Κεφάλαιο 28.pdf

© ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΑΚΕΣ ΕΚΔΟΣΕΙΣ ΚΡΗΤΗΣ ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑΤΙΚΟ ΥΛΙΚΟ ΓΙΑ ΤΟ ΧΗΜΙΚΟ ΤΜΗΜΑ ΤΟΥ ΠΑΝ/ΜΙΟΥ ΑΘΗΝΩΝσθήκη RNA πολυμεράσης για να χρησιμεύσει ως μάρτυρας. Τα θραύσματατου DNA που προκύπτουν διαχωρίζονται σύμφωνα με το μέγεθός τους με ηλεκτροφόρηση.Το πρότυπο ηλεκτροφόρησης είναι εξαιρετικά αποκαλυπτικό:μια σειρά από ζώνες που εμφανίζονται στο δείγμα του μάρτυρα δεν υπάρχουνστο δείγμα το οποίο περιέχει την RNA πολυμεράση. Οι ζώνες αυτές δεν υπάρχουνδιότι η RNA πολυμεράση προστατεύει το DNA από σχάσεις, από τιςοποίες θα προέκυπταν τα αντίστοιχα θραύσματα.Ένα εντυπωσιακό σχήμα είναι επίσης προφανές όταν συγκρίνονται οι αλληλουχίεςπολλών προκαρυωτικών προαγωγέων. Δύο κοινά μοτίβα παρουσιάζονταιπρος την 5΄-πλευρά της θέσης έναρξης (ανοδικά του μηνύματος). Είναι γνωστάως η αλληλουχία –10 και η αλληλουχία –35, διότι είναι συμμετρικά τοποθετημένεςπερίπου 10 και 35 νουκλεοτίδια ανοδικά από τη θέση έναρξης. Η κάθεμία από τις αλληλουχίες αυτές έχει μήκος 6 bp. Οι ομόφωνες (κατά μέσονόρο) αλληλουχίες τους, οι οποίες προέκυψαν από την ανάλυση πολλών προαγωγέων(Eικόνα 28.4), είναι:–35–105' TTGACATATAAT+1£¤ÛˤӷÚ͢Το πρώτο νουκλεοτίδιο (η θέση έναρξης) μιας μεταγραφόμενης αλληλουχίαςDNA σημειώνεται ως +1 και το δεύτερο ως +2. Το νουκλεοτίδιο πουπροηγείται της θέσης έναρξης σημειώνεται ως –1. Οι συμβολισμοί αυτοί αναφέρονταιστον κωδικεύοντα κλώνο του DNA. Υπενθυμίζεται ότι η αλληλουχίατου κλώνου-εκμαγείου του DNA είναι συμπληρωματική της αλληλουχίας τουμεταγραφήματος RNA (βλ. Eικόνα 5.26). Αντιθέτως, ο κωδικεύων κλώνος τουDNA έχει την ίδια αλληλουχία με εκείνη του μεταγραφήματος RNA, με τηδιαφορά ότι έχει θυμίνη (Τ) στη θέση της ουρακίλης (U). Ο κωδικεύων κλώνοςείναι επίσης γνωστός ως ο νοηματικός (+) κλώνος και ο κλώνος του εκμαγείουως ο αντινοηματικός (–) κλώνος.Οι προαγωγείς διαφέρουν σημαντικά ως προς τη δραστικότητά τους. Γονίδιαμε ισχυρούς προαγωγείς μεταγράφονται πολύ συχνά – κάθε δύο δευτερόλεπταστην E. coli. Αντιθέτως, γονίδια με πολύ ασθενείς προαγωγείς μεταγράφονταιπερίπου μία φορά κάθε 10 λεπτά. Οι περιοχές –10 και –35 των περισσότερωνισχυρών προαγωγέων έχουν αλληλουχίες που αντιστοιχούν αρκετάστις ομόφωνες αλληλουχίες, ενώ οι ασθενείς προαγωγείς τείνουν να φέρουνπολλές αντικαταστάσεις βάσεων στις θέσεις αυτές. Πράγματι, η μετάλλαξηακόμη και μίας βάσης είτε στην –10 είτε στην –35 αλληλουχία μπορείνα μειώσει τη δραστικότητα του προαγωγέα. Η απόσταση μεταξύ των συντηρημένωναυτών αλληλουχιών είναι επίσης σημαντική. Ένας διαχωρισμός τουςσε έκταση 17 νουκλεοτιδίων είναι ο βέλτιστος. Επομένως, η αποτελεσματικότηταή η ισχύς μιας αλληλουχίας προαγωγέων χρησιμεύει στη ρύθμιση της μεταγραφής.Ρυθμιστικές πρωτεΐνες οι οποίες δεσμεύονται σε ειδικές αλληλουχίεςκοντά σε θέσεις προαγωγέων και οι οποίες αλληλεπιδρούν με την RNA πολυμεράση(Κεφάλαιο 31) επηρεάζουν επίσης σημαντικά τη συχνότητα μεταγραφήςπολλών γονιδίων.(A)(B)(°)(¢)(E)883RNA πολυμεράσηH ÌÂÙ·ÁÚ·Ê‹·Ú¯›˙ÂÈ Â‰Ò5' –103'C G T A T G T T G T G T G G AGCT A T G G T T A T T T C AGTT A A C T A G T A C G C AGTG A T A C T G A G C A C AGTT T T C A T G C C T C C AT A T A A TEIKONA 28.4 Προκαρυωτικές αλληλουχίεςπροαγωγέων. Η σύγκριση πέντε αλληλουχιώναπό προκαρυωτικούς προαγωγείς αποκαλύπτει μιαεπανεμφανιζόμενη αλληλουχία ΤΑΤΑΑΤ με κέντροτη θέση –10. Η ομόφωνη αλληλουχία της θέσης–10 (κόκκινη) καθορίστηκε από έναν μεγάλοαριθμό αλληλουχιών προαγωγέων. Οι αλληλουχίεςτης εικόνας αυτής προέρχονται από τα οπερόνια(Α) lac, (Β) gal, (Γ) trp της E. coli, (Δ) τον φάγολ και (Ε) τον φάγο φΧ174.28.1.2 Oι υπομονάδες σ της RNA πολυμεράσης αναγνωρίζουν θέσειςπροαγωγέωνΟ πυρήνας α 2 ββ΄ της RNA πολυμεράσης δεν μπορεί να αρχίσει μόνος του τημεταγραφή σε θέσεις προαγωγέων. Αντιθέτως, το πλήρες ολοένζυμο α 2 ββ΄σ είναιαπαραίτητο για την έναρξη της μεταγραφής στη σωστή θέση. Η υπομονάδασ συμβάλλει στην ειδική έναρξη με δύο τρόπους. Πρώτον, μειώνει τη χημικήσυγγένεια της RNA πολυμεράσης για άλλες τυχαίες θέσεις στο DNA κατά ένανπαράγοντα 10 4 . Απουσία της υπομονάδας σ, ο πυρήνας του ενζύμου δεσμεύεται

© ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΑΚΕΣ ΕΚΔΟΣΕΙΣ ΚΡΗΤΗΣ ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑΤΙΚΟ ΥΛΙΚΟ ΓΙΑ ΤΟ ΧΗΜΙΚΟ ΤΜΗΜΑ ΤΟΥ ΠΑΝ/ΜΙΟΥ ΑΘΗΝΩΝκού δίκλωνου DNA που είχε εκτεθεί σε ποικίλες ποσότητες RNA πολυμεράσης.Η τοποϊσομεράση Ι, ένα ένζυμο που καταλύει τη συντονισμένη σχάσηκαι επανένωση του δίκλωνου DNA (Εδάφιο 27.3.3), προστέθηκε στη συνέχειαγια να χαλαρώσει το τμήμα του κυκλικού DNA που δεν βρισκόταν σε επαφήμε τα μόρια της πολυμεράσης. Τα δείγματα αυτά του DNA μετά την απομάκρυνσητης δεσμευμένης πρωτεΐνης αναλύθηκαν με ηλεκτροφόρηση σε πηκτή.Ο βαθμός της αρνητικής υπερσπείρωσης αυξήθηκε αναλογικά με τον αριθμότων μορίων της RNA πολυμεράσης που είναι δεσμευμένα ανά εκμαγείο DNA, γεγονόςπου δείχνει ότι το ένζυμο ξετυλίγει το DNA. Κάθε δεσμευμένο μόριο πολυμεράσηςξετυλίγει ένα τμήμα DNA 17 bp, το οποίο αντιστοιχεί σε 1,6 στροφές έλικας B-DNA (Eικόνα 28.7).Η αρνητική υπερσπείρωση του κυκλικού DNA ευνοεί τη μεταγραφή γονιδίωνδιότι διευκολύνει το ξετύλιγμα (Εδάφιο 27.3.2). Επομένως, η εισαγωγήαρνητικών υπερσπειραμάτων στο DNA από την τοποϊσομεράση ΙΙ μπορεί νααυξήσει την αποτελεσματικότητα προαγωγέων που βρίσκονται σε απομακρυσμένεςθέσεις. Ωστόσο, δεν διεγείρονται όλοι οι προαγωγείς από την αρνητικήυπερσπείρωση. Η θέση του προαγωγέα για την ίδια την τοποϊσομεράσηΙΙ αποτελεί μια αξιοσημείωτη εξαίρεση. Η αρνητική υπερσπείρωση μειώνειτην ταχύτητα μεταγραφής αυτού του γονιδίουØ πρόκειται για έναν κομψό μηχανισμόεπανατροφοδοτικού ελέγχου ο οποίος φροντίζει να μην προκαλείταιεκτεταμένη αρνητική υπερσπείρωση του DNA. H αρνητική υπερσπείρωσημπορεί να μειώσει την αποτελεσματικότητα αυτού του προαγωγέα αλλάζονταςτη δομική σχέση των περιοχών –10 και –35.Η μετάβαση από το σύμπλοκο του κλειστού προαγωγέα (στο οποίο το DNAείναι δίκλωνο) στο σύμπλοκο του ανοιχτού προαγωγέα (στο οποίο το DNA είναιξετυλιγμένο) αποτελεί ένα σημαντικό γεγονός για τη μεταγραφή. Το σκηνικόείναι τώρα έτοιμο για τον σχηματισμό του πρώτου φωσφοδιεστερικού δεσμούτης νέας αλυσίδας RNA.¢›ÎψÓÔ ÂÏÈÎÔÂȉ¤˜DNARNA appleÔÏ˘ÌÂÚ¿ÛË885RNA πολυμεράση•ÂÙ˘ÏÈÁ̤ÓÔ DNA(·ÓÔ›ÁÌ·ÙÔ˜ 17 bp)EIKONA 28.7 Ξετύλιγμα του DNA. Η RNA πολυμεράσηξετυλίγει 17 περίπου βάσεις του εκμαγείουDNA.28.1.4 Oι αλυσίδες του RNA σχηματίζονται de novo και αυξάνονταιπρος την κατεύθυνση 5’ προς 3’Σε αντίθεση προς τη σύνθεση του DNA, η σύνθεση του RNA μπορεί να αρχίσειde novo, χωρίς να χρειάζεται εκκινητής. Οι περισσότερες νεοσυντιθέμενες αλυσίδεςRNA έχουν στο 5΄-άκρο τους μια εξαιρετικά ευδιάκριτη ετικέτα: η πρώτηβάση στο άκρο αυτό είναι είτε pppG είτε pppA.EÙÈΤٷÛÙÔ 5'-¿ÎÚÔ2– O O O – O O– O(A ‹ G)OB¿ÛËOOPOPOPOOHOPOOHOO– OΗ παρουσία της τριφωσφορικής ομάδας υποδηλώνει ότι η σύνθεση RNAαρχίζει στο 5΄-άκρο. Από τα αποτελέσματα πειραμάτων σήμανσης με υποστρώματαγ- 32 Ρ επιβεβαιώθηκε ότι οι αλυσίδες RNA, όπως και οι αλυσίδεςDNA, αναπτύσσονται κατά την κατεύθυνση 5΄→3΄.XXYXYZYTPPP iZTPPP iP P POHP P PPOHP P PPPOH 3'·Ó¿appleÙ˘ÍË 5' 3'5'

© ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΑΚΕΣ ΕΚΔΟΣΕΙΣ ΚΡΗΤΗΣ ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑΤΙΚΟ ΥΛΙΚΟ ΓΙΑ ΤΟ ΧΗΜΙΚΟ ΤΜΗΜΑ ΤΟΥ ΠΑΝ/ΜΙΟΥ ΑΘΗΝΩΝ88628.1.5ΚΕΦΑΛΑΙΟ 28 · Σύνθεση και μάτισμα RNAH επιμήκυνση πραγματοποιείται στις φυσαλίδες μεταγραφής οιοποίες μετακινούνται κατά μήκος του εκμαγείου DNAΗ φάση επιμήκυνσης της σύνθεσης του RNA αρχίζει μετά τον σχηματισμότου πρώτου φωσφοδιεστερικού δεσμού. Μια σημαντική αλλαγή είναι η απώλειατου παράγοντα σ. Υπενθυμίζεται ότι ο πυρήνας του ενζύμου χωρίς τον σδεσμεύεται στο εκμαγείο του DNA πιο ισχυρά. Πραγματικά, η RNA πολυμεράσηπαραμένει δεσμευμένη στο εκμαγείο της μέχρι να προσεγγίσει ένα σήματερματισμού. Η περιοχή που έχει RNA πολυμεράση, DNA και νεοσυντιθέμενοRNA ονομάζεται φυσαλίδα μεταγραφής διότι περιέχει μια «φυσαλίδα»τοπικά αποδιαταγμένου DNA (Eικόνα 28.8). Το RNA που μόλις έχει συντεθείσχηματίζει μια υβριδική έλικα με τον κλώνο-εκμαγείο του DNA. Αυτή η έλικαDNA-RNA έχει μήκος 8 περίπου bp, που αντιστοιχεί σχεδόν σε μια στροφήτης διπλής έλικας (Εδάφιο 27.1.3). Η 3΄-υδροξυλική ομάδα του RNA σε αυτήντην υβριδική έλικα είναι τοποθετημένη με τέτοιο τρόπο ώστε να μπορείνα προσβάλλει το α-άτομο του φωσφόρου ενός εισερχόμενου τριφωσφορικούριβονουκλεοζίτη. Ο πυρήνας του ενζύμου περιέχει επίσης μια θέση δέσμευσηςγια τον άλλο κλώνο του DNA. Περίπου 17 bp DNA ξετυλίγονται κατά τηφάση επιμήκυνσης, όπως και κατά τη φάση έναρξης. Η φυσαλίδα μεταγραφήςδιανύει μια απόσταση 170 Å (17 nm) ανά δευτερόλεπτο, που αντιστοιχεί σεέναν ρυθμό επιμήκυνσης 50 περίπου νουκλεοτιδίων ανά δευτερόλεπτο. Αν καιαρκετά γρήγορη, η ταχύτητα αυτή είναι πολύ μικρότερη από εκείνη της σύνθεσηςτου DNA, η απόδοση της οποίας είναι 1000 νουκλεοτίδια ανά δευτερόλεπτο.RNA appleÔÏ˘ÌÂÚ¿ÛËEIKONA 28.8 Φυσαλίδα μεταγραφής.Σχηματική αναπαράσταση της φυσαλίδαςμεταγραφής κατά την επιμήκυνση ενόςμεταγραφήματος RNA. Το δίκλωνο DNAξετυλίγεται στο πρόσθιο άκρο της RNAπολυμεράσης και ξανατυλίγεται στο οπίσθιο.Το υβρίδιο RNA-DNA περιστρέφεται κατά τηνεπιμήκυνση.3'5'•·Ó·Ù‡ÏÈÁÌ·NÂÔÛ˘ÓÙÈı¤ÌÂÓÔRNAKÏÒÓÔ˜-ÂÎÌ·Á›ÔY‚ÚȉÈ΋ ¤ÏÈηRNA–DNAKˆ‰È·ˆÓÎÏÒÓÔ˜3'£¤ÛËÂappleÈÌ‹Î˘ÓÛ˘•ÂÙ‡ÏÈÁÌ·5'3'5' pppK›ÓËÛËÙ˘ appleÔÏ˘ÌÂÚ¿Û˘DNARNAEIKONA 28.9 Διαχωρισμός υβριδίουRNA-DNA. Μια δομή μέσα στην RNA πολυμεράσηεπιβάλλει τον διαχωρισμό του υβριδίου RNA-DNA, επιτρέποντας στην αλυσίδα του DNA ναεξέρχεται από το ένα μέρος και στην αλυσίδατου RNA να εξέρχεται από το άλλο.Το μήκος του υβριδίου RNA-DNA και της ξετυλιγμένης περιοχής τουDNA παραμένει μάλλον σταθερό καθώς η RNA πολυμεράση μετακινείται κατάμήκος του εκμαγείου DNA. Αυτό το εύρημα υποδηλώνει ότι το DNA ξανατυλίγεταιμε την ίδια περίπου ταχύτητα στο οπίσθιο μέρος της RNA πολυμεράσηςόπως ξετυλίγεται στο εμπρόσθιο μέρος του ενζύμου. Το υβρίδιοRNA-DNA πρέπει επίσης να περιστρέφεται κάθε φορά που ένα νουκλεοτίδιοπροστίθεται, ούτως ώστε το 3΄-ΟΗ άκρο του RNA να παραμένει στην καταλυτικήθέση. Το μήκος του υβριδίου RNA-DNA προσδιορίζεται από μια δομήμέσα στο ένζυμο που αναγκάζει το υβρίδιο RNA-DNA να χωρίζει, επιτρέπονταςέτσι στην αλυσίδα του RNA να εξέρχεται από το ένζυμο και στηναλυσίδα του DNA να ξαναενώνεται με τη συμπληρωματική της (Eικόνα 28.9).Είναι αξιοσημείωτο ότι η RNA πολυμεράση δεν έχει δραστικότητα νουκλεάσης.Έτσι, σε αντίθεση προς την DNA πολυμεράση, η RNA πολυμεράσηδεν διορθώνει τη νεοσυντιθέμενη πολυνουκλεοτιδική αλυσίδα. Συνεπώς, η πιστότητατης μεταγραφής είναι πολύ μικρότερη από εκείνη της αντιγραφής. H συχνότητασφάλματος της σύνθεσης RNA είναι της τάξεως του ενός λάθους ανά 10 4 έως

© ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΑΚΕΣ ΕΚΔΟΣΕΙΣ ΚΡΗΤΗΣ ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑΤΙΚΟ ΥΛΙΚΟ ΓΙΑ ΤΟ ΧΗΜΙΚΟ ΤΜΗΜΑ ΤΟΥ ΠΑΝ/ΜΙΟΥ ΑΘΗΝΩΝ28.2 Η ΕΥΚΑΡΥΩΤΙΚΗ ΜΕΤΑΓΡΑΦΗ ΚΑΙ Η ΜΕΤΑΦΡΑΣΗ ΕΙΝΑΙΔΙΑΧΩΡΙΣΜΕΝΕΣ ΣΤΟΝ ΧΩΡΟ ΚΑΙ ΣΤΟΝ ΧΡΟΝΟ891Eυκαρυωτική μεταγραφή και μετάφρασηΣτρέφουμε τώρα την προσοχή μας στη μεταγραφή των ευκαρυωτικών, μια πολύπιο πολύπλοκη διεργασία από ό,τι στα προκαρυωτικά. Στα ευκαρυωτικά, ημεταγραφή και η μετάφραση πραγματοποιούνται σε διαφορετικά κυτταρικά διαμερίσματα:η μεταγραφή πραγματοποιείται στον περιβαλλόμενο από διπλή μεμβράνηπυρήνα, ενώ η μετάφραση λαμβάνει χώρα στο κυτταρόπλασμα. Στα προκαρυωτικά,οι δύο διεργασίες είναι στενά συζευγμένες (Eικόνα 28.15). Πράγματι,η μετάφραση του βακτηριακού mRNA αρχίζει ενώ το μεταγράφημα ακόμησυντίθεται. Ο χωροταξικός και χρονικός διαχωρισμός της μεταγραφής και τηςμετάφρασης καθιστούν ικανά τα ευκαρυωτικά να ρυθμίζουν τη γονιδιακή έκφραση μεπολύ πιο περίπλοκους τρόπους, συνεισφέροντας στην αφθονία των ευκαρυωτικώνμορφών και λειτουργιών.(A)(B)DNADNA˘Ú‹Ó·˜5'EappleÂÍÂÚÁ·Û›·5'3'3'ÚˆÙÔÁÂÓ¤˜ÌÂÙ·ÁÚ¿ÊËÌ·K˘ÙÔÛfiÏÈÔmRNAMÂÙ·ÊÔÚ¿mRNA5'PÈ‚fiۈ̷NÂÔÛ˘ÓÙÈı¤ÌÂÓËappleÚˆÙ½ÓË5'3'PÈ‚fiۈ̷NÂÔÛ˘ÓÙÈı¤ÌÂÓËappleÚˆÙ½ÓËPOKAPYøTIKOEYKAPYøTIKOEIKONA 28.15 Μεταγραφή και μετάφραση. Αυτές οι δύο διεργασίες είναι στενά συζευγμένες σταπροκαρυωτικά, ενώ είναι χωροταξικά και χρονικά χωρισμένες στα ευκαρυωτικά. (Α) Στα προκαρυωτικά,το πρωτογενές μεταγράφημα χρησιμεύει ως mRNA και χρησιμοποιείται αμέσως ως εκμαγείο για τη σύνθεσηπρωτεϊνών. (Β) Στα ευκαρυωτικά, οι πρόδρομοι του mRNA υφίστανται επεξεργασία και ματίζονταιμέσα στον πυρήνα πριν από τη μεταφορά τους στο κυτταρόπλασμα για μετάφραση σε πρωτεΐνες. [ΚατάJ. Darnell, H. Lodish και D. Baltimore. Molecular Cell Biology, 2η έκδοση. (Scientific American Books,1990), p. 230.]Μια δεύτερη κύρια διαφορά μεταξύ των προκαρυωτικών και ευκαρυωτικώνείναι η έκταση της επεξεργασίας του RNA. Αν και τόσο τα προκαρυωτικά όσοκαι τα ευκαρυωτικά τροποποιούν το tRNA και το rRNA, τα ευκαρυωτικά επεξεργάζονταισε πολύ μεγάλη έκταση το νεοσυντιθέμενο RNA που προορίζεται να γίνειmRNA. Πρωτογενή μεταγραφήματα (μόρια προ-mRNA), τα προϊόντα τηςδράσης της RNA πολυμεράσης, αποκτούν ένα κάλυμμα στα 5΄-άκρα τους καιμια ουρά πολυ(Α) στα 3΄-άκρα τους. Αυτό που είναι πιο σημαντικό είναι ότισχεδόν όλα τα πρόδρομα μόρια του mRNA στα ανώτερα ευκαρωτικά ματίζονται(Εδάφιο 5.6.1). Τα ιντρόνια εξάγονται με ακρίβεια από τα πρωτογενή μεταγραφήματακαι τα εξόνια συνδέονται για να σχηματιστούν τα ώριμα μόριαmRNA με συνεχή μηνύματα. Μερικά μόρια mRNA έχουν μόνο το ένα δέκατοτου μεγέθους των προδρόμων τους, που μπορεί να είναι 30 kb ή και μεγαλύτερο.Ο τύπος του ματίσματος μπορεί να ρυθμίζεται κατά την πορεία τηςανάπτυξης για να δημιουργήσει παραλλαγές σε ένα θέμα, όπως είναι οι μεμβρανικέςκαι οι εκκρινόμενες μορφές μορίων αντισωμάτων. Το εναλλακτικόμάτισμα αυξάνει την ποικιλία των πρωτεϊνών στα ευκαρυωτικά και αποτελείμια καθαρή απεικόνιση του γιατί το πρωτέωμα είναι πολύ πιο πολύπλοκο απότο γονιδίωμα.

© ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΑΚΕΣ ΕΚΔΟΣΕΙΣ ΚΡΗΤΗΣ ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑΤΙΚΟ ΥΛΙΚΟ ΓΙΑ ΤΟ ΧΗΜΙΚΟ ΤΜΗΜΑ ΤΟΥ ΠΑΝ/ΜΙΟΥ ΑΘΗΝΩΝ89228.2.1ΚΕΦΑΛΑΙΟ 28 · Σύνθεση και μάτισμα RNATο RNA στα ευκαρυωτικά κύτταρα συντίθεται από τρεις τύπουςRNA πολυμεράσηςΣτα προκαρυωτικά, το RNA συντίθεται από ένα μόνο είδος πολυμεράσης.Αντίθετα, ο πυρήνας ενός ευκαρυωτικού περιέχει τρεις τύπους RNA πολυμεράσηςπου διαφέρουν ως προς την εξειδίκευση του εκμαγείου τους, τη θέσητους μέσα στον πυρήνα και την ευαισθησία τους σε αναστολείς (Πίνακας 28.2).Όλες αυτές οι πολυμεράσες είναι μεγάλες πρωτεΐνες που περιέχουν από 8 έως14 υπομονάδες και έχουν μια συνολική σχετική μοριακή μάζα μεγαλύτερη από500 kd. Η RNA πολυμεράση Ι βρίσκεται στους πυρηνίσκους, όπου μεταγράφειτη διαδοχική σειρά των γονιδίων για τα ριβοσωματικά RNA των 18 S, 5,8 Sκαι 28 S (Εδάφιο 29.3.1). Το άλλο μόριο ριβοσωματικού RNA (rRNA 5 S, Εδάφιο29.3.1) και όλα τα μόρια μεταφορικού RNA (Εδάφιο 29.1.2) συντίθενταιαπό την RNA πολυμεράση ΙΙΙ, η οποία βρίσκεται στο πυρηνόπλασμα και όχιστους πυρηνίσκους. Η RNA πολυμεράση ΙΙ, η οποία επίσης απαντά στο πυρηνόπλασμα,συνθέτει τα πρόδρομα μόρια του mRNA καθώς επίσης μερικά μικράμόρια RNA όπως εκείνα του μηχανισμού ματίσματος (Εδάφιο 28.3.5). Ανκαι όλες οι ευκαρυωτικές RNA πολυμεράσες είναι ομόλογες μεταξύ τους καιμε την προκαρυωτική RNA πολυμεράση, η RNA πολυμεράση ΙΙ περιέχει μιαμοναδική καρβοξυ-τελική δομική περιοχή στην υπομονάδα των 220 kd. Η δομικήαυτή περιοχή είναι ασυνήθης διότι περιέχει πολλαπλές επαναλήψεις μιαςομόφωνης αλληλουχίας YSPTSPS. Η δραστικότητα της RNA πολυμεράσης ΙΙρυθμίζεται από φωσφορυλιώσεις στα κατάλοιπα σερίνης και θρεονίνης τηςκαρβοξυ-τελικής δομικής περιοχής. Μια άλλη κύρια διάκριση μεταξύ των πολυμερασώνέγκειται στην απόκρισή τους προς την τοξίνη α-αμανιτίνη, ένα κυκλικόοκταπεπτίδιο το οποίο περιέχει μερικά τροποποιημένα αμινοξέα.HOCH 2 OHHONH 3 CHNOOSOHNOONHHNCH 3H 2 NOHNOOHNNHOOHNHCOCH 3·-AÌ·ÓÈÙ›ÓËΠΙΝΑΚΑΣ 28.2Eυκαρυωτικές RNA πολυμεράσεςTύπος Θέση Kυτταρικά μεταγραφήματα Ευαισθησία στην α-αμανιτίνηI Πυρηνίσκος rRNA 18 S, 5,8 S και 28 S AνθεκτικήII Πυρηνόπλασμα πρόδρομα μόρια mRNA Aναστέλλεται ισχυράκαι snRNAIII Πυρηνόπλασμα tRNA και rRNA 5 S Aναστέλλεται απόυψηλές συγκεντρώσεις

© ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΑΚΕΣ ΕΚΔΟΣΕΙΣ ΚΡΗΤΗΣ ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑΤΙΚΟ ΥΛΙΚΟ ΓΙΑ ΤΟ ΧΗΜΙΚΟ ΤΜΗΜΑ ΤΟΥ ΠΑΝ/ΜΙΟΥ ΑΘΗΝΩΝΗ α-αμανιτίνη παράγεται από το δηλητηριώδες μανιτάρι Amanita phaloides,το οποίο ονομάζεται επίσης κύπελλο θανάτου ή δολοφονικός άγγελος (Eικόνα28.16). Περισσότεροι από 100 θάνατοι προκαλούνται παγκοσμίως κάθε χρόνοαπό την κατανάλωση δηλητηριωδών μανιταριών. Η α-αμανιτίνη δεσμεύεταιπολύ ισχυρά (K d = 10 nM) στην RNA πολυμεράση ΙΙ, και με τον τρόπο αυτόεμποδίζει τη φάση επιμήκυνσης της σύνθεσης RNA. Υψηλότερες συγκεντρώσειςα-αμανιτίνης (1 μΜ) αναστέλλουν την πολυμεράση ΙΙΙ, ενώ η πολυμεράσηΙ είναι ανθεκτική στην τοξίνη. Αυτό το σχήμα της ευαισθησίας είναιεξαιρετικά συντηρημένο σε όλο το ζωϊκό και φυτικό βασίλειο.893Eυκαρυωτική μεταγραφή και μετάφραση28.2.2 Στοιχεία με δράση cis και trans: οι κλειδαριές και τα κλειδιάτης μεταγραφήςΤα ευκαρυωτικά γονίδια, όπως τα αντίστοιχα προκαρυωτικά, χρειάζονται προαγωγείςγια την έναρξη της μεταγραφής. Κάθε ένας από τους τρεις τύπους πολυμερασώναναγνωρίζει διαφορετικούς προαγωγείς. Η RNA πολυμεράση Ι μεταγράφειμόνο από ένα είδος προαγωγέα, ο οποίος υπάρχει μόνο σε γονίδιαrRNA και περικλείει τη θέση έναρξης. Σε μερικά γονίδια, η RNA πολυμεράσηΙΙΙ αποκρίνεται σε προαγωγείς που βρίσκονται στην κανονική ανοδικήθέση. Σε άλλα γονίδια, αποκρίνεται σε προαγωγείς που βρίσκονται στα γονίδιακαθοδικά της θέσης έναρξης. Οι προαγωγείς για την RNA πολυμεράση ΙΙμπορεί να είναι απλοί ή πολύπλοκοι (Εδάφιο 28.2.3). Όπως και στην περίπτωσητων προκαρυωτικών, οι προαγωγείς βρίσκονται πάντοτε στο ίδιο μόριοDNA όπου βρίσκεται και το γονίδιο που ρυθμίζουν. Συνεπώς, οι προαγωγείςαναφέρονται ως στοιχεία με δράση cis.Ωστόσο, οι προαγωγείς δεν είναι ο μόνος τύπος στοιχείων DNA που έχουνδράση cis. Τα ευκαρυωτικά και οι ιοί τους περιέχουν επιπλέον ενισχυτές(enhancers). Αυτές οι αλληλουχίες DNA, αν και δεν είναι οι ίδιες προαγωγείς,μπορούν να αυξήσουν σημαντικά την αποτελεσματικότητα των προαγωγέων.Είναι εξαιρετικά ενδιαφέρον το ότι οι θέσεις των ενισχυτών σχετικά με τουςπροαγωγείς δεν είναι καθορισμένες. Οι θέσεις αυτές μπορεί να ποικίλλουν ουσιαστικά.Οι ενισχυτές παίζουν καθοριστικό ρόλο στη ρύθμιση της γονιδιακήςέκφρασης σε ειδικούς ιστούς ή στάδια της ανάπτυξης (Εδάφιο 31.2.4).Οι αλληλουχίες των στοιχείων του DNA που έχουν δράση cis είναι θέσειςδέσμευσης πρωτεϊνών, οι οποίες ονομάζονται παράγοντες μεταγραφής. Μια τέτοιαπρωτεΐνη συχνά ονομάζεται παράγοντας με δράση trans, διότι μπορεί νακωδικεύεται από ένα γονίδιο σε ένα μόριο DNA διαφορετικό από εκείνο πουπεριέχει το γονίδιο το οποίο ρυθμίζεται. Η δέσμευση ενός παράγοντα μεταγραφήςστη σχετική αλληλουχία του στο DNA βοηθά την RNA πολυμεράσηνα εντοπίσει την κατάλληλη θέση έναρξης. Θα συνεχίσουμε την έρευνά μαςγια τη μεταγραφή με την εξέταση αυτών των στοιχείων με δράση cis και trans.EIKONA 28.16 Δηλητήριο RNA πολυμεράσης.Το Amanita phaloides, ένα δηλητηριώδες μανιτάριπου παράγει α-αμανιτίνη. [Κατά G. Lincoff καιD. H. Mitchel, Τoxic and HollucinogenicMushroom Poisoning (Van Nostrand Reinhold,1977), p.30.]28.2.3 Oι περισσότεροι προαγωγείς για την RNA πολυμεράση IIπεριέχουν ένα πλαίσιο TATA κοντά στη θέση έναρξης της μεταγραφήςΟι προαγωγείς για την RNA πολυμεράση ΙΙ, όπως εκείνοι για τις βακτηριακέςπολυμεράσες, είναι τοποθετημένοι στην πλευρά 5΄ της θέσης έναρξης τηςμεταγραφής. Τα αποτελέσματα πειραμάτων μεταλλαξιγένεσης, μελετών αποτύπωσηςκαι συγκρίσεις πολλών γονιδίων ανώτερων ευκαρυωτικών οργανισμώνέχουν δείξει τη σημασία αρκετών περιοχών ανοδικά της θέσης έναρξης.Για τα περισσότερα γονίδια που μεταγράφονται από την RNA πολυμεράση ΙΙτο πιο σημαντικό στοιχείο με δράση cis ονομάζεται πλαίσιο ΤΑΤΑ με βάσητην ομόφωνη αλληλουχία του (Eικόνα 28.17). Το πλαίσιο ΤΑΤΑ επικεντρώνεταισυνήθως μεταξύ των θέσεων –30 και –100. Επισημαίνεται ότι το ευκαρυωτικόπλαίσιο ΤΑΤΑ μοιάζει πολύ με την προκαρυωτική αλληλουχία –105' T 82 A 97 T 93 A 85 A 63 A 88 A 50 3'Ï·›ÛÈÔ TATAEIKONA 28.17 Πλαίσιο ΤΑΤΑ. Συγκρίσεις τωναλληλουχιών περισσότερων από 100 ευκαρυωτικώνπροαγωγέων οδήγησαν στην ομόφωνη αλληλουχίαπου φαίνεται. Οι δείκτες σημειώνουν τησυχνότητα (%) της βάσης σε κάθε θέση.

© ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΑΚΕΣ ΕΚΔΟΣΕΙΣ ΚΡΗΤΗΣ ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑΤΙΚΟ ΥΛΙΚΟ ΓΙΑ ΤΟ ΧΗΜΙΚΟ ΤΜΗΜΑ ΤΟΥ ΠΑΝ/ΜΙΟΥ ΑΘΗΝΩΝΗ ΤΒΡ που δεσμεύεται στο πλαίσιο ΤΑΤΑ είναι η καρδιά του συμπλόκου έναρξης(βλ. Eικόνα 28.19). Η επιφάνεια της σέλας της ΤΒΡ παρέχει θέσεις για τηνπρόσδεση και άλλων συστατικών (Eικόνα 28.21). Πρόσθετοι παράγοντες μεταγραφήςσυναρμολογούνται στον πυρήνα αυτόν με μια ορισμένη σειρά. Πρώταστρατολογείται ο TFIIA, ακολουθούμενος από τον TFIIB και στη συνέχειατον TFIIF — μια ελικάση εξαρτώμενη από την ΑΤΡ, που αρχικά χωρίζει τουςδύο κλώνους του DNA για την πολυμεράση. Τελικά, η RNA πολυμεράση ΙΙκαι στη συνέχεια ο TFIIE ενώνονται με τους άλλους παράγοντες για να σχηματίσουνένα σύμπλοκο που ονομάζεται βασικός μηχανισμός μεταγραφής. Κάποιαστιγμή κατά τον σχηματισμό του συμπλόκου αυτού η καρβοξυ-τελική δομικήπεριοχή της πολυμεράσης φωσφορυλιώνεται στα κατάλοιπα της σερίνηςκαι θρεονίνης, μια διεργασία που απαιτείται για μια επιτυχημένη έναρξη. Ησημασία της καρβοξυ-τελικής δομικής περιοχής τονίζεται από την ανακάλυψηότι ζυμομύκητες που περιέχουν μεταλλαγμένη RNA πολυμεράση ΙΙ με λιγότερεςαπό 10 επαναλήψεις δεν είναι βιώσιμοι. Οι περισσότεροι από τους παράγοντεςμεταγραφής ελευθερώνονται πριν η πολυμεράση αφήσει τον προαγωγέακαι στη συνέχεια μπορούν να συμμετάσχουν σε έναν άλλο κύκλο έναρξης.ÚˆÙ½ÓË appleÔ˘ appleÚÔÛ‰¤ÓÂÙ·È ÛÙÔ appleÏ·›ÛÈÔ TATA895Eυκαρυωτική μεταγραφή και μετάφρασηEIKONA 28.20 Το σύμπλοκο που σχηματίζεταιαπό την πρωτεΐνη η οποία δεσμεύεταιστο πλαίσιο ΤΑΤΑ. Η δομή της πρωτεΐνηςπου μοιάζει με σέλα κάθεται σε ένα τμήμα DNAπου είναι αρκετά ξετυλιγμένο και λυγισμένο.TFIIAEIKONA 28.21 Συναρμολόγηση του συμπλόκου έναρξης. Ένα τριπλό σύμπλοκο μεταξύ τηςπρωτεΐνης που δεσμεύεται στο πλαίσιο ΤΑΤΑ (πορφυρό), του TFIIA (πορτοκαλί) και του DNA. Ο TFIIAαλληλεπιδρά αρχικά με την άλλη πρωτεΐνη.Αν και τα βακτήρια δεν έχουν ΤΒΡ, τα αρχαία χρησιμοποιούν ένα μόριοΤΒΡ το οποίο είναι δομικά παρόμοιο με την ευκαρυωτική πρωτεΐνη.Πράγματι, διεργασίες μεταγραφικού ελέγχου στα αρχαία είναι, γενικά,πολύ πιο όμοιες με εκείνες των ευκαρυωτικών από ό,τι είναι οι διεργασίες τωνβακτηρίων. Πολλά συστατικά της ευκαρυωτικής μεταγραφικής μηχανής έχουνεξελιχθεί από έναν πρόγονο των αρχαίων.28.2.5 Πολλοί παράγοντες μεταγραφής αλληλεπιδρούν μεευκαρυωτικούς προαγωγείςΤο βασικό μεταγραφικό σύμπλοκο που περιγράφηκε στο Εδάφιο 28.2.4 αρχίζειτη μεταγραφή με σχετικά χαμηλή συχνότητα. Πρόσθετοι παράγοντες μεταγραφήςοι οποίοι δεσμεύονται σε άλλες θέσεις χρειάζονται για την επίτευξηυψηλών ρυθμών σύνθεσης RNA και για την επιλεκτική διέγερση ειδικώνγονιδίων. Ενισχυτικές θέσεις ανοδικά του μηνύματος ευκαρυωτικών γονιδίωνποικίλλουν τόσο ως προς την αλληλουχία όσο και ως προς τη θέση. Η ποικιλίατους υποδηλώνει ότι αναγνωρίζονται από πολλές διαφορετικές ειδικέςπρωτεΐνες. Πράγματι, πολλοί παράγοντες μεταγραφής έχουν απομονωθεί καιοι θέσεις δέσμευσής τους έχουν προσδιοριστεί με πειράματα αποτύπωσης (Eικόνα28.22). Παραδείγματος χάριν, ο Sp1, μια πρωτεΐνη περίπου 100 kd από

© ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΑΚΕΣ ΕΚΔΟΣΕΙΣ ΚΡΗΤΗΣ ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑΤΙΚΟ ΥΛΙΚΟ ΓΙΑ ΤΟ ΧΗΜΙΚΟ ΤΜΗΜΑ ΤΟΥ ΠΑΝ/ΜΙΟΥ ΑΘΗΝΩΝ896ΚΕΦΑΛΑΙΟ 28 · Σύνθεση και μάτισμα RNASV40–200 –100 +1Ÿ„ÈÌÔ RNAÚÒÈÌÔ RNA(A)DHFRÏ·›ÛÈÔ GCRNA(B)°ÔÓ›‰ÈÔıÂÚÌÈ΋˜Î·Ù·appleÏËÍ›·˜ÙÔÈ¯Â›Ô ıÂÚÌÈ΋˜ ηٷappleÏËÍ›·˜TATARNAEIKONA 28.22 Περιοχές πρόσδεσης παραγόντωνμεταγραφής. Αυτές οι πολλαπλές θέσειςπρόσδεσης παραγόντων μεταγραφής χαρτογραφήθηκανμε αποτύπωση. (Α) Πρόσδεση του Sp1(πράσινο) σε ιικό προαγωγέα του SV40 και στονπροαγωγέα για την αναγωγάση του διυδροφυλλικού(DHFR). (B) Πρόσδεση του HSTF (μπλε) σεέναν προαγωγέα θερμικής καταπληξίας τηςDrosophila. [Κατά W.S. Dynan και R. Tjan,Nature, 316(1985):774.]κύτταρα θηλαστικών, προσδένεται σε προαγωγείς που περιέχουν πλαίσια GC.Το δίκλωνο DNA του ιού SV40 (ενός καρκινογόνου ιού που μολύνει κύτταραπιθήκων) περιέχει πέντε πλαίσια GC σε περιοχές 50 έως 100 bp ανοδικά ή καθοδικάτων θέσεων έναρξης της μεταγραφής. Ο παράγοντας μεταγραφής που δεσμεύεταιστη θέση CCAAT (CTFØ ονομάζεται και NF1), μια πρωτεΐνη 60 kdαπό κύτταρα θηλαστικών, προσδένεται στο πλαίσιο CAAT. Ένας παράγονταςμεταγραφής θερμικής καταπληξίας (HSTF) εκφράζεται στη Drosophila μετά απόαπότομη αύξηση της θερμοκρασίας. Αυτή η πρωτεΐνη των 93 kd που δεσμεύεταισε DNA αναγνωρίζει την αλληλουχία:5΄-CNNGAANNTCCNNG-3΄Υπάρχουν αρκετά αντίγραφα της αλληλουχίας αυτής, γνωστής ως στοιχείο απόκρισηςστη θερμική καταπληξία, που αρχίζουν 15 bp ανοδικά του πλαισίου ΤΑ-ΤΑ. Ο HSTF διαφέρει από την σ 32 , μια πρωτεΐνη θερμικής καταπληξίας τηςE. coli (Εδάφιο 28.1.2) ως προς το ότι δεσμεύεται άμεσα σε στοιχεία απόκρισηςπροαγωγέων θερμικής καταπληξίας αντί να συνδέεται πρώτα με την RNAπολυμεράση.28.2.6 Eνισχυτικές αλληλουχίες μπορούν να διεγείρουν τη μεταγραφήσε θέσεις έναρξης που βρίσκονται χιλιάδες βάσεις μακριάΟι δραστικότητες πολλών προαγωγέων στα ανώτερα ευκαρυωτικά αυξάνονταισημαντικά από ένα άλλο είδος στοιχείου με δράση cis, το οποίο ονομάζεταιενισχυτής. Οι αλληλουχίες ενισχυτών δεν έχουν δική τους δραστικότητα προαγωγέα.Μπορούν όμως να ασκήσουν τις διεγερτικές δράσεις τους από αποστάσειςμερικών χιλιάδων βάσεων. Μπορούν να βρίσκονται ανοδικά, καθοδικά, ή ακόμη καιστη μέση ενός γονιδίου που έχει μεταγραφεί. Ακόμη, οι ενισχυτές είναι αποτελεσματικοίόταν υπάρχουν σε οποιαδήποτε αλυσίδα του DNA (ισότιμα και σεκάθε κατεύθυνση). Οι ενισχυτές των ζυμομυκήτων είναι γνωστοί ως ανοδικέςενισχυτικές αλληλουχίες (upstream activator sequences, UAS).Ένας συγκεκριμένος ενισχυτής είναι αποτελεσματικός μόνο σε ορισμένακύτταρα. Παραδείγματος χάριν, ο ενισχυτής της ανοσοσφαιρίνης λειτουργείστα λεμφοκύτταρα Β αλλά όχι σε άλλα. Καρκίνος μπορεί να προκύψειεάν η σχέση μεταξύ γονιδίων και ενισχυτών διακοπεί. Στο λέμφωμα Burkittκαι τη λευχαιμία κυττάρων Β μια χρωμοσωματική μετατόπιση φέρνει τοπρωτο-ογκογονίδιο myc (που κωδικεύει έναν παράγοντα μεταγραφής) υπό τονέλεγχο ενός ισχυρού ενισχυτή ανοσοσφαιρίνης. Η επακόλουθη απορρύθμισητου γονιδίου myc πιστεύεται ότι παίζει ρόλο στην πρόοδο του καρκίνου.Παράγοντες μεταγραφής και άλλες πρωτεΐνες που προσδένονται σε ρυθμιστικέςθέσεις του DNA μπορούν να θεωρηθούν ως κωδικοί αριθμοί που συνεργειακά ανοίγουνπολλαπλές κλειδαριές, δίνοντας πρόσβαση στην RNA πολυμεράση για ειδικά

© ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΑΚΕΣ ΕΚΔΟΣΕΙΣ ΚΡΗΤΗΣ ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑΤΙΚΟ ΥΛΙΚΟ ΓΙΑ ΤΟ ΧΗΜΙΚΟ ΤΜΗΜΑ ΤΟΥ ΠΑΝ/ΜΙΟΥ ΑΘΗΝΩΝγονίδια. Η ανακάλυψη των προαγωγέων και των ενισχυτών έχει ανοίξει τηνπόρτα για την κατανόηση του πώς γονίδια εκφράζονται επιλεκτικά στα ευκαρυωτικάκύτταρα. Η ρύθμιση της μεταγραφής γονιδίων, η οποία περιγράφεταιστο Κεφάλαιο 31, αποτελεί τον θεμελιώδη τρόπο για τον έλεγχο της γονιδιακήςέκφρασης.897Eπεξεργασία των προϊόντων της μεταγραφής28.3 ΤΑ ΠΡΟΪΟΝΤΑ ΤΗΣ ΜΕΤΑΓΡΑΦΗΣ ΚΑΙ ΤΩΝ ΤΡΙΩΝΕΥΚΑΡΥΩΤΙΚΩΝ ΠΟΛΥΜΕΡΑΣΩΝ ΥΦΙΣΤΑΝΤΑΙ ΕΠΕΞΕΡΓΑΣΙΑΟυσιαστικά, όλα τα αρχικά προϊόντα της μεταγραφής στα ευκαρυωτικά υφίστανταιπεραιτέρω επεξεργασία. Παραδείγματος χάριν, πρόδρομα μόριαtRNA μετατρέπονται σε ώριμα μόρια tRNA μετά από μια σειρά μεταβολών:διάσπαση μιας αλληλουχίας-οδηγού του 5΄-άκρου, μάτισμα για την αφαίρεσητου ιντρονίου, αντικατάσταση της 3΄-τελικής αλληλουχίας από την αλληλουχίαCCA και τροποποίηση μερικών βάσεων (Eικόνα 28.23). Μια σειρά από ένζυμαμπορεί να δρουν στην αλυσίδα του ριβονουκλεϊκού οξέος ή στις βάσειςπου το αποτελούν για να επιτύχουν το τελικό προϊόν.O‰ËÁfi˜5' G U U A U C A G U U A A U U3'OHUUAGAGGGG ACUCUCG CG CU CC C C G C A mUGU U G A A G G G C GC CCG A G C mU yUG G GAA CU A G GU UAC GA UA UG CCA U AAUAG CGU AAAUC IÓÙÚfiÓÈÔU AU CU A CÚÒÈÌÔ ÌÂÙ·ÁÚ¿ÊËÌ·EappleÂÍÂÚÁ·Û›·G mD D GGDD DAAAA5' P CUCUCGGUAC C G mG G CG mCAA3'OHACCAGAGGGCCU CC C C G C A mCG G G C G CC mT yD AGAGUUCyAGACU A 1G y AAÓÙÈΈ‰›ÎÈÔflÚÈÌÔ tRNA£¤ÛË ‰¤ÛÌ¢Û˘·ÌÈÓÔͤԘEIKONA 28.23 Επεξεργασία πρόδρομωνμορίων μεταφορικού RNA. Η μετατροπήενός πρόδρομου μορίου tRNA ζυμομυκήτωνσε ώριμο tRNA χρειάζεται την αφαίρεσηενός ιντρονίου 14 νουκλεοτιδίων (κίτρινο),τη διάσπαση μιας αλληλουχίας του 5΄άκρου(πράσινο) και την αφαίρεση του UUμε την προσάρτηση της αλληλουχίας CCAστο 3΄-άκρο (κόκκινο). Επιπλέον, μερικέςβάσεις τροποποιούνται.28.3.1 Tα άκρα του μεταγραφήματος του προ-mRNA αποκτούν ένα5’-κάλυμμα και μια ουρά 3’-πολυ(A)Ίσως το προϊόν της μεταγραφής που υφίσταται την πιο εκτεταμένη τροποποίησηνα είναι εκείνο της RNA πολυμεράσης ΙΙ: το μεγαλύτερο μέρος αυτούτου RNA υφίσταται επεξεργασία σε mRNA. Το άμεσο προϊόν μιας RNA πολυμεράσηςμερικές φορές αναφέρεται ως προ-mRNA. Τα περισσότερα μόριαπρο-mRNA ματίζονται για την αφαίρεση των ιντρονίων. Επιπλέον, τα 5΄- και3΄-άκρα τους τροποποιούνται, και αυτές οι μεταβολές διατηρούνται καθώς τοπρο-mRNA μετατρέπεται σε mRNA (Εδάφιο 28.3.3). Όπως στα προκαρυωτικά,η ευκαρυωτική μεταγραφή συνήθως αρχίζει με Α ή G. Ωστόσο, το τριφωσφορικό5΄-άκρο της νεοσυντιθέμενης αλυσίδας RNA τροποποιείται αμέσως.Στην αρχή ελευθερώνεται μια φωσφορική ομάδα με υδρόλυση. Στη συνέχεια,το διφωσφορικό 5΄-άκρο προσβάλλει το α-άτομο του φωσφόρου μιας GTP γιανα σχηματιστεί ένας πολύ ασυνήθης 5΄-5΄ τριφωσφορικός σύνδεσμος. Αυτό το

© ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΑΚΕΣ ΕΚΔΟΣΕΙΣ ΚΡΗΤΗΣ ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑΤΙΚΟ ΥΛΙΚΟ ΓΙΑ ΤΟ ΧΗΜΙΚΟ ΤΜΗΜΑ ΤΟΥ ΠΑΝ/ΜΙΟΥ ΑΘΗΝΩΝ– OOPOO5' OPP5'OO–OO–OOMÂı˘ÏȈ̤ÓËÛÙ· ηχÌÌ·Ù·0, 1 Î·È 2HOO‚¿ÛËO–O OCH 3O P MÂı˘ÏȈ̤ÓËÛÙ· ηχÌÌ·Ù·O 1 Î·È 2‚¿ÛËOO– O OCH 3O PMÂı˘ÏȈ̤ÓËO ÛÙÔ Î¿Ï˘ÌÌ· 2OHNCH 3N+NONHEIKONA 28.24 Καλύπτοντας το 5΄-άκρο. Καλύμματαστο 5΄-άκρο ευκαρυωτικού mRNA περιλαμβάνουν7-μεθυλογουανυλικό (κόκκινο) προσαρτημένομε έναν τριφωσφορικό σύνδεσμο στηριβόζη του 5΄-άκρου. Καμία από τις ριβόζες δενείναι μεθυλιωμένη στο κάλυμμα 0, μία είναι μεθυλιωμένηστο κάλυμμα 1 και οι δύο είναι μεθυλιωμένεςστο κάλυμμα 2.5' K¿Ï˘ÌÌ·5' K¿Ï˘ÌÌ·EÎÌ·ÁÂ›Ô DNANH 2AAUAAANÂÔÛ˘ÓÙÈı¤ÌÂÓÔ RNA ‹Ì· ‰È¿Ûapple·Û˘ATPPP iAAUAAA AAAAA(A) nÔÏ˘·‰ÂÓ˘ÏȈ̤ÓÔ appleÚfi‰ÚÔÌÔ mRNAδιάκριτο άκρο ονομάζεται κάλυμμα (Eικόνα 28.24). Στη συνέχεια, το άζωτο Ν-7 της ακραίας γουανίνης μεθυλιώνεται από την S-αδενοσυλομεθειονίνη για νασχηματιστεί το κάλυμμα 0. Οι παρακείμενες ριβόζες μπορούν να μεθυλιωθούνκαι να σχηματιστεί το κάλυμμα 1 ή το κάλυμμα 2. Σε αντίθεση με το αγγελιαφόροRNA και μικρά μόρια RNA που συμμετέχουν στο μάτισμα, τα μόρια τουμεταφορικού και του ριβοσωματικού RNA δεν έχουν καλύμματα. Τα καλύμματασυμβάλλουν στη σταθερότητα των μορίων mRNA, προστατεύοντας τα5΄-άκρα τους από τη δράση φωσφατασών και νουκλεασών. Επιπλέον, τα καλύμματαενισχύουν τη μετάφραση του mRNA από τα ευκαρυωτικά συστήματασύνθεσης πρωτεϊνών (Υποκεφάλαιο 29.5).Όπως αναφέρθηκε νωρίτερα, το προ-mRNA τροποποιείται επίσης στο 3΄άκρο.Τα περισσότερα ευκαρυωτικά mRNA περιέχουν μια πολυαδενυλική, πολυ(Α),ουρά σε αυτό το άκρο, η οποία προστίθεται μετά τον τερματισμό της μεταγραφής.Επομένως, το DNA δεν κωδικεύει αυτήν την ουρά πολυ(Α). Στην πραγματικότητα,το νουκλεοτίδιο που προηγείται της ουράς πολυ(Α) δεν είναι το τελευταίονουκλεοτίδιο που μεταγράφεται. Μερικά πρωτογενή μεταγραφήματα περιέχουνεκατοντάδες νουκλεοτίδια πέρα από το 3΄-άκρο του ώριμου mRNA.Πώς όμως το 3΄-άκρο του προ-mRNA παίρνει την τελική μορφή του; Ευκαρυωτικάπρωτογενή μεταγραφήματα διασπώνται από μια ειδική ενδονουκλεάση, ηοποία αναγνωρίζει την αλληλουχία AAUAAA (Eικόνα 28.25). Η διάσπαση δεν γίνεταιεάν αφαιρεθεί η αλληλουχία αυτή ή ένα τμήμα 20 νουκλεοτιδίων από το3΄-άκρο. Η παρουσία εσωτερικών αλληλουχιών AAUAAA σε ορισμένα ώριμαμόρια mRNA δείχνει ότι η AAUAAA είναι μόνο ένα μέρος του σήματοςδιάσπασηςØ αυτό που επίσης είναι σημαντικό είναι το περιβάλλον της. Μετάτη διάσπαση από την ενδονουκλεάση, μια πολυ(Α) πολυμεράση προσθέτει περίπου250 αδενυλικά κατάλοιπα στο 3΄-άκρο του μεταγραφήματος. Στην αντίδρασηαυτή η ΑΤΡ είναι ο δότης αδενυλικών.Ο ρόλος της ουράς πολυ(Α) δεν έχει ακόμη διευκρινιστεί με βεβαιότητα,παρά τις μεγάλες προσπάθειες. Ωστόσο, συσσωρεύονται ολοένα και περισσότερεςενδείξεις ότι ενισχύει την αποτελεσματικότητα της μετάφρασης καιτη σταθερότητα του mRNA. Η παρεμπόδιση της σύνθεσηςτης ουράς πολυ(Α) μετά από έκθεση σε 3΄-δεοξυαδενοσίνη(κορδυσεπίνη) δεν παρεμβαίνει στη σύνθεσητου πρωτογενούς μεταγραφήματος. Το μόριο¢È¿Ûapple·ÛË ·applefiÂȉÈ΋ ÂÓ‰ÔÓÔ˘ÎÏ¿ÛËÚÔÛı‹ÎË Ô˘Ú¿˜ ·applefiÙËÓ appleÔÏ˘(A) appleÔÏ˘ÌÂÚ¿ÛËOH 3'αγγελιαφόρου RNA που δεν έχει ουρά πολυ(Α) μπορείνα μεταφέρεται έξω από τον πυρήνα. Ένα μόριοmRNA, όμως, που δεν έχει ουρά πολυ(Α) συνήθωςείναι πολύ λιγότερο αποτελεσματικό ως εκμαγείογια σύνθεση πρωτεϊνών από ό,τι αυτό που έχει ουράπολυ(Α). Πράγματι, μερικά μόρια mRNA αποθηκεύονταιμε μια μη αδενυλιωμένη μορφή και αποκτούντην ουρά πολυ(Α) μόνον όταν επίκειται μετάφραση.Η περίοδος ημιζωής ενός μορίου mRNA μπορεί ναπροσδιοριστεί εν μέρει από τον ρυθμό αποικοδόμησηςτης ουράς πολυ(Α).EIKONA 28.25 Πολυαδενυλίωση ενός πρωτογενούςμεταγραφήματος. Μια ειδική ενδονουκλεάσηδιασπά το RNA καθοδικά του AAUAAA.Στη συνέχεια η πολυ(Α) πολυμεράση προσθέτειπερίπου 250 κατάλοιπα αδενυλικών.28.3.2 Ο μηχανισμός διόρθωσης του RNA αλλάζει τις πρωτεΐνες πουκωδικεύονται από το mRNAΤο περιεχόμενο της αλληλουχίας μερικών μορίων mRNA αλλάζει μετά τη μεταγραφή.Διόρθωση RNA (RNA editing) είναι ο όρος για μια αλλαγή της αλληλουχίαςτων βάσεων του RNA μετά τη μεταγραφή με διεργασίες διαφορετικέςτου ματίσματος. Η διόρθωση RNA είναι χαρακτηριστική σε μερικά συστήματαπου έχουν ήδη συζητηθεί. Η απολιποπρωτεΐνη Β (apo-B) παίζει σημαντικόρόλο στη μεταφορά τριακυλογλυκερολών και χοληστερόλης σχημα-

© ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΑΚΕΣ ΕΚΔΟΣΕΙΣ ΚΡΗΤΗΣ ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑΤΙΚΟ ΥΛΙΚΟ ΓΙΑ ΤΟ ΧΗΜΙΚΟ ΤΜΗΜΑ ΤΟΥ ΠΑΝ/ΜΙΟΥ ΑΘΗΝΩΝτίζοντας ένα αμφιπαθές σφαιρικό κέλυφος γύρω από τα λιπίδια που μεταφέρονταιστα σωμάτια λιποπρωτεΐνης (Εδάφιο 26.3.1). Η απολιποπρωτεΐνη Bυπάρχει σε δύο μορφές, μια απολιποπρωτεΐνη B-100 512 kd και μια απολιποπρωτεΐνηB-48 240 kd. Η μεγαλύτερη μορφή, η οποία συντίθεται στο ήπαρ, συμμετέχειστη μεταφορά λιπιδίων που συντίθενται μέσα στο κύτταρο. Η μικρότερημορφή, η οποία συντίθεται στο λεπτό έντερο, μεταφέρει τροφικό λίποςμε τη μορφή χυλομικρών. Η απολιποπρωτεΐνη B-48 περιέχει τα 2152 κατάλοιπατου αμινο-τελικού άκρου της απολιποπρωτεΐνης B-100, η οποία περιέχει συνολικά4536 κατάλοιπα. Αυτό το κολοβό μόριο μπορεί να σχηματίσει σωμάτιαλιποπρωτεΐνης, αλλά δεν μπορεί να δεσμευθεί στους υποδοχείς των λιποπρωτεϊνώνχαμηλής πυκνότητας των κυτταρικών μεμβρανών. Ποια είναι η βιοσυνθετικήσχέση αυτών των δύο μορφών απολιποπρωτεΐνης B; Μια πιθανότητα apriori είναι ότι η απολιποπρωτεΐνη B-48 παράγεται από την πρωτεολυτική διάσπασητης απολιποπρωτεΐνης B-100. Μια άλλη εξήγηση είναι ότι οι δύο μορφέςπροκύπτουν από εναλλακτικό μάτισμα (Εδάφιο 28.3.6). Τα πειραματικά αποτελέσματαδείχνουν ότι τίποτε από αυτά δεν συμβαίνει. Ένας εντελώς απρόβλεπτοςκαι νέος μηχανισμός για τη δημιουργία ποικιλομορφίας βρίσκεται σεδράση: η αλλαγή της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας του mRNA μετά τη σύνθεσή του(Eικόνα 28.26). Ένα ειδικό κατάλοιπο κυτιδίνης του mRNA απαμινώνεται σε ουριδίνη,γεγονός που αλλάζει το κωδίκιο του καταλοίπου 2153 από CAA (Gln) σε UAA(τερματισμού). Η απαμινάση που καταλύει την αντίδραση αυτή υπάρχει στο λεπτόέντερο και όχι στο ήπαρ, και εκφράζεται μόνο σε ορισμένα αναπτυξιακάστάδια.Η διόρθωση του RNA δεν περιορίζεται στην απολιποπρωτεΐνη Β. Το γλουταμινικόοξύ ανοίγει διαύλους ειδικούς για κατιόντα στο κεντρικό νευρικό σύστηματων σπονδυλωτών δεσμευόμενο σε μετασυναπτικές μεμβράνες. Η διόρθωσηRNA αλλάζει ένα κωδίκιο γλουταμίνης (CAG) στο mRNA του υποδοχέατου γλουταμινικού σε κωδίκιο αργινίνης (CGG). H αντικατάσταση της γλουταμίνηςαπό αργινίνη στον υποδοχέα εμποδίζει τη ροή των Ca +2 αλλά όχι των Na +διά μέσου του διαύλου. Η διόρθωση του RNA φαίνεται ότι είναι πιο συνηθισμένηαπό ό,τι πιστευόταν. Η χημική αντιδραστικότητα των νουκλεοτιδικώνβάσεων, περιλαμβανομένης της ευαισθησίας τους στην απαμίνωση που χρειάζεταιτη λειτουργία περίπλοκων μηχανισμών επιδιόρθωσης DNA (Εδάφιο27.6.3), έχει χρησιμοποιηθεί ως μηχανή δημιουργίας μοριακής ποικιλομορφίαςστο επίπεδο του RNA και επομένως και στο επίπεδο των πρωτεϊνών.Στα τρυπανοσώματα (παρασιτικά πρωτόζωα), ένας διαφορετικός μηχανισμόςδιόρθωσης RNA αλλάζει σημαντικά ορισμένα μιτοχονδριακά μόριαmRNA. Σχεδόν τα μισά από τα κατάλοιπα ουριδίνης σε αυτά τα μόρια mRNAεισάγονται με μηχανισμούς διόρθωσης RNA. Ένα καθοδηγητικό μόριο RNA αναγνωρίζειτην αλληλουχία που πρόκειται να τροποποιηθεί, και μια ουρά πολυ(U)στον οδηγό δίνει κατάλοιπα ουριδίνης στα μόρια mRNA, τα οποία υφίστανταιδιόρθωση. Είναι προφανές ότι οι αλληλουχίες του DNA δεν φανερώνουνπάντοτε πιστά την αλληλουχία των πρωτεϊνών που κωδικεύουν, αλλάλειτουργικά κρίσιμες αλλαγές μπορούν επίσης να συμβούν στο mRNA.1899Eπεξεργασία των προϊόντων της μεταγραφήςAappleoÏÈappleÔappleÚˆÙ½ÓË B-100MÂÙ¿ÊÚ·ÛË45365' C AA3'mRNA appleÔ˘ ‰ÂÓ ¤¯ÂÈ ‰ÈÔÚıˆı›1˘Ó·ÚÌÔÏfiÁËÛËÏÈappleÔappleÚˆÙ½Ó˘NH 4+AappleoÏÈappleÔappleÚˆÙ½ÓË B-48¢ÈfiÚıˆÛË RNAÌ ·apple·Ì›ÓˆÛË5' U AA3'mRNA appleÔ˘ ¤¯ÂÈ ‰ÈÔÚıˆı›MÂÙ¿ÊÚ·ÛË2152ÚfiÛ‰ÂÛˢappleÔ‰Ô¯¤· LDLEIKONA 28.26 Διόρθωση του RNA. Ενζυμικάκαταλυόμενη απαμίνωση μιας ειδικής κυτιδίνηςστο mRNA της απολιποπρωτεΐνης Β-100 αλλάζειένα κωδίκιο γλουταμίνης (CAA) σε κωδίκιο τερματισμού(UAA). Η απολιποπρωτεΐνη Β-48, μιακολοβή μορφή της πρωτεΐνης που έχει χάσει τηδομική περιοχή δέσμευσης του υποδοχέα LDL,δημιουργείται από αυτή τη μετα-μεταγραφική αλλαγήστην αλληλουχία του mRNA. [Κατά P.Hodges και J. Scott. Trends Biochem. Sci.17(1992):77.]28.3.3 Θέσεις ματίσματος σε πρόδρομα μόρια του mRNAεξειδικεύονται από αλληλουχίες στα άκρα ιντρονίωνΤα περισσότερα γονίδια στα ανώτερα ευκαρυωτικά αποτελούνται από εξόνιακαι ιντρόνια. Τα ιντρόνια πρέπει να εξαχθούν και τα εξόνια να συνδεθούν γιανα σχηματιστεί το τελικό mRNA με μια διεργασία που ονομάζεται μάτισμα.Το μάτισμα πρέπει να είναι εξαιρετικά ευαίσθητο: μια ολίσθηση έστω και ενόςνουκλεοτιδίου στο σημείο ματίσματος θα μετατόπιζε το πλαίσιο ανάγνωσηςστην 3΄-πλευρά του ματίσματος, δίνοντας μια τελείως διαφορετική αλληλουχίααμινοξέων. Επομένως, η σωστή θέση ματίσματος πρέπει να είναι καθαρά

© ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΑΚΕΣ ΕΚΔΟΣΕΙΣ ΚΡΗΤΗΣ ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑΤΙΚΟ ΥΛΙΚΟ ΓΙΑ ΤΟ ΧΗΜΙΚΟ ΤΜΗΜΑ ΤΟΥ ΠΑΝ/ΜΙΟΥ ΑΘΗΝΩΝ900ΚΕΦΑΛΑΙΟ 28 · Σύνθεση και μάτισμα RNAσημειωμένη.EIKONA 28.27 Θέσεις ματίσματος.Φαίνονται οι ομόφωνες αλληλουχίεςγια τις θέσεις ματίσματος 5΄ και 3΄.Το Py συμβολίζει την πυριμιδίνη.AÓÔ‰ÈÎfiÂÍfiÓÈÔı¤ÛË Ì·Ù›ÛÌ·ÙÔ˜ 5'AG GUAAGUı¤ÛˉȷÎÏ¿‰ˆÛ˘K·ıÔ‰ÈÎfiÂÍfiÓÈÔΥπάρχει κάποια ειδική αλληλουχία που δηλώνει τη θέση ματίσματος;Οι αλληλουχίες βάσεων των χιλιάδων συνδέσμων ιντρονίων-εξονίωνστα μεταγραφήματα RNA είναι γνωστές. Στα ευκαρυωτικά, από τους ζυμομύκητεςέως τα θηλαστικά, οι αλληλουχίες αυτές έχουν ένα κοινό δομικό πρώτυπο:η αλληλουχία βάσεων ενός ιντρονίου αρχίζει με GU και τελειώνει με AG. Ηομόφωνη αλληλουχία στο 5΄-άκρο του ιντρονίου σε σπονδυλωτά είναιAGGUAAGU (Eικόνα 28.27). Στο 3΄-άκρο ενός ιντρονίου η ομόφωνη αλληλουχίαείναι ένα τμήμα 10 πυριμιδινών (U ή C), ακολουθούμενο από οποιαδήποτεβάση και μετά από μια C, η οποία τελειώνει με την αμετάβλητη αλληλουχίαAG. Τα ιντρόνια έχουν επίσης μια σημαντική εσωτερική θέση πουτοποθετείται μεταξύ 20 και 50 νουκλεοτιδίων ανοδικά της θέσης ματίσματος3΄. Το σημείο αυτό ονομάζεται θέση διακλάδωσης για λόγους που θα γίνουν προφανείςσε λίγο. Στους ζυμομύκητες, η θέση διακλάδωσης σχεδόν πάντοτε είναιUACUAAC, ενώ στα θηλαστικά απαντά μια ποικιλία αλληλουχιών.Τμήματα των ιντρονίων, διαφορετικά από τις θέσεις ματίσματος 5΄ και 3΄καθώς και τη θέση διακλάδωσης, είναι λιγότερο σημαντικά για τον καθορισμότου σημείου όπου θα γίνει το μάτισμα. Το μήκος των ιντρονίων ποικίλλειαπό 50 μέχρι 10.000 νουκλεοτίδια. Το μεγαλύτερο μέρος ενός ιντρονίουμπορεί να απαλειφθεί χωρίς να αλλάζει η θέση ή η αποτελεσματικότητα τουματίσματος. Παρομοίως, το μάτισμα δεν επηρεάζεται από την εισαγωγή μεγάλωντμημάτων DNA στα ιντρόνια γονιδίων. Επιπλέον, χιμαιρικά ιντρόνιαπου κατασκευάστηκαν με μεθόδους ανασυνδυασμένου DNA από το 5΄-άκροενός ιντρονίου και το 3΄-άκρο ενός τελείως διαφορετικού ιντρονίου ματίζονταικανονικά, εφόσον δεν έχουν αλλαχθεί οι θέσεις ματίσματος και διακλάδωσης.Αντίθετα, μεταλλάξεις σε οποιαδήποτε από αυτές τις τρεις κρίσιμεςπεριοχές οδηγούν σε έκτροπο μάτισμα.Παρά τις γνώσεις μας για τις αλληλουχίες των θέσεων ματίσματος, η πρόβλεψησχημάτων ματίσματος από πληροφορίες αλληλουχιών γονιδιωματικούDNA παραμένει μια πρόκληση. Σε αλληλουχίες DNA υπάρχουν και άλλεςπληροφορίες που συμβάλλουν στην επιλογή θέσεων ματίσματος, αλλά δεν είναικατανεμημένες με κάποια κανονικότητα όπως οι αλληλουχίες των ίδιωντων θέσεων ματίσματος.AIÓÙÚfiÓÈÔı¤ÛË Ì·Ù›ÛÌ·ÙÔ˜ 3'(Py) n N C A G GΤο έκτροπο μάτισμα προκαλεί μερικές μορφές θαλασσαιμίας, μιαςομάδας κληρονομικών αναιμιών που χαρακτηρίζονται από την ελαττωματικήσύνθεση της αιμοσφαιρίνης. Σε έναν ασθενή, μια μετάλλαξη G σεA 19 νουκλεοτίδια μακριά από την κανονική θέση ματίσματος 3΄ του πρώτουιντρονίου δημιούργησε μια νέα θέση ματίσματος (Eικόνα 28.28). Το mRNAπου προέκυψε περιείχε μια σειρά κωδικίων που δεν υπάρχουν στα φυσιολογικάάτομα. Το έκτο κωδίκιο μετά το μάτισμα είναι ένα σήμα τερματισμού τηςσύνθεσης πρωτεϊνών, και έτσι η έκτροπη πρωτεΐνη τελειώνει πρώιμα. Μεταλλάξειςπου επηρεάζουν τις θέσεις ματίσματος έχει υπολογιστεί ότι προκαλούν το15% των γενετικών νόσων.º˘ÛÈÔÏÔÁÈÎfi 3'-¿ÎÚÔÙÔ˘ ÈÓÙÚÔÓ›Ô˘º˘ÛÈÔÏÔÁÈÎfi5' CCTATTGGTCTATTTTCCACCCTTAGGCTGCTG3'‚-ı·Ï·ÛÛ·ÈÌ›· 5' CCTATTAGTCTATTTTCCACCCTTAGGCTGCTG3'EIKONA 28.28 Ελαττώματα ματίσματος. Μετάλλαξη μιας βάσης (G σε Α) σε ένα ιντρόνιο του γονιδίουτης β-σφαιρίνης οδηγεί σε θαλασσαιμία. Η μετάλλαξη αυτή δημιουργεί μια νέα θέση ματίσματος 3΄(μπλε) παρόμοια με εκείνη του φυσιολογικού ματίσματος (κίτρινο) αλλά μακρύτερα ανοδικά.

© ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΑΚΕΣ ΕΚΔΟΣΕΙΣ ΚΡΗΤΗΣ ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑΤΙΚΟ ΥΛΙΚΟ ΓΙΑ ΤΟ ΧΗΜΙΚΟ ΤΜΗΜΑ ΤΟΥ ΠΑΝ/ΜΙΟΥ ΑΘΗΝΩΝ3'901Eπεξεργασία των προϊόντων της μεταγραφήςEÍfiÓÈÔ1ı¤ÛËÌ·Ù›ÛÌ·ÙÔ˜5'5'AGPGUAAGUEÍfiÓÈÔ22' OH3'GPGACNY nı¤ÛËÌ·Ù›ÛÌ·ÙÔ˜3'YAR £¤ÛËY ‰È·ÎÏ¿‰ˆÛ˘NY5'GUAAGU5'P3' OHGAGPGACYP3'2' ARYNY3'GPGA+5'GUAAGUP3'OHGACNY nYP3'2' ARYNY5'Úfi‰ÚÔÌÔ ÌfiÚÈÔEӉȿÌÂÛÔ‰ÔÌ‹˜ ‚Úfi¯Ô˘ÚÔ˚fiÓÌ·Ù›ÛÌ·ÙÔ˜MÔÚÊ‹ ‚Úfi¯Ô˘ÙÔ˘ ÈÓÙÚÔÓ›Ô˘EIKONA 28.29 Μηχανισμός ματίσματος που χρησιμοποιείται για πρόδρομα μόρια mRNA. Το ανοδικό(5΄) εξόνιο φαίνεται μπλε, το καθοδικό (3΄) εξόνιο φαίνεται πράσινο και η θέση διακλάδωσης φαίνεταικίτρινη. Το Υ σημαίνει νουκλεοτίδιο πουρίνης, το R νουκλεοτίδιο πυριμιδίνης και το Ν οποιοδήποτενουκλεοτίδιο. Η θέση ματίσματος 5΄ προσβάλλεται από την ομάδα 2΄-ΟΗ του καταλοίπου αδενοσίνηςτης θέσης διάσπασης. Η θέση ματίσματος 3΄ προσβάλλεται από τη νεοσχηματιζόμενη ομάδα 3΄-ΟΗ τουανοδικού εξονίου. Τα εξόνια συνδέονται και το ιντρόνιο ελευθερώνεται με τη μορφή βρόχου. [Κατά P.A. Sharp, Cell 2(1985):3980.]28.3.4 Tο μάτισμα αποτελείται από δύο αντιδράσειςτρανσεστεροποίησηςΤο μάτισμα νεοσυντιθέμενων μορίων mRNA είναι μια πολύπλοκη διεργασία.Χρειάζεται τη συνεργασία αρκετών μικρών μορίων RNA και πρωτεϊνών πουσχηματίζουν ένα μεγάλο σύμπλοκο, το οποίο ονομάζεται σωμάτιο ματίσματος.Ωστόσο, η χημεία της διεργασίας ματίσματος είναι απλή. Το μάτισμα αρχίζειμε τη διάσπαση του φωσφοδιεστερικού δεσμού μεταξύ του ανοδικού εξονίου(εξόνιο 1) και του 5΄-άκρου του ιντρονίου (Eικόνα 28.29). Η προσβάλλουσαομάδα στην αντίδραση αυτή είναι η 2΄-υδροξυλική ομάδα ενός καταλοίπου αδενυλικούστη θέση διακλάδωσης. Ένας 2΄,5΄-φωσφοδιεστερικός δεσμός σχηματίζεταιμεταξύ αυτού του καταλοίπου Α και της φωσφορικής ομάδας του 5΄άκρουτου ιντρονίου. Αυτή η αντίδραση είναι μια τρανσεστεροποίηση.R 1OO– –OO OP RRTÚ·ÓÛÂÛÙÂÚÔappleÔ›ËÛË32 + HR POO1O OR 3 +HOΕπισημαίνεται ότι το συγκεκριμένο κατάλοιπο αδενυλικού συνδέεται επίσηςμε άλλα δύο νουκλεοτίδια διά μέσου κανονικών 3΄,5΄-φωσφοδιεστερικώνδεσμών (Eικόνα 28.30). Επομένως, μια διακλάδωση δημιουργείται στη θέση αυτήκαι σχηματίζεται ένα ενδιάμεσο δομής βρόχου.Στη συνέχεια, το 3΄-ΟΗ άκρο του εξονίου 1 προσβάλλει τον φωσφοδιεστερικόδεσμό μεταξύ του ιντρονίου και του εξονίου 2. Τα εξόνια 1 και 2 συνδέονταικαι το ιντρόνιο ελευθερώνεται με τη μορφή βρόχου. Και στην περίπτωσηαυτή η αντίδραση είναι μια τρανσεστεροποίηση. Επομένως, το μάτι-R 2OPO5'O–OO3' 2'O O O–O POA‰ÂÓ›ÓËO O–O POO –OPOOOH°Ô˘·Ó›ÓËEIKONA 28.30 Θέση διακλάδωσης κατά τομάτισμα. Η δομή της θέσης διακλάδωσης στοενδιάμεσο δομής βρόχου στο οποίο το κατάλοιποαδενυλικού συνδέεται με τρία νουκλεοτίδια μέσωφωσφοδιεστερικών δεσμών. Ο νέος σύνδεσμος2΄-5΄ φαίνεται κόκκινος και οι συνηθισμένοι3΄- 5΄δεσμοί μπλε.

© ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΑΚΕΣ ΕΚΔΟΣΕΙΣ ΚΡΗΤΗΣ ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑΤΙΚΟ ΥΛΙΚΟ ΓΙΑ ΤΟ ΧΗΜΙΚΟ ΤΜΗΜΑ ΤΟΥ ΠΑΝ/ΜΙΟΥ ΑΘΗΝΩΝ902σμαΚΕΦΑΛΑΙΟ 28 · Σύνθεση και μάτισμα RNAεπιτυγχάνεται με δύο αντιδράσεις τρανσεστεροποίησης και όχι με υδρόλυσηακολουθούμενη από ανασύνδεση. Η πρώτη αντίδραση δημιουργεί μια ελεύθερη3΄-υδροξυλική ομάδα στο 3΄-άκρο του εξονίου 1, και η δεύτερη αντίδρασησυνδέει την ομάδα αυτή με την 5΄-φωσφορική ομάδα του εξονίου 2. Ο αριθμόςτων φωσφοδιεστερικών δεσμών παραμένει ο ίδιος κατά τη διάρκεια αυτών τωνβημάτων, γεγονός εξαιρετικά κρίσιμο διότι επιτρέπει στην αντίδραση ματίσματοςνα προχωρά χωρίς πηγή ενέργειας όπως η ΑΤΡ και η GTP.28.3.5 Mικρά πυρηνικά μόρια RNA στα σωμάτια ματίσματος καταλύουντο μάτισμα πρόδρομων μορίων mRNAΟ πυρήνας περιέχει πολλά είδη μικρών μορίων RNA με λιγότερα από 300 νουκλεοτίδια,τα οποία αναφέρονται ως μικρά πυρηνικά μόρια RNA (small nuclearRNA, snRNA). Μερικά από αυτά —τα οποία συμβολίζονται ως U1, U2, U4,U5 και U6— είναι ουσιώδη για το μάτισμα πρόδρομων mRNA. Οι δευτεροταγείςδομές αυτών των μορίων RNA είναι εξαιρετικά συντηρημένες σε οργανισμούςπου εκτείνονται από τους ζυμομύκητες μέχρι τον άνθρωπο. Αυτά ταμόρια RNA συνδέονται με ειδικές πρωτεΐνες σχηματίζοντας σύμπλοκα πουονομάζονται μικρά πυρηνικά ριβονουκλεοπρωτεϊνικά σωμάτια (small nuclearribonucleoprotein particles, snRNP). Οι ερευνητές συχνά τα αναφέρουν ως«σναρπς» (snurps). Τα σωμάτια ματίσματος είναι μεγάλα (60 S) δυναμικά συγκροτήματααποτελούμενα από μόρια snRNP, άλλες πρωτεΐνες που ονομάζονταιπαράγοντες ματίσματος και το πρόδρομο μόριο mRNA που υφίσταται τηνεπεξεργασία (Πίνακας 28.3)ΠΙΝΑΚΑΣ 28.3 Mικρά πυρηνικά ριβονουκλεοπρωτεϊνικά σωμάτια (snRNP)στον μηχανισμό ματίσματος πρόδρομων μορίων mRNAMόρια Mέγεθος των snRNAsnRNP (νουκλεοτίδια) PόλοςU1 165 Δεσμεύεται στη θέση ματίσματος 5’ καιστη συνέχεια στη θέση ματίσματος 3’U2 185 Δεσμεύεται στη θέση διακλάδωσης καισχηματίζει μέρος του καταλυτικού κέντρουU5 116 Δεσμεύεται στη θέση ματίσματος 5’U4 145 Επισκιάζει την καταλυτική δράση του U6U6 106 Kαταλύει το μάτισμαΣτα κύτταρα των θηλαστικών, το μάτισμα αρχίζει με την αναγνώριση τηςθέσης ματίσματος 5΄ από το snRNP U1 (Eικόνα 28.31). Πράγματι, το snRNPU1 περιέχει μια εξαιρετικά συντηρημένη αλληλουχία έξι νουκλεοτιδίων πουσχηματίζουν ζεύγη βάσεων με τη θέση ματίσματος 5΄ του προ-mRNA. Αυτήη δέσμευση αρχίζει τη συναρμολόγηση στο μόριο του προ-mRNA.ı¤ÛË Ì·Ù›ÛÌ·ÙÔ˜ 5'Úfi‰ÚÔÌÔ ÌfiÚÈÔ mRNA5'AÓÔ‰ÈÎfi ÂÍfiÓÈÔGUAAGU3'3'C A UsnRNA U1UCA Î¿Ï˘ÌÌ· 5'Στη συνέχεια, το snRNP U2 δεσμεύεται στη θέση διακλάδωσης στο ιντρόνιοδιά μέσου ζευγών βάσεων μεταξύ της εξαιρετικά συντηρημένης αλληλουχίαςτου snRNP U2 και του προ-mRNA. Η δέσμευση του snRNP U2 χρειάζεταιυδρόλυση ΑΤΡ. Ένα προσυναρμολογημένο σύμπλοκο U4-U5-U6 συνδέε-

© ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΑΚΕΣ ΕΚΔΟΣΕΙΣ ΚΡΗΤΗΣ ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑΤΙΚΟ ΥΛΙΚΟ ΓΙΑ ΤΟ ΧΗΜΙΚΟ ΤΜΗΜΑ ΤΟΥ ΠΑΝ/ΜΙΟΥ ΑΘΗΝΩΝ£¤ÛË ‰È·ÎÏ¿‰ˆÛ˘EÍfiÓÈÔ 1 IÓÙÚfiÓÈÔ EÍfiÓÈÔ 25' GUA AG 3'Úfi‰ÚÔÌÔ ÌfiÚÈÔ mRNAU1U2903Eπεξεργασία των προϊόντων της μεταγραφήςU1U25'GUAAG3'‡ÌappleÏÔÎÔU4-U5-U65'AGGUAU5U6U4Ï‹Ú˜ ۈ̿ÙÈÔ Ì·Ù›ÛÌ·ÙÔ˜3'EIKONA 28.31 Συναρμολόγηση σωματίου ματίσματος.Το U1 (μπλε) συνδέεται στη θέση ματίσματος5΄ και το U2 (κόκκινο) στη θέση διακλάδωσης.Στη συνέχεια, ένα προσχηματισμένοσύμπλοκο U4-U5-U6 συνδέεται με τη διάταξηαυτή για να σχηματίσει το πλήρες σωμάτιο ματίσματος.ται με αυτό το σύμπλοκο U1, U2 και του πρόδρομου μορίου mRNA για να σχηματιστείτο πλήρες σωμάτιο ματίσματος. Αυτή η σύνδεση επίσης χρειάζεταιυδρόλυση ΑΤΡ.Μια αποκαλυπτική όψη των αλληλεπιδράσεων μεταξύ των μορίων RNAστη συναρμολόγηση αυτή δόθηκε από την εξέταση διασυνδέσεων που σχηματίζονταιαπό το ψοραλένιο, ένα φωτοενεργοποιούμενο αντιδραστήριο, τοοποίο συνδέει γειτονικές πυριμιδίνες σε περιοχές ζευγαρωμένων βάσεων. Αυτέςοι διασυνδέσεις υποδηλώνουν ότι το μάτισμα γίνεται με τον ακόλουθο τρόπο:Πρώτα, το U5 αλληλεπιδρά με αλληλουχίες του εξονίου στη θέση ματίσματος5΄ και μετά με το εξόνιο 3΄. Στη συνέχεια, το U6 αποσυνδέεται από τοU4 και υφίσταται μια ενδομοριακή αναδιάταξη η οποία επιτρέπει το ζευγάρωματων βάσεων με το U2 και εκτοπίζει το U1 από το σωμάτιο ματίσματοςαλληλεπιδρώντας με το 5΄-άκρο του ιντρονίου. Η έλικα U2•U6 είναι απολύτωςαναγκαία για το μάτισμα, γεγονός που υποδηλώνει ότι τα μόρια snRNA U2και U6 πιθανώς σχηματίζουν το ενεργό κέντρο του σωματίου ματίσματος (Eικόνα28.32). Το U4 χρησιμεύει ως αναστολέας ο οποίος επισκιάζει το U6 μέχριςότου οι ειδικές θέσεις ματίσματος ευθυγραμμιστούν. Αυτές οι ανακατατάξειςέχουν ως αποτέλεσμα την πρώτη αντίδραση τρανσεστεροποίησης, δημιουργώνταςτο ενδιάμεσο δομής βρόχου και το διαχωρισμένο εξόνιο 5΄.Περαιτέρω ανακατατάξεις του RNA στο σωμάτιο ματίσματος διευκολύνουντη δεύτερη τρανσεστεροποίηση. Οι ανακατατάξεις αυτές ευθυγραμμίζουν τοελεύθερο εξόνιο 5΄ με το εξόνιο 3΄ ούτως ώστε η 3΄-υδροξυλική ομάδα του3'5'snRNA U6ACA GA GA U GAU CAG C AC GU5'AA C U A GAUsnRNA U23'EÍfiÓÈÔ 2G A5'GEÍfiÓÈÔ 1U G U A G U A 3'A C A U C U AAÚfi‰ÚÔÌÔ ÌfiÚÈÔ mRNAG UEIKONA 28.32 Καταλυτικό κέντρο ματίσματος.Το καταλυτικό κέντρο του σωματίου ματίσματοςσχηματίζεται από το snRNA U2 (κόκκινο)και το snRNA U6 (πράσινο), τα οποία συνδέονταιμε ζεύγη βάσεων. Το U2 σχηματίζει επίσης ζεύγηβάσεων με τη θέση διακλάδωσης του πρόδρομουμορίου mRNA. [Κατά H.D. Madhani και C.Guthrie. Cell 71(1992):803.]

© ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΑΚΕΣ ΕΚΔΟΣΕΙΣ ΚΡΗΤΗΣ ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑΤΙΚΟ ΥΛΙΚΟ ΓΙΑ ΤΟ ΧΗΜΙΚΟ ΤΜΗΜΑ ΤΟΥ ΠΑΝ/ΜΙΟΥ ΑΘΗΝΩΝ904εξονίουΚΕΦΑΛΑΙΟ 28 · Σύνθεση και μάτισμα RNAAκτίνηAλκοολική αφυδρογονάσηAλδολάσηK-rasKαλσιτονίνηIνωδογόνοIνοσυνδετίνηMυοσίνηΝευροαυξητικός παράγονταςκυττάρωνTροπομυοσίνηTροπονίνηprÔ-mRNAEÍfiÓÈÔ 1 EÍfiÓÈÔ 2A EÍfiÓÈÔ 2B EÍfiÓÈÔ 3EIKONA 28.33 Εναλλακτικά σχήματα ματίσματος.Ένα προ-mRNA με πολλαπλά εξόνια μερικέςφορές ματίζεται με διαφορετικούς τρόπους.Εδώ, με παρόντα δύο εναλλακτικά εξόνια(εξόνια 2Α και 2Β) το mRNA μπορεί να παραχθείμε κανένα, ένα από το καθένα ή και τα δύοεξόνια. Πιο πολύπλοκοι τρόποι εναλλακτικού ματίσματοςείναι επίσης πιθανοί.ΠΙΝΑΚΑΣ 28.4 Eπιλεγμένες πρωτεΐνεςπου προέρχονται από εναλλακτικόμάτισμα του RNAΠηγή: R. E. Breitbart, A. Andreadis, και B.Nadal-Ginard. Annu. Rev. Biochem.56(1987):467-495.5΄ τοποθετείται κατάλληλα για να μπορεί να προσβάλλει πυρηνοφιλικάτη θέση ματίσματος 3΄ και να δημιουργήσει το ματισμένο προϊόν. Τα U2,U5 και U6 που είναι δεσμευμένα στο εκτεμνόμενο ιντρόνιο δομής βρόχουελευθερώνονται συμπληρώνοντας την αντίδραση ματίσματος.Πολλά από τα βήματα στη διεργασία του ματίσματος χρειάζονται υδρόλυσηΑΤΡ. Πώς η ελεύθερη ενέργεια που προέρχεται από την υδρόλυση τηςΑΤΡ χρησιμοποιείται για να ωθήσει την υδρόλυση; Για να επιτευχθούν οι καλοδιαταγμένεςανακατατάξεις που είναι αναγκαίες για το μάτισμα, RNA-ελικάσεςπου ωθούνται από την υδρόλυση ΑΤΡ πρέπει να ξετυλίξουν τις έλικεςτου RNA και να επιτρέψουν τον σχηματισμό εναλλακτικών ζευγών βάσεων.Επομένως, αξίζει να σημειωθούν δύο χαρακτηριστικά της διεργασίας ματίσματος.Πρώτον, μόρια RNA παίζουν καθοριστικό ρόλο στην καθοδήγηση της ευθυγράμμισηςτων θέσεων ματίσματος και στη διεξαγωγή της κατάλυσης. Δεύτερον,ελικάσες ωθούμενες από την υδρόλυση της ΑΤΡ ξετυλίγουν δίκλωνα ενδιάμεσα μόριαRNA, γεγονός που διευκολύνει την κατάλυση και επάγει την ελευθέρωση των μορίωνsnRNP από το mRNA.28.3.6 Mερικά μόρια προ-mRNA μπορούν να ματίζονται μεεναλλακτικούς τρόπους δίνοντας διαφορετικά mRNAΤο εναλλακτικό μάτισμα είναι ένας αρκετά διαδεδομένος μηχανισμός για τη δημιουργίαπρωτεϊνικής ποικιλομορφίας. Συνιστά τη διαφορική συμμετοχή εξονίωνσε ένα ώριμο RNA. Το εναλλακτικό μάτισμα μπορεί να ρυθμίζεται για ναπαράγει διαφορετικές μορφές μιας πρωτεΐνης για ειδικούς ιστούς ή στάδια τηςανάπτυξης (Eικόνα 28.33). Ένα δείγμα του αυξανόμενου καταλόγου των πρωτεϊνώνπου είναι γνωστές ως προϊόντα εναλλακτικού ματίσματος παρουσιάζεταιστον Πίνακα 28.4. Πρόσφατοι υπολογισμοί δείχνουν ότι τα προϊόντα RNAτου 30% των ανθρώπινων γονιδίων ματίζονται εναλλακτικά. Το εναλλακτικό μάτισμααποτελεί έναν ισχυρό μηχανισμό που επεκτείνει την ποικιλομορφία των γονιδιωματικώναλληλουχιών. Ας υποθέσουμε, παραδείγματος χάριν, ότι είναι προνομιακόνα υπάρχουν δύο μορφές μιας πρωτεΐνης με κάπως διαφορετικές ιδιότητες,οι οποίες εκφράζονται σε διαφορετικούς ιστούς. Η εξέλιξη μιας πορείαςεναλλακτικού ματίσματος παρέχει έναν τρόπο ικανοποίησης αυτής της ανάγκηςπου είναι διαφορετικός από τον διπλασιασμό και την εξειδίκευση γονιδίων.Επιπλέον, το εναλλακτικό μάτισμα δίνει τη δυνατότητα για συνδυαστικόέλεγχο. Ας πάρουμε ένα γονίδιο με πέντε θέσεις όπου μπορεί να λάβει χώραεναλλακτικό μάτισμα. Με την υπόθεση ότι αυτές οι πορείες εναλλακτικού ματίσματοςμπορεί να ρυθμίζονται ανεξάρτητα, μπορεί να δημιουργηθεί ένα σύνολοαπό 2 5 = 32 διαφορετικά μόρια mRNA. Περισσότερες μελέτες γύρω απότο εναλλακτικό μάτισμα και τους μηχανισμούς επιλογής της θέσης ματίσματοςθα είναι πραγματικά κρίσιμες για το πεδίο της πρωτεωμικής.28.4 Η ΑΝΑΚΑΛΥΨΗ ΤΟΥ ΚΑΤΑΛΥΤΙΚΟΥ RNA ΗΤΑΝΑΠΟΚΑΛΥΠΤΙΚΗ ΤΟΣΟ ΣΕ ΣΧΕΣΗ ΜΕ ΤΟΝ ΜΗΧΑΝΙΣΜΟ ΟΣΟ ΚΑΙΜΕ ΤΗΝ ΕΞΕΛΙΞΗΤα RNA αποτελούν μια εντυπωσιακά ευπροσάρμοστη ομάδα μορίων. Όπως είδαμε,το μάτισμα καταλύεται κυρίως από μόρια RNA, με τις πρωτεΐνες να παίζουνδευτερεύοντα ρόλο. Ένα άλλο ένζυμο που περιέχει ένα βασικό συστατικόRNA είναι η ριβονουκλεάση Ρ (RNAση Ρ), η οποία καταλύει την ωρίμασητου tRNA με την αφαίρεση νουκλεοτιδίων από το 5΄-άκρο των πρόδρομωνμορίων (Εδάφιο 28.1.8). Τέλος, όπως θα δούμε στο Κεφάλαιο 29, το συστατικόRNA των ριβοσωμάτων είναι ο καταλύτης που επιτελεί τη σύνθεση πρωτεϊνών.

© ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΑΚΕΣ ΕΚΔΟΣΕΙΣ ΚΡΗΤΗΣ ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑΤΙΚΟ ΥΛΙΚΟ ΓΙΑ ΤΟ ΧΗΜΙΚΟ ΤΜΗΜΑ ΤΟΥ ΠΑΝ/ΜΙΟΥ ΑΘΗΝΩΝ5'905Kαταλυτικό RNAAÓÔ‰ÈÎfiÂÍfiÓÈÔIÓÙÚfiÓÈÔ5'GOHG5'OH3'+M·ÙÈṲ̂ӷÂÍfiÓÈ·G5'5'K·ıÔ‰ÈÎfiÂÍfiÓÈÔ3'3'414GOH399395EIKONA 28.34 Αυτο-μάτισμα. Ένα πρόδρομο μόριο του ριβοσωματικού RNA από το Tetrahymena ματίζειτον εαυτό του παρουσία ενός συμπαράγοντα γουανοσίνης (G, φαίνεται πράσινο). Ένα ιντρόνιο 414νουκλεοτιδίων (κόκκινο) ελευθερώνεται με την πρώτη αντίδραση ματίσματος. Το ιντρόνιο αυτό στη συνέχειαματίζει ξανά τον εαυτό του δύο φορές, παράγοντας ένα γραμμικό RNA το οποίο έχει χάσει συνολικά19 νουκλεοτίδια. Αυτό το RNA L19 είναι καταλυτικά ενεργό. [Κατά T. Cech, RNA as an enzyme.© 1986 by Scientific American, Inc. κατοχυρωμένα δικαιώματα.]3'3'RNAL19Η πολλαπλή χρησιμότητα του RNA αρχικά έγινε αντιληπτή από παρατηρήσειςπου αφορούσαν τις διεργασίες οι οποίες λάμβαναν χώρα σε ένα ριβοσωματικόRNA ενός μονοκύτταρου ευκαρυωτικού οργανισμού. Στο Tetrahymena(ένα βλεφαριδοφόρο πρωτόζωο), ένα ιντρόνιο 414 νουκλεοτιδίων αφαιρείταιαπό ένα πρόδρομο μόριο 6,4 kb για να δώσει το ώριμο μόριο rRNA 26 S(Eικόνα 28.34). Με μια σειρά θαυμάσιων μελετών αυτής της αντίδρασης ματίσματος,ο Thomas Cech και οι συνεργάτες του απέδειξαν ότι το RNA ματίζειτον εαυτό του για την ακριβή εκτομή του ιντρονίου των 414 νουκλεοτιδίων.Αυτά τα εντυπωσιακά πειράματα έδειξαν ότι ένα μόριο RNA μπορεί να ματίζειτον εαυτό του απουσία πρωτεϊνών και ότι, πράγματι, μπορεί να έχει εξαιρετικάειδική καταλυτική δραστικότητα.Η αντίδραση αυτο-ματίσματος χρειάζεται ένα πρόσθετο νουκλεοτίδιο γουανοσίνης.Τα νουκλεοτίδια προστέθηκαν αρχικά στο μείγμα της αντίδρασηςδιότι επικρατούσε η άποψη ότι η ΑΤΡ ή η GTP μπορεί να ήταν απαραίτητεςως πηγή ενέργειας. Πράγματι, βρέθηκε ότι τα νουκλεοτίδια ήταν απαραίτηταως συμπαράγοντες. Ο απαιτούμενος συμπαράγοντας αποδείχθηκε ότι είναι μιαμονάδα γουανοσίνης, με τη μορφή γουανοσίνης, GMP, GDP ή GTP. Το G(συμβολίζει κάθε ένα από αυτά τα μόρια) δεν χρησιμεύει ως πηγή ενέργειας,αλλά ως μια προσβάλλουσα ομάδα που ενσωματώνεται μεταβατικά στο RNA(βλ. Eικόνα 28.34). Το G δεσμεύεται στο RNA και στη συνέχεια προσβάλλειτη θέση ματίσματος 5΄ για να σχηματίσει έναν φωσφοδιεστερικό δεσμό με το5΄ άκρο του ιντρονίου. Αυτή η αντίδραση τρανσεστεροποίησης δημιουργεί μια3΄-ΟΗ ομάδα στο άκρο του ανοδικού εξονίου. Στη συνέχεια, η νέα αυτή ομάδα3΄-ΟΗ προσβάλλει τη θέση ματίσματος 3΄. Η δεύτερη αυτή τρανσεστεροποίησηενώνει τα δύο εξόνια και οδηγεί στην ελευθέρωση του εξονίου των414 νουκλεοτιδίων.Το αυτο-μάτισμα εξαρτάται από τη δομική ακεραιότητα του πρόδρομου μορίουτου rRNA. Το περισσότερο από το ιντρόνιο είναι απαραίτητο για το αυτο-μάτισμα.Το μόριο αυτό, όπως και πολλά μόρια RNA, έχει μια μορφή αναδιπλωμένηςδομής με πολλούς δίκλωνους βραχίονες και θηλιές (Eικόνα 28.35).Η εξέταση της τριδιάστατης δομής, που προσδιορίστηκε με κρυσταλλογραφίαμε ακτίνες Χ, αποκαλύπτει μια συμπαγή αναδιπλωμένη δομή που είναι από πολλέςπλευρές ανάλογη με τις δομές πρωτεϊνικών ενζύμων. Μια καλά καθορισμένηθήκη για τη δέσμευση της γουανοσίνης σχηματίζεται μέσα στη δομή αυτή.£¤Ûˉ¤ÛÌ¢Û˘ÁÔ˘·ÓÔÛ›Ó˘EIKONA 28.35 Δομή ενός αυτο-ματιζόμενουιντρονίου. Η δομή ενός μεγάλου τμήματοςτου αυτο-ματιζόμενου ιντρονίου τουTetrahymena αποκαλύπτει ένα πρότυπο περίπλοκηςαναδίπλωσης ελίκων και θηλιών. Οι βάσειςφαίνονται με πράσινο η Α, κίτρινο η C, πορφυρόη G και πορτοκαλί η U.

© ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΑΚΕΣ ΕΚΔΟΣΕΙΣ ΚΡΗΤΗΣ ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑΤΙΚΟ ΥΛΙΚΟ ΓΙΑ ΤΟ ΧΗΜΙΚΟ ΤΜΗΜΑ ΤΟΥ ΠΑΝ/ΜΙΟΥ ΑΘΗΝΩΝ906ΗΚΕΦΑΛΑΙΟ 28 · Σύνθεση και μάτισμα RNA5'5'5'£¤Ûˉ¤ÛÌ¢Û˘ GAÓÔ‰ÈÎfiÂÍfiÓÈÔGPUC U C U C U P AA G G G A G GGG OH PUC U C U C U P AA G G G A G GC U C U C UA G G G A G GA GGGAGGGPUOHGAGOHAGK·ıÔ‰ÈÎfiÂÍfiÓÈÔ°Ú·ÌÌÈÎfi ÈÓÙÚfiÓÈÔ+5' CUCUCUU3'M·ÙÈṲ̂ÓÔ RNA(Û˘Ó‰Â‰Â̤ӷ ÂÍfiÓÈ·)3'IÓÙÚfiÓÈÔEIKONA 28.36 Μηχανισμός αυτο-ματίσματος.Ο καταλυτικός μηχανισμός του αυτο-ματιζόμενουιντρονίου του Tetrahymena περιλαμβάνει μια σειράαντιδράσεων τρανσεστεροποίησης. [Κατά T.Cech, RNA as an enzyme. © 1986 by ScientificAmerican, Inc., κατοχυρωμένα δικαιώματα.]3'3'ανάλυση της αλληλουχίας των βάσεων του πρόδρομου μορίου rRNA έδειξεότι η θέση ματίσματος 5΄ ευθυγραμμίζεται με τα καταλυτικά κατάλοιπα τωνζευγών βάσεων μεταξύ μιας περιοχής πλούσιας σε πυριμιδίνες (CUCUCU) τουανοδικού εξονίου και μιας αλληλουχίας-οδηγού πλούσιας σε πουρίνες (GGGA GG)μέσα στο ιντρόνιο (Eικόνα 28.36). Το ιντρόνιο φέρνει κοντά τον συμπαράγοντατης γουανοσίνης και τη θέση ματίσματος 5΄ έτσι ώστε η 3΄-υδροξυλικήομάδα (3΄-ΟΗ) του G να μπορεί να προσβάλει πυρηνοφιλικά το άτομο του φωσφόρουστη θέση ματίσματος. Ένα άλλο μέρος του ιντρονίου στη συνέχειακρατά το καθοδικό εξόνιο σε θέση προσβολής από τη νεοσχηματιζόμενη 3΄-ΟΗ ομάδα του ανοδικού εξονίου. Ένας φωσφοδιεστερικός δεσμός σχηματίζεταιμεταξύ των δύο εξονίων και το ιντρόνιο ελευθερώνεται ως γραμμικό μόριο.Όπως και στην κατάλυση από πρωτεϊνικά ένζυμα, η αυτο-κατάλυση τουσχηματισμού ενός δεσμού και η διάσπαση μέσα στο πρόδρομο μόριο rRNAείναι εξαιρετικά εξειδικευμένη.Η ανακάλυψη ενζυμικής δραστικότητας στο αυτο-ματιζόμενο ιντρόνιο καιστη συνιστώσα RNA της RNAσης Ρ έχει ανοίξει νέες περιοχές αναζήτησηςκαι έχει αλλάξει τον τρόπο σκέψης για τη μοριακή εξέλιξη. Η ανακάλυψη ότιτο RNA μπορεί να είναι τόσο καλός καταλύτης όσο και φορέας πληροφοριώνυποδηλώνει ότι θα πρέπει να υπήρξε ένας κόσμος RNA νωρίς κατά την εξέλιξητης ζωής και πριν από την εμφάνιση του DNA και των πρωτεϊνών (Εδάφιο2.2.2).Τα πρόδρομα μόρια του αγγελιαφόρου RNA στα μιτοχόνδρια των ζυμομυκήτωνκαι των μυκήτων υφίστανται επίσης αυτο-μάτισμα, καθώς και ορισμέναπρόδρομα μόρια RNA στους χλωροπλάστες μονοκύτταρων οργανισμών,όπως είναι η Chlamydomonas. Αντιδράσεις αυτο-ματίσματος μπορούν να ταξινομηθούνσύμφωνα με τη φύση της μονάδας που προσβάλλει την ανοδική θέσηματίσματος. Το αυτο-μάτισμα της ομάδας Ι διεκπεραιώνεται από έναν συμπαράγονταγουανοσίνης, όπως στο Tetrahymena. Η προσβάλλουσα ομάδα στοαυτο-μάτισμα της ομάδας ΙΙ είναι η 2΄-ΟΗ ενός ειδικού αδενυλικού του ιντρονίου(Eικόνα 28.37).Οι μηχανισμοί αυτο-ματίσματος των ομάδων Ι και ΙΙ μοιάζουν με το μάτισμαπου καταλύεται από σωμάτια ματίσματος ως προς δύο σημεία. Πρώτον,στο αρχικό βήμα, μια υδροξυλική ομάδα ριβόζης προσβάλλει τη θέση ματίσματος5΄. Το νεοσχηματιζόμενο 3΄-ΟΗ άκρο του ανοδικού εξονίου προσβάλλειτη θέση ματίσματος 3΄ για να σχηματίσει έναν φωσφοδιεστερικό δεσμόμε το καθοδικό εξόνιο. Δεύτερον, και οι δύο αντιδράσεις είναι τρανσεστεροποιήσειςστις οποίες οι φωσφορικές ομάδες σε κάθε θέση ματίσματοςδιατηρούνται στα προϊόντα. Ο αριθμός των φωσφοδιεστερικών δεσμών παραμένεισταθερός. Το μάτισμα της ομάδας ΙΙ μοιάζει με το μάτισμα που καταλύεταιαπό σωμάτιο ματίσματος πρόδρομων μορίων του mRNA κατά μερικούςακόμη τρόπους. Η προσβολή της θέσης ματίσματος 5΄ πραγματοποιείται απόένα μέρος του ίδιου του ιντρονίου (την ομάδα 2΄-ΟΗ της αδενοσίνης) και όχιαπό έναν εξωτερικό παράγοντα (G). Και στις δύο περιπτώσεις το ιντρόνιοελευθερώνεται με τη μορφή δομής βρόχου. Επιπλέον, σε μερικές περιπτώσεις,το ιντρόνιο της ομάδας ΙΙ μεταγράφεται σε κομμάτια τα οποία συναρμολογούνταιμε δεσμούς υδρογόνου για να σχηματίσουν το καταλυτικό ιντρόνιο,με έναν τρόπο ανάλογο με τη συναρμολόγηση των snRNA στο σωμάτιο ματίσματος.Οι ομοιότητες αυτές έχουν οδηγήσει στην υπόθεση ότι το μάτισμα τουmRNA που καταλύεται από το σωμάτιο ματίσματος εξελίχθηκε απόαυτο-μάτισμα καταλυόμενο από το RNA. Το μάτισμα της ομάδας ΙΙ μπορείπολύ καλά να είναι ένα ενδιάμεσο μεταξύ του ματίσματος ομάδας Ι και του ματίσματοςστον πυρήνα των ευκαρυωτικών κυττάρων. Ένα σημαντικό βήμα στημετάβαση αυτή ήταν η μεταφορά καταλυτικής δύναμης από το ίδιο το ιντρόνιο σε

© ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΑΚΕΣ ΕΚΔΟΣΕΙΣ ΚΡΗΤΗΣ ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑΤΙΚΟ ΥΛΙΚΟ ΓΙΑ ΤΟ ΧΗΜΙΚΟ ΤΜΗΜΑ ΤΟΥ ΠΑΝ/ΜΙΟΥ ΑΘΗΝΩΝOÌ¿‰· IAYTO-MATIZOMENA INTPONIAOÌ¿‰· IIMATIMA TOY YPHNIKOY mRNA OYKATA§YETAI AO TO øMATIO MATIMATOˆÌ¿ÙÈÔ Ì·Ù›ÛÌ·ÙÔ˜P3'HO GPPHO AP2'P2'HO APPG3'OHP3' P AOHPA3' POHPPPG3'HOPP AHO 3'PAPHO 3'άλλα μόρια. Ο σχηματισμός σωματίων ματίσματος έδωσε στα γονίδια μια νέαελευθερία, διότι τα ιντρόνια δεν εξαναγκάζονταν πλέον να παρέχουν το καταλυτικόκέντρο για το μάτισμα. Ένα άλλο πλεονέκτημα της εξωτερικής κατάλυσηςγια το μάτισμα είναι ότι μπορεί να ρυθμίζεται πιο εύκολα. Ωστόσο,είναι σημαντικό να τονιστεί ότι οι ομοιότητες δεν αποδεικνύουν τη γενεαλογία.Οι ομοιότητες μεταξύ των ιντρονίων της ομάδας ΙΙ και του ματίσματος τουmRNA μπορεί να είναι αποτέλεσμα συγκλίνουσας εξέλιξης. Ίσως υπάρχειμόνο ένας περιορισμένος αριθμός οδών διεξαγωγής επαρκούς και εξειδικευμένηςεκτομής ιντρονίων. Για να προσδιορίσουμε εάν οι ομοιότητες αυτές κατάγονταιαπό γονική σειρά ή από χημεία χρειάζεται να αυξήσουμε τις γνώσειςμας στη βιοχημεία του RNA.EIKONA 28.37 Σύγκριση πορειών ματίσματος.Τα εξόνια που συνδέονται φαίνονται μπλε και κίτρινα,ενώ η προσβάλλουσα μονάδα φαίνεταιπράσινη. Στο μάτισμα της ομάδας Ι και της ομάδαςΙΙ η καταλυτική θέση σχηματίζεται από τοίδιο το ιντρόνιο (κόκκινο). Αντίθετα, το μάτισματων πυρηνικών πρόδρομων μορίων του mRNA καταλύεταιαπό snRNA και τις σχετιζόμενες με αυτάπρωτεΐνες στο σωμάτιο ματίσματος. [Κατά P. A.Sharp. Science 235(1987):769.]ΠΕΡΙΛΗΨΗ ΠΕΡΙΛΗΨΗ• Η μεταγραφή καταλύεται από την RNA πολυμεράσηΌλα τα κυτταρικά μόρια RNA συντίθενται από RNA πολυμεράσες σύμφωναμε οδηγίες που δίδονται από εκμαγεία DNA. Τα ενεργοποιημένα μονομερήυποστρώματα είναι τριφωσφορικοί ριβονουκλεοζίτες. Η κατεύθυνσητης σύνθεσης RNA είναι 5΄→3΄, όπως και στη σύνθεση του DNA.Οι RNA πολυμεράσες, σε αντίθεση με τις DNA πολυμεράσες, δεν χρειάζονταιέναν εκκινητή και δεν έχουν διορθωτική δραστικότητα νουκλεάσης.Η RNA πολυμεράση της Ε. coli είναι ένα ένζυμο πολλών υπομονάδων.Η σύσταση των υπομονάδων του ολοενζύμου των 500 περίπου kd είναια 2 ββ΄σ και η σύσταση του πυρήνα του ενζύμου είναι α 2 ββ΄. Η μεταγραφήαρχίζει σε θέσεις προαγωγέων που αποτελούνται από δύο ομόφωνες αλληλουχίες,η μία επικεντρωμένη κοντά στη θέση –10 και η άλλη κοντά στηθέση –35. Δηλαδή, 10 και 35 νουκλεοτίδια μακριά από τη θέση έναρξηςπρος την κατεύθυνση του 5΄-άκρου (ανοδικά). Η ομόφωνη αλληλουχία της

© ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΑΚΕΣ ΕΚΔΟΣΕΙΣ ΚΡΗΤΗΣ ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑΤΙΚΟ ΥΛΙΚΟ ΓΙΑ ΤΟ ΧΗΜΙΚΟ ΤΜΗΜΑ ΤΟΥ ΠΑΝ/ΜΙΟΥ ΑΘΗΝΩΝ908περιοχήςΚΕΦΑΛΑΙΟ 28 · Σύνθεση και μάτισμα RNA–10 είναι ΤΑΤΑΑΤ. Η υπομονάδα σ βοηθά το ολοένζυμο να αναγνωρίζειθέσεις προαγωγέων. Όταν η θερμοκρασία ανάπτυξης αυξάνεται,τα κύτταρα της Ε. coli εκφράζουν έναν ειδικό παράγοντα σ, ο οποίος επιλεκτικάδεσμεύεται σε διάκριτους προαγωγείς γονιδίων της θερμικής καταπληξίας.Η RNA πολυμεράση πρέπει να ξετυλίξει το δίκλωνο εκμαγείοτης διπλής έλικας για να πραγματοποιηθεί η μεταγραφή. Το ξετύλιγμα εκθέτειπερίπου 17 βάσεις στον κλώνο-εκμαγείο και ετοιμάζει το σκηνικόγια τον σχηματισμό του πρώτου φωσφοδιεστερικού δεσμού. Οι αλυσίδεςτου RNA συνήθως αρχίζουν με pppG ή pppA. Η υπομονάδα σ αποσυνδέεταιαπό το ολοένζυμο μετά από την έναρξη της νέας αλυσίδας. Η επιμήκυνσηπραγματοποιείται στις φυσαλίδες της μεταγραφής που μετακινούνταικατά μήκος του εκμαγείου DNA με μια ταχύτητα περίπου 50 νουκλεοτιδίωνανά δευτερόλεπτο. H νεοσυντιθέμενη αλυσίδα του RNA περιέχεισήματα τερματισμού που τελειώνουν τη μεταγραφή. Ένα σήμα τερματισμούείναι μια δομή φουρκέτας του RNA, η οποία ακολουθείται από μερικάκατάλοιπα U. Ένα διαφορετικό σήμα τερματισμού διαβάζεται από τηνπρωτεΐνη ρ που είναι μια ΑΤΡάση. Στην E. coli πρόδρομα μόρια tRNA καιrRNA διασπώνται και τροποποιούνται χημικά μετά τη μεταγραφή, ενώ μόριαmRNA χρησιμοποιούνται αναλλοίωτα ως εκμαγεία για τη σύνθεσηπρωτεϊνών.• Η ευκαρυωτική μεταγραφή και η μετάφραση είναι διαχωρισμένες στονχώρο και στον χρόνοΗ σύνθεση του RNA στα ευκαρυωτικά λαμβάνει χώρα στον πυρήνα, ενώη σύνθεση πρωτεϊνών πραγματοποιείται στο κυτταρόπλασμα. Στον πυρήναυπάρχουν τρεις τύποι RNA πολυμεράσης: η RNA πολυμεράση Ι συνθέτειπρόδρομα μόρια rRNA. Η RNA πολυμεράση ΙΙ συνθέτει πρόδρομαμόρια mRNA και η RNA πολυμεράση ΙΙΙ συνθέτει πρόδρομα μόρια tRNA.Οι ευκαρυωτικοί προαγωγείς είναι πολύπλοκοι, αποτελούμενοι από αρκετάδιαφορετικά στοιχεία. Οι προαγωγείς για την RNA πολυμεράση ΙΙ βρίσκονταιστην πλευρά 5΄ της θέσης έναρξης για τη μεταγραφή. Ο κάθε έναςαποτελείται από ένα πλαίσιο ΤΑΤΑ επικεντρωμένο μεταξύ των θέσεων –30και –100 καθώς και από πρόσθετες ανοδικές αλληλουχίες. Αναγνωρίζονταιαπό πρωτεΐνες που ονομάζονται παράγοντες μεταγραφής και όχι από τηνRNA πολυμεράση ΙΙ. Η πρωτεΐνη σχήματος σέλας που δεσμεύεται στοπλαίσιο ΤΑΤΑ ξετυλίγει και κάμπτει το DNA στις αλληλουχίες του πλαισίουΤΑΤΑ και χρησιμεύει ως εστιακό σημείο για τη συναρμολόγηση τωνσυμπλόκων μεταγραφής. Η πρωτεΐνη που δεσμεύεται στο πλαίσιο ΤΑΤΑαρχίζει τη συναρμολόγηση του ενεργού συμπλόκου μεταγραφής. Η δραστικότηταπολλών προαγωγέων αυξάνεται σημαντικά από ενισχυτικές αλληλουχίεςοι οποίες δεν έχουν οι ίδιες δραστικότητα προαγωγέα. Οι ενισχυτικέςαλληλουχίες μπορούν να δρουν από αποστάσεις αρκετών χιλιάδωνβάσεων και μπορεί να είναι τοποθετημένες είτε ανοδικά είτε καθοδικάενός γονιδίου.• Τα προϊόντα της μεταγραφής και των τριών ευκαρυωτικών πολυμερασώνυφίστανται επεξεργασίαΤα 5΄-άκρα των πρόδρομων mRNA καλύπτονται και μεθυλιώνονται κατάτην πορεία της μεταγραφής. Μια ουρά πολυ(Α) 3΄ προστίθεται στα περισσότεραπρόδρομα μόρια mRNA μετά τη διάσπαση της νεοσυντιθέμενηςαλυσίδας από μια ενδονουκλεάση. Διεργασίες διόρθωσης RNA αλλάζουντη νουκλεοτιδική αλληλουχία μερικών mRNA όπως εκείνης της απολιποπρωτεΐνηςΒ.Το μάτισμα πρόδρομων μορίων mRNA πραγματοποιείται από σωμάτιαματίσματος, τα οποία αποτελούνται από μικρά πυρηνικά ριβονουκλεοπρω-

© ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΑΚΕΣ ΕΚΔΟΣΕΙΣ ΚΡΗΤΗΣ ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑΤΙΚΟ ΥΛΙΚΟ ΓΙΑ ΤΟ ΧΗΜΙΚΟ ΤΜΗΜΑ ΤΟΥ ΠΑΝ/ΜΙΟΥ ΑΘΗΝΩΝτεϊνικά σωμάτια (snRNP). Οι θέσεις ματίσματος στα πρόδρομα mRNAπροσδιορίζονται από αλληλουχίες στα άκρα ιντρονίων και από θέσεις διακλάδωσηςκοντά στα 3΄-άκρα τους. Η υδροξυλική ομάδα ενός καταλοίπουαδενοσίνης στη θέση διακλάδωσης προσβάλλει τη θέση ματίσματος 5΄σχηματίζοντας ένα ενδιάμεσο δομής βρόχου. Το νέο 3΄-ΟΗ άκρο του ανοδικούεξονίου που δημιουργείται στη συνέχεια προσβάλλει τη θέση διάσπασης3΄ για να ενωθεί με το καθοδικό εξόνιο. Επομένως, το μάτισμα επιτελείταιμε δύο αντιδράσεις τρανσεστεροποίησης, με τον αριθμό των φωσφοδιεστερικώνδεσμών να παραμένει σταθερός κατά τη διάρκεια των αντιδράσεων.Τα μικρά πυρηνικά RNA στα σωμάτια ματίσματος καταλύουν τομάτισμα των πρόδρομων μορίων του mRNA. Πιο συγκεκριμένα, τα snRNAU2 και U6 σχηματίζουν το ενεργό κέντρο των σωματίων ματίσματος.909Eπιλεγμένη βιβλιογραφία• Η ανακάλυψη του καταλυτικού RNA ήταν αποκαλυπτική τόσο σε σχέσημε τον μηχανισμό όσο και με την εξέλιξηΜερικά μόρια RNA, όπως το πρόδρομο ριβοσωματικό RNA 26 S από τοπρωτόζωο Tetrahymena, υφίστανται αυτο-μάτισμα απουσία πρωτεϊνών. Μιααυτο-τροποποιούμενη παραλλαγή αυτού του ιντρονίου rRNA εμφανίζειπραγματική καταλυτική δράση. Μάτισμα που καταλύεται από σωμάτια ματίσματοςμπορεί να έχει εξελιχθεί από το αυτο-μάτισμα. Η ανακάλυψη τουκαταλυτικού RNA έχει ανοίξει νέους ορίζοντες στη διερεύνηση των πρώιμωνσταδίων της μοριακής εξέλιξης.ΟΡΟΙ-ΚΛΕΙΔΙΑμεταγραφή, 880RNA πολυμεράση, 880θέσεις προαγωγέων, 881παράγοντας μεταγραφής, 881αποτύπωση, 882ομόφωνη αλληλουχία, 883υπομονάδα σ, 883φυσαλίδα μεταγραφής, 886πρωτεΐνη ρ, 887πλαίσιο ΤΑΤΑ, 893ενισχυτής, 896προ-mRNA, 897κάλυμμα 5΄, 898ουρά πολυ(Α), 898διόρθωση RNA, 898μάτισμα RNA, 899σωμάτιο ματίσματος, 901μικρά πυρηνικά RNA (snRNA), 902εναλλακτικό μάτισμα, 904καταλυτικό RNA, 904αυτο-μάτισμα, 905ΕΠΙΛΕΓΜΕΝΗ ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΙΑAπό πού να αρχίσετεWoychik, N. A., 1998. Fractions to functions: RNA polymeraseII thirty years later. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol.63:311-317.Losick, R., 1998. Summary: Three decades after sigma. ColdSpring Harbor Symp. Quant. Biol. 63:653-666.Darnell, J. E., Jr. 1985. RNA. Sci. Am. 253(4):68-78.Cech, T. R., 1986. RNA as an enzyme. Sci. Am. 255(5):64-75.Sharp, P. A., 1994. Split genes and RNA splicing. Cell 77:805-815.Cech, T. R., 1990. Self-splicing and enzymatic activity of anintervening sequence RNA from Tetrahymena. Biosci. Rep.10:239-261.Guthrie, C., 1991. Messenger RNA splicing in yeast: Clues to whythe spliceosome is a ribonucleoprotein. Science 253:157-163.BιβλίαLewin, B., 2000. Genes (7th ed.). Oxford University Press.Kornberg, A., and Baker, T. A., 1992. DNA Replication (2d ed.).W. H. Freeman and Company.Lodish, H., Berk, A., Zipursky, S. L., Matsudaira, P., Baltimore,D., and Darnell, J., 2000. Molecular Cell Biology (4th ed.). W.H. Freeman and Company.Watson, J. D., Hopkins, N. H., Roberts, J. W., Steitz, J. A., andWeiner, A. M., 1987. Molecular Biology of the Gene (4th ed.).Benjamin Cummings.Gesteland, R. F., Cech, T., and Atkins, J. F. (Eds.), 1999. TheRNA World (2d ed.). Cold Spring Harbor Laboratory Press.RNA πολυμεράσεςCramer, P., Bushnell, D. A., and Kornberg, R. D., 2001. Structuralbasis of transcription: RNA polymerase II at 2.8 Å resolution.Science 292:1863-1875.Gnatt, A. L., Cramer, P., Fu, J., Bushnell, D. A., and Kornberg,R. D., 2001. Structural basis of transcription: An RNA polymeraseII elongation complex at 3.3 Å resolution. Science 292:1876-1882.Zhang, G., Campbell, E. A., Minakhin, L., Richter, C., Severinov,K., and Darst, S. A., 1999. Crystal structure of Thermus aquaticuscore RNA polymerase at 3.3 Å resolution. Cell 98:811-824.Campbell, E. A., Korzheva, N., Mustaev, A., Murakami, K., Nair,

© ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΑΚΕΣ ΕΚΔΟΣΕΙΣ ΚΡΗΤΗΣ ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑΤΙΚΟ ΥΛΙΚΟ ΓΙΑ ΤΟ ΧΗΜΙΚΟ ΤΜΗΜΑ ΤΟΥ ΠΑΝ/ΜΙΟΥ ΑΘΗΝΩΝ910 KEΦAΛAIO 28 · Σύνθεση και μάτισμα RNAS., Goldfarb, A., and Darst, S. A., 2001. Structural mechanismfor rifampicin inhibition of bacterial RNA polymerase. Cell104:901-912.Cheetham, G. M., and Steitz, T. A., 1999. Structure of atranscribing T7 RNA polymerase initiation complex. Science286:2305-2309.Ebright, R. H., 2000. RNA polymerase: Structural similaritiesbetween bacterial RNA polymerase and eukaryotic RNApolymerase II. J. Mol. Biol. 304:687-698.Paule, M. R., and White, R. J., 2000. Survey and summary:Transcription by RNA polymerases I and III. Nucleic AcidsRes. 28:1283-1298.Έναρξη και επιμήκυνσηBuratowski, S., 2000. Snapshots of RNA polymerase II transcriptioninitiation. Curr. Opin. Cell Biol. 12:320-325.Conaway, J. W., and Conaway, R. C., 1999. Transcriptionelongation and human disease. Annu. Rev. Biochem. 68:301-319.Conaway, J. W., Shilatifard, A., Dvir, A., and Conaway, R. C.,2000. Control of elongation by RNA polymerase II. TrendsBiochem. Sci. 25:375-380.Korzheva, N., Mustaev, A., Kozlov, M., Malhotra, A., Nikiforov,V., Goldfarb, A., and Darst, S. A., 2000. A structural modelof transcription elongation. Science 289:619-625.Reines, D., Conaway, R. C., and Conaway, J. W., 1999. Mechanismand regulation of transcriptional elongation by RNApolymerase II. Curr. Opin. Cell Biol. 11:342-346.Προαγωγείς, ενισχυτές και παράγοντες μεταγραφήςMerika, M., and Thanos, D., 2001. Enhanceosomes. Curr. Opin.Genet. Dev. 11:205-208.Park, J. M., Gim, B. S., Kim, J. M., Yoon, J. H., Kim, H. S.,Kang, J. G., and Kim, Y. J., 2001. Drosophila mediatorcomplex is broadly utilized by diverse gene-specifictranscription factors at different types of core promoters. Mol.Cell. Biol. 21:2312-2323.Fiering, S., Whitelaw, E., and Martin, D. I., 2000. To be or notto be active: The stochastic nature of enhancer action. Bioessays22:381-387.Hampsey, M., and Reinberg, D., 1999. RNA polymerase II as acontrol panel for multiple coactivator complexes. Curr. Opin.Genet. Dev. 9:132-139.Chen, L., 1999. Combinatorial gene regulation by eukaryotictranscription factors. Curr. Opin. Struct. Biol. 9:48-55.Muller, C. W., 2001. Transcription factors: Global and detailedviews. Curr. Opin. Struct. Biol. 11:26-32.Sakurai, H., and Fukasawa, T., 2000. Functional connectionsbetween mediator components and general transcriptionfactors of Saccharomyces cerevisiae. J. Biol. Chem. 275:37251-37256.Droge, P., and Muller-Hill, B., 2001. High local protein concentrationsat promoters: Strategies in prokaryotic and eukaryoticcells. Bio-essays 23:179-183.Fickett, J. W., and Hatzigeorgiou, A. G., 1997. Eukaryotic promoterrecognition. Genome Res. 7:861-878.Smale, S. T., Jain, A., Kaufmann, J., Emami, K. H., Lo, K., andGarraway, I. P., 1998. The initiator element: A paradigm forcore promoter heterogeneity within metazoan protein-codinggenes. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 63:21-31.Kim, Y., Geiger, J. H., Hahn, S., and Sigler, P. B., 1993. Crystalstructure of a yeast TBP/TATA-box complex. Nature 365:512-520.Kim, J. L., Nikolov, D. B., and Burley, S. K., 1993. Co-crystalstructure of TBP recognizing the minor groove of a TATAelement. Nature 365:520-527.White, R. J., and Jackson, S. P., 1992. The TATA-binding protein:A central role in transcription by RNA polymerases I, II andIII. Trends Genet. 8:284-288.TερματισμόςBurgess, B. R., and Richardson, J. P., 2001. RNA passes throughthe hole of the protein hexamer in the complex withEscherichia coli Rho factor. J. Biol. Chem. 276:4182-4189.Yu, X., Horiguchi, T., Shigesada, K., and Egelman, E. H., 2000.Three-dimensional reconstruction of transcription terminationfactor rho: Orientation of the N-terminal domain andvisualization of an RNA-binding site. J. Mol. Biol. 299:1279-1287.Stitt, B. L., 2001. Escherichia coli transcription termination factorRho binds and hydrolyzes ATP using a single class of threesites. Biochemistry 40:2276-2281.Henkin, T. M., 2000. Transcription termination control inbacteria. Curr. Opin. Microbiol. 3:149-153.Gusarov, I., and Nudler, E., 1999. The mechanism of intrinsictranscription termination. Mol. Cell. 3:495-504.Σχηματισμός του καλύμματος 5 και πολυαδενυλίωσηShatkin, A. J., and Manley, J. L., 2000. The ends of the affair:Capping and polyadenylation. Nat. Struct. Biol. 7:838-842.Ro-Choi, T. S., 1999. Nuclear snRNA and nuclear function(discovery of 5 cap structures in RNA). Crit. Rev. EukaryoticGene Expr. 9:107-158.Shuman, S., Liu, Y., and Schwer, B., 1994. Covalent catalysis innucleotidyl transfer reactions: Essential motifs in Saccharomycescerevisiae RNA capping enzyme are conserved inSchizosaccharomyces pombe and viral capping enzymes andamong polynucleotide ligases. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.91:12046-12050.Bard, J., Zhelkovsky, A. M., Helmling, S., Earnest, T. N., Moore,C. L., and Bohm, A., 2000. Structure of yeast poly(A) polymerasealone and in complex with 3-dATP. Science 289:1346-1349.Martin, G., Keller, W., and Doublie, S., 2000. Crystal structureof mammalian poly(A) polymerase in complex with an analogof ATP. EMBO J. 19:4193-4203.Zhao, J., Hyman, L., and Moore, C., 1999. Formation of mRNA3 ends in eukaryotes: Mechanism, regulation, andinterrelationships with other steps in mRNA synthesis.Microbiol. Mol. Biol. Rev. 63:405-445.Minvielle-Sebastia, L., and Keller, W., 1999. mRNA polyadenylationand its coupling to other RNA processing reactions andto transcription. Curr. Opin. Cell Biol. 11:352-357.Wahle, E., and Kuhn, U., 1997. The mechanism of 3 cleavage andpolyadenylation of eukaryotic pre-mRNA. Prog. Nucleic AcidRes. Mol. Biol. 57:41-71.Διόρθωση RNAGott, J. M., and Emeson, R. B., 2000. Functions and mechanismsof RNA editing. Annu. Rev. Genet. 34:499-531.Simpson, L., Thiemann, O. H., Savill, N. J., Alfonzo, J. D., andMaslov, D. A., 2000. Evolution of RNA editing in trypanosomemitochondria. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97:6986-6993.Chester, A., Scott, J., Anant, S., and Navaratnam, N., 2000. RNAediting: Cytidine to uridine conversion in apolipoprotein BmRNA. Biochim. Biophys. Acta 1494:1-3.Maas, S., and Rich, A., 2000. Changing genetic informationthrough RNA editing. Bioessays 22:790-802.Mάτισμα πρόδρομων μορίων mRNAStark, H., Dube, P., Luhrmann, R., and Kastner, B., 2001.Arrangement of RNA and proteins in the spliceosomal U1small nuclear ribonucleoprotein particle. Nature 409:539-542.Strehler, E. E., and Zacharias, D. A., 2001. Role of alternativesplicing in generating isoform diversity among plasmamembrane calcium pumps. Physiol. Rev. 81:21-50.Graveley, B. R., 2001. Alternative splicing: Increasing diversity inthe proteomic world. Trends Genet. 17:100-107.Newman, A., 1998. RNA splicing. Curr. Biol. 8:R903-R905.Reed, R., 2000. Mechanisms of fidelity in pre-mRNA splicing.

© ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΑΚΕΣ ΕΚΔΟΣΕΙΣ ΚΡΗΤΗΣ ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑΤΙΚΟ ΥΛΙΚΟ ΓΙΑ ΤΟ ΧΗΜΙΚΟ ΤΜΗΜΑ ΤΟΥ ΠΑΝ/ΜΙΟΥ ΑΘΗΝΩΝΑσκήσεις 911Curr. Opin. Cell Biol. 12:340-345.Sleeman, J. E., and Lamond, A. I., 1999. Nuclear organization ofpre-mRNA splicing factors. Curr. Opin. Cell Biol. 11:372-377.Black, D. L., 2000. Protein diversity from alternative splicing: Achallenge for bioinformatics and post-genome biology. Cell103:367-370.Collins, C. A., and Guthrie, C., 2000. The question remains: Is thespliceosome a ribozyme? Nat. Struct. Biol. 7:850-854.Aυτο-μάτισμα και καταλυτικό RNACarola, C., and Eckstein, F., 1999. Nucleic acid enzymes. Curr.Opin. Chem. Biol. 3:274-283.Doherty, E. A., and Doudna, J. A., 2000. Ribozyme structuresand mechanisms. Annu. Rev. Biochem. 69:597-615.Fedor, M. J., 2000. Structure and function of the hairpin ribozyme.J. Mol. Biol. 297:269-291.Hanna, R., and Doudna, J. A., 2000. Metal ions in ribozyme foldingand catalysis. Curr. Opin. Chem. Biol. 4:166-170.Scott, W. G., 1998. RNA catalysis. Curr. Opin. Struct. Biol. 8:720-726.Scott, W. G., and Klug, A., 1996. Ribozymes: Structure andmechanism in RNA catalysis. Trends Biochem. Sci. 21:220-224.Cech, T. R., Herschlag, D., Piccirilli, J. A., and Pyle, A. M., 1992.RNA catalysis by a group I ribozyme: Developing a model fortransition state stabilization. J. Biol. Chem. 267:17479-17482.Herschlag, D., and Cech, T. R., 1990. Catalysis of RNA cleavageby the Tetrahymena thermophila ribozyme 1: Kinetic descriptionof the reaction of an RNA substrate complementary tothe active site. Biochemistry 29:10159-10171.Piccirilli, J. A., Vyle, J. S., Caruthers, M. H., and Cech, T. R.,1993. Metal ion catalysis in the Tetrahymena ribozyme reaction.Nature 361:85-88.Wang, J. F., Downs, W. D., and Cech, T. R., 1993. Movement ofthe guide sequence during RNA catalysis by a group I ribozyme.Science 260:504-508.ΑΣΚΗΣΕΙΣ1. Συμπληρώματα. Η αλληλουχία ενός τμήματος mRNA είναι:5΄-AUGGGGAACAGCAAGAGUGGGGCCCUGUCCAAGGAG-3΄Ποια είναι η αλληλουχία του κωδικεύοντος κλώνου τουDNA; Ποια είναι η αλληλουχία του κλώνου-εκμαγείουτου DNA;2. Ελέγχοντας για λάθη. Γιατί η σύνθεση RNA δεν παρακολουθείταιπροσεκτικά για λάθη όπως η σύνθεση DNA;3. Η ταχύτητα δεν είναι η ουσία. Γιατί είναι πιο πλεονεκτικόγια τη σύνθεση DNA να είναι ταχύτερη από τη σύνθεσηRNA;4. Ικανός αναστολέας. Η ηπαρίνη αναστέλλει τη μεταγραφή,δεσμευόμενη στην RNA πολυμεράση. Ποιες ιδιότητεςτης ηπαρίνης της επιτρέπουν να δεσμεύεται στηνRNA πολυμεράση τόσο αποτελεσματικά;5. Ένα ελεύθερο κανόνι. Η πρωτεΐνη σ δεν δεσμεύεται η ίδιασε θέσεις προαγωγέων. Να προβλέψετε το αποτέλεσμαμιας μετάλλαξης που επιτρέπει στη σ να δεσμεύεται στηθέση –10 απουσία άλλων υπομονάδων της RNA πολυμεράσης.6. Κολλημένη πρωτεΐνη σ. Ποιο είναι το πιθανότερο αποτέλεσμαμιας μετάλλαξης που θα μπορούσε να εμποδίσειτην αποσύνδεση της σ από τον πυρήνα της RNA πολυμεράσης;7. Χρόνος μεταγραφής. Ποιο είναι το ελάχιστο χρονικό διάστημαπου απαιτείται για τη σύνθεση από την RNA πολυμεράσητης E. coli ενός μορίου mRNA που κωδικεύειμια πρωτεΐνη 100 kd;8. Μεταξύ φυσαλίδων. Πόσο απέχουν μεταξύ τους φυσαλίδεςμεταγραφής σε γονίδια της E. coli, τα οποία μεταγράφονταιμε μέγιστη ταχύτητα;9. Μια αποκαλυπτόμενη φυσαλίδα. Ας πάρουμε τη συνθετικήφυσαλίδα μεταγραφής RNA-DNA που απεικονίζεται παρακάτω.Ας αναφερθούμε στην κωδικεύουσα αλυσίδα τουDNA, τον κλώνο-εκμαγείο και τον κλώνο του RNA ωςκλώνους 1, 2 και 3, αντίστοιχα.3'-CCTATGAATGTCGGTACCTGTGCCGCTTATGAGGTAA...5'GG ACAC GG C GKÏÒÓÔ˜-AAUU U U UÂÎÌ·Á›ÔUU5'- UKˆ‰È·ˆÓ ÎÏÒÓÔ˜G GC CGG A A C GA A5'-GGATAC TTACAGCCAT TA C T CC ATT ... 3'10. Ατελέσφορος κύκλος. Δι- και τρινουκλεοτίδια πολλές φορέςελευθερώνονται από την RNA πολυμεράση κατά τηνέναρξη της μεταγραφής, μια διεργασία που ονομάζεταιατελέσφορος κύκλος. Η διεργασία αυτή χρειάζεται επα-RNA(α) Ας υποθέσουμε ότι ο κλώνος 3 είναι σημασμένοςμε 32 Ρ στο 5΄-άκρο του και ότι διεξάγεται ηλεκτροφόρησησε πηκτή πολυακρυλαμιδίου υπό μη αποδιατακτικέςσυνθήκες. Να προβλέψετε το αυτοραδιογραφικόπρότυπο για: (i) τον κλώνο 3 μόνον, (ii) τους κλώνους 1και 3, (iii) τους κλώνους 2 και 3, (iv) τους κλώνους 1, 2και 3 και (v) τους κλώνους 1, 2, 3 και τον πυρήνα τηςRNA πολυμεράσης(β) Ποιο είναι το πιθανό αποτέλεσμα της ριφαμπικίνηςστη σύνθεση RNA στο σύστημα αυτό;(γ) Η ηπαρίνη εμποδίζει την επιμήκυνση του RNA-εκκινητήόταν προστίθεται στον πυρήνα της RNA πολυμεράσηςπριν από το ξεκίνημα της μεταγραφής, αλλά όχιμετά την έναρξή της. Να εξηγήσετε τη διαφορά αυτή.(δ) Ας υποθέσουμε ότι η σύνθεση διεξάγεται παρουσίαΑΤΡ, CTP και UTP. Να συγκρίνετε το μήκος του μακρύτερουπροϊόντος που αποκτάται με εκείνο που αναμένεταιόταν υπάρχουν και τα τέσσερα ριβονουκλεοτίδια.

© ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΑΚΕΣ ΕΚΔΟΣΕΙΣ ΚΡΗΤΗΣ ΣΥΜΠΛΗΡΩΜΑΤΙΚΟ ΥΛΙΚΟ ΓΙΑ ΤΟ ΧΗΜΙΚΟ ΤΜΗΜΑ ΤΟΥ ΠΑΝ/ΜΙΟΥ ΑΘΗΝΩΝ912 KEΦAΛAIO 28 · Σύνθεση και μάτισμα RNAνέναρξη της μεταγραφής. Να προτείνετε μια πιθανή εξήγησηγια τον ατελέσφορο κύκλο.11. Αναστολή πολυμεράσης. Η κορδισεπίνη αναστέλλει τησύνθεση πολυ(Α) σε χαμηλές συγκεντρώσεις και τη σύνθεσηRNA σε υψηλότερες συγκεντρώσεις.15. Πολυπλοκότητα πρωτεώματος. Ποιες διεργασίες που εξετάστηκανστο κεφάλαιο αυτό κάνουν το πρωτέωμα πιοπολύπλοκο από το γονιδίωμα; Ποιες διεργασίες θα μπορούσαννα ενισχύσουν ακόμη περισσότερο την πολυπλοκότητααυτή;16. Τεχνική διαχωρισμού. Να προτείνετε έναν τρόπο με τονοποίο θα μπορούσατε να διαχωρίσετε mRNA από άλλουςτύπους RNA σε ένα ευκαρυωτικό κύτταρο.NNH 2Ασκήσεις ερμηνείας δεδομένωνHO(α) Ποια είναι η βάση της αναστολής από την κορδισεπίνη;(β) Γιατί η σύνθεση πολυ(Α) είναι πιο ευαίσθητη στηνπαρουσία κορδισεπίνης;(γ) Χρειάζεται η κορδισεπίνη τροποποίηση για ναασκήσει τη δράση της;12. Ένα επιπλέον τμήμα. Ποια είναι η αλληλουχία αμινοξέωντου επιπλέον τμήματος της πρωτεΐνης που συντίθεταισε έναν θαλασσαιμικό ασθενή που έχει μια μετάλλαξηη οποία οδηγεί σε εναλλακτικό μάτισμα; (βλ. Eικόνα28.28). Το πλαίσιο ανάγνωσης μετά τη θέση διάσπασηςαρχίζει με TCT.13. Ένα μήνυμα μακριάς ουράς. Ένας άλλος ασθενής με θαλασσαιμίαείχε μια μετάλλαξη που οδήγησε στην παραγωγήενός mRNA για την αλυσίδα β της αιμοσφαιρίνηςπου ήταν 900 νουκλεοτίδια μακρύτερη από την κανονική.Η ουρά πολυ(Α) αυτού του μεταλλαγμένου mRNAήταν τοποθετημένη μερικά νουκλεοτίδια μετά από τη μοναδικήαλληλουχία AAUAAA της επιπρόσθετης αλληλουχίας.Να προτείνετε μια μετάλλαξη που θα μπορούσενα οδηγήσει στην παραγωγή αυτού του αλλοιωμένουmRNA.Άσκηση μηχανισμούHO14. Διόρθωση RNA. Πολλά μόρια ουριδίνης εισέρχονται σεμερικά mRNA στα τρυπανοσώματα. Τα κατάλοιπα ουριδίνηςπροέρχονται από ουρές πολυ(U) μιας αλυσίδας-δότη.Τριφωσφορικοί νουκλεοζίτες δεν συμμετέχουν στηναντίδραση αυτή. Να προτείνετε έναν μηχανισμό αντίδρασηςπου είναι υπεύθυνος για την ανακάλυψη αυτή.(Υπόδειξη: Να συσχετίσετε τη διόρθωση RNA με το μάτισμαRNA.)OHNNKÔÚ‰ÈÛÂapple›ÓË (3ã-‰ÂÔ͢·‰ÂÓÔÛ›ÓË)N17. Ένα γενικό πείραμα. Πυρήνες απομονώθηκαν από εγκέφαλο,ήπαρ και μυς. Στη συνέχεια οι πυρήνες επωάστηκανμε α- 32 Ρ-UTP σε συνθήκες που επιτρέπουν τη σύνθεσηRNA, εκτός του ότι κατά την επώαση υπήρχε έναςαναστολέας της έναρξης της μεταγραφής. Το ραδιενεργόRNA απομονώθηκε και υβριδοποιήθηκε με διάφορεςαλληλουχίες DNA προσαρτημένες σε μια μικροσυστοιχίαDNA. Στα διαγράμματα που παρατίθενται, η έντασητων σκιάσεων υποδηλώνει περίπου πόσο mRNA προσκολλάταισε κάθε αλληλουχία DNA.◊apple·Ú M˘˜ EÁΤʷÏÔ˜(α) Γιατί η ένταση της υβριδοποίησης διαφέρει μεταξύτων γονιδίων;(β) Γιατί είναι σημαντικό το γεγονός ότι μερικά απότα μόρια RNA εμφανίζουν διαφορετικά σχήματα υβριδοποίησηςστους διαφορετικούς ιστούς;(γ) Μερικά γονίδια εκφράζονται σε όλους τους ιστούς.Ποια νομίζετε ότι μπορεί να είναι η φύση αυτών των γονιδίων;(δ) Να προτείνετε έναν λόγο για την προσθήκη ενόςαναστολέα της έναρξης της μεταγραφής στο μείγμα τηςαντίδρασης.18. Χριστουγεννιάτικα δένδρα. Το αυτοραδιογράφημα που παρατίθεταιδείχνει μερικά βακτηριακά γονίδια που υφίστανταιμεταγραφή. Να αναγνωρίσετε το DNA. Τί είναιοι κλώνοι αυξανόμενου μεγέθους; Πού βρίσκεται η έναρξητης μεταγραφής; Πού βρίσκεται το τέλος της μεταγραφής;Επάνω στη σελίδα, ποια είναι η κατεύθυνση τηςσύνθεσης RNA; Τί μπορείτε να συμπεράνετε για τοναριθμό των ενζύμων που συμμετέχουν στη σύνθεση RNAενός δεδομένου γονιδίου;Ασκήσεις συνδυασμού ύλης από διάφορα κεφάλαια