Κεφάλαιο 28.pdf

© ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΑΚΕΣ ΕΚΔΟΣΕΙΣ ΚΡΗΤΗΣ ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑΤΙΚΟ ΥΛΙΚΟ ΓΙΑ ΤΟ ΧΗΜΙΚΟ ΤΜΗΜΑ ΤΟΥ ΠΑΝ/ΜΙΟΥ ΑΘΗΝΩΝσθήκη RNA πολυμεράσης για να χρησιμεύσει ως μάρτυρας. Τα θραύσματατου DNA που προκύπτουν διαχωρίζονται σύμφωνα με το μέγεθός τους με ηλεκτροφόρηση.Το πρότυπο ηλεκτροφόρησης είναι εξαιρετικά αποκαλυπτικό:μια σειρά από ζώνες που εμφανίζονται στο δείγμα του μάρτυρα δεν υπάρχουνστο δείγμα το οποίο περιέχει την RNA πολυμεράση. Οι ζώνες αυτές δεν υπάρχουνδιότι η RNA πολυμεράση προστατεύει το DNA από σχάσεις, από τιςοποίες θα προέκυπταν τα αντίστοιχα θραύσματα.Ένα εντυπωσιακό σχήμα είναι επίσης προφανές όταν συγκρίνονται οι αλληλουχίεςπολλών προκαρυωτικών προαγωγέων. Δύο κοινά μοτίβα παρουσιάζονταιπρος την 5΄-πλευρά της θέσης έναρξης (ανοδικά του μηνύματος). Είναι γνωστάως η αλληλουχία –10 και η αλληλουχία –35, διότι είναι συμμετρικά τοποθετημένεςπερίπου 10 και 35 νουκλεοτίδια ανοδικά από τη θέση έναρξης. Η κάθεμία από τις αλληλουχίες αυτές έχει μήκος 6 bp. Οι ομόφωνες (κατά μέσονόρο) αλληλουχίες τους, οι οποίες προέκυψαν από την ανάλυση πολλών προαγωγέων(Eικόνα 28.4), είναι:–35–105' TTGACATATAAT+1£¤ÛˤӷÚ͢Το πρώτο νουκλεοτίδιο (η θέση έναρξης) μιας μεταγραφόμενης αλληλουχίαςDNA σημειώνεται ως +1 και το δεύτερο ως +2. Το νουκλεοτίδιο πουπροηγείται της θέσης έναρξης σημειώνεται ως –1. Οι συμβολισμοί αυτοί αναφέρονταιστον κωδικεύοντα κλώνο του DNA. Υπενθυμίζεται ότι η αλληλουχίατου κλώνου-εκμαγείου του DNA είναι συμπληρωματική της αλληλουχίας τουμεταγραφήματος RNA (βλ. Eικόνα 5.26). Αντιθέτως, ο κωδικεύων κλώνος τουDNA έχει την ίδια αλληλουχία με εκείνη του μεταγραφήματος RNA, με τηδιαφορά ότι έχει θυμίνη (Τ) στη θέση της ουρακίλης (U). Ο κωδικεύων κλώνοςείναι επίσης γνωστός ως ο νοηματικός (+) κλώνος και ο κλώνος του εκμαγείουως ο αντινοηματικός (–) κλώνος.Οι προαγωγείς διαφέρουν σημαντικά ως προς τη δραστικότητά τους. Γονίδιαμε ισχυρούς προαγωγείς μεταγράφονται πολύ συχνά – κάθε δύο δευτερόλεπταστην E. coli. Αντιθέτως, γονίδια με πολύ ασθενείς προαγωγείς μεταγράφονταιπερίπου μία φορά κάθε 10 λεπτά. Οι περιοχές –10 και –35 των περισσότερωνισχυρών προαγωγέων έχουν αλληλουχίες που αντιστοιχούν αρκετάστις ομόφωνες αλληλουχίες, ενώ οι ασθενείς προαγωγείς τείνουν να φέρουνπολλές αντικαταστάσεις βάσεων στις θέσεις αυτές. Πράγματι, η μετάλλαξηακόμη και μίας βάσης είτε στην –10 είτε στην –35 αλληλουχία μπορείνα μειώσει τη δραστικότητα του προαγωγέα. Η απόσταση μεταξύ των συντηρημένωναυτών αλληλουχιών είναι επίσης σημαντική. Ένας διαχωρισμός τουςσε έκταση 17 νουκλεοτιδίων είναι ο βέλτιστος. Επομένως, η αποτελεσματικότηταή η ισχύς μιας αλληλουχίας προαγωγέων χρησιμεύει στη ρύθμιση της μεταγραφής.Ρυθμιστικές πρωτεΐνες οι οποίες δεσμεύονται σε ειδικές αλληλουχίεςκοντά σε θέσεις προαγωγέων και οι οποίες αλληλεπιδρούν με την RNA πολυμεράση(Κεφάλαιο 31) επηρεάζουν επίσης σημαντικά τη συχνότητα μεταγραφήςπολλών γονιδίων.(A)(B)(°)(¢)(E)883RNA πολυμεράσηH ÌÂÙ·ÁÚ·Ê‹·Ú¯›˙ÂÈ Â‰Ò5' –103'C G T A T G T T G T G T G G AGCT A T G G T T A T T T C AGTT A A C T A G T A C G C AGTG A T A C T G A G C A C AGTT T T C A T G C C T C C AT A T A A TEIKONA 28.4 Προκαρυωτικές αλληλουχίεςπροαγωγέων. Η σύγκριση πέντε αλληλουχιώναπό προκαρυωτικούς προαγωγείς αποκαλύπτει μιαεπανεμφανιζόμενη αλληλουχία ΤΑΤΑΑΤ με κέντροτη θέση –10. Η ομόφωνη αλληλουχία της θέσης–10 (κόκκινη) καθορίστηκε από έναν μεγάλοαριθμό αλληλουχιών προαγωγέων. Οι αλληλουχίεςτης εικόνας αυτής προέρχονται από τα οπερόνια(Α) lac, (Β) gal, (Γ) trp της E. coli, (Δ) τον φάγολ και (Ε) τον φάγο φΧ174.28.1.2 Oι υπομονάδες σ της RNA πολυμεράσης αναγνωρίζουν θέσειςπροαγωγέωνΟ πυρήνας α 2 ββ΄ της RNA πολυμεράσης δεν μπορεί να αρχίσει μόνος του τημεταγραφή σε θέσεις προαγωγέων. Αντιθέτως, το πλήρες ολοένζυμο α 2 ββ΄σ είναιαπαραίτητο για την έναρξη της μεταγραφής στη σωστή θέση. Η υπομονάδασ συμβάλλει στην ειδική έναρξη με δύο τρόπους. Πρώτον, μειώνει τη χημικήσυγγένεια της RNA πολυμεράσης για άλλες τυχαίες θέσεις στο DNA κατά ένανπαράγοντα 10 4 . Απουσία της υπομονάδας σ, ο πυρήνας του ενζύμου δεσμεύεται