilreale impatto epidemiologico sui riceventi.La bassissima incidenza di donatori con evidenza di sieroconversione recente(anche se probabilmente vi è una sotto stima legata al possibile mancato ritorno deldonatore) minimizza la possibilità (confermata da sporadiche osservazioni) (2), ditrasmissione da donatori in fase di sieroconversione. Nella nostra popolazione l'incidenzadel fenomeno si è rivelata paragonabile a quella riscontrata per l'infezione da HIV 1,nonostante la differente prevalenza dello stato di sieropositività per i 2 virus nei donatoriali accesso (0,5% per HCV; 0,025%) per HIV l, osservazione personaJe). Ciò porterebbea ritenere che il rischio residuo di trasmissione delle 2 infezioni per via trasfusionaJe siapressoché sovrapponibile, considerando altresì che la determinazione del valore AL Tpotrebbe in qualche misura ridurre il periodo di sieronegatività HCV associato con lapotenzialità infettiva. (window phase). Recenti osservazioni indicano che la windowphase in pazienti immunedepressi può prolungarsi fino a 38 mesi (3). Non sappiamo setale fenomeno possa verificarsi anche nei donatori Dal complesso delle osservazionidisponibili, tuttavia, si può concludere che il rischio di epatite C associata con latrasfusione può essere considerato molto prossimo allo zero.

202T ab I: Dati clinici rilevanti dei pazienti con diagnosi di epatite .•• ALT MAX !!11EROCONV. DONATORE INTERVALWHCV POSTRASFUSIONEAUMENTO AI.Tl 863 Si Si 64 gg.2 311 Si Si 35 gg3 901 Si Si 45 ••.4 1620 Si Si 30 gg5 635 NO NO6 136 NO NO7 195 NO NOTab II: Pattem sierologico anti HCV dei donatori corrispondenti a1con controllo post-trasfusionale.13 pazienti!rom n ESSO SIERO LISA 1u8A jALT""NAT. :ONV. RATIO ATfERN PREGRESSO108781 M SI >5 c22+++ c33++ 21-23-39119361 F SI 4 22++c33+ 36-40-55196737 F SI 4 c22+++ c33++ 34-48138792 F SI 4 c22+++ 38-30121881 l r. SI 4 c22+++ 17-22-14204140 l r. SI 4 c33++ 46-53-6851633 M NO 4 c22++ 15-13191539 IF NO 4 c22+ 16-24-3718994 M NO 4 c22+++ 31-33-27199689 M NO >5 c22+ 25-29-30159370 M NO 3 c22++ 28-27-26156901 M NO l c22+ 33-28-2066147 M NO l c22+ 24-26-23(

203Tab. III: Caratteristiche dei donatori con sieroconversione HCV.L"' DICE SESSO ETA.' ALT mnlf#177959 M 23 284 6209275 M 21 1340 7205540 M 21 760 15152672 M 27 142 689295 F 65 IO Il188157 M 24 13 24201624 M 37 129 35# mesi intercorsi da donazione precedente.Bibliografia:l. Vamvakas EC, Taswell HF, (1994). Long term survival after blood transfusion.Transfusion 34: 471-477.2. Reesink HW, Vrielink H, van der Poel CL, Zaaijer HL, Cuypers HTM, Lelie PN,( 1994). Transmission of hepatitis C virus by an anti-HCV negative blood transfusion.Transfusion 34S: 385. (abstract)J. Cornu C, Brusse1mans C, Geubel A, Ferrant A. Cornu G, (1994). Anti-HCVseroconversion in multitransfused an d immunocompromised patients. Vox Sang 67:286-290.

204VALUTAZIONE DI UN TEST ANTI-HCV DI TERZA GENERAZIONEAPPLICATO A DUE POPOLAZIONI SELEZIONATE: EPATITI ACUTE NANB(INDAGINE RETROSPETTIVA) E DONATORI DI SANGUEINDETERMINATI ALLA SECONDA GENERAZIONE.Marisa De PalmaServizio di Immunoematologia e Trasfusionale- Azienda Ospedaliera di ModenaRispetto al test di seconda generazione HCV Ortho, la metodica HCV 3.0 ècaratterizzata da una strutturazione degli antigeni utilizzati diversa sia qualitativamentesia quantitativamente. Le modifiche più significative riguardano: l. l'aggiunta dellaproteina ricombinante NSS, polimerasi virate codificata dalla regione genomica NSS, lacui presenza sembrerebbe evidenziare più precocemente una sieroconversione da HCV,anche se tale risposta non è statisticamente prevalente rispetto a quella verso gli antigenicodificati dalle regioni Core e NS3; 2. dall'eliminazione dal pool antigenico della frazionelibera C l 00-3, presente nella terza generazione solo come parte integrante della C 200,3 da modifiche qualitative (conformazionali) oltre che qqantìtative della C 33c.La metodica rimane caratterizzata dall'uso esclusivo di antigeni ricombinanti. Pertale motivo ci è sembrato interessante valutaria in parallelo ad un kit (EIAGEN DETECTHCV-AB IFCI CLONESYSTEM) caratterizzato dall'uso esclusivo di antigeni sintetici (C 22. NS3. NS4)Come test di specificità anticorpale o di confenna sono stati utilizzati sia il RlBAIII Ortho, che l'immunoblot INNOLIA Innogenetics e il Western Blot Wellcome nei casidi discordanze significative dei test di screening.Casistica selezionataSono stati studiati 134 campioni, accuratamente selezionati fra 800 sieri,prelevati a pazienti ricoverati presso il Reparto di Malattie Infettive del Policlinico

205Universitario di Modena, con diagnosi di epatite NANB acuta (n=l18) e cronica(n=l6). I campioni erano stati raccolti e conservati nelJiarco di circa IO anni, in epocaprecedente la messa a punto delle tecniche per la ricerca degli anticorpi anti-HCV.Di tutti i pazienti era disponibile una precisa documentazione clinica e di laboratoriorelativa al periodo di ricovero e diagnosi di epatite NANB con esclusione oltre che deivirus A e B di ogni altra possibile eziologia. Per tutte le epatiti croniche la diagnosi erasopportata dall'esame istologico.I 118 pazienti con epatite acuta (81 maschi; 37 femmine) avevano una età media di34 anni (range 12-74); nei 16 pazienti con epatite cronica (11 maschi; 5 femmine) l'etàmedia risultava di 43 anni (range 21-68).Tutti i casi sono stati classificati in rapporto ai fattori di rischio dedotti dallaindagine anamnestica.NANBACUTA NANB CRONICA- Tossicodipendenti n.38 n.4- Trasfusi ed Emofilici n.l4 n. l- Contatti sessuali n.J l- Contatti sanitari n.21 n.J- Nessun fattore di rischio n.42 n.SI risultati complessivi sia per le epatiti acute che croniche sono riportati in Tabella lCi sembra interessante sottolineare per le epatiti acute la durata dell'intervallomedio di tempo intercorso tra la prima rilevazione dell'incremento delle ALT e il primocampione di siero testate per anti-HCV: per i soggetti positivi il tempo medio era di10.88 giorni; nei pazienti anti-HCV negativi l'intervallo era dimezzato( 5,45 giorni).Le discordanze (n=I3 epatiti acute; n= l epatiti croniche) sono riportate in tabella 2Alla luce dei test di conferma (Riba III per gli 8 casi Ortho 3 positivi, Innolia e WB per i6 casi Ortho 3 negativi, vedi tabelle 3 e 4):- 2 pazienti positivi unicamente al test Ortho 2 non sono stati confermati da alcun testsupplementare

206- 2 sono stati confermati positivi ( Riba III C 100- 3 l C 33c)- 6 sono stati confermati positivi a una banda ( Riba III indeterminati per C 33c)- 4 hanno dato risultati variabili per epitopi singoli o multipli della regione Core (lnnoliaeWB).Complessivamente, mentre la incidenza dei risultati negativi (36 %) nelle epatitiacute può essere giustificata dalla fase temporale del prelievo, per i 16 pazienti condiagnosi di epatite cronica la bassa percentuale di negatività (13%) e la ridottadiscordanza fra i 3 test confermano la maggiore significativita' del test in questa fase dimalattia.E' da sottolineare però come, pur non essendo stato possibile per ragioni pratichecercare i pattem di positività su tutti i sieri concordanti positivi (53%), tra i 14 casivariamente discordanti ai test di screening, gli 8 casi messi in evidenza dall'Ortho 3 sianostati tutti confermati dal Riba III (2 positivi e 6 indeteminati per C 33c isolata). Lareattività isolata verso peptidi della regione Core di 4 sieri ( 2 positivi solo IFCI, 2positivi per IFCI e Ortho 2 ) riveste ancora un incerto significato biologico. Quanto agliunici 2 campioni risultati positivi solo per Ortho 2, non essendo stati confermati danessuno degli immunoblotting testati, potrebbero essere considerati come falsi positividel test Elisa Ortho 2.L'altra categoria esaminata è costituita da 83 donatori sospesi dalle donazioninell'arco di 2-3 anni, Ortho 2 positivi, Riba n indeterminati secondo la seguentedistribuzione- 29 HCV Ortho 2 pos, Riba indeterminati per C 100-3GRUPPO A7 HCV Ortho 2 pos, Riba indeterminati per C 33cGRUPPOB47 HCV Ortho 2 pos, Riba indeterminati per C 22-3GRUPPO CI risultati dei due successivi test di screening sono illu.strati in Tabella 5: da essiemerge una buona correlazione tra Ortho 3 e Ifci per gli indeterminati C 100-3 e C 22-3

207( rispettivamente 93 e 95.7%) mentre è assai ridotta (43%) per gli indeterminati a1la C33c, pur con la limitazione di un numero esiguo di campioni (n=?).Le discordanze Ortho3. O l Ifci riguardano complessivamente 8 donatori, tuttirisultati Ortho pos l lfci neg , che sottoposti ai test supplementari hanno dati i seguentirisultatiGRUPPO A (Riba li ind per C l 00-3) · 2 Ortho l pos l lfci negl. Riba 3.0 ~ CJ00-3+ l c22 -3 ++!Il lnnolia neg Ili WB NS4 ++++1. Riba 3 .O= SOD ++(non evidenziata al Riba III)GRUPPO B (Riba n ind per C 33c) • 4 Ortho 3 pos l lfci negl. Riba 3.0 ~ CI00-3 +l C 33c +++Ili lnnolia ~E2/NSI +l NS3 ++Ili WB ~ NS3 ++l. Riba 3.0 ~ CI00-3 +l C 33c ++++Ili lnnolia ~ NSJ +++Ili WB ~ NS3 +++2. Riba 3.0 ~C 33c +++Ili lnnolia ~ NS3 ++GRUPPO C ( Riba n ind per C22-n 2 Ortho 3 pos l lfci negl. Riba 3.0 ~ CIOO -3 ++(?)Ili WB negl. Riba 3.0~ C 22-3 +Ili lnnolia ~Cl++ C2++Nessuno dei sieri sottoposti ai test di conferma ha presentato un anti NSS isolato.Il test di screening Ortho 3 rileva un maggior numero di campioni positivi, riferibili inpercentuale modesta a proteine del core e/o della regione NS4, in larga percentuale allaC 33c, confermando il presupposto che. trattandosi di una proteina conformazionale, hareattività ottimale se ottenuta con metodiche ricombinanti piuttosto che per sintesi.Un ulteriore aspetto dei dati ottenuti in questo gruppo di donatori è l'altapercentuale di positivi alla seconda generazione Elisa, non confermati dalla terza(complessivamente 42% . 27 l 29 tra i Riba ind per C 100-3, 3 l 7 tra i Riba ind per C33c, 5 l 41 tra i Riba ind per la C 22-3)

208Poiché sono già state segnalate (I,2,3) evidenze di reattività per C 100-3 e 5. l. llimitate a singoli epitopi del peptide e non specifiche per infezione da HCV, così comeper la proteina C 22-3, abbiamo inviato al Laboratorio di Ricerca e Sviluppo Ortho(Raritan, New Jersey) una campionatura dei sieri più critici, al fine di verificare se:l- venivano confermate dallo studio degli epitopi le reattività CI00-3 e C22-3evidenziate al Riba II2- venivano confermate le reattività Riba II e/o Riba III per C33c su campioni negativiall'Elisa Ortho 3 OI campioni inviati erano9/27 donatori Ortho 2 positivi, Riba II Indeterminati per CI00-3- Ortho 3.0 negativi115 donatori Ortho 2 positivi, Riba II Indeterminati per C22-3 - Ortho 3.0 negativi3/3 donatori Ortho 2 positivi, Riba II Indeterminati per C33c- Ortho 3.0 negativi4 pazienti dell'Istituto Malattie Infettive negativi ali'Ortho 3. O, tutti positivi allo screeningIFCI due dei quali positivi per Ortho 2 , con reattività confermata al WB per Core e/oali'Innolia per epitopi singoli o multipli del Core.I risultati, riportati in tabella 6 sembrano confermare la sostanziale magg1orespecificità del Test Ortho 3 .O vs Ortho 2 nel gruppo dei donatori indeterminati per c l 00e per il solo donatore indeterminato alla c 22.Quanto ai risultati dei pazienti viene prospettata l'ipotesi ( da verificare su ulterioricampionatura degli stessi propositi) di infezione non A non B non C in quanto mostranouna reattività multipla ai peptidi del Core ma con profilo di reattività diverso da quelloche contraddistingue i pazienti affetti da epatite C.Quanto ai donatori Indeterminati per C 33c, poiché non esistono a tutt'oggi datisignificativi sulle risposte a singoli epitopi del peptide il giudizio sui loro profilisierologici rimane ancora in attesa di chiarimenti da altre future metodiche, ma induce acauta riflessione su test di screening negativi con specificità an~i- C 33c al Riba III

209Tabella l.RISULTATI: Ortho 2 l Ortho 3 l IFCINANB ACUTENANB CRONICHEoosc"..- P0853'11o......."Tabella 2.DISTRIBUZIONE TEST ELISA POS NEl14 PAZIENTI DISCORDANTIORTHO 2/ ORTHO 36ORTHO 32IFCI2ORTHO 22NANB ACUTE E CRONICHETabella 3.TEST DI CONFERMA AlBA 111(8 pz. discordanti positivi Ortho 3)ORTHO 2/0RTHO 3 n•6ORTHO 3 n•2t2 IND c33t4 IND c332 POS ctOO/c33

210Tabella 4.TEST DI CONFERMAIFCI POS l ± [ - t lIFCI POS [ ± ( t l t [OATHO 2/IFCI l + T ± l + lOATHO 2/IFCI L+~T~ L-= JOATHO 2 L - ~T ____·_! lOATHO 2 L . T ~---L=-1Cl C2 COREINNOLIA WBTabella 5.CONFRONTO ORTHO 2/ ORTHO 3/ IFCIsugli 83 donatori AlBA Il INDETERMINATO29-'c1007 4 o~~·'c3347 4240~[[]:c22D OATHO 2D IFCIr--:-] ORTHO 3

,211Tabella 6.Risulati del Laboratorio Re D Ortho (Raritan-USA)(Campioni di donatori evidenziati con reticolo)c 100Ellea 2.0 Eli18 3.0 AlBA.Sample a/c ratlo a/c ratlo HCV 2.01 2.117 o.oeo Negative2 2.9154 0.939 Ne atlve3 3.783 0.021 Nega;;~3.381 0.047 c 100 ,.''3.771 0.083 Negallve2.12'2 0.063 c 100 2•1 3.770 0.028 c 100 2+3.885 0.1584 c 100 2•'3.245•0.017 c 100 1•c 22Ell1a 2.0 Eltaa 3.0 RIBASampla e/c ratlo a/c rauo HCY 2.010 1.418 0.878 Negative,. 0.728 0.308 c 22 1+, 1.887 0.198 c 22 3•,.2.874 0.347 c 22 2•11 1.294 1.718 Negati~RIBAHCV 3.0-~·g·g~Neg~!.i_~Neg!liveNegaliveN11q~t_i~eNegativerw~oativeNegative----Neg~t!~AlBAHCV 3.0NegativeC 22P 2+C 22P 4•c 22P2.-~egallvePeptidedata!C- tOo-=-31Negative~-N•Q~!ivaNegaliveN!q!tlveNegaliveNegativeNegativalngte (pept tiNegativePeptidedataC-22-3)- -SlngleIncompletat-~ulliple1--~ulliple~-~:~•!iplec 33, 0.488 0.081 c 33 2•,0.855 1.038 c 33 2•13 0.548 0.085 e ali·c 33 3•c 33 3•N""""""Bibliografia:I. Bush MP et al., (1993). A pattem of S.I. l and C 100-3 only on hepatitis C virusrecombinant immunoblot assay does not reflect HCV infection in blood donors.Transfusion 33: 84-82. Zaaijer Hl et al., (1994). Should the C 100 Antigen be removed from HCV antibodyassays? Vox Sang.66: 1503. McOmish F et al., (1994}. Geographical distribution of hepatitis C virus genotypesin blood donors: an intemational collaborative smvey. J Microbiol 32: 884-92

212ESPERIENZA MULTICENTRICA CON TEST DI 3' GENERAZIONE NELLOSCREENING HCV DEI DONATORI DI SANGUE.Enrico Passarelli-Pula**, Maurizio Lanteri***, Sante Barbante*, Cesare FaustoBertorello*, Paolo Cagetti*, Giuseppe Cambié*, Patrizia Collinassi*, Walter Cozzolino*,Marisa De Palma*, Osvaldo Giachino*, Paolo Gottardi*, Ermanna Iiritano*, GiovanniLanducci*, Michela Macri*, Mara Mazzucco*, Carlo Omodei-Zorini*, GaetanoPolignano*, Paolo Rizzone-Favicchio*, Mario Rossi*, Liliana Santarossa*, PieraVallauri*, Leopolda Zarnpieri*.*Referenti Regionali del Gruppo di Studio EPT della Società ItaHana di MedicinaTrasfusionale e di Immunoematologia•• Servizio Immunotrasfusionale Provinciale Ospedale di Macerata***Centro Trasfusionale Ospedale di VerbaniaIntroduzioneIl Gruppo di Studi sull'epatite post-trasfusionale costituitosi in seno alla SocietàItaliana di Medicina Trasfusionale e di Immunoematologia fin dal 1987 ha, a tutt'oggi,raccolto dati epidemiologici annuali sulla prevalenza di HBsAg, HbsAb, HBcAb,HCV Ab e relativi tests supplementari; ha raccolto informazioni sulla organizzazioneoperativa dei Servizi Trasfusionali Italiani nella attuazione delle diagnostiche relative allostudio dei marker delle epatiti B e C, di quelle da CMV e sulla determinazione delleAL T; ha elaborato linee di guida per lo screening HBV e HCV nei donatori, producendoinfine dati sul jollow~up dei donatori HCV Ab pos sulla base dei risultati di testsupplementari e dati sul rischio residuo di epatite post-trasfusionale da HCV dopol'utilizzazione dello screening specifico.Dopo Jlinunissione nel mercato della 3a generazione. del test di screening HCV,dotato, secondo le infonnazioni delle produzioni, di una dimostrata, aumentata sensibilitàper la evidenziazione delle fasi precoci della sieroconversione HCV Ab. i Servizi' '

213Trasfusionali Italiani hanno adottato questo nuovo test nello screening dei propndonatori.Abbiamo raccolto i risUltati di queste prime espenenze, parametrandoli ai risultatiottenuti in precedenza con 1 utilizzo della 2a generazione dei tests di screening HCVMetodiDi tutti i Servizi Trasfusionali italiani invitati a comunicare i propri dati, hannorisposto 84 Centri (Tav. l), distribuiti in ragione del 33% al nord, 38% al centro e 29%al sud del Paese. Tutti i Centri partecipanti hanno inviato dati completi riferiti al numeroglobale di campioni esaminati e suddivisi in "Donatori Conosciuti 1 ', precedentementenegativi alla ricerca delta HCV Ab con metodi di 2a generazione e "Donatori Nuovi"; nontutti i Centri partecipanti hanno specificato dettagliatamente per le categorie "DonatoriConosciuti" e "Donatori Nuovi 11la suddivisione per sesso, così che il campione dipopolazione suddiviso. per sesso è risultato essere inferiore al campione globale. Sonostati pertanto configurati sei gruppi di popolazione: l) Donatori Conosciuti Uomini; 2)Donatori conosciuti Donne; 3) Donatori conosciuti Totale; 4) Donatori Nuovi Uomini;5) Donatori Nuovi Donne~ 6) Donatori Nuovi Totale.I risultati relativi ad ognuno dei sei gruppi sono stati parametrati con i risultati dellecorrispondenti categorie esanùnate precedentemente con test di 2a generazione. Nonsono stati parametrati fra loro i risultati dei diversi gruppi di popolazione.Sono stati testati 139.025 campioni di donatori appartenenti sia alla categoria di"Donatori periodici Conosciuti" (116.194), che di quella di "Nuovi Donatori" (22.831 ).Alla categoria "Donatori Conosciuti" si sono potuti ascrivere 81.033 uomini e 21. 172donne. A1Ja categoria "Nuovi Donatori .. si sono potuti ascrivere 16.365 uomini e 5.649donne.Tutti campioni sono stati esaminati con test di screening di 3a generazionepresenti nel mercato italiano. Non sono state effettuate valutazioni comparative frasingole produzioni. Tutti i campioni, risultati ripetutamente reattivi (RR) ai test discreening di 3a generazione, sono stati successivamente esaminati con lo Immunoblot

214RIBA-3 che evidenzia, secondo le indicazioni del produttore, HCV Abs reattivi versoc!OOp, c33c, c22p, e verso la proteina NS5.Sono stati infine sottoposti all'immunoblotting, RIBA-3, 74 campioni conservati a-80°C e appartenenti a donatori risultati "RR" con metodica di 2a generazione HCV Ab e"indetenninati" al RIBA-2.RisultatiI donatori ripetutamente reattivi sono stati 786 (0,56%), suddivisi in 465 "DonatoriConosciuti Totale" (0,4% del rispettivo gruppo) e 321 (1,41% del rispettivo gruppo)"Nuovi Donatori Totale" (Tav. 2).Del gruppo "Donatori Conosciuti Uomini" 341 (0,42%) sono risultati RR, mentre74 (0,35%) sono risultati RR nel gruppo "Donatori Conosciuti Donne"; nel gruppo"Nuovi Donatori Uomini" 235 (1,44%) sono risultati RR e 82 (1,45%) sono risultati RRnel gruppo "Nuovi Donatori Donne".Del gruppo "Donatori Conosciuti" 341 RR (0,42%) erano uomini e 74 (0,35%) eranodonne, mentre del gruppo "Nuov) Donatpri" 235 RR (1,44%) erano uomini e 82 (1,45%)erano donne.Le percentuali di positività evidenziate con il test RIBA-3 sono staterispettivamente del: 19,3% per il Gruppo l); 26,03% per il Gruppo 2); 22,57% per ilGruppo 3); 59,47% per il gruppo 4); 60,56% per il Gruppo 5); 57,28% per il Gruppo 6),mentre i risultati "indeterminati" evidenziati dallo stesso test sono stati rispettivamente:28,07% per il Gruppo I); 34,25% per il Gruppo 2); 28,54% per il Gruppo 3); 22,47%per il gruppo 4); 19,72% per il Gruppo 5); 22,15% per il Gruppo 6).I 74 campioni "indeterminati" al RIBA-2 erano così raggruppabili: a) 50presentavano positività (da l+ a 4+) per il solo antigene c22-3~ b) 7 per il solo antigeneci00-3; c) 4 per il solo antigene c33c; d) 6 per il c22-3 con aggiuntiva positività dubbia(!±)anche per il c33c; e) 2 per il c22-3 con aggiuntive positività dubbie(!±) anche peril c33c e per il c!00-3; f) l per il c!00-3 con aggiuntiva positività dubbia (l±) anche per ilc22-3; g) l per il c22-3 con aggiuntive positività dubbie (l±) anche per il c!00-3 e per ili

' l2155-1-1; h) 2 per il c22-3 con aggiuntive positività dubbie (l±) per il c33c, il c!00-3 e per il5-1-1; i) l per il c33c con aggiuntiva positività dubbia (l±) per il c22-3.I risultati ottenuti col'.nuovo immunoblotting di 3a generazione hanno evidenziato37 campioni (50%) positivi e Il campioni (14,9%) negativi , mentre 26 campioni{35, 1%) sono restati "indeterminati".In generale le positività, laddove interessanti antigeni corrispondenti, si sono mlarga parte dei casi rese più evidenti passando da 1+,2+ a 3+,4+ ed in particolare ipattem di reattività si sono così distribuiti:GRUPPO a). 16 c22p; 15 c22p/c33c; 4 c22p/c100p(l±)/c33c/NS5; 3c22p/c33c/cl00p; 2 c22p/c33c/NS5(1±}; l c22p/c33c/cl00p(l±}; c22p/cl00p;c22p/c33c/cl00p(I±}/NS5/hSOD(l±); 4 c22p/c33c(l±}; l c22p/cl00p(l±}; 2 NegativiGRUPPO b). 7 Negativi.GRUPPO c). l cl00p/c33c/NS5; 2 c33c;l c22p.GRUPPO d). 2 c22p/c33c; l c22p/c33c/NS5/c100p(l±); l c22p/c33c/NS5; lc22p(l±)/c33c/c100p(l±); l Negativo.GRUPPO e). l c22p/c33c; l c22p.GRUPPO f). l Negativo.GRUPPO g). l c22p/c33c/cl00p.GRUPPO h} 2 c22p/c33c/cl00p.GRUPPO i) l c33c/c l 00p/NS5DiscussioneLa comparazione dei dati ottenuti sui gruppi totali, sia di "Donatori Conosciuti",che di "Nuovi Donatori", con quelli relativi a corrispondenti campioni di popolazione didonatori testati con la 2a generazione del test evidenziano un aumento dei valoripercentuali di reattività ripetute con i test di 3a generazione e valutabili nell'ordine del52,5% per il gruppo "Donatori Conosciuti" e del 25,53% per il gruppo "NuoviDonatori" (Tav. 3). L'andamento distributivo delle prevalenze delle reattività ripetute,

216più per i "Donatori Conosciuti" che per i ''Nuovi Donatori" subisce una vanaz10nesignificativa a seconda delle aree geografiche interessate, (Figg. 1-2).La comparazione dei dati ottenuti con l'immunoblotting RIBA-3 dei campioni RRcon quelli riferiti al RIBA-2 dimostra che per i "Donatori Conosciuti" si è verificata unadiminuzione dei risultati positivi ed indeterminati pari rispettivamente al 12,82% e al10,42%, mentre si è determinato un aumento del 13,58% dei risultati negativi_ La stessacomparazione effettuata sui risultati dei "Nuovi Donatori" ha invece messo in evidenzaun aumento moderato, pari al 4,43%. dei risultati positivi, un aumento rilevante, pari al18,71%, dei risultati negativi ed una ancora più rilevante diminuzione, pari al 22,38%,dei risultati indeterminati (Tavv 4-5-6)La valutazione dei dati, evidenziati dal RIBA-3 su1 campiom precedentementerisultati indeterminati con l'immunoblotting di 2a generazione, ha mostrato la comparsadi una reattività anti-c33c isolata nel 27% dei campioni, o accompagnata con reattivitàdiretta verso altri antigeni nel 18 o/o dei campioni. Laddove già presente in forma dubbia(1±), la reattività verso l'antigene c33c si è potenziata da 3+ a 4+ nel 100% dei casiLa comparsa di reattività verso altri antigeni è stata rispettivamente dell'ordine del20o/o per l'anti-ciOOp e del14o/o per l'anti-NSSConclusioniDall'analisi dei dati globaJi, fomiti dai Centri partecipanti, si evidenzia che la 3agenerazione dei test ELISA HCV Ab ha dimostrato uno spiccato aumento della sensibilitàcon conseguente diminuzione della specificità. Da11a parametrazione con i dati precedentisi evidenzia che a1 rilevante aumento percentuale delle reattività ripetute, sia nellapopolazione di "Donatori Conosciuti", che in quella di "Nuovi Donatori",l'immunoblotting di 3a generazione fa corrispondere nei "Donatori Conosciuti" unarilevante diminuzione dei positivi e degli indeterminati con marcato aumento dei negativiRisultati sovrapponibili, specie per i negativi e gli indetenn_inati si hanno anche dallavalutazione dei campioni appartenenti alla popolazione di "Nuovi Donatori".

' l217Questa caduta della percentuale degli indeterminati, confermata nettamente anchedall'analisi dei risultati ottenuti col RIBA~3 sui 74 campioni testati precedentemente conil RIBA-2, dimostra umi migliorata, indubbia, precisione conclusiva dell'immunoblottingdi 3a generazione.3,5Figura 1HCV-RR: PREVAI.ENZE (%)IN DONATORI CONOSCJlm3 DISTAI BUllONE NELLE DIVERSE AREE GEOGRAfiCHE \'2,52 ----·---- CJm'll'IW1,520181614121086Agura 2HCV-RR: PREVALENZA.(%) NEI NUOVI DONATORIDISTAIBU210NE NELLE DIVERSE AREE GEOGRAfiCHE

218Tavola 1Tavola 2

219HCV-RR: COMJ ARAZIONE PREVALENZE (%)ANNI 1993-1994l l lDONATORI CONOSCIUTI NUOVI DONATORI(I!J!JJ- 465.8!}6 / l!J!H •116.1!}4) (1993 •161.187/ l!J!H .. 22.831)ANNO UOIIIII DONNE TOTALE OII!NI DONNE TOTALE1993 0,21 0,23 0,19 1,08 1,3-- -1,05----.-1994 0,42 0,35 0,4 14r 1,45 1,41-'Tavola 3Tavola 4

.,..,.220Tavola 5{

}221VALUTAZIONE ESTERNA DI QUALITA' DEI SAGGI DI SCREENING ANTI­HCV NEI SERVIZI TRASFUSIONAU (S.T.) ITALIANL RISULTATIRELATIVI AL TRIENNIO 1992/94.Maria Orlando*, Alessandra Barca•, Flavia Chiaretti**, Giuseppina Ruggia*, GiuseppePizzocolo***Laboratori di Biochimica Clinica• e Fisiopatologia di Organo e Sistema** - IstitutoSuperiore di Sanità • Viale Regina Elena, 299 - 00161 Roma.••• Università degli Studi di Brescia, Cattedra di Chimica Clinica - Piazza Spedali Civili-25100 Brescia.Nel quadro delle attività promosse in Italia per la lotta all'AIDS, nel 1988 laCommissione Nazionale AIDS ha proposto l'organizzazione di un programma nazionaledi valutazione esterna di qualità dei saggi per la ricerca degli anticorpi diretti contro ilvirus dell'immunodeficienza (HIV) eseguiti presso i Servizi Trasfusionali (S. T.) Italiani.Più recentemente (1992), il programma è stato esteso ai saggi per la ricerca dell'antigenedi superficie del virus dell'epatite B (HBsAg) e degli anticorpi diretti contro il virusdell'epatite C (HCV).Scopo del progranuna è di:- misurare la capacità dei S. T. nell'eseguire correttamente i saggi di screening effettuatiobbligatoriamente sulle unità di sangue donato;- paragonare i risultati ottenuti con reagenti diversi ed in condizioni routinarie neidiversi S. T.;- fornire ai S. T. un metodo di autovalutazione delle proprie prestazioni e di controllodell'efficacia dei programmi adottati per garantire la qualità globale del laboratorio.Il monitoraggio dei saggi di screening obbligatori da parte dell'Autorità Sanitariaconsente altresì di mantenere sotto controllo le prestazioni dei S. T., e quindi la qualitàdel sangue trasfuso sull'intero tenitorio nazionale.

222Materiali e metodiL'organizzazione e l'esecuzione del programma sono state affidate all'IstitutoSuperiore di Sanità (ISS); collaborano al programma la Cattedra di Chimica ClinicadeWUniversità di Brescia ed il Servizio di Immunoematologia e Trasfusione delPoliclinico di Milano che, insieme ali'ISS, fungono da Laboratori di riferimento nei quali icampioni vengono analizzati e caratterizzati prima della spedizione.La partecipazione al programma è volontaria e gratuita; è garantita la confidenzialità deirisultatiIl modello operativo dello schema prevede l'invio quadrimestrale di pannelli di sieri,a diversa reattività o negativi, opportunamente codi~cati.Il materiale distribuito per la determinazione degli anticorpi anti-HCV è costituitoda pannelli di sieri umani liquidi ottenuti da "pool" di donatori di sangue negativi o dasingoli pazienti positivi. l campioni positivi presentano differente reattività nei confrontidei diversi determinanti antigenici: in particolare, sono stati scelti campioni positivi pergli anticorpi diretti contro gli antigeni C22, C33, sia isolati che combinati tra loro o conanticorpi diretti contro altri antigeni virali (C 100, 5.1.1, NS5).Ai campioni vengono aggiunti come conservanti mertiolato di sodio e solfato dineomicina (0.01 glmL). l campioni vengono congelati a ·30°C e mantenuti a taletemperatura fino alla loro distribuzione ai S.T., che avviene entro 30 giorni dallapreparazione.I saggi di stabilità sono eseguiti dai Laboratori di riferimento.l S. T. devono effettuare il saggio entro 20 giorni dal ricevimento ed inviare i risultatiottenuti, riportando li su opportuni modelli, all'ISS che li analizza. In tempi brevi (entro15 giorni dalla chiusura del saggio) i S. T. partecipanti ricevono la decodifica deicampioni con i risultati attesi.Successivamente i dati vengono elaborati mediante Package BMDP, caricatoneU'elaboratore centrale Siemens 7·890 del servizio Elaborazione Dati deU'lSS, e vienepreparato un rapporto contenente:l) l'analisi della prestazione per singolo S. T.;

)..2232) la sintesi dei risultati ottenuti per ogni campione in tutti i S. T.Risultati e conclusioniI risultati qui riportati si riferiscono ai tre anni di effettuazione del programma (I 992194).PartecipazioneI S. T. partecipanti sono passati da 263 nel 1992 a 275 nel 1994; anche la percentuale dirisposte inviate è aumentata raggiungendo nel 1994 il 96% circa dei S. T. partecipanti(Fig. 1 ). ciò testimonia una crescita culturale riguardo al problema della sicurezza nelletrasfusioni ed evidenzia un maggiore interesse per i programmi di controllo di qualità.Uso dei kitI kit utilizzati sono rimasti essenzialmente invariati negli anni J992w93; nel 1994 ikit di seconda generazione sono stati in gran parte sostituiti da queUi di terzagenerazione. La maggior parte dei S. T. utilizza lo stesso kit per il test di screening e perl'eventuale ripetizione ma nel corso degli anni sono aumentati i S. T. che eseguono le dueanalisi con kit diversi (Fig. 2).AccuratqzpPer quanto riguarda la capacitè di identificare correttamente i campioni lapercentuale di successo è stata elevata per i campioni negativi (circa ~lo) senza grandidifferenze nei tre anni; per i campioni positivi. nei tre anni di esecuzione del programma,si è passati dal 97"/o di corretta identificazione nel 1992 al 99.3% nel 1994. La maggiorparte dei campioni non identificati come positivi sono stati classificati come indetenninatimentre è minore la percentuale di falsi negativi (Fig. 3).La ripetitività dei saggi, misurata daJ confronto dei risultati ottenuti nello screeninge nella ripetizione indipendentemente dalla concordanza del risultato ottenuto con quelloatteso, è passata dal 77.3% nel 1992 all'81.2% nel 1994 - per questi campioni, peraltro,risulta elevata anche l'accuratezza (Fig. 4).

224RiproducibilitàNel 1994 un campione (C22/C33) è stato inviato in duplicato sotto due codicidiversi per valutare la riproducibilità within assay. La percentuale di riproducibilitàottenuta è elevata (99.2%).Analisi degli erroriIn tabella l viene riportata la distribuzione degli errori riscontrati nel corso dei treanni. Oltre ad errori della fase analitica propriamente detta, sono stati riscontrati errorianche nella fase post-analitica. Si osservano, infatti, numerosi errori di trascrizione deidati; in molti casi non vengono rispettati le formule per il calcolo del cut-off e i criteri divalidità del saggio (limiti dei valori di D. O. per i controlli) per i quali il kit ha ricevutol'autorizzazione al commercio.Tabella l.ANTI-HCVDistribuzione numerica degli erroriTIPO DI ERRORE 1992 1993 1994Classificazione 46 20 28Coerenza 54 70 8Calcolo Cut-Off 100 88 182Formula Cut-Off 90 91 83Validità del saggio 71 71 32Metodi non EIA 13 10 9Trascrizione 39 47 134l

)225N.400-S.T.O PartecipantiO Rispondenti3002001-263. - 239.··•••·····• 91%)268......... 245 91.4%)275 263........ < ·_._.·.95.6%)..... ·:. ....1001-199219931994Figura lPARTECIPAZIONE DEI S. T.AL PROGRAMMA DI V.N.E.Q.

226l AltriB:lORGANON • UID HCV EIA EJoRTHO. HCV l. Gen.OoRTHO • HCV 3. Gcn.• 0ABBOTT • HCV l.Gen. i':lABBOTT • HCV J.Gen.•• In commercio dal 1994S. T. che usano lo stesso kit per screening e ripetizione1994 = 76.1%- 1993 = 77.1%- 1992 = 85.8%Figura 2ANTI-HCVDistribuzione dei kit(

l227100 ~......- ,---"'o "·~-~-~ 75~:loc:·~o .. 50 c.~Q,="u25'

)Direttore dell'Istituto Superiore di Sanitàe Responsabile scientifico: Giuseppe VicariDirettore responsabile: Vi/ma AlberaniStampato dal Servizio per le auivilà editorialidell'Istituto Superiore di Sanità, Viale Regina Elena, 299- 00/61 ROMALa riproduzione parziale o totale dei Rapporti c Congressi ISTISANdeve essere preventivamente autorizzata.Reg. S1ampa ·Tribunale di Roma n. 131188 del / 0 marzo 1988Roma. mano 1995 (n. l)

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