Le «macchie brune» del nocciolo nel Viterbese - Atlas Plant ...

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icerca Fruttiferi
Le «macchie brune» del nocciolo
nel Viterbese: indagine
sulla microflora batterica
non anaerobica associata
Marco Scortichini* - Paola Di Prospero - Maria Pia Rossi
RIASSUNTO
Nel corso di sopralluoghi effettuati nel periodo
1999-2001 in aziende corilicole situate nei colli
Cimini (VT), è stato possibile osservare il fenomeno
delle “macchie brune” a carico del tronco e
delle branche principali. Mensilmente sono stati
effettuati prelievi dai tessuti interessati dall’alterazione
al fine di isolare, possibilmente identificare
la microflora batterica non strettamente anaerobica
e verificarne l’eventuale ruolo patogenetico.
Pantoea agglomerans è stata la specie maggiormente
rinvenuta durante tutte le stagioni.
Bacillus sp. è stato rinvenuto frequentemente associato
agli essudati acquosi fuoriuscenti dalle
“macchie brune” in primavera. Altre due specie
rinvenute occasionalmente, non sono state identificate.
Tutte le tipologie batteriche ottenute sembrano
non rivestire alcun ruolo patogenetico e
due anni dopo la comparsa delle “macchie brune”,
le piante hanno cicatrizzato i tessuti interessati
dall’alterazione. Le piante colpite non sono
mai avvizzite nei tre anni di osservazioni. Questo
studio conferma quanto osservato in precedenza
in Piemonte circa la natura abiotica del fenomeno.
PAROLE CHIAVE:
Nocciola, fattori abiotici, patogenicità, Pantoea,
Bacillus.
SUMMARY
The “brown spot” of hazelnut: investigation on the
non anaerobic bacterial microflora.
During surveys carried out on 1999-2001 in the
province of Viterbo (Latium, central Italy), it has
been possible to observe the so called “brown
spots” along the branches and trunk of hazelnut
trees. In order to isolate, possibly identify and to
ascertain the pathogenic role of non anaerobic
bacterial microflora, samples from symptomatic
trees were taken monthly. Pantoea agglomerans
was the species more frequently recovered in all
seasons. In addition, Bacillus sp. was frequently
Istituto Sperimentale per la Frutticoltura,
Roma
* L’autore è nei ruoli dell’Istituto Sperimentale
per la Patologia Vegetale di Roma,
temporaneamente distaccato presso l’ISF
found associated with bacterial exudates oozing
out the spots during spring. Two other species occasionally
found, have not been identified. However,
all isolates representing all the non anaerobic
bacterial microflora associated with the
“brown spots” do not show pathogenicity. Moreover,
two years after the appearance of “brown
spots”, most of the trees healed the tissues. All
tree showing this syndrome resulted alive over
the three years. This study confirms previous investigations
carried out in Piedmont pointing out
the “brown spots” as an abiotic syndrome.
KEY WORDS:
Hazelnut, abiotic factors, pathogenicity, Pantoea,
Bacillus.
Introduzione
L’alterazione del nocciolo (Corylus
avellana L.) denominata “macchie
brune”, fu segnalata per la prima
volta in Piemonte nel 1971 (Pesante,
1973). Negli anni successivi, il fenomeno
si estese (Gianetti et al., 1983)
e, in annate particolari, come quelle
dei primi anni ottanta e nel 1991, fu
riscontrata su numerosi ettari del
comprensorio corilicolo delle Langhe
(Scapin et al., 1994). La cultivar
maggiormente interessata dall’alterazione
fu la Tonda Gentile delle Langhe.
Durante i sopralluoghi effettuati
nel corso degli ultimi anni al fine di
verificare l’estensione della “moria”
del nocciolo causata da Pseudomonas
avellanae (Psallidas) Janse et al.
(Scortichini et al., 2002), sono stati
notati, in provincia di Viterbo, sulle
cultivar Tonda Gentile Romana e
Nocchione, sintomi simili a quelli
descritti per le “macchie brune” in
Piemonte.
Le alterazioni interessano prevalentemente
le branche principali e/o
il tronco. Ad uno stadio iniziale, le
“macchie brune” si rendono evidenti
come piccole aree superficiali di colore
bruno scuro interessanti il tessuto
corticale. Successivamente, le
macchie ingrandiscono ed assumono
una forma tendenzialmente circolare,
dal diametro variabile tra i 2-3 e i 7-
8 cm. In alcuni casi, le macchie possono
confluire interessando porzioni
ampie della corteccia. Soprattutto in
primavera, ma talvolta anche in estate
e in autunno, si assiste alla fuoriuscita
di essudati acquosi. Asportando
la corteccia, si evidenziano imbrunimenti
dei tessuti sottostanti che, solitamente,
interessano aree sottocorticali
più estese di quelle evidenziate
dalle macchie. L’anno successivo, la
corteccia inizia a screpolarsi, diminuisce
l’emissione di essudato, e,
nella maggior parte dei casi, dopo 1-
2 anni, la pianta finisce col rimarginare
l’area. In tutto il periodo che va
dalla comparsa delle macchie alla cicatrizzazione,
generalmente, la parte
aerea non manifesta sindromi patologiche
evidenti (avvizzimenti fogliari
o dei rami). Ad un esame superficiale,
il fenomeno delle “macchie brune”
può essere confuso con la “moria”
da P. avellanae.
Al fine di verificare se la microflora
batterica non strettamente anaero-
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bica fosse responsabile delle “macchie
brune” del nocciolo, sono stati
effettuati studi volti ad isolare, identificare
e chiarire l’eventuale ruolo
patogenico delle specie batteriche aerobiche
o facoltativamente anaerobiche
associate. Il presente lavoro ne
riassume i risultati.
Materiali e metodi
Isolamenti
Dall’autunno 1999 alla primavera
2001, porzioni di tessuto corticale e
sottocorticale ottenute dai margini
delle macchie, sono state prelevate in
modo sterile, mensilmente, da alberi
di nocciolo in piena produzione delle
cultivar Tonda Gentile Romana e
Nocchione, situati nei comuni di Capranica
e Vetralla (VT), mostranti i
sintomi iniziali dell’alterazione sopra
descritta. Frammenti di tessuto sono
stati macerati in mortai sterili contenenti
alcuni ml di soluzione fisiologica
(0,85% di NaCl in acqua distillata)
sterile (SFS). Sono state allestite anche
diluizioni decimali in tubo. Dopo
alcuni minuti, aliquote di 0,1 ml delle
sospensioni sono state piastrate sui
seguenti substrati: agar nutritivo
(NA), agar nutritivo aggiunto del 5%
di saccarosio (ANS) e substrato B di
King et al. (KB). Le piastre venivano
incubate a 25-27 °C per 2-4 giorni.
Ad ogni isolamento venivano prelevate
le colonie rappresentative di tutti
i tipi morfologici individuati. Le
colonie venivano strisciate in purezza
su AN per effettuare i successivi saggi.
Saggi biochimici e nutrizionali
Con gli isolati batterici ritenuti
rappresentativi dei vari isolamenti,
sono stati effettuati saggi biochimici
e nutrizionali di cui alla tabella 1,
volti alla loro identificazione secondo
le metodologie descritte da Lelliott
e Stead (1987).
Confronto dei profili proteici
Al fine di confermare l’identità
delle specie batteriche più frequentemente
riscontrate, sono state estratte
le proteine solubili totali degli isolati.
Dopo corsa elettroforetica mono-
Tab. 1 - Saggi biochimici e nutrizionali effettuati con gli isolati delle diverse tipologie
(A,B,C e D), ottenuti dalle “macchie brune” del nocciolo nel Viterbese.
A B C D
Reazione di Gram - + - -
Presenza di ossidasi - - - +
Presenza di catalasi + + + +
Ipersensibilità in tabacco - - - -
Marciume della patata - - - -
Pigmenti gialli su AN + - -
Pigmenti aranciati su AN - - - +
Riduzione dei nitr + + - -
Idrolisi dell’amido - + + -
Liquefazione della gelatina + + - -
Tolleranza al 7% di NaCl - + - -
Crescita a 37°C + + - -
Sopravvivenza a 80°C - + - -
Utilizzazione di:- citrato + + + -
- malonato + + - -
Produzione di acidità da:- glicerolo - + + +
- cellobiosio + + + -
- maltosio + + - -
- melibiosio - - - -
- salicina
AN: agar nutritivo.
- - - -
Fruttiferi
dimensionale (SDS-PAGE), i profili
sono stati confrontati con quelli di alcuni
ceppi di riferimento di Pantoea
agglomerans (Beijerinck) Gavini et
al. (Sinonimi: Erwinia herbicola
(Lohins) Dye; Enterobacter agglomerans
(Beijerinck) Ewing e Fife)
PD 525, Pectobacterium carotovorum
subsp carotovorum (Jones) Hauben
et al. (sinonimo: Erwinia carotovora
subsp. carotovora (Jones) Bergey
et al.) PD 1769, Brenneria nigrifluens
(Wilson et al.) Hauben et al.
(Sinonimo: Erwinia nigrifluens, Wilson
et al.) PD 968 e Bacillus subtilis
(Ehrenberg) Cohn NCPPB 1246.
Prove di patogenicità
Al fine di verificare l’eventuale patogenicità
degli isolati di ognuna delle
quattro tipologie, sono state effettuate
inoculazioni artificiali su piante
di nocciolo cv. Tonda Gentile Romana
e Nocchione di 4 anni, allevate in
vaso. A tale scopo, le colture batteriche
(tre isolati per ogni tipologia),
accresciutesi per 48 ore su AN, sono
state sospese in SFS fino a raggiungere
una concentrazione corrispondente
a 1-2 x 10 7 u.f.c./ml. Sono state
adottate due tecniche di inoculazione.
In un caso, con un bisturi sterile
sono state praticate ferite longitudinali
di circa 1 cm lungo la parte basale
del tronco e immediatamente dopo,
sono state deposte su di esse alcune
gocce della sospensione batterica;
nel secondo, con il bisturi sterile
sono stati sollevati di alcuni millimetri
i tessuti corticali e gocce della sospensione
sono state deposte al disotto
del taglio. Per ogni isolato sono
state inoculate quattro piante per cultivar.
Piante controllo sono state inoculate
seguendo le stesse modalità
con sola SFS. I reisolamenti sono stati
effettuati a partire da sei mesi dopo
l’inoculazione con le modalità descritte
in precedenza.
Risultati
Isolamenti
Colonie batteriche sono state isolate
in tutti i mesi dell’anno su AN,
ANS e KB, tuttavia, non sono mai
state rinvenute colonie fluorescenti
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a b
c d
Fig. 1 - Evoluzione delle “macchie brune” sul tronco di nocciolo. (Le foto si riferiscono ad
uno stesso albero.) a) Comparsa delle “macchie brune” a fine estate-autunno. b)
Fuoriuscita di essudati acquosi nella primavera successiva. c) In autunno, inizio della
cicatrizzazione dei tessuti interessati dall’alterazione. d) Due anni dopo la comparsa dei
primi sintomi, l’albero ha completamente cicatrizzato l’area interessata.
su KB. Colonie circolari, a margine
intero, di colore giallo chiaro su AN
(tipologia A), sono risultate quelle
rinvenute con maggiore frequenza,
soprattutto come numerosità nelle
singole piastre di isolamento. Colonie
di questa tipologia sono state ottenute
ad ogni isolamento. Soprattutto
nei mesi primaverili (aprile-giugno),
sono state rinvenute anche co-
lonie di colore bianco-crema su AN
(tipologia B), non elevate, a margine
ondulato e irregolare. Inoltre, sono
state ottenute colonie circolari, di
colore bianco crema, a margine intero
su AN (tipologia C) nonché colonie
di colore giallo intenso e aranciato,
circolari, a margine intero su AN
(tipologia D). Queste ultime due tipologie,
sono state rinvenute occasionalmente
nel corso degli isolamenti
effettuati. Ad ogni isolamento,
colonie rappresentative delle morfologie
osservate sono state selezionate
e conservate in purezza per l’effettuazione
dei saggi biochimici e le
prove di patogenicità. Per ogni tipologia
sono stati prescelti cinque isolati.
Saggi biochimici e nutrizionali
I risultati dei saggi biochimici e
nutrizionali per le tipologie delle colonie
batteriche rinvenute, sono riportati
in tabella 1. Gli isolati della
tipologia A hanno mostrato notevole
similitudine con P. agglomerans
mentre quelli appartenenti alla tipologia
B sono da ritenere appartenenti
al gruppo di Bacillus spp. Di incerta
collocazione sono gli isolati
delle tipologie C e D e la loro identificazione
necessita di ulteriori saggi.
Confronto dei profili proteici
Il confronto dei profili proteici, effettuato
dopo corsa elettroforetica
monodimensionale, ha evidenziato
una notevole similarità tra P. agglomerans
PD 525 e gli isolati appartenenti
alla tipologia A e tra B. subtilis
e gli isolati della tipologia B. Le altre
tipologie batteriche, si discostavano
notevolmente dai profili di P. agglomerans,
P. carotovorum, B. nigrifluens
e B. subtilis. Sulla base dei
saggi biochimici e nutrizionali nonché
dal confronto dei profili proteici,
si ha motivo di ritenere che gli isolati
della tipologia A appartengano a
Pantoea agglomerans mentre quelli
della tipologia B a Bacillus sp. Per
gli isolati delle tipologie C e D sono
in corso ulteriori saggi identificativi
al fine di arrivare ad una corretta
identificazione.
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Prove di patogenicità
Nessuno degli isolati appartenenti
alle quattro tipologie ha riprodotto,
anche parzialmente, sintomi assimilabili
alle “macchie brune”. Infatti,
anche dopo sei mesi dalle inoculazioni
non sono mai stati osservati sintomi
apprezzabili né presenza di essudati
e/o progressione di infezioni. Si
esclude, pertanto, il coinvolgimento
diretto degli isolati oggetto del presente
studio alle “macchie brune”.
Conclusioni
Le indagini effettuate hanno consentito
di accertare una frequente associazione
di alcune specie batteriche
aerobiche o facoltativamente
anaerobiche al fenomeno delle “macchie
brune” del nocciolo nel Viterbese.
Anche in Piemonte, Gianetti et al.
(1983) trovarono “ripetutamente, in
stagioni diverse”, due specie batteriche
bastoncellari, Gram-negative associate
ai tessuti legnosi interessati
dal fenomeno, anche se studi successivi
consentirono di escludere la responsabilità
di agenti patogeni nel fenomeno
delle “macchie brune” in
Piemonte (Scapin et al., 1994). P. agglomerans
è risultata la specie maggiormente
presente sia durante la stagione
vegetativa sia durante il riposo
invernale. Tuttavia, il suo ruolo patogenetico
è risultato nullo. Questa
specie si trova frequentemente associata
ai tessuti vegetali (Coplin e Kado,
2001). In Italia, è stata rinvenuta
in tessuti legnosi di cerri (Quercus
cerris L.) deperienti dell’Italia centrale
(Scortichini et al., 1993). Alcuni
ceppi di P. agglomerans, inoltre,
sono utilizzati nella lotta biologica
contro Erwinia amylovora (Burrill)
Winslow et al. Bacillus spp. sono altri
colonizzatori delle “macchie brune”
nel Viterbese, sia pure in minor
misura della specie precedente. Anche
in questo caso esse non rivestono
un ruolo patogenetico primario. È interessante
far notare che B. cereus fu
isolato in primavera da essudati fuoriuscenti
da alberi di cerro deperienti
(Scortichini e Stead, 1993). Alcuni
isolati rimangono da identificare a livello
di specie e, al pari delle altre,
non sembrano essere responsabili
delle “macchie brune”. Lo studio effettuato
ha anche consentito di escludere
la presenza di pseudomonadi
fluorescenti fitopatogene associate
alle “macchie brune” del nocciolo.
Infatti, non sono mai stati isolati né P.
avellanae né P. syringae pv. syringae
van Hall. Studi per verificare l’eventuale
presenza di specie batteriche
strettamente anaerobiche associate
alle “macchie brune” verranno intrapresi
in futuro.
Per quanto riguarda l’insorgenza
delle “macchie brune” del nocciolo,
il presente studio conferma gli studi e
le ipotesi avanzate da Gianetti et al.
(1983) e Scapin et al. (1994) sul ruolo
dei fattori abiotici quali fattori predisponenti
l’alterazione. Nelle aree
del Viterbese oggetto dello studio,
sono frequenti gelate primaverili
nonché periodi siccitosi estivi, a volte
molto prolungati che potrebbero
interferire con il metabolismo dell’albero.
È stato, infatti, osservato
nelle Langhe (Scapin et al., 1994) e
in alcune aree del Viterbese che le
“macchie brune” non compaiono negli
impianti che praticano l’irrigazione.
Una simile osservazione è stata
fatta anche per le “macchie brune”
del pioppo (Anselmi, 1979). Potrebbe,
quindi, esistere uno stretto legame
tra annate particolarmente asciutte
ed insorgenza del fenomeno. Anche
uno stato di sofferenza dell’albero
legato a svariate cause (distanza
d’impianto ridotta, suolo compatto,
notevole età della pianta) può rendere
l’alterazione più estesa (Scapin et
al., 1994). Nei casi da noi osservati,
in effetti, è stato interessante rilevare
come, alla rimozione di alcune piante
limitrofe, le “macchie brune” siano
state circoscritte dall’albero che, in
circa due anni, ha cicatrizzato completamente
la parte interessata dall’alterazione.
In precedenza (Aloj et al., 1987), i
sintomi peculiari delle “macchie brune”
sono stati descritti e menzionati
tra quelli caratterizzanti la “moria”
del nocciolo nel Viterbese. Tuttavia,
negli alberi colpiti da “moria” si possono
osservare cancri longitudinali e
aree corticali più o meno depresse
causati da P. avellanae. Inoltre, le
Fruttiferi
piante colpite dal cancro batterico
muoiono o avvizziscono parzialmente
mentre gli alberi mostranti solo
“macchie brune” continuano a vegetare
e produrre. È evidente che si tratta
di due quadri sintomatologici ben
distinti a cui sono associate microflore
batteriche diverse.
Ringraziamenti
Lavoro svolto nell’ambito di una borsa di studio del
Consiglio Nazionale delle Ricerche-Comitato Scienze
Agrarie 201.0635/21.06.15: “Le batteriosi del noce
e del nocciolo”.
LAVORI CITATI
Aloj B., Bartoletti F., Caporossi V., D’Errico
F.P., Di Dato F., Grande C., Olmi M., Paparatti
B., Tombesi A., Varvaro L. (1987) -
Una “moria” del nocciolo di natura ignota
nel Viterbese. L’Informatore Agrario, 43
(26), 55-57.
Anselmi N., Govi G. (1996) - Patologia del legname.
Edagricole, Bologna, pp. 397.
Coplin D.L., Kado C. (2001) - Pantoea. In:
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N.W., Jones J.B., Chun W. Eds., pp. 73-83.
Gianetti G., Mancini G., Scapin I., Gullino G.,
Vietto L. (1983) - Indagine sulla diffusione
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