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Controllo ufficiale degli OGMnel settore agroalimentareUgo MarchesiIstituto Zooprofilattico Sperimentale Lazio e ToscanaCentro di Referenza Nazionale per la ricerca di OGMugo.marchesi@izslt.it

Alimentigeneticamentemodificatiautorizzatinell’UnioneEuropea

Alimentigeneticamentemodificatiautorizzatinell’UnioneEuropea

Costrutto utilizzato nella soia RoundupReadyCostrutto PV-GMGT04

Soia Roundup Ready• Nel genoma della pianta risultanoinserite almeno 2 copie del geneCP4EPSPS (tolleranza al glifosato)

Costrutti utilizzati nel mais Bt176Costrutto pCIB4431 (derivato di pUC)Costrutto pCIB3064 (derivato di pUC)

Mais Bt176 geneticamente modificato• La pianta produce la proteina tossicaper la piralide• Nel genoma della pianta sono state• Nel genoma della pianta sono stateinserite 6 copie del gene CryIAb e delgene bla (resistenza alle penicilline)ed almeno due copie del gene bar(tolleranza al glufosinato)

Costrutto utilizzato nei mais Bt11 e Bt10Costrutto pZO1502 (derivato di pUC)

Mais Bt11 geneticamente modificato• La pianta produce la proteina tossicaper la piralide• Nel genoma della pianta sono stateinserite 1 copia del gene CryIAb e delgene pat (tolletanza al glufosinato)• Non risulta integrato il gene bla(resistenza alle penicilline), presenteinvece in Bt10

Costrutto utilizzato nel mais T25Costrutto p35S/Ac (derivato di pUC)

Mais T25 geneticamente modificato• Nel genoma della pianta risultainserita 1 copia intera del gene pat(tolletanza al glufosinato) ed 1 copiaparziale del gene bla (resistenza allepenicilline)

Costrutto utilizzato nel mais MON810Costrutto PV-ZMBK07 (derivato di pUC)

Mais MON810 geneticamente modificato• La pianta produce la proteina tossicaper la piralide• Nel genoma della pianta è statainserita 1 copia del gene CryIAb• Non risulta integrato il t-NOSpresente nel costrutto

Costrutto utilizzato nel mais NK 603Costrutto PV-ZMGT32L

Mais NK603 geneticamente modificato• Nel genoma della pianta risultanoinserite 2 copie del gene CP4EPSPS(tolleranza al glifosato)

Costrutto utilizzato nel mais GA21NON AUTORIZZATO (parere favorevole EFSA)Frammento del costrutto pDPG434

Mais GA21 geneticamente modificato• Nel genoma della pianta risultanoinserite 4 copie del gene mEPSPS(tolleranza al glifosato)

Metodi analitici per la ricerca di OGM• Analisi delle proteine modificatemediante tecniche Elisa• Analisi del DNA modificato mediantePolymerase Chain Reaction (PCR) per ilrilevamento qualitativo e quantitativo

Metodologie analitiche per ilrilevamento di OGM negli alimentiAnalisi delle proteine• tipo ELISA• facile esecuzione• rapidi• poco costosi• quantitativi• sensibilità non elevata• raramente applicabili suprodotti finitiAnalisi del DNA• PCR• elevate sensibilità especificità• applicabili ad alimentifiniti• quantitativi• costosi• richiedono strutture dilaboratorio adeguate

Metodologie analitiche per ilrilevamento di OGM negli alimenti (2)Fasi di una metodica PCR:• estrazione del DNA– massa del campione da omogeneizzare (≈ 30 g - 30 kg)– massa del campione da analizzare (≈ 100 mg - 10 g)– selezione del metodo di estrazione in funzionedell’alimento:• buona resa• elevata purezza• ridotta degradazione• verifica della qualità e della quantità del DNA estratto:– determinazione spettrofotometrica– Elettroforesi– PCR real time

Metodologie analitiche per ilrilevamento di OGM negli alimenti (3)• amplificazione del DNA bersaglio– PCR controllo efficienza estrazione DNA vegetale:• bersaglio: sequenze specifiche della specie oggetto di analisi– PCR screening (es. PCR p35S e terminatore NOS)– PCR specifica– PCR quantitativa

Polymerase Chain Reaction (PCR))Animazione PCR

Polymerase Chain Reaction (PCR))

Tipologie di PCR• PCR “end point”• PCR real-time

Allestimento PCR

Amplificazione DNA

Elettroforesi dell’amplificato

Rivelazione dell’amplificato

PCR : l’analisi dei risultati• PCR ⇒ “end point”:analizza gliamplificati nellafase di plateau:• Fornisce pocheinformazioni suquantità e qualitàdel DNA

Nested PCR Maggiore specificità Maggiore sensibilitàPCR IPCR IILadder

I punti critici• Organizzazione dei laboratoriArea pre-PCRAREE DI PROVA 205 e 239Preparazione reagenti, primer, master mixAREA DI PROVA 220Estrazione DNA Allestimento PCR1Aree PCRAREA DI PROVA 221/AAllestimento PCR2AREA DI PROVA 221Reazione di PCR1Reazione di PCR2Area post-PCRAREA DI PROVA 210Elettroforesi acidi nucleici

Tipologie di PCR• PCR “end point”• PCR real-time

Rivelazione aspecifica

Rivelazione specifica in fluorescenzaReporterQuencher

Analisi multicomponente

Real Time: TaqMan• Sviluppato dalla AppliedBiosystems – principio della 5’esonucleasi.• Prevede un probe che ha duefluorocromi: un reporter ed unquencher.• Sfrutta la capacitàesonucleasica in posizione 5’della polimerasi per liberare ilfluorocromo reporter.• Il fluorocromo reporter liberatoemette fluorescenza.5’3’5’Saggio 5’-3’ esonucleasicoForwardPrimerRProbeNFQMGBReversePrimer5’3’5’

Real Time: TaqMan• Sviluppato dalla AppliedBiosystems – principio della 5’esonucleasi.• Prevede un probe che ha duefluorocromi: un reporter ed unquencher.• Sfrutta la capacitàesonucleasica in posizione 5’della polimerasi per liberare ilfluorocromo reporter.• Il fluorocromo reporter liberatoemette fluorescenza.5’3’5’Saggio 5’-3’esonucleasicoForwardPrimerRProbeNFQMGBReversePrimer5’3’5’

Real Time: TaqMan• Sviluppato dalla AppliedBiosystems – principio della 5’esonucleasi.• Prevede un probe che ha duefluorocromi: un reporter ed unquencher.• Sfrutta la capacitàesonucleasica in posizione 5’della polimerasi per liberare ilfluorocromo reporter.• Il fluorocromo reporter liberatoemette fluorescenza.5’3’5’Saggio 5’-3’esonucleasicoForwardPrimerRProbeNFQMGBReversePrimer5’3’5’

Real Time: TaqMan• Sviluppato dalla AppliedBiosystems – principio della 5’esonucleasi.• Prevede un probe che ha duefluorocromi: un reporter ed unquencher.• Sfrutta la capacitàesonucleasica in posizione 5’della polimerasi per liberare ilfluorocromo reporter.• Il fluorocromo reporter liberatoemette fluorescenza.5’3’5’Saggio 5’-3’esonucleasicoForwardPrimerRProbeNFQMGBAttività esonucleasica 5’-3’Spostamento e TaglioReversePrimer5’3’5’

Real Time: TaqMan• Sviluppato dalla AppliedBiosystems – principio della 5’esonucleasi.• Prevede un probe che ha duefluorocromi: un reporter ed unquencher.• Sfrutta la capacitàesonucleasica in posizione 5’della polimerasi per liberare ilfluorocromo reporter.• Il fluorocromo reporter liberatoemette fluorescenza.5’3’5’Saggio 5’-3’esonucleasicoForwardPrimerRProbeNFQMGBAttività esonucleasica 5’-3’ReversePrimer5’3’5’

Real Time: TaqMan• Sviluppato dalla AppliedBiosystems – principio della 5’esonucleasi.• Prevede un probe che ha duefluorocromi: un reporter ed unquencher.• Sfrutta la capacitàesonucleasica in posizione 5’della polimerasi per liberare ilfluorocromo reporter.• Il fluorocromo reporter liberatoemette fluorescenza.5’3’5’Saggio 5’-3’esonucleasicoForwardPrimerRProbeNFQMGBAttività esonucleasica 5’-3’ReversePrimer5’3’5’

Real Time: TaqMan• Sviluppato dalla AppliedBiosystems – principio della 5’esonucleasi.• Prevede un probe che ha duefluorocromi: un reporter ed unquencher.• Sfrutta la capacitàesonucleasica in posizione 5’della polimerasi per liberare ilfluorocromo reporter.• Il fluorocromo reporter liberatoemette fluorescenza.5’3’5’Saggio 5’-3’esonucleasicoForwardPrimerRProbeNFQMGBAttività esonucleasica 5’-3’ReversePrimer5’3’5’

Real Time: TaqMan• Sviluppato dalla AppliedBiosystems – principio della 5’esonucleasi.• Prevede un probe che ha duefluorocromi: un reporter ed unquencher.• Sfrutta la capacitàesonucleasica in posizione 5’della polimerasi per liberare ilfluorocromo reporter.• Il fluorocromo reporter liberatoemette fluorescenza.5’3’5’Saggio 5’-3’esonucleasicoForwardPrimerRProbeNFQ MGBReversePrimerPolimerizzazione completa5’3’5’

PCR Real Time

Curva di amplificazione∆Rn2.01.61.2ExpPlateau0.80.40Base line0 10 20 30 40CtThresholdN°cicli

PCR real time: analisi quantitativaRelazione tra ciclo soglia e quantità di DNA bersaglioCt = a log (n° copie DNA bersaglio) + b con a < 0FluorescenzaCopie di DNACicli di amplificazione

PCR Real Time

PCR Real Time40TC1507 Systemy = -3,196x + 37,625R 2 = 0,998435CALIBRATORI30Ct2520CAMPIONEINCOGNITO151,50 2,00 2,50 3,00 3,50 4,00LogN copie

Fasi della ricerca di OGM1. Ricerca ingrediente (specie vegetale)2. Screening GM3. Identificazione OGM4. Quantificazione OGM

1) Ricerca ingrediente (specie vegetale)Mais•Nested PCR Zeina•PCR adh, hmg, ssIIb, invertasiSoiaNested PCR Lectina

Metodologie analitiche per ilrilevamento di OGM negli alimenti1) Ricerca ingrediente (specie vegetale)• Per la soia:PCR lectinaPCR lectina POSNegDNAdi soiaassente ononamplificabilePOS2) SCREENING GM

Metodologie analitiche per ilrilevamento di OGM negli alimenti1) Ricerca ingrediente (specie vegetale)• Per il mais:PCR zeinaNegDNA di maisassente ononamplificabilePOS2) SCREENING GM

2) Screening GMPromotore 35STerminatore NOSPromotori presenti nelle pianteGM23 1P-35S656 battericiP-nos9P-FMV811P-Ssu22P-TA29altrindTerminatori presenti nelle pianteGM4519 3 17T-35ST-nosbattericiT-E91237T-ocs22T-tmlaltrind

Costrutti genici di alcuni eventi di trasformazione

Metodologie analitiche per ilrilevamento di OGM negli alimenti2) Screening GM• Per la soia:PCR lectinaCampione nonGMNegPOSPCR 35SNegDNAdi soiaassente ononamplificabilePCR NOSPOSCampione GM ?3) Identificazione evento GM

Metodologie analitiche per ilrilevamento di OGM negli alimenti2) Screening GM• Per il mais: PCR zeinaNegCampione nonGMNegPOSNegDNA di maisassente ononamplificabilePCR NOSPCR 35SPOSCampione GM ?POS3) Identificazioneevento GM

3) Identificazione evento GMPCR Evento specificaOGM IPCR Evento specificaDNA PiantaP sequenza codificante TDNA PiantaPCR Costrutto specificaDNA PiantaP sequenza codificante TDNA PiantaPCR Evento specificaOGM IIPCR Evento specifica

4) Quantificazione evento GM

4) Quantificazione evento GM40TC1507 Systemy = -3,196x + 37,625R 2 = 0,998435CALIBRATORI30Ct2520CAMPIONEINCOGNITO151,50 2,00 2,50 3,00 3,50 4,00LogN copie

Metodologie analitiche per ilrilevamento di OGM negli alimenti3-4) Identificazione e quantificazione OGM• Per la soia:NegPCR lectina POSPCR 35SNegCampione nonGMDNAdi soiaassente ononamplificabilePCR NOSPOSCampione GM ?qPCR RRSoglia0,9%

Metodologie analitiche per ilrilevamento di OGM negli alimenti3-4) Identificazione e quantificazione OGM• Per il mais:DNA di maisassente ononamplificabileNegPCR zeinaPOSPCR NOSPCR 35SPOSNegNegPOSCampione nonGMPCR Bt176PCR Bt11PCR T25PCR MON810qPCRPOSCampione GM ?Soglia0,9%MaisVIETATOPCR NK603PCR GA21PCR StarLinkSoglia0,5%

Stato di avanzamento dei dossierdi validazione del CRLhttp://gmo-crl.jrc.it/statusofdoss.htm